HYBRIDOWELL HERPES Tespit REF Kullanım amacı. 2. Kit Tanımı SADECE ARAŞTIRMA KULLANIMI İÇİN

Transkript

1 SADECE ARAŞTIRMA KULLANIMI İÇİN HYBRIDOWELL HERPES Tespit REF Kullanım amacı 1 2. Kit Tanımı 1 3. Test Prensibi 2 4. Kit içeriği ve saklama koşulları 2 5. Kit içeriğinde bulunmayan fakat gerekli reaktif ve materyaller 2 6. Reaktiflerin rekonstitüsyonu 3 7. Uyarı ve Önlemler 3 8. Amplifiye edilmiş ürünlerin saklanması 4 9. Kontroller Tespit protokolü Sonuçların hesaplanması ve yorumlanması Test performansı 8 13.Referanslar Arıza giderme Kılavuzu Kullanım amacı HYBRIDOWELL HERPES tespit kiti, microtiter plakalarda biotinylated problar ile hibridizasyon tarafından beyin omurilik sıvıları (CSF), sulu hümor, gözyaşları, jinekolojik örnekleri gibi biyolojik numunelerde Herpes enfeksiyonlarının tespitini sağlar. Bu kit aşağıdaki Herpesviruses in tiplenmesini sağlar: Herpes Simplex Virus tip 1 ve 2 (HSV-1 ve HSV- 2), Cytomegalovirus (CMV), Varicella Zoster Virus (VZV), Epstein - Barr Virus (EBV), ve Human Herpes Virus 6 (HHV-6). Tespit, HERPES CONSENSUS GENERIC kit (Ref.: ) ile elde edilen amplifiye edilmiş ürünlerden yapılır. Hızlı ve hassas herpesvirus tespiti, opsiyonel pozoloji (teşhis geliştirme) ile adapte antiviral tedavinin erken bir başlangıcını sağlar. 2. Kit Tanımı Herpes virüs ailesi insanlarda enfeksiyonların wild (vahşi) bir spektrumu içeren DNA virüsleridir. Birincil enfeksiyon sonrası, virüs bir gizli enfeksiyon olarak devam eder. Immunsupresyon durumlarında, virüs tekrarlayan enfeksiyonları üretmek için yeniden aktive olabilir. Herpes virüslerin ailesi birkaç yıl içinde tespit edilmiş 7 ve 8 herpes virüsü dahil, 8 virüs içerir. HYBRIDOWELL HERPES tespit kiti, merkezi sinir sistemi enfeksiyonlarına, HSV-1, HSV-2, CMV, EBV, VZV ve HHV-6 sahip altı ana insan herpesvirüslerin tespiti sağlar. Ensefalit in ölüm oranı, verimli spesifik antiviral tedavileri geliştirilmesine rağmen hala yüksektir. HSV-1 ve HSV-2 necrosant ensefalit in % 20 ile 70 ini kapsar. Bu virüslerin tespiti için klasik teknikler, özellikle kültür, merkezi sinir sistemi örnekleri için adapte edilmemiştir. Altı virüs ile üretilen klinik belirtiler spesifik viral takson değildir.

2 3. Test prensibi HERPES CONSENSUS GENERIC kit (Ref.: ) ile tespit edilen pozitif numuneler tam virüsü belirlemek için HYBRIDOWELL HERPES tespit kiti ile daha fazla analiz edilebilir. HERPES KONSENSÜS GENERIC kiti (Ref.: ) ile elde edilen amplifiye ürün tekrar kullanılır ve mikroplakada kimyasal olarak denatüre ve hibridize edilmiştir. Her amplifiye ürün 6 herpesvirüs spesifik biotinylated problar ile hibridize edilmiştir.tespit 3,3',5,5' tetrametilbenzidine (TMB) ve streptavidine peroksidaz konjugat ile gerçekleştirilir. Optik yoğunluk (OD) bir mikroplaka okuyucu ile 450 nm'de okunur. 4. Kit içeriği ve saklama koşulları R 4 Negatif tespit kontrol 0.1 R 5 Denatürasyon solüsyonu ml R 6 Denatürasyon solüsyonu 2 Xi-IRRITANT 1.5 ml R 7 Microtiter plaaka (12 x 8 kuyu) 1 R 8 Kaplama solüsyonu 35 ml R 9 Spesifik prob HSV-1... R10 Spesifik prob HSV-2... R11 Spesifik prob CMV... R12 Spesifik prob VZV... R13 Spesifik prob EBV... R14 Spesifik prob HHV-6... R15 Pozitif kontrol prob HSV-1... R16 Pozitif kontrol prob HSV-2... R17 Pozitif kontrol prob CMV... R18 Pozitif kontrol prob VZV... R19 Pozitif kontrol prob EBV... R20 Pozitif kontrol prob HHV-6... R21 Yıkama solüsyonu (10x) 2 x 60 ml R22 Konjugat dilüsyon tampon T-TOKSIK 15 ml R23 Streptavidine peroksidaz konjugat (50x) 0.3 ml R24 Substrat-Tetramethilbenzidine (TMB) 15 ml R25 Stop solüsyonu C- CORROSIVE 20 ml R26 Yapıştırıcı 2 Bu kit kutu üzerinde yazılı son kullanım tarihine kadar +2 C/+8 C de açılmadan önce ve açıldıktan sonra saklanabilir. 5. Kit içeriğinde bulunmayan fakat gerekli reaktif ve materyaller HERPES CONSENSUS GENERIC kit (ARGENE) - ref.: Microtiter plaka okuyucu (450 or 450/650 nm) ve yazıcı. Otomatik mikrotiter plaka yıkayıcı (opsiyonel). Steril pipetler. Pozitif boşluk uçlu veya tıkalı (aerosol bariyer ) uçlu mikropipetler. (1-20 μl and μl) Multikanallı pipettör. Tek kullanımlık reaktif rezervuarlar. Polipropilen tüpler (1.5 ml ve 15 ml). Inkübatör (+37 C). Vorteks karıştırıcı. Distile su. Tek kullanımlık lateks veya benzeri eldivenler.

3 6. Reaktiflerin çözündürülmesi 6.1. R21 -Yıkama solüsyonu (10x) Eğer kristaller konsantre yıkama solüsyonunda gözlenirse, kristaller çözülene kadar +37 C de ısıtın. 9 hacimlik distile su ile konsantre yıkama solüsyonunun (10x) (R21) bir hacmini karıştırın. Bütün kuyuların 10 kez yıkanmasını sağlamak için yeterli reaktif hazırlayın ( her zaman kuyu başına 350 μl) Yıkama solüsyonu 1x +2 C/+8 C de 3 ay stabilidir R22/R23 - Konjugat (50x) Beyaz bir çökelti konjugat dilüsyon tamponda (R22) görünebilir. Bu çökelti reaktif verimliliğini asla etkilemez. Bu durumda, reaktifi vorteksleyin ve gerekli hacim pipetleyin. ISITMAYIN. Daha önce homojen hale getirilmiş konjugat dilüsyon tampon (R22) içinde konjugatı 50x (R23) oranında dilüe edin. 49 hacim konjugat dilüsyon buffer R22 ile 1 hacim konjugatı (50x) (R23) karıştırın. Kuyu başına 100 μl dağıtmak için yeterli reaktif hazırlayın. Dilüe edilmiş 1ml konjugat için örnek: 980 μl (R22) ile 20 μl (R23) karıştırın. Kullanıma hazır konjugat hibridizasyon adımı sırasında kullanım öncesi hazır olmalıdır. Dilüe edilmiş konjugatı saklamayın. Kitin kullanımı için önlemler UYARI: Ekstraksiyon ortamında deterjan ve/veya yüksek protein konsantrasyonları mikrotiter plakada DNA kaplama ile engellenebilir. Bu nedenle, kit içinde sadece önerilen ve sağlanan reaktifleri kullanmak ve verilen prosedürü izlemek önemlidir. 7. Uyarılar ve önlemler 7.1. Moleküler biyoloji işlemleri için uyarılar ve önlemler Amplifikasyon prosedürleri numunenin kontaminasyon riskini önlemek için yüksek yetenekli teknik gerektirir. Numune hazırlama, amplifikasyon reaksiyonu ve amplife edilmiş ürün analizi için ayrı çalışma alanları kullanın. Reaktif yada numune hazırlama alanında amplifiye bir ürünü asla başlatmayın. Kullanılan örnekler sadece bu analiz için ayrılmalıdır. Numuneler biyolojik güvenlik kabini altında hazırlanmalıdır. Farklı örnek tüpleri aynı zamanda asla açılmalıdır. Örnekleri işlemek için kullanılacak pipetler sadece bu amaçla ayrılmalıdır. Bu pipetler filtre uçlu pozitif boşluklu pipetler veya hazırlanmış pipetler olmalıdır. Kullanılan uçların farklı türleri steril olmalıdır. Eşit miktarlardaki reaktifler için kullanılan pipetler sadece bu amaçla ayrılmalıdır Genel uyarılar ve önlemler Reaktiflerin cilde temasından kaçının. Eğer temas olursa bol miktarda su ile hemen yıkayın. Reaktifler kullanıldığında eldiven giyin. Potansiyel enfeksiyöz olarak tüm örnekler ve malzemeleri kullanın ve atın. Kullandıktan sonra: malzeme, reaktifler ve atığın potansiyel olarak enfeksiyöz olarak ele alınması gerekir. Bu testi gerçekleştirmeden önce tüm talimatları okuyun. Son kullanım tarihinden sonra reaktifleri kullanmayın (etiket basılmış). Yalnızca kitte bulunan reaktifleri kullanın. Diğer üreticilerin yada farklı lot numaralı kitlerin reaktiflerini değiştirmeyin. Ağız ile asla pipetlemeyin. Özel çalışma alanlarında sigara veya içecek içmeyin, yemek yemeyin.

4 7.3. Spesifik reaktiflerin uyarı ve önlemleri Denatürasyon solüsyonu 2 (R6) sodyum hidroksit içerir: o R36/38: Göz ile solunum sistemine hasara neden olur. o S26-37/39-45: Göz ile teması durumunda hemen bol su ile yıkayın ve doktora başvurun. Uygun eldivenler ve yüz/göz koruyucu giyin. Kaza durumunda veya kendinizi iyi hissetmiyorsanız, hemen bir doktora başvurunuz (mümkünse etiketi gösterin). Kullanıma hazır problar (R9 ile R20) formamid içerir. o R61: Hamile kadınlara zaralı olabilir. o S45 :Kaza durumunda veya kendinizi iyi hissetmiyorsanız, hemen bir doktora başvurunuz (mümkünse etiketi gösterin). o S53 :Maruz kalmaktan sakının- kullanmadan önce özel kullanım talimatlarını okuyun. Yıkama solüsyonu (R21) koruyucu olarak 0.01% timerosal içerir. Konjugat dilüsyon tampon (R22) potasyum dikromat içerir. o R46 : Kalıtsal genetik hasarlara neden olabilir. o R49 : Kanser yapabilir. o S45 : Kaza durumunda veya kendinizi iyi hissetmiyorsanız, hemen bir doktora başvurunuz (mümkünse etiketi gösterin). o S53 : Maruz kalmaktan sakının- kullanmadan önce özel kullanım talimatlarını okuyun. o S60 : Bu maddenin veya ambalajının imhası tehlikeli maddelere göre yapılmalıdır o S61 :Çevreye kontrolsüz verilmesinden kaçının. Özel kullanım talimatına / Güvenlik Bilgi Formuna bakın. Stop solüsyonu (R25) hidrojen klorür içerir. o R20 : Solunması halinde sağlığa zararlıdır. o R34 : Yanıklara neden olur. o S26 :Göz ile temasında derhal bol su ile yıkayın ve doktora başvurun. o S45 : Kaza halinde veya kendinizi iyi hissetmiyorsanız hemen bir doktora başvurun. (Mümkünse bu etiketi gösterin.) Reaktiflerin cilde temasından kaçının. Eğer temas olursa bol miktarda su ile hemen yıkayın. Reaktifler kullanıldığında eldiven giyin. 8. Örneğin alınması ve taşınması Eğer amplifiye edilen ürün hemen analiz edilmemişse, kullanana kadar -18 C/-22 C dondurulmalıdır. Uzun süre saklamak (birkaç günden fazla) için ürüne 1 μl EDTA 1 M ekleyin. 9. Kontroller Kontrollerin kullanımı manipülasyonu doğrulamak için zorunludur.

5 9.1. Pozitif Kontrol Laboratuvar herpesvirus strain ile enfekte hücreler kullanılarak ek bir pozitif kontrol eklenebilir. Bu kontrol bir örnek olarak kabul edilecektir. HERPES CONSENSUS GENERIC kit Ref.: ile güçlendirilecek ve ekstrate edilecektir ve HYBRIDOWELL HERPES tespit kitinin ilgili spesifik probu ile hibridize edilecektir. Kit, herpesvirus HSV-1, HSV-2, CMV, VZV, EBV ve HHV-6 karşılık gelen bir diziden bir parçayı amplifiye etmek için herpesvirus uyumlu primerlerin kapasitesini kontrol edilebilen bir kontrol içerir. Üç pozitif kontrol şişeleri HERPES CONSENSUS GENERIC kit ref.: B de verilir, ve aynı anda numune ile amplifiye edilir. Her pozitif kontrol aşağıdaki gibi ilgili pozitif kontrol probu ile hibridize edilecektir: o Plazmidler HSV-1 ve HSV-2 den amplifiye edilmiş ürün ; pozitif kontrol probları HSV-1 ve HSV-2 ile ayrı ayrı hibridize edilir. o Plazmidler CMV ve VZV den amplifiye edilmiş ürün ; pozitif kontrol probları CMV ve VZV ile ayrı ayrı hibridize edilir. o Plazmidler EBV ve HHV-6 den amplifiye edilmiş ürün ; pozitif kontrol probları EBV ve HHV-6 ile ayrı ayrı hibridize edilir Inhibisyon kontrol Bu kontrol numunede amplifikasyon inhibitörlerin varlığını ortaya koymaktadır. Bu kontrol manipülasyon sırasında HERPES CONSENSUS GENERIC kit ref.: B ile daha önce doğrulanmıştır; tespit sırasında tekrar analiz etmeye gerek yoktur Negatif amplifikasyon kontrolü Bu kontrol kontaminasyon yokluğunu gösterir. Bu kontrol manipülasyon sırasında HERPES CONSENSUS GENERIC kit ref.: B ile daha önce doğrulanmıştır; tespit sırasında tekrar analiz etmeye gerek yoktur Negatif tespit kontrol Bu kontrol (R4) cut-off tespit etmek için olanak sağlar(kullanıma hazır). Tespit adımı esnasında, bu kontrol her biri herpes spesifik prob ile hibridizasyon için 6 ayrı kuyuda test edilmiştir. 10. Tespit prosedürü Bu prosedürde kullanılan amplifiye dilmiş ürünler HERPES CONSENSUS GENERIC ref.: B ile elde edilir. Bu kit ile sonuçlar "herpesvirus positive" dir. Aynı amplifiye edilmiş ürünler 6 spesifik prob ile hidridize edilecektir. Her çalışma için, aşağıdaki modele göre gerekli kuyuların sayılarını seçin: o Numune : Amplifiye numume başına 6 kuyu Spesifik prob HSV-1 (R9) ile hibridize edilen 1 kuyu Spesifik prob HSV-2 (R10) ile hibridize edilen 1 kuyu Spesifik prob CMV (R11) ile hibridize edilen 1 kuyu Spesifik prob VZV (R12) ile hibridize edilen 1 kuyu Spesifik prob EBV (R13) ile hibridize edilen 1 kuyu Spesifik prob HHV-6 (R14) ile hibridize edilen 1 kuyu o Kontrol: 2 kuyu amplifiye edilmiş pozitif kontrol HSV-1 / HSV-2 Pozitif kontrol prob HSV-1 (R15) ile hibridize edilen 1 kuyu Pozitif kontrol prob HSV-2 (R16) ile hibridize edilen 1 kuyu

6 2 kuyu amplifiye edilmiş pozitif kontrol CMV / VZV Pozitif kontrol prob CMV (R17) ile hibridize edilen 1 kuyu Pozitif kontrol prob VZV (R18) ile hibridize edilen 1 kuyu 2 kuyu amplifiye edilmiş pozitif kontrol EBV / HHV-6 Pozitif kontrol prob EBV (R19) ile hibridize edilen 1 kuyu Pozitif kontrol prob HHV-6 (R20) ile hibridize edilen 1 kuyu 6 kuyu negatif tespit kontrol (R4) Spesifik prob HSV-1 (R9) ile hibridize edilen 1 kuyu Spesifik prob HSV-2 (R10) ile hibridize edilen 1 kuyu Spesifik prob CMV (R11) ile hibridize edilen 1 kuyu Spesifik prob VZV (R12) ile hibridize edilen 1 kuyu Spesifik prob EBV (R13) ile hibridize edilen 1 kuyu Spesifik prob HHV-6 (R14) ile hibridize edilen 1 kuyu 2 numuneler için örnek: Mikroplaka üzerinde 24 kuyuyu planlayın: 12 amplifiye numune kuyusu, 6 pozitif kontrol kuyusu, Yukarıda anlatıldığı gibi 6 tespit negatif kontrol kuyusu o Bir mikroplaka planı çizin. o R4, cut-off değerini hesaplamak için kitte bulunan negatif tespit kontrolüdür(kullanıma hazır). o Bütün kontrolleri amplifiye ürünlerle aynı işlemi görür Denatürasyon ve fiksasyon Post-amplifikasyon için ayrılmış odada Her numune/kontrol (R4 dahil) için, numaralandırılmış 1.5 ml polipropilen tüplerde 15 μl amplifiye edilmiş ürün dağıtın. 30 μl denatürasyon solüsyonu 1 (R5) ekleyin, vorteksleyin, 30 μl denatürasyon solüsyonu 2 (R6) ekleyin, vorteksleyin, ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin; Her tüpe 600 μl kaplama solüsyonu (R8) ekleyin, ve vorteksleyin. UYARI: Kolay yorum yapmak için mikroplaka kuyuları (R7) tanımlayın. 100 μl dağıtın: o her numune için 6 kuyu; o pozitif kontrol için 2 kuyu; o negatif tespit kontrol için 6 kuyu. Bir yapışkan (R26) ile plakayı kapatın ve en az 15 dakika boyunca 37 C'de (+37 C de 1 saate kadar) inkübe edin. Alternatif olarak oda sıcaklığında bir gece inkübe edebilirsiniz. 12 kullanıma hazır probları (R9 ile R20) +37 C de kullanım öncesi 15 dakika ısıtın Hibridizasyon Plakayı baş aşağı döndürerek kuyuları boşaltın ve kağıt bir havlu üzerinde kurutma kağıdı ile kurutun. 100 μl HSV-1 (R9) probu dağıtın: o 6 numune kuyularından birinin içinde; o 6 tespit negatif kontrol kuyularından birinin içinde. 100 μl HSV-2 (R10) probu dağıtın: o 6 numune kuyularından birinin içinde; o 6 tespit negatif kontrol kuyularından birinin içinde. 100 μl CMV (R11) probu dağıtın: o 6 numune kuyularından birinin içinde; o 6 tespit negatif kontrol kuyularından birinin içinde. 100 μl VZV (R12) probu dağıtın: o 6 numune kuyularından birinin içinde;

7 o 6 tespit negatif kontrol kuyularından birinin içinde. 100 μl EBV (R13) probu dağıtın: o 6 numune kuyularından birinin içinde; o 6 tespit negatif kontrol kuyularından birinin içinde. 100 μl HHV-6 (R14) probu dağıtın: o 6 numune kuyularından birinin içinde; o 6 tespit negatif kontrol kuyularından birinin içinde. 100 μl pozitif kontrol probu HSV-1 (R15) dağıtın: o Pozitif kontrol kuyuların HSV-1/HSV-2 birisi içinde. 100 μl pozitif kontrol probu HSV-2 (R16) dağıtın: o Pozitif kontrol kuyuların HSV-1/HSV-2 birisi içinde. 100 μl pozitif kontrol probu CMV (R17) dağıtın: o Pozitif kontrol kuyuların CMV/VZV birisi içinde. 100 μl pozitif kontrol probu VZV (R18) dağıtın: o Pozitif kontrol kuyuların CMV/VZV birisi içinde. 100 μl pozitif kontrol probu EBV (R19) dağıtın: o Pozitif kontrol kuyuların EBV/HHV-6 birisi içinde. 100 μl pozitif kontrol probu HHV-6 (R20) dağıtın: o Pozitif kontrol kuyuların EBV/HHV-6 birisi içinde. Bir yapışkan (R26) ile plakayı kapatın ve 30 dakika boyunca 37 C'de inkübe edin. Hibridizasyon adımı sona ermeden önce: +18 C/+25 C oda sıcaklığında ısınması için Konjugat dilüsyon tamponu (R22) bekletin; Bölüm 6 "Reaktifleri rekonstitüsyon da verilen talimatlara göre konjugat dilüsyonunda konjugatı 50x (R23) oranında dilüe edin Post hibridizasyon yıkama Bölüm 6 "Reaktifleri rekonstitüsyon da verilen talimatlara göre yıkama solüsyonu 10x (R21) çözündürün. Bir mikroplaka yıkayıcı veya manuel olarak yıkama ile plakayı yıkayın: o Oto yıkama için: a. Yıkama prosedürüne başlamadan önce 500 μl bir purjeyi programlayın; b. Kuyuların içeriğini aspirte edin; c. 1x yıkama solüsyonun 350 μl si ile kuyuları doldurun. 30 saniye bekletin ve kuruluğu aspirte edin (tamamen aspirasyon için kontrol edin) d. 4 kere ek olarak "c. "adımını tekrar edin; e. Kalıntı yıkama solüsyonu ortadan kaldırmak için kağıt havlu üzerinde plakaya hafifçe vurun. o Manuel yıkama için: a. Plakayı baş aşağı döndürerek kuyuları boşaltın ve kağıt bir havlu üzerinde kurutma kağıdı ile kurutun; b.tekrar pipeti veya yıkama şişesi ile 1x yıkama solüsyonun 350 μl sini dağıtın. 30 saniye bekletin. Devirerek kuyuları boşaltın ve kağıt havlu üzerine kuruluğu alın; c. 4 kere ek olarak "b" adımını tekrar edin Tespit ve post-tespit yıkama Plakayı baş aşağı döndürerek kuyuları boşaltın ve bir kağıt havlu üzerine kurutma kağıdı ile kurutun. Tekrarlayıcı pipet veya diğer uygun pipet cihazı kullanarak 100 μl kullanıma hazır konjugatı ekleyin; Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin; Bölüm"10.3" deki açıklamaya göre yıkayın.

8 10.5. Görüntüleme Substratı (R24) oda sıcaklığına getirin(+18 C/+25 C). Plakayı baş aşağı döndürerek kuyuları boşaltın ve bir kağıt havlu üzerinde kurutma kağıdı ile kurutun. Her kuyu içine substratın 100 μl sini dağıtın; Oda sıcaklığında (+18 C/+25 C) karanlıkta 30 dakika inkübe edin; Her kuyuya stop solüsyonun (R25) 100 μl sini ekleyerek reaksiyonu durdurun. Havaya karşı plaka okuyucuyu da blankı okuyun ve 450 nm de optikal yoğunluğu okuyun. Çift okumada yapılabilir(450/650 nm). 11. Sonuçların yorumlanması ve hesaplanması Testin doğrulanması ve cut-off değerinin tespiti Eğer negatif tespit kontrollerinin hibridizasyonundan sonra elde edilen OD (6 spesifik problar ile hibridize olan) ilgili kuyuların her biri için <0,4 OD ise, test sadece doğrulanabilir. Cut-off tespiti (CO): o Bir cut-off değeri (CO), altı probun her biri ile hibridizasyon sonrası tespit negatif kontroller ile elde edilen 6 sının ortalamasından hesaplanmaktadır. Hesaplama: o Eğer OD okuma 450 nm de yapılırsa, CO = OD ortalama o Eğer OD okuma 450/650 nm da yapılırsa: CO = OD ortalama Amplifikasyon pozitif kontroller ile elde edilen OD cut-off değeri üzerinde olmalıdır. Eğer bu şartlardan bir tanesi yerine getirilmezse, test GEÇERSİZ Kabul edilir ve tekrar edilmelidir. Elde edilen sonuçlar daha sonra analiz edilir Sonuçların Yorumlanması Kontrol ve cut-off değerinin doğrulaması sonrası, her prob ile hibridizasyondan sonra elde edilene numune OD değerlerini karşılaştırın: o Eğer OD numune > CO + 10% ise; Amplifikasyon herpesvirus için pozitiftir. o Eğer OD numune < CO - 10% ise; Amplifikasyon herpesvirus için negatiftir. o Eğer OD numune = CO ± 10%; Amplifikasyon belirlenemez ve amplifiye edilen ürün tekrar test edilmelidir. Belirlenemez amplifiye edilmiş ürünlerin tekrar test edilmesinden sonra: o Eğer OD numune > CO + 10% ise; Amplifikasyon herpesvirus için pozitiftir. o Eğer OD numune < CO - 10%A ise; Amplifikasyon herpesvirus için negatiftir. o Eğer OD numune = CO ± 10%; Yeni bir numune elde edin ve tekrar test edin*. * Eğer yeni numunede elde edilen OD CO 10% ise, numune ilgili herpesvirus için pozitif olarak belirlenmiştir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanılan DNA amplifikasyonu için yöntemler Hoffman- La Roche için çıkarılmış ABD patent N ve tarafından karşılanmaktadır. Ne ARGENE den herhangi bir ürün ne de bu yayında her şeyi satın almak bu yöntemleri kullanma yetkisi olarak yorumlanmamalıdır.

9 12. Testin performansı CSFler de retrospektif testten elde edilen sonuçlar MINJOLLE S. et al. J. Clin. Microbiol (1999).. 37: Kurum içi farklı PCR lar (HSV-1, HSV-2, CMV, VZV) ile daha önce karakterize edilen uçuk enfeksiyon şüpheli 100 numune analiz edildi. İstenen PCR Spesifik PCR HERPES CONSENSUS 78 HSV HSV CMV VZV Mükemmel bir korelasyon farklı teknikler ile elde edildi. Ayrıca, HERPES CONSENSUS GENERIC ve HYBRIDOWELL HERPES IDENTIFICATION kitlerin kullanımı diğer klinik örneklerin karakterizasyonunu sağlar: 2 HSV-1 3 HSV-2 1 CMV 6 EBV 5 VZV 2 HHV-6 4 herpetik ko-enfeksiyonlar dahil CMV+VZV+HSV-2 HSV-2+VZV CMV+HHV-6 CMV+VZV Bu sonuçlar klinik örneklerde altı Herpesvirüslerin aynı anda tespit edilmesinin ne kadar ilginç olduğunu göstermektedir. 100 CSFler arasında, 14 numuneye karşılık gelen 19 viral enfeksiyon incelenmiştir yada tespit edilmiştir. Bu nedenle, 26 örnek (% 26) spesifik referans PCR sahip 12 (% 12) karşı pozitif olarak tespit edildi ve onaylandı Fransa'da önceden çalışılmış 37 örneğin sonuçları. HERPES CONSENSUS GENERIC kit sonra HYBRIDOWELL HERPES IDENTIFICATION kit ve kurum içi PCR lar ile elde edilen sonuçlar karşılaştırın (6 spesifik PCR lar, amplifiye edilmiş ürünler microtiter plaka da tespit edilir). Herpetik enfeksiyonu şüphesi 37 örnek analiz edildi: 28 CSF 2 tam kan (on EDTA) 1 sulu hümor 3 cornea 1 oral numune 1 amniyotik sıvı 1 vitrektomi

10 Spesifik PCR HERPES CONSENSUS GENERIC + - Toplam Toplam sonuç doğrulanmıştır. 2 CSFler kurum içi PCR ile negatif olarak ve HERPES CONSENSUS test ile pozitif olarak tespit edildi: Biri HSV-1 pozitiftir ve diğeri CMV pozitiftir. HERPES CONSENSUS test ile negatif olarak tespit edilen her iki numune EDTA örnekte CMV pozitif sulu hümor ve bir EBV pozitif tam kana karşılık gelir. Duyarlılık: 90% Özgüllük: 88%

11 13. Referanslar 1) MINJOLLE, S., C. MICHELET, I.JUSSELIN, M. JOANNÈS, F. CARTIER, et R. COLIMON. Amplification of the six Major Human Herpesviruses from Cerebrospinal Fluid by a single PCR. J. Clin. Microbiol (1999).. 37: (2) NICAND E., V. LACOSTE, M. GRANDADAM, R. TEYSSOU, et Y. BUISSON. Sept Intérêts de la biologie moléculaire dans le diagnostic des infections virales du système nerveux central. Revue Française des Laboratoires. 315: (3) BOUQUILLON C., A. DEWILDE, L. ANDREOLETTI, V. LAMBERT V. CHIEUX, Y. GERARD, G. LION, L. BOCKET, et P. WATTRE. Simultaneous detection of 6 human herpesviruses in cerebrospinal fluid and aqueous fluid by a single PCR using stair primers. J. of Medical Virology Nov2000 ; 62(3): (4) MARKOULATOS P., GEORGOPOULOU A., SIAFAKAS N., PLAKOKEFALOS E., TZANAKAKI G., KOUREA-KREMASTINOU J. Laboratory Diagnosis of Common Herpesvirus Infections of the Central Nervous System by a Multiplex PCR Assay. J Clin. Microbiol. 2001; 39: p (5) WEIL AA, GLASER CA, AMAD Z, FORGHANI B. Patients with suspected herpes simplex encephalitis: rethinking an initial negative polymerase chain reaction result. Clin Infect Dis Apr 15;34(8): (6) ROBERT PY, TRACCARD I, ADENIS JP, DENIS F, RANGER-ROGEZ S Multiplex detection of herpesviruses in tear fluid using the "stair primers" PCR method: prospective study of 93 patients. J Med Virol Apr;66(4): (7) COLIMON R. Introduction to the virological diagnosis of the most frequent infections of the central nervous system. J. of Clinical Virology 25 (2002) S1-S3. (8) CABEDA J.M., CASTRO A.P., AMORIN M.L., MENDES A.C., MONTEIRO L., AMORIM J.M. Detection of herpesvirus infection of the CNS: the experience of Hospital Geral de Santo Antonio. J. of Clinical Virology 25 (2002) S53-S57. (9) MINJOLLE S., ARVIEUX C., GAUTIER A., JUSSELIN I., THOMAS R., MICHELET C., COLIMON R. Detection of herpesvirus genomes by polymerase chain reaction in cerebrospinal fluid and clinical findings. J. of Clinical Virology 25 (2002) S59-S70. (10) CALVARIO A., BOZZI A., SCARASCIULLI M., VENTOLA C., SECCIA R. STOMATI D., BRANCASI B. Herpes Consensus PCR test: a useful diagnostic approach to the screening of viral diseases of the central nervous system. J. of Clinical Virology 25 (2002) S71-S78. Posters : (1) BARRANGER C., KABACHE N., CRÉTÉ N., JOANNÈS M. Herpes Consensus Detection by single tube Amplification and microplate Detection in cerebrospinal fluid (CSF) samples. European Virology 2000, Glasgow, Scotland,September (2) BARRANGER C., CRÉTÉ N., KABACHE N., JOANNÈS M., and HARRIS P. Herpes Consensus Detection in cerebrospinal fluid samples. American Society of Microbiology, Orlando, USA, May (3) ZHANG A., and GINOCCHIO C.C.

12 Performance Evaluation of the Argene Generic Herpes Consensus and Herpes Consensus Identification Kits for the Detection of the Six Major Herpesviruses. American Society of Microbiology, Orlando, USA, May 2001 (4) BARRANGER C., KABACHE N., JOANNÈS M., and HARRIS P. Single-tube Consensus Detection by PCR of herpes simplex types 1 and 2 or 6-member herpes group viruses in cerebral spinal fluid using microplates. Clinical Virology Symposium, Clearwater, USA, April/May (5) STOFFLER-MEILICKE M., HEILBRONN R. and ENGELMANN E. Use of a Commercial Herpes Consensus PCR for the Detection of Different Herpes Viruses in Cerebrospinal Fluid and Other Clinical Materials.. IUMS, Paris, July (6) SCHAEFER C., NOPPEN C., CALDARONE A., SCHAEFER C. Detection and identification of six herpes-family viruses using magna pure LC and herpesconsensus PCR. IUMS, Paris, July 2002.

13 14. Arıza giderme kılavuzu Reaksiyon vermemesi yada zayıf vermesi OLASI NEDENLER ÖNERİLER Ekstraksiyon prosedürü İnhibisyon kontrol negatif ise, tekrar ekstraksiyon yapın, inhibisyon kontrollü sonucu kontrol edin. Yıkama prosedür adımda önerildiği gibi ek santrifüj gerçekleştirin. Ampilifikasyon prosedürü Pozitif kontrol sonucunu kontrol edin. Eğer zayıf yada negatifse, amplifikasyon programını kontrol edin. Üretici tarfından önerildiği gibi termocycler ın performansını kontrol edin. Denatürasyon prosedürü Uygun prosedür:denatürasyon 1, vorteks, Denatürasyon 2, vorteks, 5 dakika inkübasyon. Hibridizasyon sıcaklığı yetersizdir. Hibridizasyon süresince sıcaklığı kontrol edin. Konjugat konsantrasyonu çok düşüktür. Konjugat dilüsyonunu kontrol edin Yüksek arkaplan OLASI NEDENLER ÖNERİLER Yıkama prosedürü. Post-hibridizasyon ve post-tespit yıkama prosedürünü, sayısını ve zamanını izleyin. Konjugat konsantrasyonu çok yüksektir. Konjugat dilüsyonu kontrol edin. Konjugat çökeltisi sırasında sorun. Konjugat kuyu üstüne değil kuyu altına pipetlenmelidir. Konjugatın inkübasyon sıcaklığı çok yüksektir. Oda sıcaklığını kontrol edin (+18 C/+25 C).