3.Nesil. Makale no.: C1401

Transkript

1 RIDASCREEN Norovirüs 3.Nesil Makale no.: C1401 R-Biopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, D Darmstadt, Almanya Telefon: +49 (0) / Fax: +49 (0)

2 1. Kullanım amacı İn vitro diagnostik kullanım içindir. RIDASCREEN Norovirüs 3.Nesil insan dışkı örneklerinde norovirüs genogrup I ve II nin kalitatif tespiti için enzim immunoassaydir. 2. Özet ve testin açıklaması Norovirüsler ABD de yılda tahmini 23 milyon vakayla dünya çapında gastroenteritin önemli nedenidir (1, 2). Enfeksiyon bakım tesisleri, hastaneler, çocuk gündüz bakımı ve cezaevleri gibi kurum ve topluluklarda ya da yolcu gemilerinde patlak verdiğinde genellikle dahil oldukları bulunmuştur (3, 4, 5). Norovirüs enfeksiyon salgınları halk sağlığı açısından önemli bir yük olabilmesine rağmen daha sık bakteriyel enfeksiyon salgınları olarak bildirilmektedir (6). Norovirüs kaynaklı gastroenterit güçlü bulantı, kusma güçlü ve şiddetli ishal gösterir saat inkübasyon süreci vardır sonra semptomlar saat sürebilir. Sadece 100 virüs partikülünün bulaşıcı dozu son derece düşüktür, kişiden kişiye çok etkili yayılması için bu virüse ortam sağlar. Virüs kusmuk ve dışkı ile atıldığından, virüsü taşıyan aerosol damlacıklarının oluşumu iletimin aerogenic yolunu fekal-oral iletim kadar önemli kılar. Bu sosyal topluluk ortamlarında enfeksiyonun genellikle çok hızla yayılmasında belirgindir. Birkaç istisna dışında virüs yaklaşık iki haftalık bir süre için atılır, daha fazla bulaşma ek riski oluşturur. Belirgin değişkenlik kapsamlı bağışıklığa hiç izin vermediğinden norovirüs tekrar enfeksiyonu mümkündür. Dışkı örneği analizinin her zamanki diagnostik metodları elektron mikroskobuna veya esas olarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tarafından genomun moleküler tanısına sınırlıdır. Bu metodlar nispeten talep ettikleri için ve özel uzmanlık ve özel laboratuar-teknik ekipman gerektirdiğinden daha basit ve daha hızlı tarama testi gereklidir. Zaten devam eden gelişimin üçüncü neslinde bu ELISA, bu sorun için çok alakalı bir yanıttır. Monoklonal antikorlarla RIDASCREEN Norovirüs ELISA her iki norovirüs genogrubun çok özel ve çok duyarlı tanımlamasını sağlar. 3. Test prensibi RIDASCREEN Norovirüs 3.Nesil Testi sandviç-tip yöntemde spesifik monoklonal antikorlar kullanır. Mikrokuyu plağın kuyu yüzeyi birkaç farklı genotip antijenleri için spesifik antikorlarla kaplanır. Bir pipet oda sıcaklığında (20 25 C) inkübasyon için biyotinli monoklonal anti-norovirüs antikorları (Konjugat 1) ile birlikte mikrokuyu plağın kuyusuna incelenecek kontroller ve dışkı örneğinin bir süspansiyonunu yerleştirmek için kullanılır. Yıkama aşaması sonrası, streptavidin poly-peroksidaz konjugat (Konjugat 2) eklenir ve tekrar oda sıcaklığında (20 25 C) inkübe edilir. Dışkı örneğinde norovirüslerin varlığı ile hareketsiz antikorlar, norovirüs antijenler ve biyotinstreptavidin-peroksidaz kompleksi ile konjuge antikorlar içeren bir sandviç kompleksi oluşur. Başka yıkama aşaması bağlanmamış streptavidin poly-peroksidaz konjugatı kaldırır. Substrat RIDASCREEN Norovirüs

3 eklenmesinden sonra bağlanan enzim mikrokuyu plağın kuyularındaki önceden renksiz olan solüsyonun rengini eğer test pozitifse maviye dönüştürür. Durdurma reaktifinin eklenmesi rengi maviden sarıya dönüştürür. Ekstinksiyon numunede bulunan norovirüslerin konsantrasyonuyla orantılıdır. 4 Sağlanan reaktifler Kit içindeki reaktifler 96 tespit için yeterlidir. Plak 96 Mikrokuyu plak, strip tutucuda 12 mikrokuyu strip (bölünebilen); monoklonal anti-norovirüs antikorlarıyla kaplı Seyreltici ml Örnek dilüsyon buffer, protein-buffered NaCl solüsyonu; kullanıma hazır;mavi renkli Yıkama 100 ml Yıkama buffer, fosfat buffered NaCl solüsyonu (konsantre 10-kat); 0.1% thimerosal içerir Kontrol + 2 ml Pozitif kontrol; inaktif Norovirüs capsid protein); kullanıma hazır Kontrol - Konjugat 1 Konjugat 2 2 ml 13 ml 13 ml Negatif kontrol (örnek dilüsyon buffer); kullanıma hazır Stabilize protein solüsyonunda biyotin-konjuge anti-norovirüs antikorlarları; kullanıma hazır; mavi renkte Stabilize protein solüsyonunda streptavidin poly- peroksidaz konjugat; kullanıma hazır; turuncu renkli Substrat 13 ml Hidrojen peroksit/tmb; kullanıma hazır Durdurma 8 ml Durdurma reaktifi; 1 N sülfürik asit;kullanıma hazır 5. Reaktifler ve onların saklanması Tüm reaktifler 2 8 C de saklanmalıdır ve etikette basılı tarihe kadar kullanılabilir. Seyreltilmiş yıkama buffer 2 8 C de saklanması şartıyla maksimum 4 hafta için kullanılabilir. Mikrobiyel kontaminasyon önlenmelidir. Son kullanma tarihinden sonra kalite garantisi artık geçerli değildir. Alüminyum çanta kilit parçalanmayacak şekilde makasla açılmalıdır. Gerekmeyen herhangi mikrokuyu strip hemen alüminyum çantaya konulmalı ve 2 8 C de saklanmalıdır. Renksiz substratın ayrışmasını veya oto-oksidasyon nedeniyle maviye dönmesini önlemek için direkt ışıktan korunmalıdır. Birkez substrat maviye dönmüşse kullanılmamalıdır. RIDASCREEN Norovirüs

4 6. Ek gerekli reaktifler ve gerekli ekipman 6.1. Reaktifler - Distile veya deiyonize su 6.2. Ekipman Test tüpleri Tek kullanımlık pipetler (Makale no.: Z0001) Vorteks karıştırıcı (isteğe bağlı, 9.3. bakın) µl ve 1 ml hacimleri için mikropipet Ölçüm silindiri (1,000 ml) Kronometre Mikrokuyu plaklar veya çok kanallı pipetler için yıkama cihazı (300 µl) Mikrokuyu plaklar için fotometre (450 nm ve referans filtre nm) Filtre kağıdı (laboratuvar havlusu) 0.5% hipoklorit solüsyonu içeren atık kabı 7. Kullanıcılar için önlemler Sadece in vitro diagnostik kullanım içindir. Bu test sadece eğitimli laboratuvar personeli tarafından yapılmalıdır. Medikal laboratuvarlardaki çalışma kuralları takip edilmelidir. Her zaman bu test için kullanıcı talimatlarına sıkıca bağlı kalın. Numuneler veya reaktifler ağızla pipetlenmemeli ve yaralı cilt veya mukoz membranlarıyla temas önlenmelidir. Numuneleri kullanırken kişisel koruyucu donanım (Uygun eldivenler, laboratuvar ceketi, koruyucu gözlük) giyin ve test bittikten sonra ellerinizi yıkayın. Örneklerin işlendiği alanlarda sigara içmeyin veya birşey yiyip içmeyin. Daha fazla detay için da Malzeme Güvenlik Bilgi Formuna (MSDS) bakın. Bu kit inaktif Norovirüs capsid protein içeren bir pozitif kontrol içerir. Hasta örnekleri gibi olası bulaşıcı materyal gibi işlenmeli ve uluslararası güvenlik düzenlemeleri ile uyumlu kullanılmalıdır. Yıkama buffer koruyucu olarak 0.1 % thimerosal içerir. Bu maddenin cilt veya mukoz membranlarıyla teması önlenmelidir. Kullanımdan sonra tüm reaktiflerin ve materyallerin uygun ve sorumlu şekilde atımını sağlayın. Atım için lütfen ulusal düzenlemelere bağlı kalın. RIDASCREEN Norovirüs

5 8. Numune toplama ve saklama Dişki örnekleri ishal başlangıç belirtilerinin meydana gelmesinden sonra üç gün içinde mümkün olduğunca çabuk alınmalıdır. Kullanılıncaya kadar test materyalini 2 8 C de saklayın. Eğer materyal üç gün içinde test için kullanılamıyorsa -20 C veya daha soğukta saklanmasını öneririz. Numunenin tekrar tekrar dondurulup çözdürülmesinden kaçının. Örnek dilüsyon buffer içinde dışkı örneğini seyrelttikten sonra 1:11, yedi gün içinde kullanım için 4 C de saklanabilir. Dışkı örnekleri ve rektal lekeler koruyucular, hayvan serumları, metal iyonlar, oksitleyici maddeler veya deterjanlar içeren taşıma ortamıyla taşıma kaplarında toplanmamalıdır, bunlar RIDASCREEN Norovirüs 3.Nesil Testine müdahale edebilir. Rektal lekeler kullanılacaksa dışkı materyali hacminin test için yeterli olduğundan emin olun (yaklaşık 100 mg). Kontakt izleme asemptomatik taşıyıcıları belirlemek amacıyla klinik semptomlar göstermeyen kontakt kişilerden alınan dışkı örneklerini içermelidir. 9. Test prosedürleri 9.1. Genel bilgi Tüm reaktifler ve mikrokuyu Plak kullanımdan önce oda sıcaklığına (20 25 C) getirilmelidir. Bu mikrokuyu stripler oda sıcaklığına erişene kadar alüminyum çantadan çıkartılmamalıdır. Bu reaktifler kullanımdan hemen önce iyice karıştırılmalıdır. Kullandıktan sonra mikrokuyu stripler (kapalı çantalarda yerleşik) ve reaktifler tekrar 2 8 C de saklanmalıdır. Birkez kullanıldığında mikrokuyu stripler tekrar kullanılmamalıdır. Bu reaktifler ve mikrokuyu stripler paketleme zarar görmüşse veya şişelerden sızıntı varsa kullanılmamalıdır. Çapraz kontaminasyonu önlemek için örneklerin kit bileşenleriyle direkt teması önlenmelidir. Bu test direkt güneş ışığında yapılmamalıdır. Buharlaşma kayıplarını önlemek için mikrokuyu plağın kaplanmasını veya üstüne plastik wrap yerleştirilmesini öneririz Yıkama buffer hazırlama 9 kısım distile suyla 1 kısım yıkama buffer konsantreyi Yıkama karıştırın. Konsantre içinde bulunan herhangi kristali 37 C de su banyosunda ısıtılarak önceden çözülmüş olmalıdır. 9.3 Örnekleri hazırlama 1 ml RIDASCREEN örnek dilüsyon buffer Seyreltici 1 ile etiketli bir test tüpünü doldurun. Sadece ikinci çıkıntının üstüne ince dışkı örneğini aspire etmek için (yaklaşık 100 µl) ve süspansiyon yapmak için test tüpünde buffera eklenmesi için tek kullanımlık bir pipet kullanın (makale no. Z0001). Katı dışkı örneğiyle süspansiyon yapmak için spatula veya tek kullanımlık aşılama döngüsü ile eşit miktarda (yaklaşık mg) ekleyin. İçine aspirasyon ve tek kullanımlık pipetten ejeksiyon ile dışkı süspansiyonunu homojenize edin veya alternatif olarak Vorteks karıştırıcıda karıştırın. İri dışkı partiküllerinin çökelmesi için kısa RIDASCREEN Norovirüs

6 süre (10 dakika) süspansiyonu beklemeye bırakın ve dışkı süspansiyonunun bu netleşmiş supernatantı testte direkt olarak kullanılabilir. Eğer test prosedürü otomatik ELISA sisteminde yapılıyorsa supernatant partikülsüz olmalıdır. Bu durumda 5 dakika 2,500 G da örneğin santrifüj edilmesi önerilir. Not: Seyreltici 1 içinde seyreltilen dışkı örnekleri Seyreltici 1 kullanılması şartıyla tüm RIDASCREEN ELISA içinde kullanılabilir İlk inkübasyon Strip tutucuda yeterli sayıda kuyunun yerleştirilmesinden sonra 100 µl pozitif kontrol Kontrol + negatif Kontrol - veya dışkı örneği süspansiyonunu kuyulara ekleyin. Daha sonra 100 μl biyotin-konjugatlı antikor Konjugat 1 ekleyin ve karıştırın (plağın kenarına hafifçe vurarak); sonra oda sıcaklığında (20 25 C) 60 dk inkübe edin Yıkama Dikkatli yıkama doğru sonuçların elde edilmesi için önemlidir ve bu nedenle talimatlara göre ilerleyin. Kuyularda inkübe edilen madde yerel düzenlemelere uygun olarak atım için atık kabı içine boşaltılmalıdır. Bundan sonra kalan nemi uzaklaştırmak için emici kağıt üstüne plağa vurarak çıkartın. Sonra her defasında 300 µl yıkama buffer kullanılarak 5 kez plağı yıkayın. Emici kağıdın hala kuru ve kullanılmamış olan kısmında her yıkama sonrası vurup çıkartarak tamamen kuyuların boşaldığından emin olun. Mikroplak yıkayıcı veya tam otomatik ELISA kullanıyorsanız makinenin doğru şekilde ayarlandığından emin olun; gerekirse üreticiden ayarları isteyin. R-Biopharm tarafından verilen aletler valide ayarlar ve iş protokolleri ile zaten programlanmıştır. Yıkama iğnelerinin tıkanmasını önlemek için, sadece partikülsüz dışkı süspansiyonları dağıtılmaldır (bakın 9.3.,Önekleri hazırlama). Ayrıca tüm sıvının her yıkama aşamasında aspire edildiğinden emin olun İkinci inkübasyon Kuyulara 100 µl streptavidin poly-peroksidaz konjugat Konjugat 2 doldurmak için bir pipet kullanın sonra oda sıcaklığında (20 25 C) 30 dk inkübe edin Yıkama Kısım 9.5 de belirtildiği gibi yıkayın Üçüncü inkübasyon Tüm kuyuları 100 µl substrat Substrat ile doldurun. Sonra oda sıcaklığında karanlıkta (20 25 C) 15 dk plağı inkübe edin. Daha sonra reaksiyonu durdurmak için 50 µl durdurma reaktifi Durdurma ile tüm kuyuları doldurun. Plağın kenarına hafifçe vurarak dikkatlice karıştırdıktan RIDASCREEN Norovirüs

7 sonra 450 nm de ekstinksiyon (isteğe bağlı: 450/620 nm) ölçün. Havada yani mikrokuyu plak olmadan sıfır noktasını ayarlayın. Not: Yüksek-pozitif hasta örnekleri substratın siyah renkli çökeltilerine sebep olabilir. 10 Kalite kontrol reaktif süresi bitiminin belirtileri Kalite kontrol amaçları için, testin doğru şekilde yapılmış olması ve reaktiflerin stabil olmasını sağlamak için pozitif ve negatif kontroller her test yapıldığında kullanılmalıdır. Negatif kontrol için ekstinksiyon oranı (OD) 450 nmde 0.2 den küçükse (450/620 nm de dan küçük) ve pozitif kontrol için ölçülen değer 450 nm veya 450/620 nm de 0.8 den büyükse test doğru yapılmıştır. Negatif kontrol için 0.2 den (0.160) büyük değer yıkamanın yetersiz olmuş olabileceğini gösterir. Olması gereken değerlerden sapma, bir bulanıklık veya kuyulara doldurulmadan önce renksiz substratın mavi renklenmesi reaktiflerin süresinin bittiğini gösterebilir. Öngörülen değerler karşılanmazsa, aşağıdaki noktalar testi tekrarlamadan önce kontrol edilmelidir: - Kullanılan reaktiflerin son kullanma tarihi - Kullanılan ekipmanın işlevselliği (ör. kalibrasyon) - Doğru test prosedürü - Kontaminasyon veya sızıntılar için kit bileşenlerinin görsel kontrolü maviye dönen substrat solüsyonu kullanılmamalıdır. Testi tekrarladıktan sonra hala şartlar yerine getirilmediyse, lütfen üretici veya yerel R-Biopharm distribütörünüzle temasa geçin. 11. Değerlendirme ve yorumlama Cut-off hesaplama Cut-off oluşturmak için 0.15 ekstinksiyon birimleri negatif kontrol için ölçülen ekstinksiyona eklenir. Cut-off = negatif kontrol için ekstinksiyon Test sonuçları Ekstinksiyon oranı hesaplanan cut-off değerinden %10 daha fazlaysa numunenin değerlendirilmesi pozitiftir. Ekstinksiyon oranı cut-off değerinden %10 az ve %10 fazlası aralığındaysa numunenin değerlendirilmesi marjinaldir. Tekrar taze dışkı örneğiyle yeniden inceleme giri bölge içine düşüyorsa örneğin değerlendirilmesi negatifdir. RIDASCREEN Norovirüs

8 Hesaplanan cut-off altında %10 dan fazla ekstinksiyonlara sahip örnekler negatif düşünülmelidir. 12. Yöntem sınırlamaları RIDASCREEN Norovirüs 3.Nesil Testi insanlarda hastalığa neden olan her iki genogrubu (I ve II) tespit ederek dışkı örneklerinde norovirüs antijenlerini belirler. Tüm genotipler ve ilgili subtipler test edilmedi ancak hemen hemen bu zamana kadar gastroenterit salgınlarından bilinen genotiplerin tümü örnekteki viral yük örnek alımı sırasında ELISA tespit sınırı altında aralığa sahip olmadığı sürece tespit edilebilir. Klinik belirtilerin ortaya çıkması ya da şiddeti için ekstinksiyonun belirlenen seviyesiyle ilişkilendirmek mümkün değildir. Elde edilen sonuçlar her zaman klinik tablo ile birlikte yorumlanmalıdır. Asemptomatik kişilerin virüsü salgılaması mümkündür ve onlar bu ELISA ile bulunabilir (kontakt izleme). Mevcut virüs yükü her zaman belirleyicidir. Pozitif sonuç başka bulaşıcı patojenlerin varlığını ekarte etmez. Bu literatür yeterince potansiyel gastroenterit patojenler ile çift ve çoklu enfeksiyonları açıklar ve onların ayırıcı metodlarla teşhisi konulabilir. Bir çok durumda klinik belirtiler ve bulgular monocausal kökenli olanlara göre daha belirgindir. Negatif sonuç norovirüs enfeksiyon olasılığını ekarte etmez. Bu, zaman içinde kötü bir noktada örnek alınarak virüsün aralıklı atılımı ile açıklanabilir (Kısım 8 "Numune toplama ve saklama" bakın), minimal bir viral yük veya numunenin uygunsuz kullanım ile. Hasta anamnezi norovirüs enfeksiyon şüphesini destekliyorsa inceleme başka dışkı örneğiyle tekrarlanmalıdır. Sınırda bir sonuç dışkı örneğindeki virüslerin homojen olmayan dağılımı, başlangıçta ELISA için sınırda viral yük veya mikrokuyuların yetersiz yıkanması ile açıklanabilir veya enfeksiyonun regresyonda olduğunu gösterebilir. Bu durumda inceleme aynı örnekten ikinci bir süspansiyonla veya incelenmesi gereken başka dışkı örneğiyle tekrarlanmalıdır. RIDASCREEN Norovirüs ELISA şu anda mekonyum örnekleri için valide değildir, bu yüzden bu testlerin sonuçları dikkatle yorumlanmalıdır. Örnek alırken bebek bezinden dışkı numunesine geçebilen kremler, yağlar ve merhemler gibi çeşitli bebek bakım ürünleri norovirüs-negatif dışkı örneklerini spike etmek için kullanılmıştır ve analiz sonuçlarına etkisi bulunmamıştır. Markalı ürünlerle test edildiğinde norovirüs-pozitif dışkı örnekleri negatif olarak etkilenmiş bulunmadı. RIDASCREEN Norovirüs

9 13.. Performans özellikleri Test kalitesi Sonradan donduruldukları (-20 C) ve saklandıkları yerde Viroloji Enstitüsü, Dresden Teknoloji Üniversitesinde 2004/2005 kış sezonu esnasında rutin diagnostik uygulama çerçevesinde ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile incelenmiş 60 örnek içeren RIDASCREEN Norovirüs ELISA 3.Nesil ile bir validasyon çalışması kış sezonundan (Ocak-Mayıs) başka 123 örnek RT-PRCR ile tanımlandı sonra daha sonra kullanım için donduruldu ve saklandı. Her iki örnek panelinin sonuçları Tablo 1 de özetlenmiştir. Tablo 1: RIDASCREEN Norovirüs ELISA 3.Nesil ve RT-PCR arasında korelasyon RT-PCR RIDASCREEN Panel WS 2004/5 RIDASCREEN Panel WS Duyarlılık: 93.3 % 78.6 % Özgüllük: % % Pozitif prediktif değeri (PPV): % % Negatif prediktif değeri (NPV): 93.8 % 77.9 % Doğruluk: 96.7 % 87.8 % Çapraz reaktivite Bağırsak kanalından patojenik mikroorganizmaların çeşitliliği RIDASCREEN Norovirüs ELISA ile incelendi. Bu çalışmalar ml başına organizma konsantrasyonları gösteren seyreltilmemiş bakteri veya virüs süspansiyonlarıyla yapıldı. Bu çalışmanın sonuçları Tablo 2 de özetlenmektedir. Tablo 2: Patojenik mikroorganizmalarla çapraz reaktivite Organizma Köken [OD 450/620] Adenovirüs Hücre kültür supernatant Aeromonas hydrophila Kültür Bacillus cereus Kültür Bacteroides fragilis Kültür Campylobacter coli Kültür Campylobacter jejuni Kültür RIDASCREEN Norovirüs

10 Candida albicans Kültür Citrobacter freundii Kültür Clostridium difficile Kültür Clostridium perfringens Kültür Clostridium sordellii Kültür E. coli (O26:H-) Kültür E. coli (O6) Kültür E. coli (O157:H7) Kültür Enterobacter cloacae Kültür Enterococcus faecalis Kültür Klebsiella oxytoca Kültür Proteus vulgaris Kültür Pseudomonas aeruginosa Kültür Rotavirus Hücre kültür supernatant Salmonella enteritidis Kültür Salmonella typhimurium Kültür Serratia liquefaciens Kültür Shigella flexneri Kültür Staphylococcus aureus Kültür Vibrio parahaemolyticus Kültür Yersinia enterocolitica Kültür Kesinlik RIDASCREEN Norovirüs ELISA tekrarlanabilirliği zayıf-yüksek pozitif aralığında tam ölçümü gösteren altı referans ile test edildi. İntra-test tekrarlanabilirliğini bellirlemek için bu referansların 40 tekrarı test edildi. Ortalama değerler ve varyasyon katsayıları (VC) kitlerin üç lotu için belirlendi. İnter- test tekrarlanabilirliği için 10 farklı çalışma gününden elde edilen referanslar gün başına iki çalışmayla iki kez test edildi. Ölçümler kitlerin üç lotu için üç teknisyen tarafından belirlendi. İnter-lot tekrarlanabilirliği kitlerin tüm üç lotu için belirlendi. Beklendiği gibi, Referans 6 sonuçları analizlerin tümünde negatifdi. Çalışmanın sonuçları Tablo 3 de gösterilmektedir. RIDASCREEN Norovirüs

11 Tablo 3: RIDASCREEN Norovirüs ELISA kesinliği Referans Ortalama değer / VC 1 MV [OD 450/620] Kit lot 1 Intra-test Inter-test Inter-lot Kit lot 2 Kit lot 3 Kit lot 1 Kit lot 2 Kit lot 3 Kit lot VC (%) 5.86% 5.00% 5.75% 13.08% 10.23% 13.40% 4.79% MV [OD 450/620] VC (%) 5.79% 5.48% 4.43% 13.23% 16.24% 18.10% 7.58% MV [OD 450/620] VC (%) 6.19% 6.46% 7.06% 11.77% 13.61% 20.32% 6.60% MV [OD 450/620] VC (%) 8.46% 5.46% 10.09% 16.22% 13.16% 19.87% 4.80% MV [OD 450/620] VC (%) 5.80% 7.64% 8.02% 18.82% 17.17% 24.12% 7.39% MV [OD 450/620] VC (%) n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a 13.4 Analitik duyarlılık RIDASCREEN Norovirüs ELISA analitik duyarlılığı elektron mikroskobu (EM) ve real-time RT- PCR ile norovirüs konsantrasyonları için önceden test edilmiş örneklerden iki doğal dışkı örneği (genogrup I ve II için birer tane) için belirlendi. EM ve PCR incelemeleri için uygun virüs konsantrasyonu elde etmek için her iki örnekte ilk olarak 20% ye (1:5) önceden seyreltildi. Her önceden seyreltilmiş örnek altı dilüsyon daha oluşturmak için kullanıldı (10 güce 1 serisi). Bu altı dilüsyon aşaması RIDASCREEN Norovirüs ELISA (üç ölçümde) ve EM ve real-time RT-PCR ile incelendi. Her bir dilüsyonda konsantrasyonlar sonra mikroskopik sayım ve PCR ölçümü için hesaplandı. Tespit sınırı (LoD) ELISA nın artık pozitif sonuç vermediği konsantrasyonda belirlendi ve dışkı gramı başına RNA kopyaları (PCR) veya dışkı gramı başına partiküller (EM) olarak ifade edildi. RIDASCREEN Norovirüs Testinde genogrup I (GI) için LoD dışkı gramı başına 1.51 x 10 6 RNA kopyasıdır (dışkı gramı başına 1.18 x 10 7 partikül) ve genogrup II (GII) için LoD dışkı gramı başına 1.99 x 10 6 RNA kopyasıdır. Sonraki GII dilüsyon aşaması için partiküllerin sayısı artık elektron mikroskobu ile tespit edilemez bu nedenle bu değer bu noktadan önce ölçülen dilüsyon RIDASCREEN Norovirüs

12 adımlarının dışında hesaplandı. Bu hesaplamanın sonucu GII için dışkı gramı başına 1.22 x 10 6 partiküldü (Tablo 4, sol kolona bakın). Dışkı gramı başına hesaplanan LoD değerlerine dayanarak tespit sınırları (LoD) reaksiyon karışımında analitlerin konsantrasyonları için belirlendi (1:11 örnek dilüsyonu). GI için bu sonuçlar ml reaksiyon karışımı başına 1.51 x 10 5 RNA kopya ve ml reaksiyon karışımı başına 1.18 x 10 6 partiküldü. GII için bu sonuçlar ml reaksiyon karışımı başına 1.99 x 10 5 RNA kopyası ve ml reaksiyon karışımı başına 1.22 x 10 5 partiküldü (Tablo 4, sağ tarafa bakın). Sonuçların tümü Tablo 4 te özetlenmektedir. Tablo 4: RIDASCREEN Norovirüs ile LoD Genogruplar real-time RT- PCR [kopyalar/ml] Seri dilüsyonda EM [partiküller/g] Reaksiyon karışımında (1 kısım örnek (seri dilüsyondan) + 10 kısım Seyreltici 1) real-time RT- PCR [kopyalar/ml] EM [partiküller/g] GGI 1.51 x 10 6* 1.18 x 10 7* 1.51 x 10 5** 1.18 x 10 6** GGII 1.99 x 10 6* 1.22 x 10 6* 1.99 x 10 5** ** * EM veya PCR içinde pozitif sonuçla son dilüsyona dayanan hesaplama ** Seyreltici 1 içinde test-spesifik dilüsyonda hesaplanan konsantrasyonlar 14 Müdahale edici maddeler Aşağıdaki maddelerin belirlenen konsantrasyonlarda norovirüs pozitif ve norovirüs negatif dışkı örneklerine karıştırıldığında test sonuçlarına etkisi görülmedi: baryum sülfat (5% w/w), loperamid (antidiarrheal ilaç; 5% w/w), Pepto-Bismol (antidiarrheal ilaç, 5% v/w), mukinler (5% w/w), siklamat (yapay tatlandırıcı, 5% v/w), insan kanı (5% v/w), stearik asit ve palmitinik asit karışımı (1:1, 40% w/w), metronidazol (0.5) (antibiyotik 5% v/w), diklofenak ( % v/w). RIDASCREEN Norovirüs

13 Ek Teste özgü semboller: Plak Seyreltici 1 Yıkama Kontrol + Kontrol - Mikrokuyu plak Örnek dilüsyon buffer Yıkama buffer Pozitif kontrol Negatif kontrol Konjugat 1 Konjugat 1 Konjugat 2 Konjugat 2 Substrat Durdurma Substrat Durdurma reaktifi RIDASCREEN Norovirüs

14 Bibliyografi 1. Corwin A. L. et al.: Shipboard impact of a probable Norwalk virus outbreak from coastal Japan. Am. J. Trop. Med. Hyg. 61(6), (1999). 2. Daniels N. A. et al: A foodborne outbreak of gastroenteritis associated with Norwalk-like viruses: First molecular traceback to deli sandwiches contaminated during preparation. The Journal of Infectious Diseases, 181, (2000). 3. Gaulin C. et al.: Transmission of calicivirus by a foodhandler in the pre-symptomatic phase of illness. Epidemiol. Infect. 123, (1999). 4. Jiang X. et al.: Outbreaks of gastroenteritis in elderly nursing homes and retirement facilities associated with human caliciviruses; Journal of Medical Virology 50: (1996). 5. Jiang X. et al.: Expression, self-assembly, and antigenicity of the Norwalk virus capsid protein; Journal of Virology Vol. 66 No. 11, (1992). 6. Kohn M. A., MD, et al.: An outbreak of Norwalk virus gastroenteritis associated with eating raw oysters. Jama 273, (1995). 7. Kukkula M. et al.: Outbreak of viral gastroenteritis due to drinking water contaminated by Norwalk-like viruses. The Journal of Infectious Diseases 180, (1999). 8. Lodder W. J. et al.: Molecular detection of Norwalk-like caliciviruses in Sewage. Applied and Environmental Microbiology Vol. 65 No 12, (1999). 9. Otsu R. et al.: Detection of small round structured viruses in stool specimens from outbreaks of gastroenteritis by electron microscopy and reverse transcription-polymerase chain reaction. Acta virologica 44, (2000). 10. Oyofo B. A. et al.: Norwalk-like virus and bacterial pathogens associated with cases of gastroenteritis onboard a U.S. navy ship. Am. J. Trop. Med. Hyg. 61(6), (1999). 11. Payment P. et al.: Incidence of Norwalk virus infections during a prospective epidemiological study of drinking water related gastrointestinal illness. Can. J. Microbiol. 40, (1994). 12. Pönkä A. et. al.: An outbreak of calicivirus associated with consumption of frozen raspberries. Epidem. Infect. 123; (1999). 13. Prasad B. V. Venkataram et al.: X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science Vol. 286, (1999). 14. Schreier E. et al.: Molecular epidemiology of outbreaks of gastroenteritis associated with small round structured viruses in Germany in 1997/98; Arch. Virol. 145, (2000). 15. Taylor M. B. et al.: An epidemiological investigation of Norwalk virus infection in South Africa. Epidemiol. Infect. 116, (1996). 16. Wright Peter J. et al.: Small round-structured (Norwalk-like) viruses and classical human caliciviruses in southeastern Australia, Journal of Medical Virology 55, (1998). 17. Zheng D.P. et al. : Norovirus classification and proposed strain nomenclature. Virology 346, (2006). RIDASCREEN Norovirüs

15 18. Chan M.C.W. et al. : Fecal viral load and Norovirus associated gastroenteritis. Emerging infectious diseases ( Vol. 12, No 8 (2006). 19. Román E. et al. : Acute viral gastroenteritis : proportion and clinical relevance of multiple infections in Spanish children. J.Med. Microbiol. 52, (2003). 20. Okitsu-Negishi S. et al.: Detection of Norovirus Antigens from recombinant Virus-like particles and stool samples by a commercial Norovirus Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kit. J.Clin. Microbiol. 44, (2006) 21. Castriciano S. et al. : Comparison of the RIDASCREEN norovirus enzyme immunoassay to IDEIA NLV GI/GII by testing stools assayed by RT-PCR and electron microscopy. J.Virol.Methods (2007) RIDASCREEN Norovirüs