Makalenin Orjinal Adı: Identification of a novel gene set in human cumulus cells predictive of an oocyte's pregnancy potential

Transkript

1 Makalenin Orjinal Adı: Identification of a novel gene set in human cumulus cells predictive of an oocyte's pregnancy potential Yazarlar/Enstitü: Amy E. Iager, M.Sc.,a Arif M. Kocabas, Ph.D., b Hasan H. Otu, Ph.D., c,d Patricia Ruppel, Ph.D., e Anna Langerveld, Ph.D., f Patricia Schnarr, B.Sc., g Mariluz Suarez, M.Sc., h John C. Jarrett, M.D., f Joe Conaghan, Ph.D.,i Guilherme J. M. Rosa, Ph.D.,j Emilio Fern_andez, M.D., k Richard G. Rawlins, Ph.D., l Jose B. Cibelli, D.V.M., Ph.D., a,m,n and Javier A. Crosby, Ph.D. k a Gema Diagnostics, Ann Arbor, Michigan; b Laboratory of Developmental Neurobiology, Rockefeller University, New York, New York; c Department of Medicine, BIDMC Genomics Center, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts; d Department of Bioengineering, Istanbul Bilgi University, Istanbul, Turkey; e Innovative Analytics, Kalamazoo, Michigan; f Genemarkers, Kalamazoo, Michigan; g Jarrett Fertility Group, Carmel, Indiana; h Stanford Fertility and Reproductive Medicine Center, Stanford Hospital, Palo Alto, California; i Pacific Fertility Center, San Francisco, California; j Departments of Animal Sciences and Biostatistics and Medical Informatics, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin; k Unidad de Medicina Reproductiva, Clínica Las Condes, Santiago, Chile; l Department of Obstetrics and Gynecology, Rush University Medical Center, Chicago, Illinois; m Departments of Physiology and Animal Science, Michigan State University, East Lansing, Michigan; and n Laboratorio Andaluz de Reprogramaci_on Celular (LARCEL), Consejería de Salud, Junta de Andalucía, Seville, Spain Dergi: Fertil Steril, Vol. 99, No:3, pp:745 52, Kısa Özet: Amaç: Çoklu kliniklerde ıvf pratiğinin bir parçası olarak klinik ve hasta varyasyonu hesaplanarak,kümülüs hücrelerinde (KH) gebelik sonuçlarının tahmininde kullanılabilecek gen ekspresyonunun tanımlanması Tasarım: Tek insan cumulus-oosit komplexinin kombine mikroarray ve kantitatif reverse trankripsiyon poliferaz zinar reaksiyon uygulanarak retrospektif analizi Yer:Çok sayıda özel IVF klinikleri Hastalar:98 hasta 55 hastanın örneğine qrt-pcr analizi,yapıldı.27 hastanın gebeliği canlı doğumla sonuçlanmıştır. Müdahaleler:Gen expresyon analizi için kullanılacak Kh leri oosit toplanmasından hemen sonra ayrıldı.gebelik tahmin analizi için ağırlıklı oylama ile birini dışarıda bırakma yöntemi kullanıldı. Ana Sonuç:58 hastadan, 101 örnekte 12 gen exprasyonunun kombinasyonu Bulgular: KH de exprese olan gebelik sonuçları tahmininde 12 gen bulundu.bu gebelik tahmin modelinin doğruluğu %78,sensitivitesi %72,spesifitesi %84,pozitif prediktif değeri %81 ve negatif prediktif değeri %76 dır.eğri altında kalan olan 0,763+/-0,079 olup random tahmin olan 0,5 den anlamlı olarak büyüktür. Sonuç: İnsan KH nin gebelik sonuçlarını tahmin etmede etkili olabileceği düşünülen gen ekspresyon analizi için IVF-ET den edilen oositler kullanılmıştır.

2 Giriş: In vitro fertilizasyonun başarısını önündeki en büyük engel, sağlıklı tekil gebelik için gereken oosit ve embriyo seçiminde kesin objektif bir metodun hala bilinmemesidir. Mevcut olan seçim yöntemleri subjektiftir ve güvenilir olmayan morfolojik parametrelere dayanmaktadır. Multipi embriyo transferi gebelik şansını arttırsada çogul gebeliklerde anne ve fetüs için sayısız sağlık riskleri mevcuttur.bu nedenle arastırmalar tek embriyo transferine doğru kaymıştır. Yaşamla bağdaşan en iyi oosit ve embriyoyu seçebilecek non-invazif bir yöntem ile gebelik oranları artırılırken, çoğul gebeliklere bağlı riskler de azaltılmış olacaktır. Omik ler çağı başladığından beri moleküler alandaki bilgilerimiz insan üremesi etrafında toplanmıştır ve infertilite tedavisini hedefleyen büyük adımlar atılmıştır. Özellikle çoğu çalışma embriyo kalitesi belirteçlerini tanımlama ve proteomikler, metabolomikler ve transkriptomikler aracılığı ile gebelik sonuçlarını belirlemeyi hedeflemiştir (2-6). KH leri oositin etrafında bulunan destek hücreleridir ve IVF proçeslerinde toplanmışlardır. Oositin ovulasyon, fertlizasyona hazırlanmasında önemli rol oynarlar. KH ile oosit arasındaki gap-junctionlarla iki yönlü iletişim vardır. Sinyal molekülleri, aminoasitler, esansiyel metabolitler (7,8) ve muhtemelen mikro RNA lar ile bu iletişim sağlanır (9). Dahası KH lerdeki gen ekspresyonu embriyo kalitesini belirlemede ve gebelik sonuçlarını tahmin etmede non-invazif bir yöntem olabilir. Aslında bazı çalışmalarda KH lerdeki mrna ekspresyonu ile oosit ve / veya embriyo kalitesi arasında bir ilişki olduğu gösterilmiştir (10-18), ve başarılı gebelikle sonuçlanan ve sonuçlanmayan oositlerin KH de farklı ekspresyonlar saptanmıştır. Hamel ve ark. PGK1 ve RGS2 ekspresyonunun gebelik tahmininde kullanulabileceğini hasta üzerinde göstermiştir. Ancak bu çalışmanın kısıtlılığı hasta populasyonunun tümüne uygulanamamasıdır(23). Bir diğer önemli konu, gen ekspresyon analizini tasarlarken sonuçların başka faktörlerden de etkilenebileceğini göz önünde bulundurmak gerektiğidir. 2 yeni çalışmada SDC4, VCAN, EFNB2 ve CAMK1D gibi 11 gen üzerine yoğunlaşılmıştır (24,25). Ancak bu çalışmalarda hastalar sadece belli bir bölgeye aittir ve daha geniş hasta populasyonuna uyarlanamayabilir. Ayrıca ICSI prosedürü de gebelik sonuçlarını etkileyebilir. Ayrıca bu çalışmalarda 2 stimulasyon protokolü uygulanmıştır ve SDC4 ve VCAN ekspresyonunu etkileyebilir (18,25). Otörlerin de belirttiği gibi daha geniş ve ilişkisiz genlerin taranması ile ayrım gücü artacaktır. Bu çalışma insan KH lerinde eksprese olan genler aracılığı ile oosit viabilitesi ve gebelik üretebilme kapasitesi ile ilgili fikir veren biomarkerların tanınması amaçlanmıştır. Mikroarray ve kantitatif reverse transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyon (qrt-pcr) metodu kombinasyonu kullanılmıştır. Bu çalışma gebelik sonuçlarını tahmin eden 12 yeni gen tanımlamıştır. MATERYAL-METOD Hasta seçimi, implantasyon ve gebelik Şili de bir ve US de 2 klinikte IVF veya ICSI yapılan hastalardan retrospektif olarak yapılmış bir çalışmadır. Her hastaya 1, 2 veya 3 embriyo transferi (ET) yapılmıştır ve ET 2., 3. veya 5. günde yapılmıştır. Kliniğin programına göre ET den 4-9 hafta sonra USG ile gestasyonel kese ve fetal kalp atımı görülen gebelikler klinik gebelik olarak tanımlanmıştır. Örnekler sadece transfer edilen embriyoların tümünden gebelik elde edilen (tam başarı:p) ve transfer edilen hiçbir embriyodan gebelik elde edilemeyen (sıfır başarı:n) hastalardan toplanmıştır. Sonrasında canlı doğum sonuçları da kaydedilmiştir. 35 yaş üstü hastalar, 4 cm den büyük myomu olan hastalar, BMI>35 olan hastalar ve kemo-radyoterapi öyküsüolan hastalar çalışmaya dahil edilmemiştir.ağır erkek faktörü nedeniyle infertil olan çiftler de (toplam sperm sayısı <5 milyon ve testiler bx öyküsü olan)çalışmaya dahil edilmemiştir.

3 Hasta stimilasyonu Hastalar için en uygun yöntem seçilmiştir fakat genellikle GnRH agonisti ve GnRH antagonisti, spontan ovulasyonu baskılamak amacı ile kombine edilmiştir. Saf veya rekombinat FSH kullanılmıştır. hmg veya luteal faz desteği kullanıulmış veya kullanılmamıştır. Ovaryan cevap ve foliküler gelişim serum E2 düzeyi ölçümü ve TVS ile yapılmıştır. Son foliküler maturasyon aşaması için hcg uygulanmıştır ve oositler 36 saat sonra USG eşliğinde toplanmıştır. İnsan KH toplanması Kümülüs-oosit kompleksleri (KOK) kültür medyumlarında, kan, diğier hücreler ve debristen tamamen temizlenerek hazırlandı. Her KOK tan az sayıda KH, en dış en iç tabakadan olmamasına dikkat edilerek mekanik olarak ayrıldı. Her KH örneği fosfatlı salin solüsyon ile muamele edildi ve mikrosantrifüj tüplerinde 100 µl tampon özü ile tamponlandı ve pipet ile nazikçe toplandı. 30 dakika 42 C de inkübe edildi, santrifüj edildi ve sıvı nitrojen ile donduruldu. Oositler de ET ne kadar kültüre edildi. RNA izolasyonu Pipocure RNA izolasyon kitleri kullanıldı. Toplam RNA kalite ve kantitesi nanodrop 2000 spektrofotometre ile analiz edildi. Toplam RNA izolasyonu Michigan Üniversitesinde yapıldı. Mikroarray analizi 36 hastadan elde edilen 64 KH örneği analiz edildi. cdna sentezi ve çoğaltılması yapıldı. Affymetrix Gen Chip Mikroarray analiz Suite 5.0 ve Ekspreyon Console Software kullanıldı. Tahmin analizi Ağırlıklı oylama için sinyal gürültü oranı (SNR) kullanıldı. P ve N örnek gruplarında ideal genin komşuşuğundaki vektörler tanımlandı. SNR her grupta yüksek anormal ekspresyonu engellemekteydi. Geniş pozitif SNR değerleri P grubu için iyi bir tahminci ve geniş negatif SNR değerleri de N grubu için iyi bir tahminci olmuştur. Tahmin modeli uygulandığında veri grubu deneme ve doğrulama grubu olarak ayrıldı. Kantitatif real time PCR cdna sentezi için 8 ng total RNA ve yüksek kapasiteli cdna reverse transkripsiyon kiti kullanıldı. Termal dönüştürücü şartları; 10 dakika 95 C, ardından 15 saniye 14 siklus 95 C de ve sonra 4 dakika 60 C de. Endojen kontrol genleri 18S, GAPDH ve β-aktinrelatif kantifikasyon ve transkripsiyon için kullanıldı. 64 KH örneğinden 49 u önceden mikroarrayde kullanıldı. 37 yeni hastadan KH örneği toplanarak TLDA ( Taqman Low dansity array) ile analiz edildi. İstatistik P ve N grupları arasındaki klinik karakteristikler için Mann-Whitney testi (28) kullanı8ldı. İstatistiksel olarak anlamlı fark için α=.01 kabul edildi. qrt-pcr gen ekspresyon

4 verilerinin gebelik tahmin analizi için Fisher test kullanıldı. Gen ekspresyonundaki farkların analizi için ANOVA kullanıldı. SONUÇLAR Hasta ve örnek klinik karakteristikleri 55 hastadan alınan, 101 KH örneğinin 86 sı qrt-pcr TLDA ile analiz edildi (şekil1- tablo 1) tüm TLDA P örneklerinin gebelikleri klinik gebelik tanımına göre konfirme edildi. 86 örnekten 1 tanesi konfirme etmek, rafine etmek ve doğrulamak için kullanıldı. 25, 45 ve 16 örnek sırasıyla CLC, JFG ve PFC kliniklerinden sağlandı (Ek tablo-1). Örneklerin çoğu (n=69) 2 embriyo transferi yapılan hastalardan, 8 i tek embriyo transferi yapılan hastalardan ve 9 u 3 embriyo transferi yapılan hastalardan elde edilmişti. 47 örneğin ET si 2. veya 3. ve 39 u 5. günde yapılmıştı. ET günü ile P ve N grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmadı. Oosit yaşı, siklus sayısı açısından da P ve N grupları arasında fark bulunmadı (Ek tablo 2). P grubunda metafaz II deki oosit sayısı fazlaydı ve P grubu fertilizasyon oranı az bulundu (Ek tablo 2). Gruplar arasındaki bu farklılıklar nedeniyle gen ekspresyon analizinde klinik korelasyona gidildi. Gebelik tahmin analizi 64 örneğin transkripsiyonal analizi için öncelikle mikroarray kullanıldı (35 N ve 29 P). Bu grup deneme grubu ( 18 N ve 15 P) ve doğrulama grubu (17 N ve 14 P) olmak üzere ayrıldı. Prediktif genlerin performansını test etmek için doğrulama grubu kullanıldı. Başarı ile ilişkili genleri kullanabilmek için deneme grubu ( P vs. N) oluşturuldu. Tahmin sonuçları için Fisher test, permutasyon testi ve randomizasyon testi kullanıldı (P<0,05). Tahmin genlerinin qrt-pcr ile doğrulanması ve saflaştırılması Gebelik sonuçlarını tahmin değeri olan 227 gen bulundu. Bunların 196 sı bizim TLDA sağlamasında bulundu. En stabil ekspresyonu belirlemek için endojen kontrol genleri olan β- aktin, GAPDH ve 18S kullanıldı. 18S en stabil olanı idi ve Ct değerleri bu genin ekspresyon düzeyine göre normalize edildi. Tahmin edici gen grubu konfirme etmek ve sonrasında saflaştırmak için mikroarrayde kullanılan 64 örneğin dışında 49 örnek alt grup olarak kullanıldı ( 24 N ve 25 P, tablo 1). 18S e göre normalize edilmesinin ardından, 84 gen TLDA da mikroarrayde kullanılan 49 örnek ile uyumlu ekspresyon göstermekteydi. Bu 84 genin gebelik tahmin analizinde kullanılması ile 12 genden oluşan tahmin grubu oluşturuldu. Bu 12 genine tahmin değerini değerlendirmek için hastalardan elde edilen 37 yeni biyolojik örneğe TLDA yapıldı (19 N ve 18 P, tablo 1, şekil 1), mikroarray yapılmadı. Şekil 1

5 Tablo 1 Gebelik sonuçları biyomarkerları olarak KH gen ekspresyonu 12 gen tahmin grubu qrt-pcr TLDA kullanılarak örnek grubu A (önceden mikroarray ile tespit edilen 49 örnek), örnek grubu B ile doğrulandı (37 yeni biyolojik örnek, mikroarray kullanılmayan). P örneklerinden N ile karşılaştırıldığında 7 gen up regüle edildi ve 5 gen down regüle edildi (Ek tablo 3). Doğrulama grubuna (B-37 örnek) uygulandığında gebelik tahmin modelinin doğruluğu %78, sensitivitesi %72, spesifitesi %84, pozitif prediktif değeri %81 ve negatif prediktif değeri %76 bulundu (tablo 2). Tablo 2

6 Alıcı işletim karakteristik (ROC) analizi bir testin tanısal değerini belirlemede en yaygın kullanılan yöntemdir (31,32). 12 genin başarılı tahmin değerini belirlemede 37 B örneği ile doğrulanmıştır (Ek tablo 3). Eğri altında kalan alan (EAA) tahmin yeteneğini gösterir. EAA 0,763 +/- 0,079 (p=.0009) bulunluştur ve bu 0,5 olan random tahmin şansı değerinden anlamlı olarak büyüktür. Bu çalışmanın örnek genişliği ve ROC analizine göre EAA, önceki IVF merkezlerinin tanısal raporlarına göre düşüş göstermektedir (33,34). Tablo 3 Gen ekspresyonunun klinik korelasyonu Hastaların klinik karakteristikleri, 12 gen ekspresyon tahmin değerleri korele edildi. Artmış yanlış pozitif hata oranlarını yönetebilmek için α=.01 kullanıldı. Hiçbir tahmin değeri ile korele olmayan sürekli değişkenler MII oosit sayısı ve fertlizasyon oranını (2PN/MII) içermekteydi. MII oosit sayısı ve fertilizasyon oranı gebelik sonuçlarına göre değişiklik göstermesine rağmen hiçbir değişken ekspresyonu ile korele değildi. Yani P ve N grupları arasında farklı MII oosit sayısı ve farklı fertilizasyon oranları olmasına rağmen bu durum gebeliğin başarısı ile ilşkisiz bulunmuştur. Sadece 2 değişkenin, gonadotropin ve ET katateri, gen ekspresyonunu anlamlı olarak değiştirmediği bulundu (Ek tablo 5). Gonadotropin ile ilişkili olarak sadece JFG, p FSH/hMG rejimi kullanmaktaydı (n=45); PFC, rfsh kullanmaktaydı (n=16). Yani bölge ile gonadotropin arasında kafa karıştırıcı bir fark bulunmaktaydı ve bu sonuçlar ile ilişkili sonuçlar da dikkatle yorumlanmalıdır. Benzer şekilde ET katateri ile ilişkili sonuçlar da dikkatle yorumlanmalıdır. Çünkü farklı bölgelerde farklı katater kullanımı sonucu da kafa karıştırıcı sonuçlar bulundu. Wallace katateri ile alınan örnek sayısı çok azdı (n=5). Son olarak klinikler ile ilişkili olarak örneklerin çoğu CLC den toplandı. Burada örnekler daha erken alındı ve JFG ye göre daha uzun süre saklandı. TARTIŞMA IVF sırasında canlı oositleri ve embriyoları seçebilme yeteneğinin medikal, sosyal ve ekonomik yararları olacaktır. KH kullanılarak yapılacak tanısal bir analiz, morfoloji ile birlikte bu amaca hizmet edecektir. Kritik soru, gelişmekte olan bir test hasta ve kliniklere bağlı değişkenlerin üstesinden gelebilecek kadar güçlü olacak mıdır? Bu rapor, ilk kez, farklı bölgelerden ve farklı klinik uygulamalardan elde edilen 12 genlik yeni bir grubu tanımlamıştır.

7 Bizim amacımız KH de eksprese olan genlere dayanarak viabl oosit seçiminde non-invazif destek yöntem bulmaktır. Bu çalışmada gebelik tahmini için bulunan genler önceki bulunan genler ile uyuşmamaktadır ancak bu şaşırtıcı değildir. Bu durum teknik uygulamalardaki farklılıklara bağlı olabilir. Tahmin grubundaki genler glukoz metabolizması, transkripsiyonel regülasyon, gonadotropin regülasyonu ve apaptozis ile ilişkilidirler. Tüm bunlar KOK için önemli genlerdir. Bazı gen ve gen ailelerinin bilinen fonksiyonları olsa da bu genlerin gebelik tahmininde rol alıyor olmaları imkansız değildir. Örneğin FGF gen ailesi, hücre yaşamı regülasyonunda önemli rol oynar ve FGF-12, bizim P grubunda N ile karşılaştırıldığında up regüle bulunmuştur. Glukoliz yolağında matabolize olan glukoz KOK için kritik bir metabolitti (4). Prüvat ve laktat gibi glukoz KH için önemli besin kaynağıdır. Glukozun bu ara ürünlere dönüşmesi daha da önemlidir. Granuloza hücreleri gelişmekte olan oositi desteklemede kritik rol alır. İlk birkaç hücre bölünmesi için gereken enerji için maternal destek sağlar. SLC2A kolaylaştırılmış taşıyıcı ailesinin bir üyesi olan SCL2A9 (GLUT9) glukoz homeostazında önemli rol oynar (36). SCL2A9 özellike ürik asit ve glukoz gibi heksoz şekerleri taşır (37). İnek modelinde matür KOK ların immatürlere göre daha fazla glukoz ve bunun metabolit ürünlerini kullandığı gösterilmiştir. Bu durum göz önünde bulundururlduğunda, SCL2A9 un artmış ekspresyonu viabl oositlerin KH lerinde daha dinamik bir glukoz taşınmasını ve böylelikle daha fonksiyonel bir KOK olduğunu yansıtıyor olabilir. NR2F6 da P örneklerinde up regüle bulunmuştur. Bu gen artık nükleer reseptördür, nükleer reseptör süperailesinin bir subgrubudur. KH lerindeki esas fonksiyonu bilinmese de, reprodüktif proçeste bir çok rol oynar (39). LH reseptör (LHr) transkripsiyonunu inhibe ettiği gösterilmiştir (40). KH yüzeyinde LHr formasyonu ovulasyonu indükleyen LH surge ü öncesi foliküler maturasyonda anahtar rol alır. LHr nin aşırı ekspresyonu ovulatuar proçeste ters etki yapar. Polikistik overi olan kadınların overlerinde bu reseptör yüksek bulunmuştur (41). N grubunda NR2F6 ekspresyonu az bulunmuştur. Folikülün suboptimal matürasyonu ile ilişkili olabilir. P grubunda N ye göre up regüle olan diğer genler ; ARI D 1 B, FAM36 A,GPR 137 B VE ZNF 132 dir.ari D 1 B, SWI/ SNF kromatin yeniden düzenlenme komplexinin bir parçasıdır ve hücre siklusu kontrolunde önemli rolo oynar. Kromatin yeniden düzenlenme maturasyonunu da içeren foliküler hücreler ile oosit arasında gap-junctionlar ile sağlanan iletişiminin önemi çalışmalarda gösterilmiştir.(42).p grubunda artmış ARID 1 B, gap-junction iletişimini kolaylaştıracak ve oosit iletişimini artıracaktır.fam 36 A nın fonksiyonu tam anlaşılmamıştır.mitokondride ve iç membranda bulunmaktadır. GPR 137 B de yeterince karakterize edilememiştir, ancak bir iç membran proteini olan protein ile birleşmiş reseptör ( GPCR) genini kodlar.foliküler mikroçevrede GPR 137 B sinayal mekanizmasını sağlar. ZNF 132 de hala karekterize edilememiş genlerdendir. Çinko parmak protein ailesinin üyesidir. Transkrpsiyon faktörlerinin DNA bağlayan alt grubuna direkt etki eder. P grubunda N ile karşılaştırıldığında 5 gen down regüledir. DNAJC15, RHBDL 2, MTUS 1, NVP 133 ve ZNF 93. Bu genlerin spesifik işelevi ile ilgili çok az şey bilinmektedir.. DNAJC15 mitondride membranlarda lokalizedir ve ısı şok bağlayıcı yapılarla ilişkili olduğu düşünülmektedir. RHBDL 2 intermembran proteazıdır. Yeni çalışmalar intermembran proteazların gelişim ve metobolizma gibi hücre proçeslerini düzenleyici rolu olduğu gösterilmiştir.(43). MTUS 1 in önceden overlerde diğer dokularda daha fazla salgılandığı söylenmiştir (44) ancak overdeki temel görevi bilinmemektedir. NVP 133, nükleostoplazmik taşıyıcı aktivitede rol alır ( glukoz transportu gibi). Son olarak ZNF

8 93, bir diğer çinko parmak genidir.esas görevi hala bilinmesede diğer çinko parmak proteinleri gibi transkripsiyon faktörlerinin DNA bağlayıcı kompenentinde direkt rol aldığı düşünülmektedir. Gebe olan ve olamyan hastalar arasında M II oosit sayısı ve fertilizasyon oranları arasında anlamlı fark olsada, gen expresyon analizinin klinik korelasyonu, bu farkların gen expresyon değerleri ile korele olmadığını göstermiştir. Dolayısı ile bizim prediktif gen grubunun gücü ile ilişkisi yoktur. Gonadotropin ve ET katater seçiminin gen ekspresyonuna etkisi tanımlanmıştır. Klinik merkez ile ilişkili olarak, CLC ile JFG arasında farklar saptanmıştır. Örneklerin çoğu CLC den toplanmıştır. Daha erken toplandığından daha uzun süre saklanmıştır. Bu durum eş değişkenler arasındaki farkı açıklamaktadır. SONUÇ Burada gebelik tahmininde rolü olan KH de eksprese olan 12 yeni gen grubu sunmaktayız. Bu veriler, farklı klinikler, farklı stimülasyon protokollerinden elde edilmiştir ve %78 doğruluğa sahiptir. ROC analizi ile, bu testin prediktif gücü belirlenmiştir, EAA 0,763+/-0,079 olup random tahmin şansı olan 0,5 den anlamlı olarak yüksektir (p=.0009). başarılı bir tanı testi olması umulmaktadır. Heterojen hasta profili ve farklı tedavi protokollerine rağmen umut vericidir. Bir sonraki basamak, bu gen analizlerini randomize kontrollü klinik çalışmalar ile prospektif olarak bir çok merkezde, en yüksek gebelik potansiyeli olan embriyoyu transfer etmek için gereken oositi seçmede tahmin değerini konfirme etmektir. KAYNAKLAR 1. Fauser BC, Devroey P, Macklon NS. Multiple birth resulting from ovarian stimulation for subfertility treatment. Lancet 2005;365: Huang Z, Wells D. The human oocyte and cumulus cells relationship: new insights from the cumulus cell transcriptome. Mol Hum Reprod 2010;16: Nel-Themaat L, Nagy ZP. A review of the promises and pitfalls of oocyte and embryo metabolomics. Placenta 2011;32S3:S Leese HJ, Baumann CG, Brison DR, McEvoy TG, Sturmey RG. Metabolism of the viable mammalian embryo: quietness revisited. Mol Hum Reprod 2008; 14: Sher G, Keskintepe L, Nouriani M, Roussev R, Batzofin J. Expression of shlag in supernatants of individually cultured 46-h embryos: a potentially valuable indicator of embryo competency and IVF outcome. Reprod Biomed Online 2004;9: Fragouli E, Bianchi V, Patrizio P, Obradors A, Huang Z, Borini A, et al. Transcriptomic profiling of human oocytes: association of meiotic aneuploidy and altered oocyte gene expression. Mol Hum Reprod 2010;16: Buccione R, Schroeder AC, Eppig JJ. Interactions between somatic cells and germ cells throughout mammalian oogenesis. Biol Reprod 1990;43: Matzuk MM, Burns KH, Viveiros MM, Eppig JJ. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science 2002;296: Katakowski M, Buller B, Wang X, Rogers T, Chopp M. Functional microrna is transferred between glioma cells. Cancer Res 2010;70:

9 10. McKenzie LJ, Pangas SA, Carson SA, Kovanci E, Cisneros P, Buster JE, et al. Human cumulus granulosa cell gene expression: a predictor of fertilization and embryo selection in women undergoing IVF. Hum Reprod 2004;19: Zhang X, Jafari N, Barnes RB, Confino E, Milad M, Kazer RR. Studies of gene expression in human cumulus cells indicate pentraxin 3 as a possible marker for oocyte quality. Fertil Steril 2005;83(Suppl 1): Hasegawa J, Yanaihara A, Iwasaki S, Mitsukawa K, Negishi M, Okai T. Reduction of connexin 43 in human cumulus cells yields good embryo competence during ICSI. J Assist Reprod Genet 2007;24: Gasca S, Pellestor F, Assou S, Loup V, Anahory T, Dechaud H, et al. Identifying new human oocyte marker genes: a microarray approach. Reprod Biomed Online 2007;14: Feuerstein P, Cadoret V, Dalbies-Tran R, Guerif F, Bidault R, Royere D. Gene expression in human cumulus cells: one approach to oocyte competence. Hum Reprod 2007;22: Cillo F, Brevini TAL, Antonini S, Paffoni A, Ragni G, Gandolfi F. Association between human oocyte developmental competence and expression levels of some cumulus genes. Reproduction 2007;134: van Montfoort APA, Geraedts JPM, Dumoulin JCM, Stassen APM, Evers JLH, Ayoubi TAY. Differential gene expression in cumulus cells as a prognostic indicator of embryo viability: a microarray analysis. Mol Hum Reprod 2008;14: Anderson RA, Sciorio R, Kinnell H, Bayne RAL, Thong KJ, de Sousa PA, et al. Cumulus gene expression as a predictor of human oocyte fertilisation, embryo development and competence to establish a pregnancy. Reproduction 2009;138: Adriaenssens T, Wathlet S, Segers I, Verheyen G, de Vos A, van der Elst J, et al. Cumulus cell gene expression is associated with oocyte developmental quality and influenced by patient and treatment characteristics. Hum Reprod 2010;25: Gebhardt KM, Feil DK, Dunning KR, Lane M, Russell DL. Human cumulus cell gene expression as a biomarker of pregnancy outcome after single embryo transfer. Fertil Steril 2011;96:47 52.e Assidi M, Montag M, Van der Ven K, Sirard MA. Biomarkers of human oocyte developmental competence expressed in cumulus cells before ICSI: a preliminary study. J Assist Reprod Genet 2011;28: Assou S, Haouzi D, Mahmoud K, Aouacheria A, Guillemin Y, Pantesco V, et al. A noninvasive test for assessing embryo potential by gene expression profiles of human cumulus cells: a proof of concept study. Mol Hum Reprod 2008;14: Hamel M, Dufort I, Robert C, Gravel C, Leveille MC, Leader A, et al. Identification of differentially expressed markers in human follicular cells associated with competent oocytes. Hum Reprod 2008;23: Hamel M, Dufort I, Robert C, Leveille M-C, Leader A, Sirard M-A. Genomic assessment of follicular marker genes as pregnancy predictors for human IVF. Mol Hum Reprod 2010;16: Wathlet S, Adriaenssens T, Segers I, Verheyen G, Janssens R, Coucke W, et al. New candidate genes to predict pregnancy outcome in single embryo transfer cycles when using cumulus cell gene expression. Fertil Steril 2012;

10 98:432 9.e Wathlet S, Adriaenssens T, Segers I, Verheyen G, van de Velde H, Coucke W, et al. Cumulus cell gene expression predicts better cleavage-stage embryo or blastocyst development and pregnancy for ICSI patients. Hum Reprod 2011; 26: Kocabas AM, Crosby J, Ross PJ, Otu HH, Beyhan Z, Can H, et al. The transcriptome of human oocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 2006;103: Golub TR, Slonim DK, Tamayo P, Huard C, Gaasenbeek M, Mesirov JP, et al. Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science 1999;286: Zar JH. Biostatistical analysis. 5th ed. Upper Saddle River, NJ: Pearson Prentice- Hall; Nevins JR, Potti A. Mining gene expression profiles: expression signatures as cancer phenotypes. Nat Rev Genet 2007;8: Radmacher MD, McShane LM, Simon R. A paradigm for class prediction using gene expression profiles. J Comput Biol 2002;9: Zhou KH, O'Malley AJ, Mauri L. Receiver-operating characteristic analysis for evaluating diagnostic tests andpredictivemodels.circulation 2007;115: Linden A. Measuring diagnostic and predictive accuracy in disease management: an introduction to receiver operating characteristic (ROC) analysis. J Eval Clin Pract 2006;12: Esterhuizen AD, Franken DR, Lourens JGH, Prinsloo E, van Rooyen LH. Sperm chromatin packaging as an indicator of in-vitro fertilization rates. Hum Reprod 2000;15: F_abregues F, Balasch J, Creus M, Carmona F, Puerto B, Quinto L, et al. Ovarian Reserve test with human menopausal gonadotropin as a predictor of in vitro fertilization outcome. J Assist Reprod Genet 2000;17: Watson AJ. Oocyte cytoplasmic maturation: a key mediator of oocyte and embryo developmental competence. J Anim Sci 2007;85:E Sutton-McDowall ML, Gilchrist RB, Thompson JG. The pivotal role of glucose metabolism in determining oocyte developmental competence. Reproduction 2010;139: Augustin R, Carayannopoulos MO, Dowd LO, Phay JE, Moley JF, Moley KH. Identification and characterization of human glucose transporter like protein-9 (GLUT9): alternative splicing alters trafficking. J Biol Chem 2004; 279: Sutton ML, Cetica PD, Beconi MT, Kind KL, Gilchrist RB, Thompson JG. Influence of oocyte-secreted factors and culture duration on the metabolic activity of bovine cumulus cell complexes. Reproduction 2003;126: Bertolin K, Bellefleur A-M, Zhang C, Murphy BD. Orphan nuclear receptor regulation of reproduction. Anim Reprod 2010;7: Zhang Y, Dufau ML. Nuclear orphan receptors regulate transcription of the gene for the human luteinizing hormone receptor. J Biol Chem 2000;275: Jakimiuk AJ, Weitsman SR, Navab A, Magoffin DA. Luteinizing hormone receptor, steroidogenesis acute regulatory protein, and steroidogenic enzyme messenger ribonucleic acids are overexpressed in thecal and granulosa cells from polycystic ovaries. J Clin Endocrinol Metab 2001;86: Luciano AM, Franciosi F, Modina SC, Lodde V. Gap junction mediated communications

11 regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth and differentiation through camp-dependent mechanism(s). Biol Reprod 2011;85: Erez E, Fass D, Bibi E. How intramembrane proteases bury hydrolytic reactions in the membrane. Nature 2009;459: Nagase T, Ishikawa K-i, Kikuno R, Hirosawa M, Nomura N, Ohara O. Prediction of the coding sequences of unidentified human genes. XV. The complete sequences of 100 new cdna clones from brain which code for large proteins in vitro. DNA Res 1999;6: EK ŞEKİLLER VE TABLOLAR EK ŞEKİL 1

12 EK TABLO 1 EK TABLO 2 EK TABLO 3

13 EK TABLO 4 EK TABLO 5