MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II. RNA Çalışmaları Transkriptom

Transkript

1 MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II RNA Çalışmaları Transkriptom

2 RNA Bakteri hücresinin %6 sı Memeli hücresinin %1.1 i Total 10-15µg RNA nın RNA dır %80-85 i rrna %15-20 si trna ve nukleusa ait küçük RNA lar %1-5 i mrna

3 RNA Transkripsiyon: DNA daki bilginin RNA ya aktarılması Protein translasyonu için geçici olarak bilgi iletir. - Tek zincirli bir polinu kleotid - Riboz sekeriçerir. - DNA daki timin yerine urasil içerir. - Olgunlaşmış mrna moleku llerinin 5 ve 3 uçları işlevsel önem taşır.

4

5 RNA RNA eşleniklik kuralına uygun olarak kalıp DNA zinciri u zerinden transkribe olur. Genlerin buÿu k kısmı proteinleri kodlarken az bir kısım gen ise transle olmayan işlevsel RNA ları kodlar. Genin nu kleotid dizilimi bir proteindeki aminoasitlerin sırasını belirler. Bu dizilim proteinin şeklini, boyutunu veişlevini belirler. mrna u çlu nu kleotid grupları (kodon) halinde trna antikodonunun mrna kodonu ile eşleşmesi aracılığı ile ribozomlarda transle olur.

6 RNA Çeşitleri mrna; Protein kodlayan RNA - Transkriptlerdir. - Ökaryotlarda transkripsiyon sonrası işlemden geçirilir ve 3 uç modifikasyonu, intronlarınuzaklaştırılması İşlevsel/Yapısal RNA - trna; a.a leri ribozomlara taşır. - rrna; ribozomlarınyapısalve katalitik bileşenleridir. - snrna(küçük çekirdek RNA); splaysozomun yapısal ve katalitik bileşenleridir. - snorna (küçük nükleolar- çekirdekçik- RNA); rrna ların olgunlaşmasına katılır. - scrna; stoplazmadaki protein trafiğini yönlendirir. - sirna (smallinterfering RNA); gen ifadesinin kontrolünde kullanılır. - mirna (Mikro RNA): transkripsiyon sonrası gen düzenlemesinde görev alır.

7 Transkripsiyon RNA polimeraz; RNA sentezini katalizler - DNA zincirlerinden birini kalıp olarak kullanır Belirli bir gen için hep aynı zincir u zerinden gerçekleşir. - DNA ifade edilecek kısmı ile açılır. - Uzayan RNA zincirinin 3 ucuna serbest nu kleotidleri takar den 3 yönu ne RNA sentezi

8 Transkripsiyon Transkripsiyon asimetriktir DNA nın yalnızca bir zinciri kalıp zincir RNA ya transkribe olur. RNA transkripti kalıp olmayan zincirle aynı dizilime sahiptir. RNA yalnızca 5 den 3 yönu ne transkribe olur. Kalıp zincir 3 5 yönu nde okunur.

9 RNA polimeraz Prokaryotlar: tek bir RNA polimeraz mrna, rrna and trna Trankripsiyon ve translasyon birbiri ile eşli gider. Ökaryotlar: 3 RNA polimeraz RNA polimeraz I: rrnagenleri RNA polimeraz II: mrna Transkriptler işlenir. RNA polimeraz III: trna, 5S rrna Ökaryotlarda transkripsiyon çekirdekte, translasyon sitoplazmada ribozomlarda gerçekleşir.

10 Transkripsiyon basamakları Başlangıç Genin 5 ucundan RNA polimeraz promotora bağlanır. DNA çift zinciri ayrılır. Uzama Nu kleotidler 3 uçtan ilave olur. GTP den enerjisi sağlar. Sonlanma Genin 3 ucunda gerçekleşir.

11 Ökaryotik mrna işlenmesi 5 uç: şapka/capping 5 uca 7- methylguanosine ilavesi 3 uç: poly(a) kuyruğu 3 uca adenin nu kleotidi eklenir. Intron çıkarılması 5 GU ve 3 AG snrnp splaysozom katalizi sağlar.

12 RNA İzolasyonu Gen anlatımı Gen anlatımının analizi Gen anlatımının düzenlenmesi İşlenme Klonlama çalışmalarının önemli kısmı RNA izolasyonuna dayanır. Klonlama çalışmalarında cdna kitaplığının kurulması ve kitaplıktan istenen genin izolasyonu için total RNA dan mrna izolasyonu gereklidir.

13 RNA Ekstraksiyonu Hücre çeperi ve membranının parçalanması (LİZİS) Hücre lizatının santrifüjlenmesi (diğer makromoleküllerden ayrılması) Genomik DNA dan ayrılması için asidik solüsyonlarla muamele Trizol, Guanidinium HCl veya guanidinium tiyosiyanat (güçlü denaturanlar) homojenatı, ile fenol:kloroform ekstraktıuygulanabilir. Pürifikasyon RNA nın yoğunlaştırılması Kalite ve saflığının tespiti

14 RNA İzolasyonu BAŞARILI BİR RNA İZOLASYONU, diğer moleküllerle kontamine olmamış ve yıkılmamış RNA ların saflaştırılması demektir. Riboz rezidüleri 2 ve 3 pozisyonunda halkasal grup taşıdıklarından kimyasal olarak DNA dan daha reaktiftir ve Rnaz ile kolayca yıkılır. RNA saflaştırılmasının en güç yanı endojen RNaz ların RNA yı parçalamalarıdır!!! Ekzojen Rnaz lar

15

16 Endojen ve Eksojen RNaz ile Savaşı Kazanım Yolları; Endojen RNaz için; - Guanidinium isothiocyanate (GITC) - RNAzol/Trizol/Ultraspec (14M GITC and urea salts) - Qiagen RNeasy kullanılmalı Eksojen RNaz profilaktik tedbirlerin dikkatli kullanılması ile ortadan kaldırılabilir. Eksojen Rnaz kontaminasyonu en sık; - Kontamine bufferlar - Otomatik pipet uçları ile olur.

17 Eksojen RNaz ile Savaşı KazanımYolları; Bazı cam eşyalar %0.1 oranında çözünmüş DEPC bulunan suda 2 h 37 o C de bekletilip steril dh 2 O ile yıkanarak 15 d. otoklavlanır. Cam eşyalar 180 o C de 8 h, 300 o C de 4h veya kloroform ile yıkanarakda Rnaz inaktive edilebilir. DEPC ciddi karsinojen maddedir!!

18 RNA Analizi Northern Analizi (Gen ekspresyonu için) cdna kütüphanesi için kaynak RT- PCR RNase koruma metotları Splicing defects

19 GEN İFADESİ Genom statik, transkriptom ve proteom dinamik. Transkriptom ve proteom; hu cre/doku ya özgu l profile sahip. DNA >>>>>>RNA>>>>>> Protein

20 GEN EKSPRESYONU ANALİZİ 5 3 PROMOTOR exon 1 intron exon 2 Reporter gene analysis hnrna 5 transcription 3 RNA processing RNA analysis mrna 5 m 7 GpppN 3 AAAAAA degradation protein

21

22 mrna Analiz Yöntemleri Northern Analizi (Tek gen analizi) RT- PCR (Ters Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu) (Tek gen analizi) Mikroarray- Mikroçip (Genom boyunca analiz) Splicing defects

23 Northern Analizi Bu yöntemde DNA yerine mrna veya viral RNA kullanılarak işlem yürütülür. 1.RNA izolasyonu, 2. RNA nın jel elektroforezinde yürütülmesi 3. Uygun bir membrana aktarılması 4.Membrandaki RNA ların, radyoaktif işaretli ve tek zincirli bir DNA prob ile melezlenmesi ve sonucun otoradyografi veya boyamayla saptanması Bu yöntemin avantajı, genin RNA kopyasının boyutunun belirlenmesi ve farklı dokularda farklı RNA ürünü olasılığının araştırılmasında kullanılmasıdır. Ancak işlem hacmi düşük olan bu teknikte miktar tayini hassas değildir.

24 Northern Blotting 5 10µg izole edilen RNA 260/280nm ~ 2.0 (c.f. DNA 1.8) Denatürasyoniçin formamide ile ısıtılır. Agaroz jel elektroforezi Formaldehyde 0.66M/2.2mM Glyoxal/Methyl Mercuric Hydroxide Tuz solüsyonu kullanılarak membrana RNA Blotlamazı/transfer

25 Northern Blotting RNA transferi naylon yada nitroselüloz membran/filtre Hibridizasyon bufferı oldukça önemlidir. (Rapid Hyb ~ 1hr) Prob (cdna fragment/antisense RNA) kemolimünesan yada radyoaktif olarak işaretlenebilir. Random işaretleme yaygın olarak kullanılan metottur.

26 Northern Blotting Ambion RNAlater Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (GAPDH), β-actin, β 2 -microglobulin

27 Revers transkripsiyon (RT)- PCR Total veya polya RNA u zerinden reverse transcriptase enzimi ile cdna sentezlenir. Gen spesifik (ekzon) primerler ile PCR yapılır. Özellikle eş zamanlı PCR (Real Time PCR) cihazları ile yu ksek hassasiyette miktar tayini yapılabilmektedir. İşlem hacmi northern blot tan yu ksek mikroarraylerden du şu ktu r.

28 Revers transkripsiyon (RT)- PCR Genler etkilerini mrna üretimi ile ortaya çıkarırlar. Normal koşullarda RNAz enzimlerinin aktivitesi ile çok çabuk parçalandıklarından, mrna lar ile laboratuvar şartlarında çalışılması oldukça güçtür. Bu nedenle mrna preparatları mrna nın DNA karşılığı olan cdna ya çevrilirler ve bu halde kullanılırlar. RT- PCR dan mrna veya viral RNA nın çoğaltılmasında faydalanılır. Bu PCR çeşidinde bir ters transkriptaz enzimi (RT) ve DNA primeri kullanılır.

29 Revers transkripsiyon (RT)- PCR RT- PCR iki aşamalı olup RNA dan tamamlayıcı DNA sentezi (ters transkripsiyon) ve tamamlayıcı DNA (cdna) nın da standart PCR yoluylaçoğaltılmasıaşamalarını kapsar. RT- PCR da reaksiyonun ilk basamağı olan ters transkripsiyon aşamasında kullanılan primerler (oligo dt veya random) poliadenillenmiş bölgeye bağlanırlar. Bu nedenle RT- PCR ile 3 - poly (A) kuyruğuna sahip mrna ların çoğaltma işlemleri yapılabilir. Primer bağlanma yerlerinin genelde transkriptin tam ucunda olmaması nedeniyle tüm RNA molekülünün tam kopyasının çoğu kez elde edilememesi yöntemin zayıf yönüdür. İşlem hacmi Northern blot tan yüksek mikroçiplerden düşüktür.

30 Revers transkripsiyon (RT)- PCR Revers transkriptaz enzimi ile RNA DNA ya dönüştürülür. Oligo dt 5 3 AAAAAAA TTTTTTT Random primers (pdn 6 ) 5 3 AAAAAAA NNNNNN NNNNNN Gene-specific primer 5 3 AGCGA AAAAAAA *Semi- quantitative PCR *Quantitative Real- Time PCR e.g. TaqMan

31 RT Reaksiyonu; 1 µg total RNA 1µl 500ng primer (pdn 6 ) 1µl 0.1 mm DTT 1µl 1mM dntps 2µl 1U RNase inhibitor 1µl Nuclease free H 2 O 13µl Toplam 19µl 80 C 4 ısıt, snap on ice + 1µl 200U MMLV superscript (Invitrogen) 25 C C C- 2 Revers transkripsiyon (RT)- PCR 1-20µl into 50 µl typical PCR

32 Reverse transcription (RT)- PCR For rare messages other RT enzymes available e.g. ImProm (Promega) RT ve PCR reaksiyonu aynı tüp içerisinde gerçekleştirilebilir. (QIAGEN OneStep RT- PCR Kit)

33

34 DNA Mikroarray (DNA Mikrodizin) cdna array: bç uzunluğunda probların cam yu zeylere basılması ile u retilir. Oligo array: bç uzunluğundaki oligonu kleotidlerin önce sentezlenip sonra çip yu zeyine immobilize edilmesi veya doğrudan çip u zerinde sentezlenmesi (fotolitografi) ile u retilir.

35 Mikroarray İleri derecede genotip ve gen ekspresyon analizleri için geliştirilmiş bir tekniktir. Küçük örnek hacimleri kullanılarak tek deneyde mikroçipler, Tek nükleotid polimorfizmi (SNP) veya değişik (örn: hastalıklı) ve normal fizyolojik koşullardaki modifiye gen ekspresyonunun (mrna daki artış ve azalışlar) hızlı bir şekilde çalışılmasını sağlar. Mikroçip teknolojisi ile yaklaşık 1.8*1.8 cm ebatlarındaki bir cam üzerinde (dizi veya array) birden fazla DNA bölgesini (neredeyse tüm bir genomunu) tek bir seferde yüksek hassasiyette incelemek mümkündür. DNA mikroçipleri aktif proteinlere çevrilebilen ya da çevrilemeyen RNA ların saptanmasında da kullanılabilir. Bu tip analizler ekspresyon analizi ya da ekspresyon profili belirleme şeklinde adlandırılır.

36 Mikroçip yönteminin kullanım amaçları iki hedefe yönelik olarak uygulanmaktadır. 1. Gen ekspresyon düzeyinin ve düzey farklılıklarının ölçülmesi: 2. Genom baz dizisinin ve genomlar arası dizi farklılıklarının ortaya konması: Tek nu kleotid polimorfizmi (single nucleotide polymorphism) gibi teknikler ile mutasyon analizleri yapılabilmektedir. Bu amacı gerçekleştirmek için bir gende olabilecek tu m farklı mutasyon ihtimalleri tek bir çip u zerinde test edilir. SNP mikroarraylerin de yardımı ile hastalığa veya hastalığa yatkınlığa neden olan genler saptanabilmektedir.

37 Avantajları Aynı anda binlerce hatta genomdaki tüm genlerin ekspresyon düzeyleri incelenebilmektedir. Belli bir hu cre tu ru nu n belirli bir ortam için gen ifadesi profili belirlenip, bu profiller farklı hu cre tipleri ve/veya farklı çevre koşullarındaki gen ifadesi profilleriylekarşılaştırılabilirler. Bu işlemler için yu ksek kararlılık ve verim elde edebilmek amacıyla az miktarlarda DNAörneği yeterliolmaktadır. Mikroçip teknolojisi sayesinde, DNA u zerindeki tek baz değişiklikleri bile saptanabilmekte, kısa su rede ve oldukça pratik olarak birkaç bin genin analizini yapmak mu mku n olabilmektedir. Otomasyona dayalı bir sistem olduğu için insan kaynaklı hataların ortaya çıkma ihtimalide oldukça du şu ktu r.

38 Dezavantajları Tu m deney du zeneği nu kleik asit hibridizasyon yöntemine bağlıdır ve yu ksek oranda benzerlik gösteren DNA dizileri problem yaratabilmektedir. Bu nedenle mikroçipten elde edilen veriler klasik gen ekspresyon analiz yöntemleriyle doğrulanmalıdır. Ayrıca tu m mikroçip deneylerinin aynı hassasiyette olmayışı, ekspresyondaki ku çu k değişikliklerin analizde fark edilemeyecek boyutta olması, birbirinden farklı çipler kullanılarak yapılan deneylerin karşılaştırılmasında yaşanan zorluklar, optimizasyon ve standardizasyon sorunları ve herhangi bir deneyden elde edilen sonuçları her yönu yle değerlendirebilecek biyoinformatik programların henu z tam geliştirilememiş olması karşılaşılan sorunlardan birkaçıdır. Bu tu r sorunları çözebilmek amacıyla Microarray Gene Expression Data Society gibi bazı yeni kuruluşlar oluşturulmaktadır.

39 Microarray lerin gen ekspresyonu için kullanımı ile ilgili çalışmalar ilk kez 1995 de Science Dergisi nde yayınlanmıştır. 39

40 Microarray ile tamamlanan ilk ökaryotik genom ise Saccharomyces cerevisiae ninki olmuştur ve bununla ilgili çalışma da yine Science Dergisi nde, 1997 yılında yayınlanmıştır. Bitkilerde mikroçip teknolojisi ilk defa Arabidopsis te 40

41 Mikroçip teknolojisinin temeli moleküler hibridizasyondur. Bu teknikle hazırlanan bir gen dizisinin (prob) araştırmak istenilen örnekte (DNA, RNA veya protein) komplementerinin olup olmamasının bulunması esasına dayanır. 41

42 Mikroarray Çalışma Tekniği 1. Hedef DNA/cDNA dizilerine tamamlayıcı diziler içeren probların immobilize edildiği mikroarray platformunun hazırlanması veya ticari olarak temin edilmesi. 2. İncelenecek numuneden floresan ile işaretlenmiş cdna/dna/crna nın hazırlanması. 3. İşaretlenmiş cdna/dna/crna ile mikroçip platformunun hibridizasyon solüsyonu içerisinde karşılaştırılması.

43 Mikroarray Çalışma Tekniği 4. Yıkama sonrasında platform yüzeyinde hibridizasyonun varlığının tarayıcı veya okuyucu aracılığıyla analiz edilmesi ve görüntünün bir bilgisayarda depolanması. 5. Depolanan görüntünün bir yazılım aracılığıyla değerlendirilmesi ile mikroçip platformu üzerindeki hangi noktalarda hibridizasyon olup olmadığının ve niceliksel olarak düzeyinin (koyu mavi- yeşil- sarı- kırmızı renk yelpazesinde) değerlendirilmesi ve yorumlanması.

44

45 İncelenecek örnek (kan, beyin omurilik sıvısı, tümör gibi değişik dokulardan elde edilen DNA veya RNA molekülleri) floresans veya radyoaktif olarak işaretlendikten sonra amaca uygun çipler ile hibridizasyona bırakılır. 45

46 Sinyallerin büyüklüğü ve lokalizasyonu bilgisayar yardımı ile değerlendirilerek sonuca gidilir. 46

47 Mikroçipler; hastalıklı ve normal bir hücrede gen ekspresyonunun karşılaştırılması suretiyle hastalık ile alakalı genlerin belirlenmesindekullanılabilmektedir. 47