S çanlarda papainle oluflturulan osteoartritin Mankin skoru ile zamana ba l derecelendirilmesi

Transkript

1 ACTA ORTHOPAEDICA et TRAUMATOLOGICA TURCICA Acta Orthop Traumatol Turc 2007;41(3): S çanlarda papainle oluflturulan osteoartritin Mankin skoru ile zamana ba l derecelendirilmesi Quantification of papain-induced rat osteoarthritis in relation to time with the Mankin score Nergis MURAT, 1 Bahattin KARADAM, 2 Sermin ÖZKAL, 3 Vasfi KARATOSUN, 2 Sedef G DENER 1 Dokuz Eylül Üniversitesi T p Fakültesi, 1 Farmakoloji Anabilim Dal, 2 Ortopedi ve Travmatoloji Anabilim Dal, 3 Patoloji Anabilim Dal Amaç: Papainle deneysel olarak oluflturulan s çan osteoartrit modelinde k k rdak yap s ndaki de ifliklikler Mankin skorlama sistemiyle zamana ba l olarak derecelendirildi. Çal flma plan : Çal flmada 21 adet erkek Wistar s çanda osteoartrit oluflturmak için %4 lük papain solüsyonu (10 µl) ve aktivatörü 0.03M sistein (10 µl) sa diz eklemine 1, 4 ve 7. günlerde enjekte edildi. Kontrol olarak ise ayn miktarda steril serum fizyolojik solüsyonu sol dizlere enjekte edildi. S çanlardan rastgele seçimle yediflerli üç grup oluflturuldu. Her bir gruptaki s çanlar n yaflam son enjeksiyondan s ras yla 1, 2 ve 4 hafta sonra yüksek doz eter anestezisi ile sonland r ld ve sa ve sol diz eklemleri ç kar ld. Eklem k k rda yap s nda oluflan de iflikliklerin histolojik derecelendirmesi modifiye Mankin skoru kullan larak yap ld. Sonuçlar: K k rdak yap s de erlendirildi inde, her üç grupta da yüzeysel tabakada düzensizlik ve fibrilasyonlar; geçifl ve radial alanlardaki hücre say lar nda azalma ve tabakalanma gözlenirken, pannus oluflmad izlendi. Her üç grupta da modifiye Mankin skoru papain uygulanan dizlerde kontrollere göre anlaml derecede yüksek idi (p<0.05). Birinci, ikinci ve dördüncü hafta Mankin skorlar papain grubunda s ras yla 4.3±0.9, 6.9±1.3 ve 10.4±1.9; kontrol dizlerde ise 2.7±0.5, 4.0±0.8 ve 4.4±1.0 bulundu. Papain enjeksiyonundan sonra bir hafta ve dört hafta beklenen gruplar aras nda Mankin skoru anlaml farkl l k gösterdi (p=0.0471). Ç kar mlar: Enjeksiyondan dört hafta sonra elde etti imiz bulgular osteoartritin erken evre bulgular ile uyumlu görünmektedir. Bu araflt rman n sonuçlar erken evre osteoartrit tedavisine yönelik çal flmalara fl k tutabilir. Anahtar sözcükler: K k rdak, eklem/ilaç etkisi/patoloji; hastal k modeli, hayvan; diz eklemi/patoloji; osteoartrit/kimyasal yolla oluflan; papain; s çan. Objectives: The aim of this study was to evaluate structural changes in relation to time with the use of the Mankin scoring system in papain-induced rat osteoarthritis. Methods: Osteoarthritis was induced in 21 male Wistar rats by injecting an admixture of 4% papain (10 µl) and its activator 0.03 M cycteine (10 µl) into the right knee joints on the first, fourth, and seventh days. The same volume of sterile saline solution was injected into the left knees as controls. The rats were assigned to three groups equal in number and were sacrificed under high-dose ether anesthesia after one, two, and four weeks of the last papain injection, respectively. The study and control knee joints were removed and histologic changes in cartilage structure were assessed and quantified with the modified Mankin scoring system. Results: Histologically, all papain injected knees exhibited irregularity and fibrillation in the superficial layer, decreased cell count and multilayering in transitional and radial zones, and no pannus formation. The modified Mankin scores were significantly higher compared to the control knees in all the groups (p<0.05), being 4.3±0.9, 6.9±1.3, and 10.4±1.9 in diseased knees, and 2.7±0.5, 4.0±0.8, and 4.4±1.0 in the control knees after after one, two, and four weeks of the last papain injection, respectively. There was a significant difference between the Mankin scores of the rats sacrificed after one and four weeks of the last papain injection (p=0.0471). Conclusion: Findings observed after four weeks of papain injection seem to be consistent with early osteoarthritic changes. Our results may provide insight into therapeutic strategies for early osteoarthritis. Key words: Cartilage, articular/drug effects/pathology; disease models, animal; knee joint/pathology; osteoarthritis/chemically induced; papain; rats. Yaz flma adresi: Dr. Vasfi Karatosun. Erzene Mah., 116/16 Sok., No: 8/12, Bornova, zmir. Tel: Faks: e-posta: vasfi.karatosun@deu.edu.tr Baflvuru tarihi: Kabul tarihi:

2 234 Acta Orthop Traumatol Turc Osteoartrit, eklem k k rda ve subkondral kemikte y k m ve tamir olaylar aras ndaki normal dengenin bozulmas sonucu geliflen, sadece k k rdak dokunun de il, eklemi oluflturan ve destek sa layan kemik, sinovya, kapsül, ligaman, kas ve tendonlar n bütün olarak yer ald dinamik bir hastal k sürecidir. [1,2] nsanlarda yap lan çal flmalarda patolojik de iflikliklerin standardizasyonu ve derecelendirilmesi için eklem doku örne i almak güçtür. [3] Hastal n daha iyi anlafl lmas için insanlardakine benzer deneysel osteoartrit modelleri kullan lmaktad r. Eklemi oluflturan dokulardaki yap sal de ifliklikleri ve bu de ifliklikleri etkileyen risk faktörlerini belirlemede ve tedavi yaklafl mlar n n etkinli ini de- erlendirmede deneysel modeller yarar sa lamaktad r. [4] Osteoartrit çal flmalar için farkl hayvanlarda birçok deneysel model oluflturulmufltur. [5] Genel olarak hayvanlardaki osteoartrit modelleri travmayla, ameliyatla, enzimatik olarak, eklem instabilitesi ve ekstrasellüler matriks dejenerasyonu yaratarak, kondrosit metabolizmas n bozan çeflitli ajanlar ile oluflturulmaktad r. Proteolitik enzimlerden biri olan papain de deneysel osteoartrit modeli oluflturmada kullan lmaktad r. Bu enzimin kollajen integrasyonu üzerine etki etmesi ve kondrosit üzerinde do rudan etkisinin olmamas ve düflük dozlarda etkisinin geri dönüflümlü olmas, di er kimyasal modellere üstünlü ünü oluflturmaktad r. [6] Eklem içine papain enjeksiyonunun insan osteoartritine benzer bir model oluflturdu u çeflitli histopatolojik çal flmalarda gösterilmifltir. [4,7-10] Bu çal flmalarda sonuçlar histopatolojik olarak ortaya konmufl; ancak, karfl laflt rmal çal flmaya olanak verecek bir skorlama ile de erlendirme yap lmam flt r. Bu çal flmada, papainle deneysel olarak oluflturulan osteoartrit modelinde k k rdak yap s ndaki de iflikliklerin bir skorlama ile zamana ba l evrelendirilmesi amaçland. Gereç ve yöntem Çal flmada gr a rl nda, 21 adet erkek Wistar cinsi s çan kullan ld. Çal flma Dokuz Eylül Üniversitesi T p Fakültesi Deney Hayvan Etik Kurulu nca de erlendirilip onayland. S çanlar, tüm deney süresince sabit s cakl kta (24 C) tutulan odalarda bar nd r ld, standart bir yemle beslendi ve su içmeleri k s tlanmad. Çal flman n her evresinde, uygulama aflamas ndan önce s çanlara eter anestezisi uyguland. Osteoartrit oluflmas patolojik olarak de erlendirildi. Deneysel osteoartrit oluflturulmas Osteoartrit, %4 lük papain solüsyonu ve onun aktivatörü 0.03M sisteinle oluflturuldu. [9] Her iki maddenin stok solüsyonundan 10 ar µl ayn enjektöre çekilip toplam 20 µl sa diz eklemine enjekte edildi. Sol diz eklemine ise, kontrol amaçl, ayn hacimde steril distile su enjekte edildi. Enjeksiyonlar 1, 4 ve 7. günlerde yap ld. [9] Son enjeksiyondan sonra s - çanlardan rastgele seçimle yediflerli üç grup oluflturuldu. Bu gruplardaki s çanlar n yaflam enjeksiyondan s ras yla bir, iki ve dört hafta sonra yüksek doz eter anestezisi ile sonland r ld ktan sonra sa ve sol diz eklemleri ç kar ld. Histopatolojik inceleme Diz eklem örnekleri %10 luk nötral tamponlu formalin solüsyonu içinde saklan p, daha sonra %10 luk formik asit solüsyonu içinde dekalsifiye edildi. Parafin bloklamay takiben örnekler hematoksilen-eozin ve toluidin mavisi ile boyand. Bu flekilde haz rlanan preparatlar n histolojik de erlendirmesi fl k mikroskobunda yap l p, eklem k k rda yap s nda oluflan de ifliklikler modifiye Mankin skoru kullan larak de erlendirildi. [11] Modifiye Mankin skorlama sisteminde, eklem k k rda yap lar, hücre say lar, toluidin mavisi veya safranin-o ile boyanabilme özelli i, geçifl bölgesinin (tidemark zone) özelli i ve k k rdak yüzeyde pannus formasyonu olup olmamas de erlendirilerek her örne e befl ayr kategoride puan verilir. Osteoartrit çal flmalar nda kullan lan ve hiyalin eklem k k rda n n dejeneratif de iflikliklerinin histolojik olarak incelenmesine olanak veren bu skorlama sisteminde puanlama 0-32 aras nda de iflmekte; düflük skorlar k k rdak dokudaki hafif de ifliklikleri, büyük skorlar ise ileri derecede dejenerasyonu belirtmektedir. [11] statistiksel analiz Veriler ortalama±standart hata fleklinde gösterildi. Gruplarda kontrollerle yap lan karfl laflt rmalar için Mann-Whitney U-testi, üç grubun karfl laflt r lmas için ise Kruskal-Wallis varyans analizi uyguland. P<0.05 de eri istatistiksel olarak anlaml kabul edildi.

3 Murat ve ark. S çanlarda papainle oluflturulan osteoartritin Mankin skoru ile zamana ba l derecelendirilmesi Kontrol Papain Tart flma Osteoartrit skoru Eklemi oluflturan dokulardaki yap sal de ifliklikleri de erlendirmede, bu de ifliklikleri etkileyen risk faktörlerini belirlemede ve tedavi yaklafl mlar n n etkinli ini de erlendirmede deneysel osteoartrit mo hafta 2 hafta 4 hafta fiekil 1. Enjeksiyonu takiben bir, iki ve dört hafta beklenen gruplar n modifiye Mankin skorlar. Sonuçlar Son enjeksiyonu takiben bir hafta beklenen grup: Modifiye Mankin skorlamas yla yap lan de erlendirmeye göre, papain uygulanan dizlerde yüzeysel bölgedeki hücrelerde fliflme, boya tutma özelli inde hafif oranda azalma gözlendi. Geçifl bölgesi de çok tabakal hal alm flt. Modifiye Mankin skoru papain ve steril distile su enjekte edilen dizler aras nda anlaml farkl l k gösterdi (kontrol 2.7±0.5, papain 4.3±0.9; p<0.05) (fiekil 1). Son enjeksiyonu takiben iki hafta beklenen grup: Papain uygulanan dizlerde yüzeysel düzensizlik, yüzeysel bölgedeki hücrelerde fliflme, orta ve derin bölgede az oranda hipersellülerite, boya tutma özelli inde azalma ve geçifl bölgesinde tabakalanma gözlendi (fiekil 2). Kontrol dizlerle karfl laflt r ld nda modifiye Mankin skoru anlaml derecede yüksek bulundu (kontrol 4.0±0.8, papain 6.9±1.3; p<0.05) (fiekil 1). Son enjeksiyonu takiben dört hafta beklenen grup: Papain uygulanan dizlerden elde edilen örneklerde yüzeysel düzensizlikler, yüzeysel bölgede hücre kayb, orta bölgede hipersellülerite, derin bölgede hiposellülerite, geçifl bölgesine uzanan yar klar, boya tutma özelli inde azalma ve geçifl bölgesinde tabakalanma gözlendi (fiekil 3). Kontrol grubu ile karfl laflt r ld nda modifiye Mankin skoru anlaml derecede yüksek bulundu (kontrol 4.4±1.0, papain 10.4±1.9; p<0.05) (fiekil 1). Gruplararas karfl laflt rmalarda kontrol gruplar aras nda anlaml farkl l k bulunmazken, papain enjeksiyonundan sonra bir hafta ve dört hafta beklenen gruplar aras nda anlaml farkl l k vard (p=0.0471) (fiekil 1). fiekil 2. Yüzeysel düzensizlikler, hücrelerde fliflme, geçifl bölgesinde tabakalanma (H-E x 40). fiekil 3. Orta ve derin bölgede hücre kayb, derin yar klar ve geçifl bölgesinde tabakalanma ve yer yer kay plar (H-E x 100).

4 236 Acta Orthop Traumatol Turc dellerinden yararlan lmaktad r. Oluflma mekanizmalar na göre bu modeller mekanik ve yap sal olarak iki ana gruba ayr l r. [3] Mekanik osteoartrit modellerinde eklemde instabilite yarat larak veya yük da - l m de ifltirilerek osteoartrit oluflturulur. Ön çapraz ba kesilmesi, bu grubun literatürdeki çal flmalarda s k kullan lan örne idir. [11-15] Yap sal osteoartrit modellerinde, fiziksel, kimyasal veya enzimatik bir etken ile do rudan k k rdak doku kompozisyonunda de ifliklikler meydana getirilerek osteoartrit oluflturulur. Osteoartrit oluflma süresi mekanik modellere göre daha k sad r. [16] Papain proteolitik bir enzimdir. Ekstrasellüler matrikste proteoglikanlar üzerine etkiyerek kondroitin sülfat sal n m na yol açar ve sonuçta kollajen integrasyonunu bozar. [9] Ancak, kollajen ve kondrositler üzerine do rudan etkisi yoktur. [17] Papainin k k rda n yenilenme mekanizmalar n tamamen bozmad ve yenilenme kapasitesinin uygulanan doz ile ters orant l oldu u saptanm flt r. [3,18,19] Bu durum, oluflturulacak modelde osteoartritin evrelendirilmesine ve uygun tedavi seçe- i sonuçlar n n farkl evrelerde de erlendirilmesine olanak sa layacakt r. Papainin eklemiçi enjeksiyonunun, histopatolojik olarak insan osteoartritine benzer bir model oluflturdu u çeflitli çal flmalarda gösterilmifltir. [4,7-10,17] Bu çal flmalarda papain farkl dozlarda ve aral klarla kullan lm flt r. Sonuçlar histopatolojik olarak de erlendirilmifl; ancak, karfl laflt rmal çal flmaya olanak verecek bir skorlama ile de erlendirme yap lmam flt r. Mankin skorlama sistemi hassas bir yöntemdir ve en hafif osteoartritik de ifliklikleri inceleme ve de- erlendirme olana tan maktad r. Dejenere k k rdak dokudaki hücrelerin özellikleri, matriks yap s ndaki de ifliklikler, geçifl bölgesinin durumu, pannus oluflumu ve eklem yüzeyinin karakteristi i bu skorlama sistemiyle de erlendirilebilir. [11] Osteoartritte görülen morfolojik de iflikliklerin büyük bir bölümünü kapsamas ve de erlendirmeci-içi ve aras farkl l klar n az olmas nedeniyle yeterli bir sistemdir. [20] Osteoartritin farkl evrelerinde kondrositlerin metabolik durumu ile Mankin skorlama sistemi aras nda korelasyon bulunmufltur. [21] Literatürdeki papain çal flmalar nda da ayn iliflki histopatolojik olarak ortaya konmufl; ancak, istatistiksel de erlendirmeye al nmam flt r. [4,8,9] Çal flmam zda, papainle oluflturulan osteoartrit modelinde geçen süre ile k k rdak yap - s ndaki dejenerasyon derecesi aras ndaki iliflkinin do ru orant l oldu unu saptad k ve bunu ilk kez olmak üzere skorlama sistemi ile ortaya koyduk. Enjeksiyondan dört hafta sonra elde etti imiz bulgular n osteoartritin erken evre bulgular ile uyumlu oldu u kan s nday z. Bu araflt rma sonuçlar n n erken evre osteoartrit tedavisine yönelik, tedavi edici ajan n/yöntemin araflt r laca çal flmalara fl k tutaca n düflünüyoruz. Kaynaklar 1. Altman RD. The syndrome of osteoarthritis. J Rheumatol 1997;24: Buckwalter JA, Mankin HJ. Articular cartilage: degeneration and osteoarthritis, repair, regeneration, and transplantation. Instr Course Lect 1998;47: Pritzker KP. Animal models for osteoarthritis: processes, problems and prospects. Ann Rheum Dis 1994;53: Bentley G. Papain-induced degenerative arthritis of the hip in rabbits. J Bone Joint Surg [Br] 1971;53: Martel-Pelletier J. Pathophysiology of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage 1998;6: Moskowitz RW. Experimental models of degenerative joint disease. Semin Arthritis Rheum 1972;2: Farkas T, Bihari-Varga M, Biro T. Thermoanalytical and histological study of intra-articular papain-induced degradation and repair of rabbit cartilage. I. Immature animals. Ann Rheum Dis 1974;33: Farkas T, Bihari-Varga M, Biro T. Thermoanalytical and histological study of intra-articular papain-induced degradation and repair of rabbit cartilage. II. Mature animals. Ann Rheum Dis 1976;35: Huang MH, Ding HJ, Chai CY, Huang YF, Yang RC. Effects of sonication on articular cartilage in experimental osteoarthritis. J Rheumatol 1997;24: Murray DG. Experimentally induced arthritis using intraarticular papain. Arthritis Rheum 1964;7: Yoshimi T, Kikuchi T, Obara T, Yamaguchi T, Sakakibara Y, Itoh H, et al. Effects of high-molecular-weight sodium hyaluronate on experimental osteoarthrosis induced by the resection of rabbit anterior cruciate ligament. Clin Orthop Relat Res 1994;(298): Wenz W, Breusch SJ, Graf J, Stratmann U. Ultrastructural findings after intraarticular application of hyaluronan in a canine model of arthropathy. J Orthop Res 2000;18: Abatangelo G, Botti P, Del Bue M, Gei G, Samson JC, Cortivo R, et al. Intraarticular sodium hyaluronate injections in the Pond-Nuki experimental model of osteoarthritis in dogs. I. Biochemical results. Clin Orthop Relat Res 1989; (241): Schiavinato A, Lini E, Guidolin D, Pezzoli G, Botti P, Martelli M, et al. Intraarticular sodium hyaluronate injections in the Pond-Nuki experimental model of osteoarthritis in dogs. II. Morphological findings. Clin Orthop Relat Res 1989;(241): Altman RD, Tenenbaum J, Latta L, Riskin W, Blanco LN, Howell DS. Biomechanical and biochemical properties of dog cartilage in experimentally induced osteoarthritis. Ann Rheum Dis 1984;43: Kikuchi T, Sakuta T, Yamaguchi T. Intra-articular injection of collagenase induces experimental osteoarthritis in mature

5 Murat ve ark. S çanlarda papainle oluflturulan osteoartritin Mankin skoru ile zamana ba l derecelendirilmesi 237 rabbits. Osteoarthritis Cartilage 1998;6: Havdrup T, Henricson A, Telhag H. Papain-induced mitosis of chondrocytes in adult joint cartilage: an experimental study in full-grown rabbits. Acta Orthop Scand 1982; 53: Yang F, Shi Z. A study on papain-induced osteoarthritis in rabbit temporomandibular joint. Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi 2002;20: [Abstract] 19. Lin YS, Huang MH, Chai CY. Effects of helium-neon laser on the mucopolysaccharide induction in experimental osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis Cartilage 2006;14: van der Sluijs JA, Geesink RG, van der Linden AJ, Bulstra SK, Kuyer R, Drukker J. The reliability of the Mankin score for osteoarthritis. J Orthop Res 1992;10: Mankin HJ, Dorfman H, Lippiello L, Zarins A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteoarthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. J Bone Joint Surg [Am] 1971; 53: