Moleküler mikrobiyolojik yöntemler, mikrobiyoloji

Transkript

1 KURS Hastanede Salg n Yönetimi: Salg nda Moleküler Mikrobiyolojik Yöntemlerin Kullan m Dr. Bar fl OTLU 1 1 nönü Üniversitesi T p Fakültesi, T bbi Mikrobiyoloji Anabilim Dal, Malatya Yaz flma Adresi: Dr. Bar fl OTLU nönü Üniversitesi T p Fakültesi, T bbi Mikrobiyoloji Anabilim Dal, MALATYA Moleküler mikrobiyolojik yöntemler, mikrobiyoloji laboratuvarlar n n tan sal gücünü giderek daha da art rmaktad r. H zl ve yüksek duyarl - l kta olmalar ndan dolay, hastane salg nlar n n tespiti ve önlenmesinde de oldukça önemli bir yere sahiptirler. Bu yöntemler; bafll ca etken mikroorganizman n tespit edilmesinde, direnç ve virülans mekanizmalar n n belirlenmesinde, salg n izolatlar aras ndaki klonal iliflkinin araflt r lmas nda kullan lmaktad r. Moleküler mikrobiyoloji çal flmalar ndan elde edilecek tüm veriler, moleküler epidemiyolojinin temelini oluflturmaktad r. Hastane salg n na neden olan patojenin, en h zl flekilde tespit edilerek antibiyotik direnç profilinin belirlenmesi, salg n n kontrolü ve yay - l m n n engellenmesi aç lar ndan oldukça önemlidir. Geleneksel mikrobiyolojik yöntemler özellikle zor üreyen veya üretilemeyen mikroorganizmalar göz önüne al nd nda bu ihtiyaçlara her zaman cevap veremeyebilir. Örne in; fenotipik yöntemlerle antimikrobiyal duyarl l k testleri için, klinik örneklerden bakterinin saf olarak izole edilmesi zorunludur. Bu ifllemler s ras nda subkültürler de gerekebildi inden antimikrobiyal direnç sonuçlar gecikebilmektedir. Direncin tespit edilmesinde geç kal nmas veya direnç tipinden kaynaklanabilecek hatal sonuçlar, di- Hastane İnfeksiyonları Dergisi 2013;17(1):7-16 7

2 Otlu B. rençli salg n sufllar n n tedavisini ve kontrolünü zorlaflt rmaktad r. Mikroorganizmalar n Tan s nda Kullan lan Moleküler Mikrobiyolojik Yöntemler Moleküler mikrobiyolojik yöntemler, klinik örnekteki patojen mikroorganizman n varl n tespit etmek için özgül nükleik asit dizilerini (DNA veya RNA) hedef al r. lk nükleik asit temelli tan testleri, 1970 li y llar n bafllar nda restrüksiyon endonükleaz ve revers transkriptazlar n keflfedilmesinden sonra gelifltirilmeye bafllanm flt r. Polimeraz zincirleme tepkimesinin (Polymerase Chain Reaction, PCR) 1983 y l nda keflfedilmesi, moleküler biyolojinin h zla geliflmesini sa lam fl ve nükleik asit temelli tan testleri rutin laboratuvarlarda yerini almaya bafllam flt r. Nükleik asitlerin tespitinde temel olarak iki farkl strateji bulunmaktad r. Bunlardan ilki; hedef nükleik asidin, prob hibridizasyonu yöntemiyle direkt olarak tespit edilmesidir. Di eri ise; in vitro amplifikasyon yöntemi ile hedef dizinin ço alt lmas d r. Food and Drug Administration (FDA) taraf ndan onaylanm fl (1988 y l nda) ilk nükleik asit temelli tan testi, Chlamydia trachomatis ve Neissseria gonorrhoeae nin tespiti için kullan lan nükleik asit hibridizasyon testidir (Gen-Probe PACE). Direkt nükleik asit tan yöntemlerinden bir di eri de, hedef dizinin (genellikle 16S rrna veya 23S rrna) florensans problarla hibridize edildi i fluorescence in situ hybridization (FISH) yöntemidir. Bu yöntem genellikle kültür pozitif örneklerde mikroorganizmalar n cins ve tür düzeyinde tan mlamalar için kullan lm flt r. Direkt tespit yöntemlerinin önemli avantaj, sofistike cihazlara ihtiyaç duymamas d r. Nükleik asit amplifikasyon yöntemleri; PCR, nucleic acid sequence-based amplification (NAS- BA), strand displacement amplificaiton (SDA), rolling circle amplification (RCA), loop mediated isothermal amplification (LAMP) olmak üzere birçok farkl modifikasyona sahiptir. Klinik laboratuvarlarda kullan lan FDA taraf ndan onaylanm fl ilk nükleik asit amplifikasyonuna dayanan test (1993 y l nda), C. trachomatis (Amplicor CT, Roche) için gelifltirilmifltir. Polimeraz zincirleme tepkimesi ile ilgili ilk geliflmeler, kullan lan polimeraz enzimi ve s döngü cihazlar nda olmufltur. Nested PCR yönteminin gelifltirilmesiyle yönteminin duyarl l art r lm fl, Multipleks PCR yöntemlerinin tan t lmas ile de ayn anda birden fazla hedefin tespit edilmesi olanakl hale gelmifltir. Real-time (efl zamanl ) PCR tekniklerinin gelifltirilmesi, PCR nin keflfinden sonraki en önemli geliflmedir. Real-time PCR yöntemleri klasik nükleik asit ço altma yöntemlerinden daha h zl ve daha duyarl d rlar. Ayr ca amplikonun görüntülenmesi için reaksiyon tüpünün aç lmas gerekmedi inden kontaminasyon riski daha azd r. Bu yöntemlerde ço alt lan amplikonlar; floresan iflaretli problar kullan larak, TaqMan, molecular beacons, FRET (Floresans rezonans enerji transfer), Scorpions, Amplifluor gibi yöntemlerle özgül olarak, SYBR Green I, YO-PRO-1 ve etidyum bromür gibi DNA ya ba lanabilen boyalarla özgül olmayarak gösterilebilir. Farkl floresan moleküllerin, farkl dalga boylar nda fl ma yapmalar real-time multipleks PCR uygulamalar n n yap lmas na da olanak sa lam flt r. Real-time PCR yöntemleri, hastane salg nlar nda en önemli faktör olan h z, duyarl l k ve birden fazla etkenin ayn anda gösterilmesi gibi ihtiyaçlara cevap verebilmektedir. Örne in; Sancho-Tello ve arkadafllar, ticari olarak gelifltirilen real-time multipleks PCR yöntemini (LightCycler SeptiFast, Roche) kullanarak, piyojenik infeksiyonlu hastalar n eksüdalar nda 25 patojeni ayn anda araflt rm fl ve kültür yöntemine göre daha duyarl bulmufllard r. Son y llarda; genomik, biyoinformatik ve elektronik alan nda yaflanan h zl geliflmeler sonucu, hem mevcut yöntemlerin gücü art r lm fl hem de yüksek teknoloji ürünü yeni yöntemler gelifltirilmifltir. Bu geliflmeler bafll ca; -nükleik asit izolasyonunda, -kullan lan enzim ve kimyasallarda, -florometrik, luminometrik, spektrofotometrik ölçüm yapan cihazlarda, -biyoinformatik analiz programlar nda olmufltur. Son y llarda gelifltirilen sistemlerden en göze çarpanlar; DNA mikroçip teknolojileri (DNA microarray) ve biyosensörlerdir. lk defa 1995 y l nda tan t lan DNA mikroçip teknolojileri, çevresel ve klinik örneklerden mikroorganizmalar n tan s için gi- 8 Hastane İnfeksiyonları Dergisi 2013;17(1):7-16

3 Hastanede Salg n Yönetimi: Salg nda Moleküler Mikrobiyolojik Yöntemlerin Kullan m derek artan oranda kullan lmaktad r Bu teknoloji, moleküler biyoloji alan nda özellikle hibridizasyon tekniklerindeki geliflmenin ürünüdür. Bunlara ek olarak, mikroorganizmalara ait ulafl labilir genom bilgisinin giderek artmas ve geliflen bilgisayar teknolojileri, bu yönteme son y llarda önemli bir ivme kazand rm flt r. Yöntem k saca; PCR ile elde edilen floresanla iflaretli amplikonlar n çok say da farkl oligonükleotid prob içeren kat yüzeylerde, kendisine uyan probla hibridize olmas temeline dayanmaktad r. Yüzeye ba l problarla hibridize olan iflaretli amplikonlar n yayd floresan sinyaller, daha sonra optik ya da lazer taray c ile saptanarak bilgisayar analizi ile de erlendirilmektedir. Geleneksel hibiridizasyon testleriyle aras ndaki en önemli fark, mikroçip teknolojisi ile yüzlerce gen bölgesinin ayn anda hedeflenebilmesidir. Friedrich ve arkadafllar n n toplam 157 prob kulland klar çal flmada, Enterobacteriaceae ailesi üyeleri hem tür düzeyinde tan mlanm fl hem de aminoglikozid, tetrasiklin ve beta-laktam gibi önemli antimikrobiyallere karfl direnç genleri ayn anda araflt r lm flt r. Di er bir çal flmada gram-negatif bakterilerde; TEM, SHV ve CTX-M gibi GSBL tipleri araflt r lm flt r. Bu çal flmada, 156 aminoasit de iflikli ini tespit edebilecek 618 prob kullan lm fl ve GSBL ye neden olabilecek genler befl saatte tespit edilebilmifltir. Bütün bu üstün özelliklerine ra men DNA mikroçip teknolojilerinin bugün için moleküler mikrobiyoloji laboratuvarlar nda rutin kullan m henüz yayg n de ildir. Ancak yap lan çal flmalar mikroorganizmalar n tespiti ve direnç durumlar n n gösterilmesinde umut vericidir. Bu yöntemin en önemli dezavantaj yüksek maliyetidir. Biyosensörler, bugün için moleküler tan da belki de gelinen en son nokta olma özelli ini tafl - maktad r. Canl lar n alg lama ve yan t verme mekanizmas, biyosensörlerin gelifltirilmesi için temel oluflturmufltur. Biyosensörler; "International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) taraf ndan, "kimyasal bir bileflene karfl verilen biyolojik yan t optik, termal ya da elektriksel sinyallere dönüfltüren cihazlar" olarak tan mlanmaktad r. Glukoz oksidaz enziminin oksijen elektrotlar üzerine sabitlendi i ve kandaki glukozu ölçmeye yarayan ilk biyosensör 1960'l y llarda tan t lm flt r. Biyosensörlerle mikroorganizmalar n tespitine yönelik çal flmalar 1990'l y llarda bafllam fl ancak son befl y l içerisinde büyük ivme göstermifltir. Çok az örnek gerektirmesi, k sa sürede sonuç vermesi ve tafl nabilir olmalar gibi avantajlar ndan dolay özellikle g da kaynakl patojenlerin tespitine yönelik biyosensörler h zla gelifltirilmektedir. Son y llarda hastane kaynakl infeksiyonlar n erken tan s için birçok farkl inovatif biyosensör projesi gelifltirilmektedir. Bu çal flmalardan en ilgi çekicilerinden biri, Uppsala, Bio-X Solutuions for Hospital Acquired Infections projeleri aras nda yer alan t bbi cihazlar n yüzeyindeki mikroorganizmay an nda tespit edebilecek optik tabanl biyosensör platformudur. Bu tür çal flmalarla hastane infeksiyonlar - n n geliflmeden önlenmesi amaçlanmaktad r. Salg n Analizi ve Moleküler Epidemiyoloji Etken mikroorganizmalar n tür düzeyinde tan mlanmas, etken organizman n bulafl kayna n n izlenmesinde, kolonizasyon ve infeksiyon ay r m - n n yap lmas nda yetersizdir. Ancak belirli bir mikroorganizma ile iliflkili infeksiyonun prevalans ndaki art fl, hastalar n belirli yer ve zaman içinde kümeleflme göstermesi ya da izolatlar n benzer antimikrobiyal duyarl l k profiline sahip olmalar, salg n n fark edilmesini sa lar. Hastane salg nlar tespit edildikten sonra, hastalarla ilgili klasik epidemiyolojik veriler toplanmal ve salg n n kayna - n n belirlenebilmesi için çal flmalar bafllat lmal - d r. Salg nla ilgili toplanacak her türlü veri, epidemiyolojik çal flmalar için yol gösterici olacakt r. Salg na neden olan izolatlar (hastalardan, hastane personelinden veya çevreden izole edilen) aras ndaki klonal iliflkinin ortaya konmas için tiplendirmeye gereksinim vard r (Tablo 1). Önceleri bu amaçla, serotiplendirme, morfotiplendirme, rezistotiplendirme, biyotiplendirme, bakteriyofaj tiplendirmesi, hücresel proteinlerin poliakrilamid jel elektroforezi ile analizi, immünblot finger printing, multilokus enzim elektroforezi gibi fenotipik tiplendirme yöntemleri kullan lmaktayd. Ancak bu yöntemler, ay r m güçlerinin yetersiz olmas ve uygulama zorluklar nedeniyle yerlerini, genomu hedef moleküler tiplendirme yöntemlerine b rakt lar. Hastane İnfeksiyonları Dergisi 2013;17(1):7-16 9

4 Otlu B. Tablo 1. Moleküler tiplendirme yöntemlerinin bafll ca amaçlar. 1. Salg n n kayna n n belirlenmesi 2. Hastalar n epidemiyolojik olarak birbiriyle olan iliflkilerinin belirlenmesi 3. Geçifl yollar ve al nacak önlemlerin belirlenmesi 4. Reaktivasyonun yeni bulafltan ay rt edilmesi 5. Hastane infeksiyonlar ve toplumsal kaynakl infeksiyonlar n belirlenmesi 6. Epidemiyolojik sürveyans ve kontrol yöntemlerinin de- erlendirilmesi zolatlar aras ndaki klonal iliflkinin araflt r lmas nda kullan lan ilk moleküler yöntemlerden biri, plazmit profil analizidir. Bu yöntemde, öncelikle her bir izolat n tafl d plazmit ya da plazmitler özel bir ekstraksiyon yöntemiyle elde edilir. Ekstraksiyondan sonra yap lan jel elektroforezi ile plazmitlerin say ve büyüklükleri karfl laflt r lmaktad r. Ayr flt r lmalar zor olan büyük plazmitler için ( kb) ya da yöntemin ay rt etme gücünü art rmak için plazmit DNA s restrüksiyon endonükleaz enzimiyle kesilerek karfl laflt rma yap labilir. Ay r m gücü ve tiplendirebilirlik özelli i bakteri türlerine ba l olarak de iflmektedir. Tiplendirme çal flmas s ras nda, plazmitlerin sonradan kazan - labilen ya da kaybedilebilen hareketli ekstrakromozomal DNA molekülleri oldu u unutulmamal - d r. Klonal olarak iliflkili izolatlar n farkl plazmit profili göstermeleri olas bir durumdur. fiüpheli bir salg nda, klasik epidemiyolojik verilerin varl nda üç ya da daha fazla benzer büyüklükte ve say da plazmit içeren izolatlar epidemiyolojik olarak iliflkili kabul edilebilir. Ancak, plazmit içermeyen ya da bir veya iki plazmit içeren izolatlarda yöntemin ay r m gücü düflüktür. Bu durumda ikinci tiplendirme yöntemi kullan lmal d r. Hastane infeksiyonlar na neden olan bakterilerin moleküler tiplendirilmesinde, kromozomal DNA polimorfizmine dayal olan yöntemler, h zl ve güvenilir olmalar yla ön plana ç kmaktad rlar. Pulsed field gel electrophoresis (PFGE), restriction fragment length polymorphism (RFLP), Arbitrarily primed polymerase chain reaction (AP- PCR), random amplified polymorphic DNA (RAPD) ve repetitive extragenic palindromic element-pcr (rep-pcr) gibi fragment analizi temelli yöntemler yayg n olarak kullan lanlard r. Bu yöntemlerle izolatlar aras ndaki iliflkilerin belirlenmesinde, bant paternlerinin benzerlik yüzdesine ya da bant say s ve büyüklü ündeki farkl l klara göre de erlendirme yap l r. Birçok bakteri için halen alt n standart moleküler tiplendirme metodu olan ve tüm genomu hedef alan PFGE, tekrarlanabilirli i ve ay r m gücü en yüksek yöntemlerden biridir. Özellikle hastane salg nlar gibi zaman ve mekan s n rl salg nlarda son derece etkili bir tiplendirme yöntemidir. Yöntem k saca, bakteriyel genomun restrüksiyon enzimiyle kesim profilinin belirlenmesi esas na dayanmaktad r. PFGE yönteminde, elektroforez s ras nda, elektriksel alan ve ak m periyodik olarak de- ifltirilir. Bu flekilde, normal elektroforez koflullar nda birbirinden ayr lamayacak kadar büyük olan DNA parçalar n n, elektroforetik alanda molekül a rl klar na göre göç ederek birbirinden ayr lmas sa lan r (fiekil 1). Oluflan DNA fragmentleri, kromozom üzerinde farkl alanlarda bulunan enzimin kesim bölgeleri aras ndaki mesafeleri göstermektedir. Bakteri kromozomunda gerçekleflen mutasyonlar, restrüksiyon enziminin kesim yerlerini ve/veya bunlar aras ndaki uzakl n de iflmesine neden olmakta ve böylece sufllara özgül DNA bant profilleri ortaya ç kmaktad r. PFGE tiplendirme sonuçlar na göre izolatlar aras ndaki genetik iliflkinin belirlenmesi için, oluflan DNA bant profillerinin do ru de erlendirilmesi gereklidir. Bu yüzden de yüksek çözünürlükte, yeterli kalitede ve say da DNA fragmenti elde edilmelidir. Salg n analizi süresince, PFGE yöntemi koflullar de iflmeden uygulanmal d r. Bant profillerinin kalitesine ve say s na yans yacak de ifliklikler çal flman n tümünün yanl fl yorumlanmas na neden olabilir. Verilerin karfl laflt r lmas n ve yorumlanmas n etkileyebilecek parametreler; Bakterilerin parçalanmas ve DNA izolasyonu aflamalar, DNA fragmentlerinin ayr flt r lmas nda kullan lacak agarozun seçimi, Elektroforez s ras nda kullan lan tampon ve uygulanan ak m miktar, 10 Hastane İnfeksiyonları Dergisi 2013;17(1):7-16

5 Hastanede Salg n Yönetimi: Salg nda Moleküler Mikrobiyolojik Yöntemlerin Kullan m fiekil 1. PFGE yönteminin ana basamaklar. DNA fragmentlerinin yüksek çözünürlükte foto raflanabilmesi, Uygun moleküler büyüklük standard n n seçilmesi ve analiz programlar nda jeller aras ndaki uyumsuzlu un giderildi i normalizasyon aflamalar d r. Güvenilir ve tekrar edilebilir sonuçlar elde edildikten sonra sufllar aras ndaki iliflkilerin de- erlendirilmesinde farkl yaklafl mlar mevcuttur. lk defa Tenover ve arkadafllar 1995 y l nda PFGE sonuçlar n n yorumlanmas için belirli kriterler önermifllerdir. Daha sonra yapt klar eklemelerle; ayn say da ve büyüklükte bant içeren izolatlar ayn ya da ay rt edilemez olarak kabul edilmifltir. Birbirlerinden genetik olarak farks z olarak kabul edilen bu izolatlar, ayn zamanda epidemiyolojik olarak da iliflkilidir. Klasik epidemiyolojik bilgilerle do rulanabiliyorsa iki izolat aras ndaki tek bant fark da ay rt edilemez olarak kabul edilir. Yine bu kriterlere göre; izolatlar aralar nda 2-3 bant fark olanlar yak n iliflkili ve 4-6 bant farkl olanlar muhtemel iliflkili olarak de erlendirilmektedir (fiekil 2). zolatlar aras nda 7 veya daha fazla bant fark oldu unda ise izolatlar epidemiyolojik olarak iliflkisiz olarak kabul edilmifltir. Bu kriterler özellikle hastane salg nlar için, s n rl bir sürede (1-3 ay) gerçekleflen salg nlar için gelifltirilmifltir. Bir y l ve daha uzun süreyi içeren, genifl kapsaml çal flmalar için uygun de ildir. Tenover fiekil 2. Tenover kriterlerine göre izolatlar aras ndaki iliflki; a) Ayn, b) Yak n iliflkili, c) Muhtemel iliflkili, d) liflkisiz. Hastane İnfeksiyonları Dergisi 2013;17(1):

6 Otlu B. ve arkadafllar PFGE sonuçlar n etkileyecek nokta mutasyonlar n önemini ve tiplendirme sonuçlar na etkisini de vurgulam fllard r. nsersiyonlar, delesyonlar, yeniden düzenlenmeler ve tek baz de ifliklikleri PFGE paternlerini etkileyebilecek genetik olaylard r. Moleküler epidemiyolojik çal flmalarda incelenen izolat say s art kça bant profillerinin de erlendirilmesi ve sonuçlar n yorumlanmas için bilgisayar analizlerine ihtiyaç duyulmaktad r (fiekil 3). Özellikle farkl laboratuvarlarda, farkl zamanlarda yap lan çal flmalardan elde edilen sonuçlar n karfl laflt r labilmesi için bilgisayar programlar ile küme (cluster) analizi kaç n lmazd r. Bu amaçla en çok kullan lan bilgisayar programlar ; Gel-Compar (Applied Maths, Kortfijk, Belgium) (fiekil 4), Dendron (Solltech, Oakdale, Iowa), Diversity Database Fingerprinting Software (Bio-Rad Laboratoires), Gene Profiler (Scanlytics, Fairfaz, Va), Phoretix 1-D (Nonlinear USA, Durham, N.C.) Quantar Pro (Key- Gene Producrts, Wageningen, Netherlands) ve Taxotron (Taxolab, Institut Pasteur, Paris, France) dur. Restriction fragment length polymorphism yöntemi, mikroorganizmalar n yo un kültürlerinden elde edilen ya da PCR ile ço alt lan (PCR- RFLP) kromozomal DNA n n uygun restrüksiyon endonükleaz enzimiyle kesildikten sonra, agaroz elektroforeziyle DNA parçalar n n ayr flt r lmas temeline dayanmaktad r. Tekrarlanabilirli i yüksek, kolay, h zl ve ucuz yöntemdir. Bu yöntemin dezavantaj, restrüksiyon endonükleaz enziminin kro- fiekil 3. PFGE sonucu oluflan bantlar n iflaretlenmesi. fiekil 4. Bant profillerinin Gel-Compar (Applied Maths, Kortfijk, Belgium) program ile de erlendirilmesi ve Unweighted pair group method with mathematical averaging (UPGMA) ile oluflturulan dendogram. 12 Hastane İnfeksiyonları Dergisi 2013;17(1):7-16

7 Hastanede Salg n Yönetimi: Salg nda Moleküler Mikrobiyolojik Yöntemlerin Kullan m mozomal DNA da çok say da kesim yapmas sonucu oluflan fazla say daki bantlar n n de erlendirilmesinin zor olmas d r. Kolay de erlendirilebilir say da bant elde etmek için, oluflan bantlar n belirli bir k sm yla hibridizasyona girebilecek problardan yararlan lan yöntemler gelifltirilmifltir. Bunun için agarozdaki DNA fragmentleri naylon membrana aktar l p, iflaretli problarla hibridizasyonu yap lmaktad r. Probla hibridize olan DNA fragmentlerinin oluflturdu u bant profili gözle ya da bilgisayar programlar yla de erlendirilmektedir. Özellikle k sa süreli salg nlarda etken mikroorganizmalar aras ndaki klonal iliflkiyi belirlemek amac yla en çok baflvurulan yöntemlerden biri olan AP-PCR tekni inde, genom bilgisine gereksinim olmadan seçilen bir veya daha fazla primerle DNA tesadüfi olarak ço alt l r. Amplifikasyon ürününün agaroz jel elektroforezini takiben her bir sufla ait DNA bant profilleri de erlendirilir. Bu yöntemin özgüllük ve duyarl l, kullan lan primerler, amplifikasyon kar fl m n n içeri i, s döngüleri (özellikle primerlerin ba lanma derecesi), elektroforez koflullar ve sonuçlar n yorumlanmas nda kullan lan kriterlerden önemli ölçüde etkilenmektedir. Bu sorunlar optimize edilmifl bir protokolün takip edilmesiyle giderilebilir. Az say da izolat için, h zl ve kolay uygulanabilir bir yöntemdir. Tüm organizmalar genomlar nda say s ve büyüklü ü de iflen tekrarlayan diziler bulundurur. Prokaryotlarda tekrarlayan diziler ilk olarak Salmonella typhimurium ve Escherichia coli de tan mlanan REP (repetitive extragenetic palindrome) dizileridir. Tekrarlayan REP DNA dizilerinin gösterilmesini temel alan Rep-PCR yönteminde; bu dizilere komplementer olan primerler kullan larak, tekrarlar aras nda kalan DNA parçalar n n amlifikasyonu yap lmaktad r. zolatlar aras nda tekrar elementlerinin say s ve birbirlerine olan uzakl klar, moleküler tiplendirme için gerekli olan tipe özgü bant profilini oluflturmaktad r. Tekrarlanan elementler ve kullan lacak primerlerin baz diziliminin bilinmesi zorunlu de ildir. Yöntemin kolay uygulanabilmesi, ayn anda çok say da izolat ile çal fl labilmesi ve ay rt edicili inin yüksek olmas avantajlar d r. Özellikle hastane salg nlar n n h zl tespiti için gelifltirilmifl olan Diversilab Sistemi (Biomerieux, Fransa) Rep-PCR tabanl otomatize bir tiplendirme sistemidir. Bu yöntem genel olarak dört ana basamaktan oluflmaktad r. Bunlar; nükleik asit izolasyonu, hedef DNA daki Rep elementlerinin PCR ile ço alt lmas, oluflan ürünlerin elektroforezi ve sonuçlar n analizi basamaklar d r. zolatlar aras ndaki klonal iliflkinin analizi için DiversiLab Software (version 3.4) ile Pearson korelasyon katsay s kullan lmaktad r (fiekil 5). Bu sistemde, kullan lan protokollerin ve cihazlar n standardizasyonu sa lanarak laboratuvar içi ve laboratuvarlar aras tekrarlanabilirli i yüksek sonuçlar elde edilebilmektedir. Amplified Fragment Lenght Polymorphism (AFLP) tekni i, PCR tabanl oldukça duyarl bir fiekil 5. Diversilab Sistemi (Biomerieux, Fransa) ile oluflturalan dendoram ve benzerlik matriksi. Hastane İnfeksiyonları Dergisi 2013;17(1):

8 Otlu B. DNA tiplendirme yöntemidir. Bu yöntem 1990 l y llarda genomu tesadüfi ço altan tiplendirme yöntemlerinin (AP-PCR, RAPD) dezavantajlar n gidermek üzere gelifltirilmifl ve 1995 y l nda Vos ve arkadafllar taraf ndan tan t lm flt r. Bu yöntem salg n analizlerinden daha çok, popülasyon geneti i, adli t p, bitki ve hayvan türlerinin slah nda s k kullan lan duyarl ve tekrarlanabilirli i yüksek bir yöntemdir. AFLP yönteminin gücü, farkl genomik bölgelerdeki polimorfizmleri efl zamanl olarak h zl bir flekilde belirlenmesidir. Tüm genomik DNA n n restrüksiyon enzimiyle kesimini takiben, oluflan parçalara primer ba lanma bölgelerinin (adaptör moleküller) eklenerek PCR ile ço alt lmas ve elektroforez basamaklar n içerir (fiekil 6). Görüntüleme için EtBR yerine, daha çok gümüfl nitrat ya da floresan iflaretli problar kullan l r. Son zamanlarda Multilocus Sequence Typing (MLST), Single-locus sequence typing (SLST), Single-nucleotide polymorphism (SNPs) gibi dizi analizine dayal moleküler tiplendirme yöntemleri kullan lmaya bafllanm flt r. Ancak bu yöntemler oldukça sofistike yöntemlerdir ve hastane salg nlar nda bugün için pratik uygulamalar s k de ildir. Bununla birlikte viral salg nlar n analizinde DNA dizi analizi yöntemleri tek seçenektir. Tekrarlanabilirli i yüksek olan bu yöntemler özellikle mikroorganizmalar n global karfl laflt r lmalar ve popülasyon geneti i çal flmalar nda kullan lmaktad r. Moleküler tiplendirme yöntemlerinin her birinin farkl avantajlar ve dezavantajlar vard r (Tablo 2). Hastane salg nlar n n analizinde seçilecek moleküler tiplendirme yöntemi için flu özellikler dikkate al nmal d r; Önceden standardize edilmifl, h zl bir yöntem olmal d r. Yöntem mümkün oldu unca genifl mikroorganizma grubuna uygulanabilmelidir. Ay r m gücü yüksek olmal d r. Salg n ile epidemiyolojik olarak iliflkili ve iliflkisiz sufllar biribirinden tam olarak ay rt edebilmelidir. Laboratuvarlar aras ve laboratuvar için tekrarlanabilirli i yüksek olmal d r. Sonuçlar kolayca yorumlanabilir olmal d r. Laboratuvar flartlar na uygun, kurulmas ve uygulanmas kolay olmal d r. Moleküler tiplendirme sonuçlar, epidemiyolojik araflt rmalar n bir parças d r ve ancak klasik epidemiyolojik veriler varl nda de erlidir. Klasik epidemiyolojik veriler olmadan yap lan moleküler tiplendirme, sadece zaman ve para kayb na neden olur. fiekil 6. AFLP tekni inin ana basamaklar. 14 Hastane İnfeksiyonları Dergisi 2013;17(1):7-16

9 Hastanede Salg n Yönetimi: Salg nda Moleküler Mikrobiyolojik Yöntemlerin Kullan m Tablo 2. Baz moleküler tiplendirme yöntemlerinin karfl laflt rmas. RAPD/ Plazmit Dizi PFGE AFLP PCR-RFLP Rep-PCR AP-PCR analizi analizi Tiplendirebilirlik Mükemmel Mükemmel Mükemmel De flken Mükemmel yi Mükemmel Tekrarlanabilirlik Mükemmel yi yi yi yi yi yi Ayr m gücü Mükemmel Mükemmel orta Yüksek yi yi yi Uygulama kolayl Orta Orta Kolay Kolay Kolay Orta/ yi Zor Yorumlama kolayl Kolay Kolay Kolay yi Orta/ yi Orta/ yi Zor Hastane salg nlar nda, etken mikroorganizman n tespitinde ve antimikrobiyal direncin saptanmas nda, gelifltirilen yeni yöntemlerle birlikte moleküler yöntemlerin kullan lmas giderek artmaktad r. Özelikle baz mikroorganizmalarda bu yöntemler öne ç kmaktad r. Ancak beklentinin aksine, bugün için rutin fenotipik yöntemlerin yerine geçebilecek ideal bir moleküler test henüz yoktur. Her iki yöntemin birlikte kullan lmas, hastane salg nlar n n en h zl ve en do ru flekilde tespit edilmesine maksimum katk y sa layacakt r. KAYNAKLAR 1. Arshak K, Mohamed Z, Souna E, Anthony T. Principles of Bacterial Detection: Biosensors, ecognition Receptorsand Microsystems Bhunia AK. Biosensors and bio-based methods for the separation and detection of foodborne pathogens. Adv Food Nutr Res 2008;54: Csako G. Present and future of rapid and/or high-throughput methods for nucleic acid testing. Clin Chim Acta 2006;363: Dols JA, Smit PW, Kort R, Reid G, Schuren FH, Tempelman H, et al. Microarray-based identification of clinically relevant vaginal bacteria in relation to bacterial vaginosis. Am J Obstet Gynecol 2011;204: D'Souza SF. Microbial biosensors. Biosens Bioelectron 2001;16: Durmaz R. Direnç geliflimini önlemede moleküler mikrobiyolojinin katk s. ANKEM 2009;23(Ek 2): Durmaz R. Moleküler epidemiyolojik tiplendirme yöntemlerinin hastane infeksiyonlar nda kullan m. Do anay M, Ünal S, fiardan YÇ (editörler). Hastane nfeksiyonlar Ankara: Bilimsel T p Yay nevi, 2013: Durmaz R. Moleküler epidemiyolojinin prensipleri. Durmaz R (editör). Uygulamal Moleküler Mikrobiyoloji. 2. Bask. stanbul: Nobel T p Kitabevleri, 2001: Friedrich T, Rahmann S, Weigel W, Rabsch W, Fruth A, Ron E, et al. High-throughput microarray technology in diagnostics of enterobacteria based on genomewide probe selection and regression analysis. BMC Genomics 2010;11: Lazcka O, Del Campo FJ, Munoz FX. Pathogen detection: a perspective of traditional methods and biosensors. Biosens Bioelectron 2007;22: Leinberger DM, Grimm V, Rubtsova M, Weile J, Schroppel K, Wichelhaus TA, et al. Integrated detection of extended-spectrum-beta-lactam resistance by DNA microarray-based genotyping of TEM, SHV, and CTX-M genes. J Clin Microbiol 2010;48: Mothershed EA, Whitney AM. Nucleic acid-based methods for the detection of bacterial pathogens: present and future considerations for the clinical laboratory. Clin Chim Acta 2006;363: Muldrew KL. Molecular diagnostics of infectious diseases. Curr Opin Pediatr 2009;21: O'Connor L, Glynn B. Recent advances in the development of nucleic acid diagnostics. Expert Rev Med Devices 2010;7: Otlu B, Durmaz R. Farkl baktei ve maya türlerinin alttiplendirilmesinde için ortak bir arbitrary primed polimeraz zincirleme reaksiyon (AP-PZR) protokolü. Durmaz R (editör). Uygulamal Moleküler Mikrobiyoloji. 2. Bask. stanbul: Nobel T p Kitabevleri, 2001: Otlu B. AFLP ve ribotiplendirme prensip ve uygulamalar. Durmaz R (editör). Uygulamal Moleküler Mikrobiyoloji. 2. Bask. stanbul: Nobel T p Kitabevleri, 2001: Otlu B. Nükleik Asit Temelli Mikroorganizma Tan mlama Yöntemleri. I. KLIMUD Kongresi, Kongre Kitab, 2011, Antalya. Hastane İnfeksiyonları Dergisi 2013;17(1):

10 Otlu B. 18. Otlu B. Biyosensörler (Biyoalg lay c lar). XXXIV. Türk Mikrobiyoloji Kongresi, Kongre Kitab, 2010, K br s. 19. Otlu B. Direnç saptanmas nda kullan lan moleküler yöntemler. EKMUD, Kongre Kitab 2010, stanbul. 20. Otlu B. Tiplendirme Sonuçlar n n Yorumlanmas Kurs: Bakterilerde Moleküler Tiplendirme Yöntemleri: Prensip-Uygulama-Sorunlar, XXXIII. Türk Mikrobiyoloji Kongresi, 2010, Bodrum. 21. Otlu B. Biosensors: Biyoreseptör Molecules. 6 th International Advanced Technologies Symposium (IATS 11), Kongre Kitab, 2011, Elaz, Turkey. 22. Rasooly A. Biosensor technologies. Methods 2005;37: Sancho-Tello S, Bravo D, Borras R, Costa E, Munoz- Cobo B, Navarro D. Performance of the LightCycler SeptiFast test Mgrade in detecting microbial pathogens in purulent fluids. J Clin Microbiol 2011;49: Shaw KJ, Docker PT, Yelland JV, Dyer CE, Greenman J, Greenway GM, et al. Rapid PCR amplification using a microfluidic device with integrated microwave heating and air impingement cooling. Lab Chip 2010;10: Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV. How to select and interpret molecular strain typing methods for epidemiological studies of bacterial infections: a review for healthcare epidemiologists. Infect Control Hosp Epidemiol 1997;18: Velusamy V, Arshak K, Korostynska O, Oliwa K, Adley C. An overview of foodborne pathogen detection: in the perspective of biosensors. Biotechnol Adv 2010;28: Weile J, Knabbe C. Current applications and future trends of molecular diagnostics in clinical bacteriology. Anal Bioanal Chem 2009;394: Westbrook G, Holmes H. Epidemiologic strain typing. In: Isenberg HD (ed). Clinical Microbiology Procedures Handbook. Washington C.D: ASM Pres, 2004: Ya c A. Bakterilerde tekrarlayan gen segmentleri ve kullan m alanlar. 30. Ya c A. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) ve polimeraz zincir reaksiyon (PZR) bazl tipleme yöntemleri. Durmaz R (editör). Uygulamal Moleküler Mikrobiyoloji. 2. Bask. stanbul: Nobel T p Kitabevleri, 2001: Zhu S, Liu Z, Zhang W, Han S, Hu L, Xu G. Nucleic acid detection using single-walled carbon nanohorns as a fluorescent sensing platform. Chem Commun (Camb) 2011;47: Uppsala Bio, Bio-X Solutuions for Hospital Acquired Infections aspx?id=122738&mpath=7400,7401,7689 ( ) 16 Hastane İnfeksiyonları Dergisi 2013;17(1):7-16