T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIBBİ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI BLASTOCYSTIS TÜRLERİNDE PİROSEKANS YÖNTEMİYLE ALTTÜR BELİRLENMESİ

Transkript

1 T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIBBİ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI BLASTOCYSTIS TÜRLERİNDE PİROSEKANS YÖNTEMİYLE ALTTÜR BELİRLENMESİ YÜKSEK LİSANS TEZİ Tuğçe Nil YANTIRA Danışman Öğretim Üyesi Doc. Dr. Funda DOĞRUMAN AL ANKARA Haziran-2013

2

3 T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIBBİ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI BLASTOCYSTIS TÜRLERİNDE PİROSEKANS YÖNTEMİYLE ALTTÜR BELİRLENMESİ YÜKSEK LİSANS TEZİ Tuğçe Nil YANTIRA Danışman Öğretim Üyesi Doc. Dr. Funda DOĞRUMAN AL Bu tez Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından /52 proje numarası ile desteklenmiştir. ANKARA Haziran-2013

4

5 İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay...I İçindekiler..II Resimler Listesi..V Şekiller Listesi...VII Tablolar Listesi...IX Semboller, Kısaltmalar..X 1. GİRİŞ GENEL BİLGİLER Blastocystis Tarihçesi Taksonomisi Morfolojisi Yaşam Döngüsü Epidemiyolojisi Patogenez İmmünolojik Özellikleri Klinik Tedavi Tanı Yöntemleri Mikroskobik Tanı Kültür İmmünolojik Tanı Moleküler Tanı II

6 3. GEREÇ VE YÖNTEM Örneklerin Toplanması Kullanılan Araç ve Gereçler Kullanılan Cihazlar Kullanılan Kimyasalar KullanılanTicari Kitler Yöntemler Direkt Mikroskobik İnceleme Solusyonlarının Hazırlanışı Kültür Solusyonunun Hazırlanışı Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) Ekstraksiyon DNA nın Çoğaltılması ve Gösterilmesi Elektroforez için kullanılan solüsyonlar Pirosekans İstatistiksel Analiz BULGULAR Blastocystis Mikroskobisi Nanodrop ile DNA Miktarı Ölçümü PZR Sonuçları Pirosekans Sonuçları TARTIŞMA SONUÇ ÖZET SUMMARY III

7 9. KAYNAKLAR EKLER ÖZGEÇMİŞ IV

8 Resimler Resim 1 : Trikrom boyamada Blastocystis protozoonları. (Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Parazitoloji Laboratuvarında çekilmiştir.) Resim 2 : Dizilemede forward (yeşil), rewerse (sarı) ve sekans primerine (mavi) ait olan ortak gen bölgeleri Resim 3: Pyromark Q24 vakum çalışma istasyonu (1) Resim 4: Çalkalama işleminin uygulandığı shaker Resim 5: Pyromark Q24 vakum çalışma istasyonu (2) Resim 6: Pyromark Q24 PCR probu Resim 7: Plaka tutucu Resim 8: Isı bloğu Resim 9: Pyromark Q24 Cihazı Resim 10: Pyromark Q24 Kartuş ve Dağılımı Resim 11: Pyromark Q24 Cihazına ait kartuş yerleşim konumu, dağıtım ünitesi Resim 12: Pyromark Q24 Cihazına Ait İşlem Haznesi Resim 13: Serum fizyolojikle hazırlanan direk mikroskobi preparatında Blastocystis protozoonu Resim 14: Lugol solüsyonu hazırlanan direk mikroskobi preparatında Blastocystis protozoonu Resim 15: Ringer s solüsyonunda üretilen Blastocystis protozoonunun kültür solüsyonundan yapılan direk mikroskobisindeki görünümü V

9 Resim 16: SB83 primeri kulanılarak yapılan Konvansiyonel PZR sonrası PK, T5, T6, T8, T17, T20, T37, T46, T109 örneklerine ait jel elektroforez görüntüsü ( subtip 1 ) M: moleküler ağırlık standartı (Marker) PK: pozitif kontrol Resim 17: SB340 primeri kulanılarak yapılan Konvansiyonel PZR sonrası PK, T7, T17, T34, T39, T41, T43, T54, T70, T71 örneklerine ait jel elektroforez görüntüsü ( subtip 2 ) M: moleküler ağırlık standartı (Marker) PK: pozitif kontrol Resim 18: SB227 primeri kulanılarak yapılan Konvansiyonel PZR sonrası PK, T12, T15, T25, T32, T89, T101, T117, T154, T179 örneklerine ait jel elektroforez görüntüsü ( subtip 3 ) M: moleküler ağırlık standartı (Marker) PK: pozitif kontrol Resim 19: SB82, SB227, SB340 primeri kulanılarak yapılan Konvansiyonel PZR sonrası mix subtip olarak saptanan T17 subtip 1 ve 2, T39 subtip 2 ve 3 ve T43 subtip 2 ve 3 olarak genotiplendirilen örneklere ait jel elektroforez görüntüsü M: moleküler ağırlık standartı (Marker) VI

10 Şekiller Şekil 1: Blastocystis yaşam döngüsü Şekil 2: Serbest kalan pirofosfatlar Şekil 3: Sülfiraz ve lusiferaz aktivitesi Şekil 4: Apiraz aktivitesi Şekil 5: T42 numaralı örneğe ait NanoDrop analiz ekranı görüntüsü Şekil 6 : Pyromark Q24 cihazına ait Pyromark analiz programının ekran görüntüsü Şekil 7: Pirosekans yöntemi ile düşük kalite olarak genotiplendirilmesi yapılan T32 nolu DNA örneğinin nükleotid dizilerinin gösterilmesi Şekil 8: Pirosekans yöntemi ile düşük kalitede olarak genotiplendirilmesi yapılan T148 nolu DNA örneğinin nükleotid dizilerinin gösterilmesi Şekil 9: Pirosekans yöntemi ile birebir dizayn edilen subtip 1 dizisi ile uyumlu olarak genotiplendirilmesi yapılan T1 nolu DNA örneğinin nükleotid dizilerinin gösterilmesi Şekil 10: Pirosekans yöntemi ile birebir dizayn edilen subtip 2 dizisi ile uyumlu olarak genotiplendirilmesi yapılan T7 nolu DNA örneğinin nükleotid dizilerinin gösterilmesi Şekil 11: Pirosekans yöntemi ile birebir dizayn edilen subtip 3 dizisi ile uyumlu olarak genotiplendirilmesi yapılan T117 nolu DNA örneğinin nükleotid dizilerinin gösterilmesi Şekil 12: Pyromark Q24 protokolüne göre kontrol edildiğinde birebir dizayn edilen subtip 1 dizisi ile uyumlu olarak genotiplendirilmesi yapılan T5 nolu DNA örneğinin nükleotid dizilerinin gösterilmesi VII

11 Şekil 13: Pyromark Q24 protokolüne göre kontrol edildiğinde birebir dizayn edilen subtip 2 dizisi ile uyumlu olarak genotiplendirilmesi yapılan T4 nolu DNA örneğinin nükleotid dizilerinin gösterilmesi Şekil 14: Pyromark Q24 protokolüne göre kontrol edildiğinde birebir dizayn edilen subtip 3 dizisi ile uyumlu olarak genotiplendirilmesi yapılan T168 nolu DNA örneğinin nükleotid dizilerinin gösterilmesi VIII

12 Tablolar Tablo 1: Konvansiyonel PZR sırasında kulanılan STS primerlerinin dizileri Tablo 2: PZR reaksiyon karışımı Tablo 3: STS amplifikasyonu için reaksiyon şartları Tablo 4: STS amplifikasyonu için reaksiyon şartları Tablo 5: Pirosekans Subtip Dizileri Tablo 6: 2x PyroMark PCR Master Mix içeren reaksiyon karışımı Tablo 7: PZR amplifikasyonu için reaksiyon şartları Tablo 8: Kullanılacak bağlanma tamponu, streptavidin, RNase-serbest su ve PCR ürün miktarları Tablo 9: Annealing Buffer ve Sekans Primeri Miktarları Tablo 10: Kappa Testi Değer Aralığı Tablo 11: Örneklerin ekstraksiyon sonrası DNA miktarları (ng/μl) Tablo12: Çalışmaya dahil edilen örneklerin PCR reaksiyonu sonrası Subtip dağılımı Tablo 13: Çalışmaya dahil edilen örneklerin pirosekans sonrası subtip dağılımı Tablo 14: Blastocystis örneklerinin Konvansiyonel PZR ve Pirosekans Sonuçları Tablo 15: Blastocystis saptanmasında iki farklı moleküler yöntem olan Pirosekans ve Konvansiyonel PZR nin uyumu IX

13 Semboller, Kısaltmalar DNA: Deoksiribonükleik Asit PZR: Polimeraz Zincir Reaksiyonu RFLP: Restriction Fragment Length Polimorphism B. hominis: Blastocystis hominis PBS: Phosphate Buffered Saline TRİS: Tris (Hydroxymethyl) Aminomethane EDTA: Etilen Diamin Tetra Asetik Asit TE: Tris, EDTA Buffer Rpm: Revolutions per minute TBE: Tris-Borate-EDTA Bp: Base Pair (baz çifti) ml: Mililitre µl: Mikrolitre dntp: Deoksiribonükleotid Trifosfat X

14 1. GİRİŞ Paraziter hastalıkların tüm dünyada yaklaşık dört milyar insanı etkilediği tahmin edilmektedir.¹ Bu hastalıklar, özellikle hijyen ve sanitasyonu, sosyoekonomik düzeyi, eğitim durumu ve yaşam standartları düşük olan toplumları ciddi şekilde tehdit etmektedir. 2 Yapılan çalışmalarda Blastocystis in sağlıklı bireylerde ve gastrointestinal semptomu olan hastalarda en sık görülen protozoon olduğu bildirilmiştir.³ Patojenik potansiyeli tartışmalı olmakla birlikte hem semptomatik hem de asemptomatik bireylerde varlığı tespit edilmişitir. 4 Blastocystis insanlarda ve hayvanlarda görülmekte olan bir bağırsak parazitidir. Gelişmiş ülkelere oranla gelişmekte olan ülkelerde %30-50 oranlarında yaygınlığa sahiptir. 5 Birçok durumda Blastocystis in tek başına patojen olduğu olgular bulunmaktadır. Tanısı genel olarak ışık mikroskobu ile yapılır. Boyutları değişen şekillerde avakuoler, vakuoler, granular, multivakuoler, ameboid ve kist formları mevcuttur. 6 Transmisyon elektron mikroskobisi özellikle çok yağ ve glikojen deposu olan atipik Blastocystis kistlerini ayırt etmede kullanılabilir. 7 Alt türe özgü tanı primerleri olan STS (sequence tagged site) primerlerinin Yoshikawa tarafında Blastocystis in alltür tayini için dizayn edilmesi araştırma yöntemlerinin ilerlemesine çok hızlı bir yön kazandırmıştır. 8 Diğer moleküler araştırma yöntemleri arasında RFLP, DNA dizi analizi, DNA barkoding, gerçek zamanlı PZR ve nested PZR bulunmaktadır. 9 1

15 Konvansiyonel PZR yönteminin çeşitli dezavantajlara sahip olması Blastocystis çalışmalarında da farklı yöntemlerin denenmesine olanak sağlamıştır. Son zamanlarda kullanımı iyice artan ve özellikle viral etkenlerin tanısında sık kullanılan pirosekans yöntemi birçok moleküler yöntemin aksine hızlı, zahmetsiz ve spesifik sonuçlar elde edilmesine olanak tanıyan bir DNA dizi analiz tekniğidir. 10 Bakteriyel ve fungal etkenlerin tanısında da sık kullanımı olan pirosekans yönteminin parazitolojik araştırmalarda kullanıldığı az sayıda çalışma mevcuttur yılında Stensvold ve ark. Blastocystis genotiplendirmesini pirosekans yöntemini kullanarak gerçekleştirdikleri bir çalışma bulunmaktadır. 12 Çalışmamızda son yıllarda rutin tanıda da kulanılmaya başlanmış olan ikinci jenerasyon DNA dizi analiz yöntemi olan pirosekans yönteminin Blastocystis protozoonunun alttür tayininin belirlenmesinde kullanımı amaçlanmıştır. Konvansiyonel PZR yönteminin kontaminasyon riski taşıyan emek yoğun ve zaman alıcı bir yöntemdir. Blastocystis in altürlerinin belirlenmesinde STS primerleri kullanılarak yapılan konvansiyonel PZR ile yedi alttür tayini yapılmaktadır. Çalışmamızda kültür (Ringer s solusyonu) ile elde edilen 60 Blastocystis izolatının STS primerleri kullanılarak konvansiyonel PZR ve pirosekans yöntemi ile alt türleri belirlenmiştir. Bu çalışma ülkemizde pirosekans yöntemiyle Blastocystis alttürlerinin belirlendiği ilk çalışma özelliğindedir. 2

16 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Blastocystis Blastocystis in patojen olduğunu söylemek için klinik belirtilere neden olabilecek başka bir protozoon, bakteri ve viral etken görülmemesi gerekmektedir. Bakteriyel ve viral ajanlar olmaksızın, fazla sayıda Blastocystis var ise bunun patojeniteden sorumlu olduğu düşünülmektedir. 13 Blastocystis uzun yıllar sınıflandırılamamış, kimi yazarlarca mantar, kimi yazarlarca protozoon sınıflamasına dahil edilmiş olan bir mikroorganizmadır. Ancak protozoon besiyerinde üremesi, mantar ve bakteri besiyerinde üreyememesi; protozoonlara etkili ilaçlara duyarlı olup, amphoterisine dirençli olması; hücre çeperinin protozoonlara benzeyip, yavaş hareket eden pseudopodlarının olması gibi nedenlerle bugün protozoon olarak kabul edilmektedir. 14 Blastocystis enfeksiyonu, fekal-oral yolla bulaşmaktadır; genellikle asemptomatiktir. Semptomatik olgularda ishal, karın ağrısı, kramp, bulantı, kusma, ateş, şişkinlik, gaz, kaşıntı, kilo kaybı, dışkıda lökosit, rektal kanama, eozinofili, anemi görülebilmektedir. Blastocystis gelişmekte olan ülkelerde yaşayanlarda gelişmiş ülkelere oranla daha sık görülmektedir. 14 Son yıllarda yapılan çalışmalar ile bulaş yolları aydınlatılmıştır. İnsan-insan, hayvan-hayvan, insan-hayvan, hayvaninsan geçişleri moleküler yöntemler kullanılarak gösterilmiştir. Hayvan bakıcılarında %41 gibi yüksek oranlarda belirlenmesi Blastocystis türlerinin aynı zamanda zoonotik özellik taşıdığını göstermiştir. 15 3

17 Henüz insan ve diğer canlılarda Blastocystis in neden olduğu hastalık tablosu tam olarak tanımlanmamıştır. Gastrointestinal hastalıklarda ancak diğer infeksiyöz ve noninfeksiyöz nedenlerin eliminasyonu yapıldıktan sonra etken olarak sorumlu tutulabileceği belirtilmiştir. Fakat tümüyle diğer etkenlerin araştırılıp belirlenmesinin güç olması nedeniyle bu yaklaşım üzerinde tartışmalar sürmektedir Tarihçesi Sınıflandırması, yaşam döngüsü, biyolojik özellikleri, epidemiyolojisi, özellikle de patojenitesi açısından birçok bilinmezlik içeren, araştırmalar sonucunda farklı ve karşıt görüşlerin ortaya konulduğu Blastocystis, ilk defa 1911 yılında Alexeieff tarafından maya mantarı olarak tanımlanarak Blastocystis enterocola olarak isimlendirilmiştir. 16 Brumpt, 1912 yılında farklı konaklarda Blastocystis in farklı türlerinin olduğunu belirtmiş ve insanlardan izole edilen türüne günümüzde de geçerliliğini koruyan Blastocystis hominis (B.hominis) denilmesini önermiştir. 17 Taze dışkıda görülen Blastocystis nükleuslarının belirlenememesi, mantar görünümünde olması, ısıtılmadan psödopodların görülememesi, boyutlarındaki değişkenliğin herhangi bir protozoondan beklenenden çok daha geniş sınırlarda olması, tomurcuklanma ile üremesi nedeniyle önce mantar olarak düşünülmüştür. Özellikle tropikal ve subtropikal ülkelerde daha sık olarak rastlanılmakta tüm dünyada yaygın olarak bulunmaktadır. 18,19 Blastocystis hakkında 1967 yılında Zierdt in bu patojenin çeşitli formları olduğunu tanımlanmıştır. Günümüze kadar olan süreçte, 4

18 Blastocystis in insanlarda patojen olduğuna dair oldukça fazla sayıda araştırma yayınlanmıştır Taksonomisi B.hominis, Zierdt tarafından 1988 de protozoon olarak tanımlanmış ve Sarcodina subfilumunda sınıflandırılmıştır. Blastocystis mantar ve bakteri besiyerinde üreyememesine karşın barsak protozoonları için hazırlanan besiyerlerinde üremektedir. Kültürde ürerken bakterilere gereksinim duyması, aksenik olarak güç üremesi, 33 C altında çoğalamaması, 30 C altında ölmesi, amfoterisine dirençli, protozoonlara etkili ilaçlara karşı duyarlı olması protozoonlara daha yakın olduğu izlenimi vermektedir. Ayrıca hücre çeperinin protozoonlarınkine benzemesi, endodiyogeni ile çoğalması, yavaş hareket eden pseudopodlarının olması, önceden vakuol, bugün ise santral cisim olarak adlandırılan üreme organelinin varlığı nedeniyle protozoonlar içerisinde olması gerektiği ileri sürülmüştür. 20 Sınıflandırması tartışılan B.hominis, yapılan moleküler çalışmalar sonucunda 1996 yılında Silberman ve ark. nın B.hominis SSUrRNA sının sekanslanmasını gerçekleştirmeleri ile heterojen, tek ve çok hücreli protistaların (kahverengi algler, diatomlar, krizofitler, su küfleri gibi) yer aldığı Stramenopile grubunun içerisinde protozoon olarak tanımlanmıştır. Son olarak da Cavalier-Smith 1998 de Stramenopile in Chromista aleminin altındaki Heterokonta bölümüyle (infrakingdom) identik olduğunu belirterek B.hominis in Heterokontid Chromista olduğunu ifade etmiştir. Sarcomastigophora sınıfında, Blastocystea takımında Blastocystidae ailesinde Blastocystis cinsi ve hominis türü olarak tanımlanmaktadır. 5

19 Günümüzde Blastocystis alttürleri insan ve hayvanlarda da enfeksiyona neden olmaktadır. Bu sebeple isimlendirmesinde Blastocystis sp. kullanılmaktadır Morfolojisi Kültür ve direkt dışkı incelemelerinde Blastocystis in farklı morfolojik tipleri görülebilmektedir. Morfolojik formların nitelik ve patojenite ile ilişkisi henüz bilinmemektedir. Dışkı örneklerinde en sık olarak sırasıyla vakuoler, granüler, multivakuoler ve kist formunun görüldüğü bildirilmiştir. Ameboid form çok nadir olarak bildirilmiştir. Avakuoler formun insan bağırsağında bulunduğu düşünülmektedir. Kültürde vakuoler ve granüler formun baskın olduğu, kültür ortamındaki değişikliklerin hangi türün görüleceğini belirlenmesini sağlayabileceği düşünülmektedir. 20,22 Elektron mikroskobik incelemelerde, Blastocystis in tüm formlarında nükleusta elektron opak materyalin, nükleus kenarında kresentrik bant görünümünde yer aldığı tespit edilmiştir. Bu morfolojik görüntünün hücre döngüsünün evrelerinden veya fizyolojik koşullardan bağımsız olduğu da gözlenmiştir. Blastocystis in sitoplazmasında mitokondri benzeri organellerin farklı sayıda ve morfolojide olduğu, ayrıca diğer ökaryotik hücre yapıları olan golgi kompleks, endoplazmik retikulum, poliribozomların da görüldüğü belirtilmiştir Vakuoler form (Santral cisim): Tipik Blastocystis formu olup rutin tanıda ışık mikroskobunda aranan ve tanınan formdur. Kültürde de en sık bu form görülmektedir. Daha çok yuvarlak veya hafif düzensiz çeperli olup boyutları da farklı çaplarda olabilmektedir (2-200 μm). Dışkı örneklerinde yaklaşık olarak ortalama 4-15 μm boyutunda görülmekte, daha geniş çaplar kültürde bulunabilmektedir. 22,24 6

20 2. Granüler form: Morfolojik olarak vakuoler form ile benzer özellik taşımakla birlikte santral vakuol içeriği farklılık göstermektedir. Boyutları 6,5-80 μm arasında değişmektedir. 20 Granuler form, vakuoler forma benzer. Ancak morfolojik ve sitokimyasal olarak değişik merkezi vakuol içeriğine sahiptir Multivakouler form: Dışkı materyalinden alınan formda, kültürden gelen formdaki tek büyük vakuol yerine çok sayıda, değişik büyüklük ve morfolojide vakuoller bulunabilmektedir. 26,27 Özellikle taze dışkı örneklerinde görüldüğü belirtilmiştir. Boyutları 5-8 μm olup sitoplazmasında çok sayıda küçük vakuoller içerdiği bildirilmiştir. Kültür ortamında vakouler veya granüler forma dönüşebilmektedir. 20,24 4. Avakuoler form: Oldukça nadir rastlanan bir form olarak bilinmektedir. Boyutu 5 μm civarında olup yüzey örtüsü ve vakuolü yoktur. 24 Avakuoler formlarda organel matrikse uzanan sayısız krista bulunmaktadır. Kültür formlarda bu yapılar oldukça az sayıdadır ve kısa tübüler veya kesecik şeklindedirler. Avakuoler formlarda mitokondri benzeri organeller diğer formlardakilere göre daha az elektron opaktır. Bu farklılıkların anlamı henüz bilinmemektedir. 26,27 5. Kist formu: Blastocystis in kist benzeri formu ilk kez Melhorn tarafından AIDS li bir hastanın dışkısında bulunmuştur. 28 Kist / kistik / dirençli form da denilmektedir. Blastocystis in kist formu kültürdeki vakuoler ve granuler formlardan ve genelde taze dışkı örneklerindeki multivakuoler formlardan küçüktür. 29 Kalın çok katmanlı bir duvar organizmayı çevreler. Boyutu 3-10 μm olup sıklıkla da 5 μm den küçük olarak görülmekte ve ışık mikroskobu ile tanımlanmasının zor olduğu 7

21 bildirilmektedir. Sitoplazmasında içeriği glikojen ve lipid olan çok sayıda vakuol içermektedir. 22,24 6. Amoeboid form: Santral vakuol yoktur ve hücre merkezine yakın bir veya iki nükleus vardır. Hücreler Blastocystis in diğer formlarında görünen morfolojik özelliklerin çok azını taşımaktadır. 30 Amoeboid / amoebiform denilen bu formun boyutu 3 8 μm olup psödopodlar yaparak bakteriler ile beslendiği ileri sürülmektedir. 20,22, Yaşam Döngüsü Çeşitli yaşam döngüleri ileri sürülmüş fakat hiçbiri in vivo ve in vitro olarak doğrulanamamıştır. Işık ve elektron mikroskobunda en iyi gösterilmiş üreme şekli (özellikle kist formunda) binary füzyon/ikiye bölünmedir. Vakuoler formun multivakuoler formdan, vakuollerin genişlemesi veya birleşmesiyle oluştuğu gösterilmiştir. Granüler formun kültür ortamında ortam koşullarının değişmesiyle vakuoler formdan oluştuğu gösterilmiştir. 8

22 Şekil 1: Blastocystis yaşam döngüsü. 31 Blastocystis in infektif formunun kist formu olduğu düşünülmekte ve oral yolla alınan kistlerin bağırsakta ekskiste olarak enfeksiyonun oluştuğu belirtilmektedir. Yaygın olarak kabul gören yaşam döngüsünde iki farklı kist yapısının olduğu, ince duvarlı kist yapısının otoenfeksiyondan, kalın duvarlı kist yapısının ise dışkı ile dışarı atılarak su ve besinlerin kontaminasyonundan sorumlu olduğu belirtilmektedir. Vakuoler form bağırsaklarda ya multivakuoler forma dönüşerek prekist formu oluşturup şizogoni ile ince duvarlı kist yapısının oluşumuna ya da amoeboid forma dönüşüp prekist oluştuktan sonra şizogoni ile kalın duvarlı kistlerin meydana gelerek dışkı ile atılmalarıyla sonuçlanan yaşam döngüsünde yer almaktadır. 27,32 9

23 İnsan vücudunun Blastocystis in kist duvarını eritebilecek enzimleri vardır ve mide asidi veya barsak enzimleri olmadan da kist duvarı çözülüp yavru hücreler serbestleşebilir. Kist formundaki sitoplazmik görünüm bağırsaklarda bulunan avakuoler formunkine benzer. Kistler taze dışkı materyalinden çok, beklemiş dışkı materyallerinde görülür. Bu bulgu, kist formunun oluşumunun, konaktan çevre koşullarına geçişe verilen bir yanıt olabileceğini göstermektedir Epidemiyolojisi Fekal-oral yolla bulaşan Blastocystis tüm dünyada, özellikle tropikal ve subtropikal bölgelerdeki ülkelerde, gelişmekte olan ülkeler ve hijyen koşullarının düşük olduğu toplumlarda % 50 ye varan oranlarda, gelişmiş ülkeler ve hijyen koşullarının iyi olduğu toplumlarda yaklaşık % 10 oranında saptandığı bildirilmektedir. Yapılan çalışmalarda gastrointestinal semptomu olan hastalarda ve sağlıklı bireylerde en sık görülen protozoon olduğu bildirilmiştir. 34 Tüm dünyada görülen bir parazit olup özellikle tropikal ve subtropikal bölgelerde daha sıktır. Prevalansı gelişmiş ülkelerde % 1,5 ile % 10, gelişmekte olan ülkelerde ise % 30 ile % 50 arasında değişmektedir. 35 Son yıllarda prevalans çalışmaları önemli bir artış göstermiş, Bu çalışmalarda, Blastocystis in genotip dağılımına ışık tutmuştur. 3 Ülkeden ülkeye ve aynı ülkenin farklı bölgelerinde prevalansı değişmektedir. Hayvanlar ve insanlarda kötü hijyen koşulları, kontamine yiyecek veya su ve tüketimine bağlı olarak görülme sıklığı artmaktadır

24 Blastocystis alttür dağılımı Türkiye'de, diğer ülkelerde görülen alttürlerine büyük bir benzerlik taşımaktadır. Özyurt ve ark. çalışmasına göre prevalansı daha önce yapılmış mevcut çalışmalarla benzerlik göstermektedir. İnsanda Blastocystis enfeksiyonlarından özellikle subtip 3 ün, ayrıca subtip 1, 2 ve 4 ün de izole edildiği tespit edilmiştir. Subtip 5-9 un insanlarda enfeksiyona nadiren neden olduğu gösterilmiştir. 37 Kaya ve ark.'nın yaptıkları bir başka çalışmada; Blastocystis ile birlikte bağırsak semptomlarının sıklıkla görüldüğü, olası diğer etkenlerin elimine edilmesi durumunda Blastocystis in de patojenite açısından değerlendirilmesinin yararlı olacağı bildirilmiştir. 38 İnceboz ve ark; İzmir bölgesinde gastrointestinal şikayetler ile hastaneye başvuran çocukların %15,5 inde Blastocystis saptamıştır. 39 İrritabl bağırsak sendromu (IBS) olan hastaların (150 olgu) % 32 sinde mikroskobik inceleme, % 46 sında ise kültürle Blastocystis saptanmış, IBS lu olmayan ishalli kontrol grubunda ise bu oran % 7 olarak belirlenmiştir. Blastocystis in IBS etyolojisinde rol oynayabileceği hipotezi ortaya çıkmıştır. 4 Türkiye de Blastocystis prevalansı % 1,4 -% 44,3 arasında bildirilmektedir. Çalışmalar incelendiğinde bazı araştırıcıların X40 objektifle incelenen mikroskop sahasında beş ve daha fazla sayıda Blastocystis i bildirdikleri, bazılarının ise sayıyı dikkate almadan bildirim yapmaları prevalansın geniş sınırlarda yer almasının sebebi olarak görülmektedir. 40,41 11

25 2.7. Patogenez 1967 yılında, Zierdt ve ark. Blastocystis in bir protozoon olduğunu kanıtlamasından günümüze kadar Blastocystis in insanlarda potansiyel patojen olduğunu bildiren bir çok çalışma yayınlanmıştır. 17,42 Blastocystis türlerinde antijenik ve genetik olarak heterojenitenin gözlenmesi, virulan ve avirulan kökenlerin olabileceğini düşündürmekte ve farklı Blastocystis türlerinin insanda enfeksiyon yapabileceğini olası kılmaktadır. Farklı serotiplerin, patojenik olarak farklı düzeylerde etkili olabileceği görüşü de mevcuttur. 42,43,44 Zuckerman ve ark. radyoaktif bir belirteç kullanarak yaptıkları araştırmada, Blastocystis enfeksiyonu olan hastalarda bağırsak geçirgenliğinin bozulduğunu göstermiştir. 45 Henüz insan ve diğer canlılarda Blastocystis in neden olduğu hastalık tablosu tam olarak tanımlanmamıştır. Gastrointestinal hastalıklarda ancak diğer infeksiyöz ve noninfeksiyöz nedenlerin eliminasyonu yapıldıktan sonra etken olarak sorumlu tutulabileceği belirtilmiştir. Fakat tümüyle diğer etkenlerin araştırılıp belirlenmesinin güç olması nedeniyle bu yaklaşım üzerinde tartışmalar sürmektedir. Yeterli sayıda olgu-kontrol çalışmalarının yapılmamış olması olguların seçimi ve sonuçların yorumundaki zorluğa neden olmaktadır. Bazı araştırıcılar Blastocystis in patojen olmadığını, semptomatik olgularda saptanmasının bu protozoonu sorumlu kılmaya yetmediğini, oluşan semptomların eşlik eden patojenlerle ya da nonenfeksiyöz nedenlerle ilişkili olduğunu öne sürmüşlerdir

26 Blastocystis enfeksiyonu olan insanlarda, serum IgG yanıtı saptanmamıştır. Kist formun dış katmanına karşı IgG2 yanıtı geliştiği ve irritabl kolon sendromlu hastalarda bu yanıtın daha şiddetli olduğunu bildirmiştir. 7 Long ve ark. yaptığı çalışmada Blastocystis in IL-8 ve granulosit-makrofaj koloni sitimülasyon faktörlerinde 24 saat sonunda artışa neden olduğu gösterilmiştir. Ayrıca Blastocystis in enfeksiyonun başlangıç aşamasında konağın bağışıklığını düşürerek diğer fırsatçı patojenlerin konakta enfeksiyona sebep olmasını kolaylaştırdığı gözlemlenmiştir. 46 Blastocystis in patojenitesini ve virülans faktörlerini belirlemeye yönelik yapılan çalışmalarda, parazitin belirli hücre dizilerinde (HT-29 kolon epitel hücre dizisi) sitopatik etki yapabildiği ve yine bu hücrelerden proinflamatuvar bir sitokin olan IL-8 ve GM-CSF üretimini indüklediği belirlenmiştir. 47,48 Çeşitli sayıda çalışma Blastocystis in patojenik belirsizliğinin olduğunu göstermektedir. Ayrıca Blastocystis in konaktaki yoğunluğu ve farklı alttürlerin patojenik etkisini konağa bağlı olduğunu gösteren çalışmalar da mevcuttur. Blastocystis immün sistemi baskılanmış olan HIV li hastalarda tedavi edilmesi açısından klinik öneme sahiptir İmmünolojik Özellikleri Araştırıcılar koruyucu immüniteye bağlı olarak bazı hastalarda kendini sınırlayan Blastocystis enfeksiyonu olduğunu ileri sürmüşlerdir. Geç çocukluk ve erişkinlik dönemlerinde enfeksiyon hızının düşük olması daha önce geçirilen enfeksiyon ile immün yanıtın aktive 13

27 edildiğini göstermektedir. Bazı çalışmalarda ise erişkinlerde yüksek enfeksiyon hızı saptanmıştır. Toplumda Blastocystis e karşı kazanılmış koruyucu bağışıklık ve doğuştan bağışıklık ile ilgili bilgiler sınırlıdır. 50 Antikor yanıtının olmadığını savunan görüşlerin yanında IBS olan ve Blastocystis enfeksiyonu saptanan hastalarda IgG2 subtipinin kontrol grubuna göre daha yüksek olduğu gösterilmiştir. Bu antikorun, lenfosit ve makrofajlara sunulmak üzere bağırsaklardaki Peyer plaklarında bulunan M hücreleri tarafından taşınan, parazitin yüzey çeperindeki yapılara karşı oluştuğu ileri sürülmüştür. 51 Blastocystis enfeksiyonlarına konak yanıtının araştırılmasında uygun hayvan modeli geliştirilmesinin büyük yarar sağlayacağı belirtilmiştir. 22 Ratların Blastocystis enfeksiyonuna daha duyarlı oldukları, fare, hamster ve tavşanın ise uygun model olmadığı gösterilmiştir. 52,53 Blastocystis in yüzey çeperindeki karbonhidrat epitoplarına karşı spesifik IgM tipinde monoklonal antikor yanıtı oluştuğu yapılan araştırmalarda gösterilmiştir. Bu monoklonal antikorlardan bir kısmının B.hominis in yüzey çeperindeki epitoplara spesifik iken, bir kısmının santral cisme bağlanarak aynı zamanda başka Blastocystis kökenleri ile de çarpraz reaksiyon verdiği tespit edilmiştir. Bu durumda yüzey çeperindeki antijenik yapıların türe spesifik, santral vakuoldeki yapıların ise cinse spesifik olduğu görüşü ileri sürülmüştür. Enfekte hastalarda esas immun yanıtın yüzey çeperi karbonhidratlarına karşı olduğu ve yüzey çeperinin Blastocystis paraziti için immünolojik yanıta karşı bir bariyer görevi yaptığı da bildirilmiştir. 54,55 14

28 Blastocystis e karşı sitotoksik özellik taşımayan bu mab yanıtının yanında, sitotoksik özellik taşıyan ve spesifik olarak 30kDa plazma membranı ilişkili proteine bağlanan sitotoksik mab (ID5) ile ilgili yapılan araştırmada ID5 epitopunun tür ve izolat spesifik olduğu belirlenmiştir. Blastocystis in bu sitotoksik mab ile yapılan uzun süreli kültürlerinde, bazı kökenlerde sitotoksik etkinin meydana gelmediği gösterilmiştir. Bu durum 30 kda proteininin tüm izolatlarda olmaması nedeniyle fonksiyonel öneme sahip olduğu ve kökenlerin ID5 duyarlı ve dirençli olarak ayrılabileceği şeklinde açıklanmıştır. 44,56,57 Blastocystis in hücre yüzeyinde bulunan karbonhidrat yapısındaki antijenlerin, antikor oluşumunu sağladığı belirlenmiştir. Henüz antijen yapıları konusunda bilgiler yetersiz olup, subtipler arasında ortak antijenlerin ve subtiplere özgü antijenik yapıların tespit edilmesine yönelik çalışmalar, özellikle serolojik tanı araçlarının geliştirilmesinde ve tedavi yaklaşımlarının belirlenmesinde büyük yarar sağlayacaktır Klinik Klinik olarak, sulu diyare, karın ağrısı, karında şişkinlik hissi, gaz yakınmaları, mide bulantısı, kabızlık, iştahsızlık, kilo kaybı, fekal lökosit, rektal kanama, anemi, kaşıntı, kanda % 4-12 oranında eozinofili görülebilmektedir. Blastocystis saptanan hastalarda rektal kanama, anemi ve inflamatuar semptomlar, düşük hemoglobin ve hematokrit değerlerine yol açmaktadır. 13,58 Akut gastroenterit olgularında, örnekler Trikrom boyası ile boyandığında % den % 60 a varan oranlarda Blastocystis görüldüğü bildirilmiştir

29 Blastocystis e bağlı olduğu düşünülen enfeksiyonlarda semptomlar kendisine özgü değildir. En sık görülen belirtiler arasında ishal, abdominal ağrı ve kramplar, rahatsızlık hissi ve bulantı yer almaktadır. Akut olgularda fazla miktarda su gibi ishal tarif edilmiştir. İştahsızlık, yorgunluk ve gaz gibi diğer şikayetler de gözlemlenmiştir. 59 Bazı olgularda ateş, rektal kanama, eozinofili, hepatomegali ve splenomegali, deri döküntüleri ve kaşıntıya rastlandığı bildirilmektedir. 60 Semptomsuz enfeksiyonların tahmin edilenden daha fazla olduğu düşünülmektedir. Çünkü tanıda Blastocystis in tüm formlarına bakılmamakta ve bazı araştırmalarda tanı kriteri olarak X40 büyütme ile her sahada 5 ve üstü sayıda Blastocystis formlarının varlığı enfeksiyon olarak kabul edilmektedir Tedavi Blastocystis tedavisinde tercih edilecek seçenekler metronidazol ve nitroimidazoller, mümkün olan ülkelerde ise iyodokinolondur. Tedavi başarısız olursa daha ileri tedavinin seçimi ampiriktir.ko-trimoksazol, trimetoprim-sülfametaksazol veya aminoglikozid, paromomisin ikinci tedavi seçeneği olarak en uygun seçimdir. Kemoterapi, semptomu olmayan hafif veya geçici semptomları olan hastalar için önerilmez. 36,62 Tedavide çok etkili veya orta düzeyde etkili furazolidon, kinakrin, ornidazol, tinidazol ve ketokonazol gibi ilaçlar da bildirilmiştir. 63,64 Tedavi edilmeyen Blastocystis olgularında insan gastrointestinal sisteminde birkaç haftadan birkaç yıla kadar kaldığını bildiren raporlar mevcuttur

30 2.11. Tanı Yöntemleri Diğer klinik laboratuvarların aksine, klinik parazitoloji laboratuarlarında bireysel değişiklikler ve kişisel değerlendirmeleri de içeren bir çok manuel test kullanılmaktadır. Geleneksel tanı yöntemlerinde deneyimli personel ve zaman önemli bir faktördür. Tanıda en çok kullanılan metod ışık mikroskobisinde incelemedir. 66 Enfeksiyonun tanısında rutin dışkı muayenesinin dışında; nativ-lugol, çoklaştırma yöntemi, Blastocystis kültürü, trikrom boyama yöntemi, modifiye Ziehl-Neelsen boya metodu kullanılmaktadır. Ayrıca immünolojik yöntemlerde indirek immun floresan antikor (İFA) ve ELİSA yöntemleri antikor belirlemede kullanılmıştır. 67 Blastocystis in tanısı halen mikroskobi ve daha hassas olan kültür yöntemine dayanmaktadır Mikroskobik Tanı Tanıda en çok kullanılan metod ışık mikroskobisinde incelemedir. Bu aşamada yapılan nativ-lugol inceleme kolay olup en sık kullanılan yöntemdir. Boyalı preparat incelemesinin özellikle de trikrom boyama yöntemi ile hazırlanan preparat incelemesinin çok değerli olduğu belirtilmektedir. Ayrıca hematoksilen, Gram, Giemsa, Wright boyama yöntemlerinin de başarılı olduğu tespit edilmiştir

31 Resim 1 : Trikrom boyamada Blastocystis protozoonları. (Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Parazitoloji Laboratuvarında çekilmiştir.) Işık mikroskobisinde 3-20 μm boyutlarında tek vakuollü ve bu vakolü çevreleyen dar sitoplazma içerisinde görülen 4 ila 6 noktasal yapı ve en dışta kalın bir duvar yapısı tipik görünümü oluşturmaktadır. Trikrom boyamada ise nativ-lugol inceleme ile gözden kaçan formlar görülebilir. Küçük kırmızı boyanan nükleus ve mitokondri benzeri organeller, kırmızı veya yeşil boyanan vakuol ile özellikle kist formunda, yeşil boyanan kalın hücre duvarı görülebilir. Vakuolün içeriğine göre boyanma değişikliği gösterdiği bildirilmiştir. 24,69 Dışkı mikroskobisinde nadir, az sayıda orta yoğunlukta çok sayıda gibi kantitasyonun yapılması ve olgulardan farklı zamanlarda en az üç kez örnek alınarak incelenmesi, bu arada olguların diğer paraziter, bakteriyel ve viral etkenler açısından da değerlendirilmelerinin gerektiği belirtilmektedir. 69 Blastocystis tanısı genellikle ışık mikroskobu ile özellikle vakuollü formunun görülmesiyle kolayca konur. Tanı koyarken 18

32 lökositlerden, Cryptosporidium spp. ve özellikle Entamoeba histolytica, Entamoeba hartmanii ve Endolimax nana gibi diğer protozoon kistlerinden ayırt edilmelidir. Distile su ve diğer protozoonlar için kullanılan konsantrasyon metodları, Blastocystis' in vakuollü, granuler ve multivakuollü formlarını parçaladığı için, bunun yerine izotonik tuzlu su kullanılmalıdır Kültür Kültür yapılmadan önce konsantrasyon metodlarının uygulanması, bazı araştırıcılar tarafından, hücrelerin parçalanmasına neden olduğu gerekçesiyle önerilmemekle birlikte bazı araştırıcılar konsantrasyon metodu ile başarılı olduklarını belirtmişlerdir. 22,69,71,72 Bazı çalışmalarda kültürün mikroskobik incelemeye üstünlüğü gösterilmekle birlikte çok sayıda Blastocystis var ise kültürün başarılı olabileceği, bunun da mikroskobik inceleme ile tanınacağını belirten görüşlerde mevcuttur. 5,71,72 Kültürde Blastocystis in üremesi için anaerobik ortam ve 37 C lik ısı sağlanmalıdır. Boeck ve Drbohlav ın yoğunlaştırılmış yumurtalı besiyeri, Dobell and Laidlaw besiyeri (ringer solüsyonu +%20 insan serumu+streptomisin sülfat), Diamond s triptikaz serum monofazik besiyeri, Minimal essential medium (MEM)+%10 at serumlu, Iscove s modified Dulbecco s medium +%10 at serumu ve Ringer s solusyonu kullanılan kültürler arasında belirtilmektedir. 16 Araştırıcılar, bir çok rutin laboratuarında kullanılan direkt dışkı inceleme metoduna göre kültür metodunun daha özgül olduğunu saptamışlardır

33 İmmünolojik Tanı Klinik tanıya yönelik uygun antikor ve immünolojik testler bulunmamaktadır. Fakat araştırma amaçlı indirekt immünfloresan antikor (IFA) ve ELISA yöntemleri Blastocystis antikor belirlemede kullanılmıştır. 74 Blastocystis ile enfekte semptomatik ve asemptomatik olgular ile sağlıklı kontrol grubundaki olguların ELISA yöntemiyle serum ve dışkılarında anti- Blastocystis IgA ve serum IgG düzeyleri ile serum ve dışkıda Blastocystis antijenlerinin araştırıldığı çalışmada, semptomatik Blastocystis enfeksiyonu olan olgulardaki tüm antikor düzeyleri kontrollerden yüksek saptanmış olup, özellikle sekretuvar IgA nın humoral IgA dan daha yüksek düzeyde tespit edildiği belirtilmiştir. Dışkı ve serumda, spesifik antijenlerden, dışkıdaki daha yüksek olmak üzere, her iki antijen düzeyinin kontrollerden daha yüksek tespit edildiği belirlenmiştir. Kontrol olgularında antikor yanıtı ve antijen saptanmamıştır. 75 İnvaziv yöntemler olan endoskopi ve kolonoskopi ile tanımlanan olgular mevcuttur. Moleküler yöntemler ise araştırma amaçlı kullanılmaktadır Moleküler Tanı Blastocystis in moleküler analizinde PZR, nested PZR, dideoksi sekanslama, RFLP, pirosekans yöntemleri kullanılmaktadır. 23 Son yıllarda farklı mikroorganizmalar için kullanılmaya başlanmış olan pirosekans yönteminin Blastocystis genotiplendirmesinde kullanımına yönelik sadece bir çalışma mevcuttur

34 Blastocystis in alttürlerini moleküler teknikler kulanmadan birbirlerinden morfolojik olarak ayırt etmek imkansızdır. 76 Konvansiyonel PZR nin doğrudan dışkı örneklerinde Blastocystis in tespitinde oldukça duyarsız olduğu, bu nedenle, moleküler analizini kolaylaştırmak için in vitro çoğaltma yöntemi hala yaygın olarak kullanılmaktadır. 77,78 Yoshikawa ve arkadaşları tarafından geliştirilen sequencedtagged site (STS) primerleri ile insan dışkısından izole edilen Blastocystis türlerinden güvenilir bir şekilde yedi farklı alttüre ayırt edilebilmektedir. 79 Blastocystis alttür tayini için bu bölgeyi taramak amacıyla STS primerlerini geliştirerek, yedi farklı alttür tanımlanmasını olanak sağlamışlardır. 23 Sequence-tagged site (STS); genomda tek kopya olarak bulunan kısa dizidir. STS içinde tekrarlayan diziler olmakla birlikte, her iki uç bölge iyi korunmuş benzersiz (unique) diziler taşır. Bu bölgeye yönelik primer geliştirilebilmesi için ilgili bölgenin (SSUrDNA) DNA dizi analizine gereksinim duyulur. Aynı tür içindeki farklı üyelerin veya yakın ilişkili türlerin çalışılması için iyi bir genetik araçtır. 80 SSU-rDNA PCR-RFLP (riboprinting) analizi Blastocystis alttür tayininde tanıda hızlı, ucuz ve yaygın kullanılan diğer bir yöntemdir. Fakat PZR ürünleri farklı restriksiyon endonükleazlar kullanarak farklı primerlerle amplifiye edildiğinde farklı yöntemlerin kullanıldığı çalışmalarla karşılaştırılması zordur. Ribodemlerin ortaya çıkarılmasında sadece iki veya üç enzimin kullanılması, aynı paterni gösteren ama farklı genetik sekanslara sahip izolatların tanımlanmasını güçleştirmektedir. 81 DNA barkoding yöntemi ile Blastocystis SSU rdna sının 5 ucundaki yaklaşık 600 bç lik bölgenin dizi analizi, subtiplendirmede yararlı olabileceği saptanmıştır

35 RFLP yöntemi dideoksi sekanslama ve intragenik bölgelerin ard arda PCR ına dayalı bir yöntemdir. PCR-RFLP analiz yöntemi Blastocystis ssrrna gen bölgesinin dayalı olarak oluşturulmuştur ve amplifikasyondaki primerler arasında çeşitlilikler tanımlanmamıştır. 23 Polimeraz Zincir Reaksiyonu 1985 yılında Kary Mullis tarafından ilk kez bilim dünyasına sunulmuş olup, günümüzde modern bilime önemli katkılar sağlamıştır. Bu yöntem moleküler teknolojideki önemli gelişmelerden biridir. PCR bakteri virüs mantar parazit ve protozoon gibi etkenlere ait hedef nükleik asit zincirlerinin ve primer adı verilen spesifik komplementer oligonükleotitler ve ısıya dayanıklı polimeraz enzimleri (Taq) kullanarak in vitro olarak çoğaltılmasını sağlayan oldukça özgün güvenilir bir moleküler tekniktir. 83,8 Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR), in vitro koşullarında DNA dizilerinin çoğaltılması esasına dayanmaktadır. PZR; basit, spesifik ve hassas bir tekniktir. 85,86 Etken DNA sının belirli bir bölgesinin nükleotid dizilerinin saptanmasında; Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR), Jel elektroforezi kullanılarak gerçekleştirilir. PZR tekniği, temelde üç aşamadan oluşmaktadır; DNA Zincirinin Açılması (Denaturation) Kalıp DNA (template DNA), 92-95⁰C de 1-2 dakika tutularak çift sarmal yapıdaki DNA iplikçikleri birbirlerinden ayrılmaktadır. DNA 22

36 zincirini ayırmak için, bazı durumlarda 5-10 dakika ön ısıtma yapmak gerekebilir. 88 Primerlerin Açılan DNA Zincirlerine Yapışması (Annealing) Reaksiyon sıcaklığının, 37-65⁰C ye düşürülerek oligonükleotid primerlerinin açılan DNA zincirlerinin kendi baz dizilerine karşılık gelen bölgeye yapışması işlemidir. Bu işlem, üretilecek baz uzunluğuna bağlı olarak saniyede gerçekleşmektedir. 87 Primer Uzaması (Primer Extesion) DNA zincirleri üzerine yapışan primerlerin DNA polimeraz enzimi (Taq DNA polymerase) vasıtasıyla uzatılmasıdır. Taq DNA polymerase 72 o C sıcaklıkta daha iyi çalıştığı için genel olarak tüm çoğaltma işlemleri bu sıcaklıkta yapılmaktadır. 84 PZR sonucunda elde edilen ürün, çoğaltılması hedeflenen DNA parçası ile iki primerin toplam uzunluğu kadardır. Üç basamaktan (denaturation, annealing, primer extension) oluşan işlem, bir PZR devrini temsil eder. Bu işlem, genel olarak 25 ile 40 defa tekrar edilerek başlangıçtaki DNA dizisinden milyonlarca yeni DNA parçacığı çoğaltılır. PZR sonucunda elde edilen DNA parçacıkları agaroz veya poliakrilamit jellerde yürütüldükten sonra, etidyum bromid (EtBr) ile gözlemlenir. 88 Konvansiyonel PZR yöntemi yüksek duyarlılığına rağmen uzun işlem basamakları zaman kaybına yol açmaktadır. Blastocystis alt türlerinin tayininde çok sayıda Blastocystis izolatinin alttür tayininin yapılması her izolat için yedi farklı primer ile reaksiyon gerektirmektedir. Uzun sürede gerçekleştirilip yoğun emek harcanan bir yöntem özelliği 23

37 taşımaktadır. Epidemiyolojik çalışmaların yapılmasında bu durum zorluk yaratmaktadır. Son zamanlarda bir çok alanda olduğu gibi parazitoloji alanında da gerçek zamanlı PZR ve DNA dizi analizinin kullanımı araştırıcılar arasında yaygınlaşmıştır. DNA Dizi Analizi DNA dizi analizi, gen yapısı ve genetik kontrol mekanizmaları hakkında bir çok bilgi edinmemizi sağlamıştır. Herhangi bir organizmadan çok miktarda saf DNA elde edilmesini sağlayan rekombinant DNA tekniklerinin gelişmesine paralel olarak DNA dizi analizi yöntemleri de gelişme göstermiştir. Etken DNA sının belirli bir bölgesinin nükleotid dizilerinin saptanması; Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR), Dizileme (Sekans Reaksiyonu), Jel elektroforezi görüntüleme ve bilgisayarda değerlendirme ile gerçekleştirilir yılında Robert Holley tarafından 74 nükleotidlik bir trna molekülünün dizi analizi yapılmıştır yılında Allan Maxam- Walter Gilbert ve Frederick Sanger tarafından iki farklı DNA dizi analizi yöntemi bulunmuştur yılında Akiyoshi Wada DNA dizi analizinin otomatik olarak yapılmasını önermiştir ve robotlar geliştirilmeye başlanmıştır yılında California Teknoloji Enstitüsünden (Caltech) Leroy Hood ve Llyod Smith tarafından DNA dizi analizinde kullanılacak tam otomatik bir makine bulunmuştur. DNA dizi analizinde günümüzde birbirinden farklı iki yöntem kullanılmaktadır. 24

38 Bu iki yöntem; 1- Maxam ve Gilbert in kimyasal kırılma yöntemi Sanger-Coulson un zincir sonlanma yöntemi. 90 Bu iki yöntemden, Sanger Coulson un yöntemi günümüzde daha yaygın olarak kullanılmaktadır. Allan Maxam ve Walter Gilbert in geliştirdikleri yöntemin prensibi hidrazin, dimetil sülfat ya da formik asit in, DNA da bulunan bazları özgül olarak değiştirmesine ve daha sonra eklenen piperidinin değişikliğe uğramış nükleotitlerin bulunduğu noktalardan zinciri kırmasına dayanır. 91 Bu yöntemde, nükleotit dizisi saptanacak olan DNA önce 5 - ucundan P ile ya da floresan bir boya ile işaretlenir. DNA nın iki iplikciği birbirinden ayrılarak ya da DNA uygun bir restriksiyon enzimi ile kesilerek DNA nın yalnızca bir ucundan işaretlenmesi sağlanır. İkinci adımda ise DNA molekülleri dört tüpe ayrılarak A, C, G ya da T nükleotitlerini değiştirmek ve kırmak için gerekli tepkimeler gerçekleştirilir. Reaksiyon için kısıtlı bir süre verilerek her tüpde farklı pozisyonlardaki hedef nükleotidlerden kırılmış DNA parçaları elde edilir. Sonuçta kırılmanın olduğu pozisyona göre hepsi 5 - pozisyonlarından işaretli ancak boyları birbirinden farklı bir dizi DNA fragmenti elde edilmiş olur. Elde edilen boyları gittikçe kısalan DNA dizileri, jel elektroforezi ile birbirlerinden büyüklüklerine göre ayrılır ve otoradyografi uygulanarak bantlar görüntülenir. 92 Sanger metodu ile uzun DNA bölgelerinin dizilenmesi için dizileme öncesi uygulanması gereken koloni ve klonlama yöntemlerinin 25

39 çok uzun süre alan zahmetli işlemler olması bilim adamlarının alternatif yöntemleri araştırmaya sokmuştur. 93 Otomatik DNA Dizi Analizi İnsan Genom Projesi gibi büyük projeler çok sayıda DNA dizi analizi yapılmasını gerektirmektedir. Artan analiz sayısı, uzun zaman ve yüksek iş gücü gerektirir. Bu gelişmeler sonucunda otomasyon kaçınılmaz olmuştur. Otomatik DNA dizi analizleri zaman kazancı yanında, standart çalışma koşulları ve elde edilen sonuçların değerlendirilmesinde de yarar sağlamıştır. Otomatik analizde de Sanger in enzimatik DNA sentezine dayanan zincir sonlanma yöntemi kullanılmıştır. Otomatik DNA dizi analiz cihazları basit olarak, sabit bilgisayarda yüklü programlar ile bu programların yönettiği elektroforez sistemini içerir. Elektroforetik ünitelerde bulunan lazer ışık kaynağı ile monokromatik bir ışık oluşturulur. Söz konusu DNA nın bulunduğu jelmatriks bu monokromatik ışık ile taranır. Elektroforez süresince DNA ya bağlanan floresan boya ışık ile taranan bölgeye geldiğinde uyarılır. Uyarılan boya kendi için karakteristik olan dalga boyunda ışığı geri yansıtır. Yansıyan bu ışık demeti bir detektör tarafından kaydedilir. Kaydedilen veriler bilgisayar programları ile değerlendirilerek sonuçlar grafiksel ya da matematiksel olarak bilgisayar ekranına aktarılır. 91 Bu yöntem sayesinde, istenen DNA dizisinin nükleotid bazında içeriği saptanır. Primerler aracılığıyla uzatılan DNA dizisine eklenen her işaretli nükleotid yardımı ile DNA bölgesinin içeriği tespit edilebilir. 26

40 Pirosekans Son yılardaki kayda değer teknolojik yenilikler karmaşık örneklerin daha önce görülmemiş hızda dizilenmesine olanak sağlamıştır. Bu doğrultuda 1996 da Rogaghi ve arkadaşları sentez yoluyla dizileme prensibine dayalı pirosekans metodunu geliştirmiştir. 93 Pirosekans DNA polimerizasyon tepkimesi sırasında ortaya çıkan PPi tespitine dayalı gerçek zamanlı bir dizi analiz yöntemidir. İlk olarak bu yöntem DNA polimeraz aktivitesini izlemede kullanılmıştır. 94 Etken DNA sının belirli bir bölgesinin nükleotid dizilerinin saptanmasında; Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR), Dizileme (Pirosekans reaksiyonu), Bilgisayarda değerlendirme şeklindedir. Sekanslama işlemi PZR ürünlerinin tek zincir DNA (ssdna) ya dönüşmesi ile başlar. Tek sarmal DNA kalıp olarak kullanılmak üzere izole edilir, her bir primer çifti biotin ile 5' ucundan işaretlenir. Sekans primeri PZR ile çoğaltılmış olan bir tek zincir DNA ile hibridize edilir. 94 Enzim olarak DNA polimeraz, ATP sülfürilaz, lüsiferaz ve apiraz kullanılır. Substrat olarak adenozin 5 fosfosülfat ve lusiferin ile inkübe edilir. dntp (deoksiribonükleotid trifosfat) lardan ilki reaksiyona eklenir. 95 Eğer dntp kalıp DNA daki baza komplementer ise ortamda bulunan DNA polimeraz, bu dntp nin DNA sarmalına eklenmesini kataliz eder. dntp DNA kalıbına bağlanırken dntp üzerindeki 2 adet fosfat açığa çıkar ve ortama 2 fosfatlı bir yapı olan pirofosfat (PPi) ortama geçmiş olur. 27

41 Her nükleotid eklenmesinde bir pirofosfat serbest kalır. Ortama çıkan pirofosfat; ATP sülfiraz yardımı ile ATP ye çevrilir. Oluşan ATP nin yardımı ile lusiferin, oksilusiferin e dönüşür. Oksilusiferin ise görünür bir ışın yayar. Oluşan bu ışın miktarı ATP miktarı ile orantılıdır. Oluşan ışın CCD (kızıl ötesi) kamera ile tespit edilir ve seri tepecik şeklinde kaydedilir. Işınların seri tepecik şeklinde kaydedilmesine program adı verilir. Işın programda bir yükseklik veya tepecik şeklinde görülür. Her bir tepeciğin yüksekliği eklenmiş olan nükleotid sayısıyla orantılıdır Işın miktarı ATP miktarı ile orantılıdır. Işın program da bir yükseklik olarak görülür. Nükleotid parçalayıcı bir enzim olan apiraz devamlı olarak ATP ve dntp leri parçalar. Böylece ışık oluşumu kesilir. Yani ortamda yeni reaksiyon oluşturacak dntp ve ATP kalmamış olur ve bu şekilde ortam ikinci nükleotidin ilave edilmesine hazırlanmış olur. 95 Dört enzimin yer aldığı bu aşamalar kapalı bir sistemde, plakta ve tek bir kuyucukta yapılabilir. İşlemin süresi kısadır. Apiraz ATP yi ve bağlanmamış olan dntp leri parçalar ışık kesilir. Reaksiyon solüsyonu yenilenir. Komplementer DNA zinciri yapılır. Nükleotid dizisi program daki sinyal tepeciklerinden saptanır. Program da iki kat yükseklik gösteren tepecikler eş iki nükleotidin ardarda bağlanması sonucu oluşmaktadır. 95 Pirosekans yöntemi DNA sentezi esnasında açığa çıkan pirofosfatların saptanması esasına dayanan bir real-time (gerçek-zamanlı) kantitatif dizi analizi tekniği olması; konvansiyonel PCR yöntemine göre, uygulaması basit, kolay değerlendirilen, hızlı ve real-time (gerçek-zamanlı) olması nedeniyle tercih edilmektedir. Aynı zamanda jel elektroforezine gerek duyulmaması ile kapalı sistem PCR yöntemi olarak büyük avantaja sahiptir

42 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Örneklerin Toplanması Çalışmaya Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Araştırma Laboratuarı ve Ankara Eğitim ve Araştırma Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuarına yılları arasında rutin inceleme için gelen hastalardan alınan dışkı örnekleri dahil edilmiştir. Dışkı örnekleri geniş ağızlı, kuru, temiz ve plastik kapaklı steril toplama kaplarına alındı. Mikroskobik olarak incelendi Blastocystis pozitifliği saptanan örneklerden, kültürde ( Ringer s solusyonu % 10 at serumu ve % 0,05 asparajin) üremesi sağlanan suşların ekstraksiyon ile DNA izolasyonu yapıldıktan sonra konvansiyonel PZR ve pirosekans yöntemi ile tiplendirilmek üzere -20⁰C de muhafaza edildi Kullanılan Araç ve Gereçler Kullanılan Cihazlar Santrifüj ( Boeco U-32 R, Almanya ) Mikrosantrifüj (Beckman Coulter, Almanya) Spin Santrifüj (Biosan, Almanya) Vorteks ( Boeco U-32 R, V1 Plus, Almanya ) Hassas Terazi ( Kern PFB, Almanya ) Etüv ( Nüve, Türkiye ) Işık Mikroskobu ( Olympus CX31, Japonya ) Biyogüvenlik kabini ( Metisafe Class 2, Türkiye ) Thermal Cycler, Gene Amp PCR System 9700 ( Applied Biosystems, ABD ) 29

43 Otoklav ( Sanyo MLS-3020-U, Japonya ) Ben mari ( Techne TE-8J, İngiltere ) Mikrodalga Fırın ( Arçelik, Türkiye ) ph Metre ( Fisher Scientific, ABD ) Jel Görüntüleme Sistemi ( Uvitec Fine Reader, İngiltere) NanoDrop ND1000 UV-Vis Spektrofotometre ( Thermo Scientific, ABD) Soğutucu, 2-8⁰C ( Uğur, Turkiye ) Derin Dondurucu, -20 ºC ( Uğur, Türkiye ) Vakum Santrifüj ( Labconco, USA ) Elektroforez Güç Kaynağı ( Wealtec, Tayvan ) Elektroforez Tankı ( Agagel Mini Biometra, Almanya ) Mikropipet ; 0,5-10 µl lik µl lik µl lik ( Continental lab, Beta pette, Canada ) Steril pipet uçları ( Grainer Bio One, Almanya ) 0,5-1,5 ml lik Ependorf (Grainer Bio One, Almanya ) ml lik Grayner ( Grainer Bio One, Almanya ) Lam (Citoglas, Çin) Lamel (18x18) Cover glass, Çin) Cam Malzemeler Thermal Cycler ( Sensoquest Labcycler, Almanya ) Pyromark Q24 Cihazı ( Cat. No , Almanya) Pyromark Q24 MDx Vakum İstasyonu (Cat. No [220V], Almanya ) PyroMark Q24 Kartuş ( Cat. No , Almanya ) Millipore Saf su Cihazı ( Merck, Almanya ) Euro-Line T-Shaker ( Almanya ) Spin Cihazı ( Combi Spin FVL-2400N, Litvanya ) 80 ⁰C ye Ulaşabilen Isı Bloğu ( Wealtec HB-1,Tayvan ) 30

44 PCR plakaları Plaka mikseri Kullanılan Kimyasalar At serumu (Gibco, Almanya) L-Asparajin (Merck, Almanya) Sodyum klorür (Sigma, Almanya) Kalsiyum klorür (Sigma, Almanya) Potasyum klorür (Sigma, Almanya) Toz halindeki iyot kristalleri (Sigma, Almanya) Serum fizyolojik (Sigma, Almanya) Steril distile su EDTA (Applichem, Almanya) Borik Asit (Applichem, Almanya) Tris (Amresco, Canada) Triton X-100 (Sigma, Almanya) Orange G (Applichem, Almanya) Glasiyel Asetik Asit (Merck, Almanya) Etidyum Bromür (Sigma, Almanya) Ultra distile Su (D. Zeydanlı, Türkiye) Etil Alkol (Merck, Almanya) Serum Fizyolojik (Sigma, Almanya) Primerler: Thermo Scientific ( Almanya) Size marker ( New England Biolabs, Almanya ) Hemo KlenTaq Reaction Buffer ( New England Biolabs, Almanya ) Tag DNA polimeraz ( Hemo KlenTaq, New England Biolabs, Almanya) dntp (Thermo scientific-finnzymes,usa ) 31

45 Marker, DNA Ladder (New England Biolabs, Almanya) DNase, RNase Free Su Annealing Buffer Kullanılan Ticari Kitler Pirosekans kit (Pyromark Q24 kit, Almanya) DNAzol (MRCgene, Almanya) 3.3.Yöntemler Hazırlanışı Direkt Mikroskobik İnceleme Solüsyonlarının hazırlandı. Direkt mikroskobi de kullanılan solüsyonlar aşağıdaki şekilde Serum Fizyolojik NaCl 8.5 g. Distile su 1000 ml. Lugol un İyot Solüsyonu Potasyum iyodür 10 g. Kristal iyot 5 g. 32

46 Distile su 100 ml. Tüm dışkı örneklerinden serum fizyolojik ve Lugol un İyot solüsyonu ile lam ve lamel arası preparatlar hazırlandı. Bu preparatlar, ışık mikroskobunda önce düşük büyütmeli, daha sonrada yüksek büyütmeli objektiflerde incelendi. Her preparat lökosit, eritrosit, protozoa kist ve trofozoitleri açısından değerlendirildi. Blastocystis açısından pozitif hasta örneklere ekstraksiyon için iki adet kültür yapıldı Kültür Solüsyonunun Hazırlanışı Ringer s Solüsyonu Stok solusyon 10x olarak hazırlandı. NaCl 86 g, CaCl 3.3 g, KCl 3.0 g, Asparagine 5gr, ph: Karışım 1000 ml distile su ile tamamlandı ve otoklavlandı. 1X oranında dilüe edilerek kullanıldı. 33

47 Bu solüsyondan % 10 at serumu (56 ⁰C de 30 dk inaktive edilmiş) içeren 1X lik kültürler hazırlandı. Çalışmaya alınan örneklerde Blastocystis pozitif örneklerin üretilmesi amacıyla kültüre alındı. Kültür için Ringer s solüsyonu kullanıldı. Katı dışkı örneklerinden 2 gr, sıvı örneklerden 1 ml alınarak, graynerlardaki Ringer s solüsyonunun içine ekimi yapıldı ve tüplerin ağzı sıkıca kapatıldı. Daha sonra 37 ⁰C lik etüvde inkübasyona bırakıldı ve 3 gün sonra üreme kontrolü için mikroskobik olarak değerlendirilmeye alındı. Üreme kontrolü yapılan kültür örnekleri daha sonra ekstraksiyon öncesi DNA zol e ayrılması için ön işleme tabi tutuldu. DNA Parçalama(Lizis)Tamponunun Hazırlanışı 40 mm sodyum sitrat %1 lik triton X ml için; 1,1646 gr sodyum sitrat, 99ml steril distile su, 1 ml Triton X-100 4ml kültür solusyonu 4 katlı gazlı bezden yeni bir graynera süzüldü. Üzerine 10ml ye kadar Ringer s solusyonu eklendi. Karışım süspanse edilip, 400 g de 10 dk santrifüjlendi. Süpernatan döküldü. Bu işlemler 2 kere tekrarlandı. Son uygulamadan sonra grayner içerisinde 1 ml kadar sıvı bırakıldı. Pellet ile süspanse edilip 1,5 luk kuru ependorfa 34

48 aktarıldı. Ependorflar g de 2 dk santrifüj edildi, süpernatan döküldü üzerine 1-1,5 ml kadar 40 mm sodyum sitrat %1 lik triton X-100 ile muamele 30 sn bekletildi. Tüpler 500 g de 5 dk santrifüj edildi,,süpernatan döküldü, 1ml DNA zol eklenerek 10 dk manuel olarak karıştırıldı ve ekstraksiyon işlemine tabi tutulana kadar + 4⁰C de muhafaza edildi Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) Ekstraksiyon TE Buffer Hazırlanışı 10 mm Tris HCl için mg, 200 ml distile su, 1mM, 58.4 mg EDTA, ph=8.0 Otoklavda steril edilerek buz dolabında saklanmıştır. %100 lük Etanol Etil alkol (Absolute) 100ml Buzdolabında +4º C de saklanmıştır. 35

49 %75 lik Etanol Etil alkol (Absolute) 75 ml Steril distile su 25 ml Buzdolabında +4º C de saklanmıştır. Örneklerden DNA eldesi için DNA-zol ekstraksiyon yöntemi kulanılmıştır. Bu yönteme göre; 1. DNA zol deki kültür materyeli g de +4 C de, 10 dk santrifüj edildi. 2. Üst kısımda biriken tabakadan 500µl kadar toplandı ve başka ependorfa aktarıldı. Ependorfa DNA zol ile ½ oranında % 100 lük etanol eklenerek manuel olarak 8-10 kere karıştırıldı. DNA nın kapak tarafına çökmesi için 1-3 dk kadar ters çevrilip bekletildi. 3. DNA görür halde ise pipet ucu yardımıyla başka bir ependorfa aktarıldı. DNA görür halde değilse üst kısımda oluşan bulutlu tabakayı toplanarak başka ependorfa aktarıldı g de 5 dk +4 C de derecede santrifuj edildi. 5. Üzerine -20 C den %75 lik etanol eklenerek manuel olarak 3-6 kere karıştırıldı. 1 dk DNA dibe çökmesi için tüp dik olarak bekletildi, 1000 g de +4 C de 2 dk santrifüj edildi. Bu basamak 2 defa tekrarlandı. 6. Süpernatan döküldü etanolün tamamen uzaklaşması için 500 g de 5-10 dk vakum santrifüjünde örnekler santrifüj edildi µl TE buffer( ph:8) eklendi. 8. Tüm DNA örnekleri, C de saklandı. 36

50 Elde edilen DNA lar Nanodrop ND 1000 UV-Vis Spektrofotometre (Thermo Scientific, ABD) cihazı ile saflık ve miktarlarının belirlenmesi amacıyla ölçülmüştür. NanoDrop ND-1000 DNA, RNA, protein ve boyanın absorbanısını ölçmek için kullanılan bir spektrofotometredir DNA nın Çoğaltılması ve Gösterilmesi Blastocystis türlerinin amplifikasyonu STS 1-7 (Forward) ve (Reverse) evrensel primerleri kullanılarak yapılmıştır. Çalışmada kullanılan primerlerin oligonükleotid dizileri Tablo 1 de verilmiştir. 97 Tablo 1:Konvansiyonel PZR sırasında kulanılan STS primerlerinin dizileri SUBTİP PRİMER DİZİLERİ BP PRİMER KAYNAĞI GENBANK NO ST 1 SB83 ST 2 SB340 SB227 ST 3 ST 4 SB337 ST 5 SB336 ST 6 SB332 ST 7 SB155 F:GAAGGACTCTCTGACGATGA R:GTCCAAATGAAAGGCAGC 351 Nand II AF F:TGTTCTTGTGTCTTCTCAGCTC 704 HJ96-I AY R:TTCTTTCACACTCCCGTCAT F:TAGGATTTGGTGTTTGGAGA 526 HV AF R:TTAGAAGTGAAGGAGATGGAAG F:GTCTTTCCCTGTCTATTCTGCA 487 RN 94-9 AY R:AATTCGGTCTGCTTCTTCTG F:GTGGGTAGAGGAAGGAAAACA 317 SY 94-3 AY R:AGAACAAGTCGATGAAGTGAGAT F:GCATCCAGACTACTATCAACATT 338 HJ96AS-I AF R:CCATTTTCAGACAACCACTTA F:ATCAGCCTACAATCTCCTC 650 B AF R:ATCGCCACTTCTCCAAT 37

51 PZR Reaksiyon Karışımı Her bir örnek için numaralandırılmış steril 0,2 ml lik PZR tüplerine, klinik örneklerden ekstrakte edilen DNA örneğinden 2 μl eklendikten sonra hazırlanan PZR reaksiyon karışımı 23 μl dağıtılmış ve spin santrifüj yapıldıktan sonra termal döngü cihazına (Thermal Cycler, Applied Biosystems) yerleştirilmiştir. Tablo 2 de verilmiştir. Çalışmada STS 1-7 amplifikasyon karşımının hazırlanması PZR reaksiyon karışımının hazırlanması Tablo 2: PZR reaksiyon karışımı BİLEŞEN SON KONSANTRASYON MİKTAR DNaz ve RNaz içermeyen su µl 5X Hemo KlenTaq Reaction Buffer 1X 5 µl dntp miks 10 µm 0.2mM 0.5 µl PRİMER Forward STS µm 0.3mM 0.75 µl PRİMER Reverse STS µm 0.3mM 0.75 µl Hemo KlenTaq DNA polimeraz µl DNA 2 µm 2 µl Toplam Hacim - 25 µl 38

52 Amplifikasyon şartları Çalışmada STS 1-7 amplifikasyonu için kullanılan PZR amplifikasyon şartları sırasıyla Tablo 3 ve 4 te verilmiştir. Tablo 3: STS amplifikasyonu için reaksiyon şartları Reaksiyon aşaması Sıcaklık Süre Döngü Sayısı Ön ısıtma 94 C 3 dakika 1 Denatürasyon 94 C 30 saniye Primer bağlanması 62 C 45 saniye 30 Uzama 72 C 1 dakika Son uzama 72 C 7 dakika 1 Muhafaza 4 C Tablo 4: STS amplifikasyonu için reaksiyon şartları Reaksiyon aşaması Sıcaklık Süre Döngü Sayısı Ön ısıtma 94 C 3 dakika 1 Denatürasyon 94 C 30 saniye Primer bağlanması 61 C 45 saniye 30 Uzama 72 C 1 dakika Son uzama 72 C 7 dakika 1 Muhafaza 4 C 39

53 PZR ürünleri %2 lik agaroz jelde yürütülerek Blastocystis alttürlerinin hangileri tayini yapılmıştır. PZR ürünlerinden 9 ar μl alınarak 3 μl yükleme tamponu (orange G) ile iyice karıştırılmıştır ve elektroforez tankına yerleştirilen jelin kuyucuklarına sırasıyla yüklenmiştir. Elektroforez yürütme tamponu olarak 1X TBE (Tris-Borik asit-edta) kullanılmıştır. Güç kaynağı 100 Volt ve 90 ma olacak şekilde ayarlanarak çalıştırılmıştır. Yükleme tamponunun jel üzerinde yürümesi takip edilerek yaklaşık 40 dakika jelin 3/4 lük kısmını yürümesi beklenerek elektroforez işlemi sonlandırılmıştır Elektroforez için kullanılan solüsyonlar 5X Tris-Borik asit-edta (TBE) tamponu stok solüsyonu Tris-Base 54 g Borik Asit g EDTA (0.5 M, ph: 8.0) 20 ml Kimyasallar çözündükten sonra distile su ile 1L ye tamamlanmıştır. ph 8.0 e ayarlanarak oda ısısında saklanmıştır. Elektroforez tamponu (1X TBE) 5X TBE stok tampon solüsyonundan 200 ml alınarak distile su ile 1000 ml ye tamamlanmıştır. 1X TBE solüsyonu agaroz jelin hazırlanmasında ve elektroforez yürütme tamponu olarak kullanılmıştır. 40

54 Jel yükleme tamponu (Orange G) hazırlanışı Orange G 25 mg, Gliserol 3 ml, 5X TBE tamponu 2 ml, saklanmıştır. 5 ml distile suda çözülerek hazırlanmış ve +4 ºC de Etidyum bromid (Et-Br) çözeltisi hazırlanışı 10 mg etidyum bromid 1 ml distile suda çözülerek hazırlanmış ve +4 ºC de saklanmıştır. Agaroz jel hazırlanışı (%2) Elektroforez için %2 lik agaroz jelin hazırlanmasında, 2 g agaroz tartılarak 1X TBE tamponu ile 100 ml ye tamamlanmıştır ve mikrodalga fırında homojen bir şekilde şeffaf hale gelinceye kadar ısıtılmıştır. Daha sonra jel tarağı yerleştirilerek jel tepsisine dikkatlice döküldükten sonra yaklaşık 30 dakika oda ısısında beklenerek jelin katılaşarak donması sağlanmıştır. Daha sonra jel içerisinden tarak çıkartılarak elektroforez tankına yerleştirilmiştir. 41

55 Pirosekans Eylül Kasım 2012 yılları arasında toplanan 60 Blastocystis izolatının ekstraksiyon aşamasından sonra konvansiyonel PZR yöntemi ile evrensel STS primerleri kullanılarak alttürleri belirlenmiş aynı zamanda pirosekans yöntemiyle de alttür tayini yapılmıştır. Blastocystis in pirosekanslanmasında 18S small subinit rrna gen sekansı kullanılmıştır. Tablo 5 te görüldüğü gibi Subtip 1(1), Subtip 3(1), Subtip 4(1), Subtip 6(1), Subtip 7(1) de genetik polimorfizimler mevcuttur. 12 Tablo 5: Pirosekans Subtip Dizileri 12 SUBTİP Subtip 1 Subtip 1(1) Subtip 2 Subtip 3 Subtip 3(1) Subtip 4 Subtip 4(1) Subtip 5 Subtip 6 Subtip 6(1) Subtip 7 Subtip 7(1) DİZİ GCTATAAACGATACCGACTAGGGGTTAGTAGAGGTCAAAGTGT GCTATAAACGATACCGACTAGGGGTTAGTAGAGGTCTATGTGT GCTATAAACGATACCGACTAGGGGTTAGTAGAGGTCAATGTGT ACTATAAACGATACCGACTAGAGGTTAGTAAAGGTCATTGTGT GCTATAAACGATACCGACTAGAGGTTAGTAAAGGTCATTGTGT ACTATAAACGATACCGACTAGGGGTTAGTAATGGTCATTGTGT ACTATAAACGATACCGACTAGGGGTTAGTGGAGGTCATTGTGT GCTATAAACGATACCGACTAGGGGTTAGTAGAAGTCATTGTGT GCTATAAACGATACCGACTAGGGGTTAGTAGATATCCAATGGT GCTATAAACGATACCGACTAGGGCTTAGTAGATATCCAATGGT GCTATAAACGATACCGACTAGGAGTTAGTAGATGATCCAATGGT GCTATAAACGATACCGACTAGGAGTTAGTAGAT-ATCCGATGGT Primerlerin dizaynında yedi alttürün tayini için Clustal (multiple sequence alignment) programı ile ortak gen bölgeleri belirlendi ve bu bölgelere ait forward ve rewerse primerleri yerleştirilerek 42

56 polimorfizmlerin saptanabilmesi sağlandı. 98 Sekans primeri Blastocystis in alltür tayini için dizilemenin yapılabilmesi amacıyla dizayn edildi. Resim 2 : Dizilemede forward (yeşil), rewerse (sarı) ve sekans primerine (mavi) ait olan ortak gen bölgeleri 43

57 44

58 45

59 46

60 47

61 48

62 49

63 50

64 51

65 52

66 Pirosekans için DNA nın Çoğaltılması Her bir örnek için numaralandırılmış steril 0,2 ml lik PZR tüplerine, ekstrakte edilen DNA örneğinden 5 μl eklendikten sonra hazırlanan PZR reaksiyon karışımı 25 μl dağıtılmış ve spin santrifüj yapıldıktan sonra termal döngü cihazına Thermal (Sensoquest Labcycler) yerleştirilmiştir. Örnek hazırlanırken tüm ayıraçlar ve kullanılacak solüsyonlar 15-25⁰C aralığında kullanıldı. Çalışmada PZR Master Mix içeren amplifikasyon karşımının hazırlanması Tablo 6 da verilmiştir. Tablo 6: 2x PyroMark PCR Master Mix içeren reaksiyon karışımı BİLEŞEN SON KONSANTRASYON MİKTAR PyroMark PCR Master Mix, 2x 1X 12.5µl PRİMER Forward 0.2 μm 0.5µl PRİMER Reverse 0.2 μm 0.5µl RNase-Free Su - 6.5µl DNA - 5µl Toplam - 25 µl 53

67 Primer dizileri; RSBHpyro2F: 5'-GCG AAA GCA TTT ACC AAG GAT GT-3' RSBHpyro2R: 5'-Biotin-CCG GAA CCC AAA GAC TTT GAT-3' Tablo 7: PZR amplifikasyonu için reaksiyon şartları Reaksiyon aşaması Sıcaklık Süre Döngü Sayısı Ön ısıtma 95 C 15 dakika 1 Denatürasyon 94 C 30 saniye Primer bağlanması 60 C 30 saniye 45 Uzama 72 C 30 saniye Son uzama 72 C 10 dakika 1 Muhafaza 4 C Pirosekans için Vakum Çalışma İstasyonu Protokolü Analiz edilecek DNA biyotinlenmiş primerlerden birisini kullanan PZR tarafından amplifiye edilir. Biyotinlenen PCR ürünü daha sonra streptavidin kaplı sepharose boncuklar tarafından bloke edilerek hareketsizleştirilir. Pyromark Q24 kullanılarak analiz edilecek örnekler Pyromark Q24 vakum çalışma istasyonu kullanılarak hazırlanır. 54

68 Resim 3:Pyromark Q24 vakum çalışma istasyonu(1) Yöntem; PZR reaksiyonunun tamamlanmasının ardından steril 0,2µl lik ependorf tüp içerisinde üretici firmanın önerileri doğrultusunda örnek başına Tablo 7 de gösterilen miktarlarda bağlanma tamponu, streptavidin, RNaseserbest su eklenir. İçinde streptavidin sephorose tanecikler olan şişe tamamen homejen bir hal alıncaya kadar çalkalanır. Streptavidin ile kaplanmış sephorose tanecikler ile bağlama tamponu karıştırılır ve PCR ürünü eklenen 24 hazneli PCR plakanın her bir haznesine 80 µl hacminde dağıtılır. 55

69 Tablo 8: Kullanılacak bağlanma tamponu, streptavidin, RNase-serbest su ve PCR ürün miktarları BİLEŞEN MİKTAR Bağlanma tamponu 40 µl Streptavidin 2 µl RNase-serbest Su 28 µl PCR ürünü 10 µl Toplam 80 µl Şerit kapağı kullanılarak PCR plakası kapatılır rpm de 5 dakika çalkalanır. Resim 4:Çalkalama işleminin uygulandığı shaker 56

70 Pyromark Q24 vakum çalışma istasyonu teknelerine; 50 ml %70 lik etanol, 40 ml denaturasyon solüsyonu, 50 ml 1X yıkama tamponu, 50 ml yüksek saflıkta su, 70 ml yüksek saflıkta su eklenir. Resim 5: Pyromark Q24 vakum çalışma istasyonu (2) Vakum pompası çalıştırılır. Problar yüksek saflıktaki su içeren tekne içerisinde yıkanır. 70 ml yüksek saflıkta su tekrar tekneye doldurulur. 57

71 Çalkalama işleminden hemen sonra PCR probunu çalışma tabakasına yerleştirillir. Filtre probunu hareketsizleştirilmiş DNA ipliğini yakalaması için yavaşça PCR plakasının üzerine indirilir ve tüm haznelerin aspire edildiğinden emin olunur. Filtre probu %70 lik etanol içeren tekneye transfer edilir ve 5 sn süre ile yıkama işlemine tabi tutulur. Filtre probu denaturasyon solusyonu içeren tekneye transfer edilir ve 5 sn süre ile yıkama işlemi uygulanır. Filtre probu yıkama solusyonu içeren tekneye transfer edilir ve 10 sn süre ile yıkama işlemi uygulanır. Filtre uçlarından sıvı akmaması için 5 sn süreyle 90 derece pozisyonunda tutulur ve vakum anahtarı kapatılır (Resim 6). Resim 6: Pyromark Q24 PCR probu Alet yavaşça sallanarak Tablo 9 daki oranlarda hazırlanan sıralama primerlerini ve annealing buffer içeren 24 hazneli PCR plakanın içine boşaltılır, bir süre beklenir. 58

72 Tablo 9: Annealing Buffer ve Sekans Primeri Miktarları BİLEŞEN MİKTAR Annealing buffer 24,2 µl Blastocystis sekans primeri (stok10mm) 0,8 µl (0.3mM) Toplam 25 µl Sekans primeri; RSBHpyro2S: 5'-TAG ATA CCC TCG TAG TCT TA-3' Vakum aleti yüksek derecede saf su içeren tekne içerinine transfer edilir ve 10 sn yıkama işlemi uygulanır. Vakum aleti yüksek derecede saf su içeren tekne içerinine transfer edilir vakum uygulanarak 5 sn süreyle çalkalanır. Filtre uçlarından sıvı akmaması için 5 sn süreyle 90 derece pozisyonunda tutulur ve vakum anahtarı kapatılır. Vakum aleti park konumuna getirilir. Pirosekans için Pyromark Q24 Cihazi Çalışma Prensibi Örnekleri içeren 24 hazneli PCR plaka plaka tutucu vasıtasıyla 2 dk süreyle 80⁰C de ısı bloğunda bekletilir. Resim 7: Plaka tutucu 59

73 Resim 8: Isı bloğu Plaka plaka tutucudan çıkartılır ve örnekler oda sıcaklığına gelmesi için 5 dk bekletilir. Daha sonra plaka pyromark Q24 cihazı içerisine yerleştirilir. Resim 9: Pyromark Q24 Cihazı 60

74 Pyromark gold Q24 ayıraç kutusu kullanılan örnek sayısına göre bilgisayar programında oluşturulan miktarlarda nükleotidler, enzim ve substrat eklenir. Resim 10: Pyromark Q24 Kartuş ve Dağılımı Pyromark Q24 cihazını açılır. Kartuş girişini açın ve kartuş etiketi dış tarafa bakacak şekilde hazırladığınız kartuşu cihaza yerleştirilir. Resim 11: Pyromark Q24 Cihazına ait kartuş yerleşim konumu, dağıtım ünitesi 61

75 Plaka tutucu çerçeve açılır ve ısı bloğuna plaka yerleştirilir. Resim 12:Pyromark Q24 Cihazına Ait İşlem Haznesi Cihaz çalıştırılır. Cihaz şu prensibe göre dizileme işlemini gerçekleştirir. o Sekans primeri tek zincirli PCR ile amplifiye edilmiş DNA şablonuna hibridize edilir. o DNA şablonu DNA polimeraz ve substratlar ile inkübe edilir. o Dört nükleotidin ilki reaksiyona eklenir. Eğer nükleotid şablon dizilimi içindeki bazın tamamlayıcısı ise bu durumda DNA polimeraz tarafından DNA dizilimine katılır. o Her nükleotidin DNA dizilimine katılması ile eş zamanlı olarak eşit mol miktarlarında pirofosfat (PPi) serbest bırakılır. o ATP sülfüraz PPİ adenozin 5' sülfafosfatın bulunduğu ortamda ATP ye dönüştürür. 62

76 Şekil 2:Serbest kalan pirofosfatlar o Bu aşamada lusiferinin lusiferaz tarafından oksilusiferine dönüşümünü gerçekleştirirken ATP miktarına orantılı miktarda görülebilir bir ışık da üretir. Gönderilen ışık kullanılan ısıya duyarlı cihaz (CCD) kamera tarafından dedekte edilir ve program içinde bir doruk noktası olarak görülür. Her bir ışık sinyali katılan nükleotidlerin sayısı ile orantılıdır. Şekil 3:Sülfiraz ve lusiferaz aktivitesi o Bir nükleotid ayrıştırıcı enzim olan apiraz, bağımsız nükleotidleri ve ATP yi sürekli olarak ayrıştırır. Ayrıştırma işlemi tamamlandığında başka bir nükleotid eklenir. Şekil 4: Apiraz aktivitesi 63

77 o Nükleotidler bir seferde bir adet eklenir. o İşlem devam ederken tamamlayıcı DNA dizini oluşur ve program taraması içindeki sinyal tepe noktasından nükleotid sralama belirlenir İstatistiksel Analiz gerçekleştirilmiştir. Verilerin analizi SPSS 15.0 istatistik programı kullanılarak Altmış farklı Blastocystis izolatının alttür tayininde kullanılan iki farklı moleküler yöntem olan Konvansiyonel PZR ve Pirosekans ın uyumluluğu Kappa testi ile değerlendirilmiştir. Test uygulanırken konvansiyonel PZR ile mix subtip olarak belirlenen T17, T39, T43 izolatları Kappa testi nin değerlendirmesine dahil edilmemiştir. Kappa testi nin değerlendirme aralığı aşağıdaki gibidir: Tablo 10: Kappa Testi Değer Aralığı Düşük- Önemsiz uyum Düşük- Orta düzeyde uyum Orta derece uyum İyi derecede uyum Mükemmel uyum Pirosekans yöntemi altın standart olarak kabul edilerek Konvansiyonel PZR nin pirosekans yöntemine göre duyarlılık ve özgüllüğü hesaplanmıştır. 64

78 4.BULGULAR Bu çalışmaya dahil edilen Blastocystis suşları Eylül 2011 Kasım 2012 tarihleri arasında Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Mikrobiyoloji Araştırma Laboratuvarı ve Ankara Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarına parazitolojik inceleme amacıyla gönderilen dışkı örneklerinden izole edildi. Gönderilen örneklerden mikroskobik inceleme sonrasında Blastocystis görülenlerden %10 at serumu % 0,05 asparajin içeren Ringer s solüsyonunda kültürü yapıldı. Kültür sonrasında elde edilen 60 Blastocystis suşu çalışmada kullanıldı. Daha sonra DNAzol e alınan dışkı örnekleri DNA izolasyonu DNAzol yöntemi kulanılarak yapıldıktan sonra Nanodrop ile DNA ölçümleri yapılarak -20⁰C de saklandı. Blastocystis izolatlarının konvansiyonel PZR ve pirosekans yöntemleri ile genotiplendirmesi yapıldı Blastocystis Mikroskobisi Resim 13: Serum fizyolojikle hazırlanan direk mikroskobi preparatında Blastocystis protozoonu 65

79 Resim 14: Lugol solüsyonu hazırlanan direk mikroskobi preparatında Blastocystis protozoonu Resim 15: Ringer s solüsyonunda üretilen Blastocystis protozoonunun kültür solüsyonundan yapılan direk mikroskobisindeki görünümü. 66

80 4.2. Nanodrop ile DNA Miktarı Ölçümü DNAzol ekstraksiyon yöntemi ile elde edilen DNA miktarı Nanodrop ND 1000 UV-Vis Spektrofotometre (Thermo Scientific, ABD) cihazı ile ölçülmüştür. DNA miktarı aynı kalmak şartıyla konvansiyonel PZR ve pirosekans ile genotiplendirilmesi yapılmıştır. Örneklerin PZR öncesi DNA miktarları Tablo 11 de verilmiştir. Şekil 5: T42 numaralı örneğe ait NanoDrop analiz ekranı görüntüsü 67

81 Tablo 11: Örneklerin ekstraksiyon sonrası DNA miktarları (ng/μl) Örnek No DNA Miktarı (ng/μl) Örnek No DNA Miktarı (ng/μl) T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T105 1 ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T142 5,6 ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T149 1,5 ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl T ng/μl 68

82 DNAzol ekstraksiyonundan sonra Blastocystis in evrensel STS primerleri kullanılarak PZR ile genotiplendirilmesi yapılan suşların agaroz jel elektroforezinde görüntülemesi yapıldı. Blastocystis in pirosekansı için 18S small subunit rrna genlerine dayalı olarak altür spesifik bölgelerine göre dizayn edilen primerler kullanılarak Blastocystis DNA sının çoğaltıldı. Daha sonra sekans primeri kullanılarak pirosekans yöntemi ile genlotiplendirildi PZR Sonuçları DNA zol ekstraksiyon yöntemi ile DNA eldesi gerçekleştirilen Blastocystis örnekleri STS evrensel primerleri kullanılarak yedi subtip için genotiplendirmesi yapıldı. Çalışmamıza dahil edilen örnekler yedisi subtip 1, dokuzu subtip 2, kırkbir tanesi subtip 3 olarak genotiplendirildi. Bir örnekte subtip 1-2 mix enfeksiyonu, iki örnekte de subtip 2-3 mix enfeksiyonu saptandı. Tablo 12: Çalışmaya dahil edilen örneklerin PCR reaksiyonu sonrası Subtip dağılımı Subtip Sayı % Yüzde Subtip 1 7 % 11,6 Subtip 2 9 % 15 Subtip 3 42 % 70 Subtip 1-2 (mix) 1 % 1,6 Subtip 2-3 (mix) 2 % 3,3 69

83 STS evrensel primerleri kullanılarak yapılan konvansiyonel PZR sonrası agaroz jel elektroforez görüntülerinden örnekler sırasıyla resim da verilmiştir. Moleküler ağırlık standardına göre subtip 1, 351 bp; subtip 2, 704 bp; subtip3, 526 bp aralığındagörüntülenmektedir. 97 Resim 16: SB83 primeri kulanılarak yapılan Konvansiyonel PZR sonrası PK, T5, T6, T8, T17, T20, T37, T46, T109 örneklerine ait jel elektroforez görüntüsü ( subtip 1 ) M: moleküler ağırlık standartı (Marker) PK: pozitif kontrol Resim 17: SB340 primeri kulanılarak yapılan Konvansiyonel PZR sonrası PK, T7, T17, T34, T39, T41, T43, T54, T70, T71 örneklerine ait jel elektroforez görüntüsü ( subtip 2 ) M: moleküler ağırlık standartı (Marker) PK: pozitif kontrol 70

84 Resim 18: SB227 primeri kulanılarak yapılan Konvansiyonel PZR sonrası PK, T12, T15, T25, T32, T89, T101, T117, T154, T179 örneklerine ait jel elektroforez görüntüsü ( subtip 3 ) M: moleküler ağırlık standartı (Marker) PK: pozitif kontrol Resim 19: SB82, SB227, SB340 primeri kulanılarak yapılan Konvansiyonel PZR sonrası mix subtip olarak saptanan T17 subtip 1 ve 2, T39 subtip 2 ve 3 ve T43 subtip 2 ve 3 olarak genotiplendirilen örneklere ait jel elektroforez görüntüsü M: moleküler ağırlık standartı (Marker) 71

85 4.4. Pirosekans Sonuçları DNAzol ekstraksiyon yöntemi ile DNA eldesi gerçekleştirilen Blastocystis örnekleri pirosekans için 18S small subunit r RNA genlerine dayalı olarak pirosekans için alltür spesifik bölgelerine göre dizayn edilen primerler kulanılarak genotiplendirilmesi yapılmıştır. 12 Pirosekans ile çalışmamıza dahil edilen 60 örneğin altısı subtip 1, onbiri subtip 2, kırkikisi subtip 3 olarak genotiplendirmilştir. Tablo 13: Çalışmaya dahil edilen örneklerin pirosekans sonrası subtip dağılımı Subtip Sayı % Yüzde Subtip 1 6 % 10 Subtip 2 11 % 18,3 Subtip 3 42 % 70 72

86 Şekil 6 : Pyromark Q24 cihazına ait Pyromark analiz programının ekran görüntüsü 73

87 Şekil 7: Pirosekans yöntemi ile düşük kalite olarak genotiplendirilmesi yapılan T32 nolu DNA örneğinin nükleotid dizilerinin gösterilmesi Subtip 2 T32 CTATAAACG ATACCGACTA GGGGTTAGTA GAGGTCAATG TGT CTATAAACG ATACCGACTA GGGGTTAGTA GAGGTCAATG TGT Analiz esnasında iki adet baz 32. pozisyondaki G ve 36. pozisyondaki G sekans dizisinde eksik olarak görülmektedir, subtip 2 olarak tanımlanmasına engel değildir. 74

88 Şekil 8: Pirosekans yöntemi ile düşük kalitede olarak genotiplendirilmesi yapılan T148 nolu DNA örneğinin nükleotid dizilerinin gösterilmesi SUBTİP 3 T148 ACTATAAACG ATACCGACTA GAGGTTAGTG AAGGTCATTG TGT ACTATAAACG ATACCGACTA GAGGTTAGTG AAGGTCATTG TGT Analiz esnasında iki adet baz 21. Pozisyondaki A, 30. pozisyondaki G, 34. pozisyondaki T ve 43. pozisyondaki T sekans dizisinde eksik olarak görülmektedir, subtip 3 olarak tanımlanmasına engel değildir. 75

89 Şekil 9: Pirosekans yöntemi ile birebir dizayn edilen subtip 1 dizisi ile uyumlu olarak genotiplendirilmesi yapılan T1 nolu DNA örneğinin nükleotid dizilerinin gösterilmesi Şekil 10: Pirosekans yöntemi ile birebir dizayn edilen subtip 2 dizisi ile uyumlu olarak genotiplendirilmesi yapılan T7 nolu DNA örneğinin nükleotid dizilerinin gösterilmesi 76

90 Şekil 11: Pirosekans yöntemi ile birebir dizayn edilen subtip 3 dizisi ile uyumlu olarak genotiplendirilmesi yapılan T117 nolu DNA örneğinin nükleotid dizilerinin gösterilmesi Şekil 12: Pyromark Q24 protokolüne göre kontrol edildiğinde birebir dizayn edilen subtip 1 dizisi ile uyumlu olarak genotiplendirilmesi yapılan T5 nolu DNA örneğinin nükleotid dizilerinin gösterilmesi 77

91 Şekil 13: Pyromark Q24 protokolüne göre kontrol edildiğinde birebir dizayn edilen subtip 2 dizisi ile uyumlu olarak genotiplendirilmesi yapılan T4 nolu DNA örneğinin nükleotid dizilerinin gösterilmesi Şekil 14: Pyromark Q24 protokolüne göre kontrol edildiğinde birebir dizayn edilen subtip 3 dizisi ile uyumlu olarak genotiplendirilmesi yapılan T168 nolu DNA örneğinin nükleotid dizilerinin gösterilmesi 78

92 Tablo 14: Blastocystis örneklerinin Konvansiyonel PZR ve Pirosekans Sonuçları Örnek No Konvansiyonel Pirosekans Örnek No Konvansiyonel Pirosekans PZR PZR T1 Subtip-3 Subtip-3 T51 Subtip-3 Subtip-3 T2 Subtip-1 Suptip-1 T52 Subtip-3 Subtip-3 T4 Subtip-2 Subtip-2 T53 Subtip-3 Subtip-3 T5 Subtip-1 Subtip-1 T54 Subtip-2 Subtip-2 T6 Subtip-1 Subtip-1 T55 Subtip-2 Subtip-2 T7 Subtip-2 Subtip-2 T59 Subtip-3 Subtip-3 T8 Subtip-1 Subtip-1 T70 Subtip-2 Subtip-2 T11 Subtip-3 Subtip-3 T71 Subtip-2 Subtip-2 T14 Subtip-3 Subtip-3 T82 Subtip-3 Subtip-3 T15 Subtip-3 Subtip-3 T89 Subtip-3 Subtip-3 T17 Subtip-1 ve 2 Subtip-2 T93 Subtip-3 Subtip-3 T20 Subtip-1 Subtip-3 T101 Subtip-3 Subtip-3 T21 Subtip-3 Subtip-3 T104 Subtip-3 Subtip-3 T22 Subtip-3 Subtip-3 T105 Subtip-3 Subtip-3 T26 Subtip-3 Subtip-3 T109 Subtip-1 Subtip-1 T30 Subtip-3 Subtip-3 T112 Subtip-3 Subtip-3 T32 Subtip-3 Subtip-2 T117 Subtip-3 Subtip-3 T33 Subtip-3 Subtip-3 T121 Subtip-3 Subtip-3 T34 Subtip-2 Subtip-2 T129 Subtip-3 Subtip-3 T35 Subtip-3 Subtip-3 T142 Subtip-2 Subtip-2 T36 Subtip-3 Subtip-3 T148 Subtip-3 Subtip-3 T37 Subtip-1 Subtip-1 T149 Subtip-3 Subtip-3 T38 Subtip-3 Subtip-3 T154 Subtip-3 Subtip-3 T39 Subtip-2 ve 3 Subtip-3 T163 Subtip-3 Subtip-3 T40 Subtip-3 Subtip-3 T165 Subtip-3 Subtip-3 T41 Subtip-2 Subtip-2 T167 Subtip-3 Subtip-2 T42 Subtip-3 Subtip-3 T168 Subtip-3 Subtip-3 T43 Subtip-2 ve 3 Subtip-3 T177 Subtip-3 Subtip-3 T47 Subtip-3 Subtip-3 T179 Subtip-3 Subtip-3 T49 Subtip-3 Subtip-3 T181 Subtip-3 Subtip-3 79

93 Tablo 15: Blastocystis saptanmasında iki farklı moleküler yöntem olan Pirosekans ve Konvansiyonel PZR nin uyumu p=0,00 0,05 Konvansiy onel PZR Pirosekans ST- 1 ST- 2 ST- 3 Total ST ST ST Total UYUMLULUK Kappa:0,884 Blastocystis izolatlarının alttürlerinin belirlenmesi için kullanılan Pirosekans ve Konvansiyonel PZR yöntemlerinin uyumluluğu istatistiksel olarak kappa testi ile yapılmıştır. Pirosekans ile subtip 2 olarak saptanan iki örnekten biri PZR ile subtip 1 diğeri subtip 3 olarak olarak saptanmıştır. Ayrıca pirosekans ile subtip 3 olarak saptanan bir örnek PZR ile subtip 1 olarak olarak saptanmıştır. Pirosekans ve Konvansiyonel PZR arasında uyum % 88 olarak belirlenmiştir. Kappa testi değerlendirmesine göre bu uyum mükemmel olarak tanımlanmaktadır.(tablo 15) Konvansiyonel PZR ile sadece 3 örnekte pirosekanstan farklı sonuç alınmıştır. Konvansiyonel PZR %94,7 oranında pirosekans yöntemi ile aynı subtipi saptamıştır. Pirosekans altın standart kabul edildiğinde Konvansiyonel PZR nin duyarlılığı % 95 ve özgüllük ise % 95,23 olarak belirlenmiştir. 80

94 5.TARTIŞMA Blastocystis, taksonomide Stramenopiles içinde konumlandırılmış tek hücreli bir parazittir. 99 Sadece gastrointestinal semptomları taşıyan hasta bireylerde değil, yaygın olarak sağlıklı bireylerden de alınan dışkı örneklerinde bireylerde de yaygın olarak görülmektedir. 20 Günümüzde küçük 18S(SSU) rrna geninin filogenetik analizi ve nükleotid polimorfizmine dayalı yedi alttürünün altısı insanlardan izole edilebilmiştir. 100,101 Subtip 3 Blastocystis in insanlardan izole edilen en yaygın alt türüdür. 46 Singapur da 276 hastadan RFLP yöntemi ile saptanan dokuz pozitif suşun 7 tanesinin subtip 3, 2 tanesinin de subtip 1 olduğu belirlenmiştir. 114 Blastocystis türlerinin genotiplendirilmesi özellikle PZR ve RFLP yöntemi kullanılarak yapılmıştır. 56 Türe özgü spesifik primerler dideoksi sekanslama yöntemi ile oluşturulmuştur. 97 SSU rrna geninin tipik olarak 18S(SSU) rrna geninin hedefleme PZR ürünleri yaklaşık 1800 bp dır Blastocystis suşu içeren oniki insan, oniki domuz, 8 kuş izolatı üzerinde PFLP yöntemi ile yapılan genotiplendirme çalışmasında türler arasında farklı subtiplerin olduğu gözlemlenmiştir. 115 Pirosekans teknolojisi gerçek-zamanlı bir yöntemdir ve dizileme için ideal bir analiz yöntemi olarak kullanılmaktadır. DNA dizileri 81

95 içinde sekanslama ile sentez ilkesine dayalı olarak dizilemeyi gerçekleştirmektedir. 102 Sistem nükleotid tespite dayalı olarak çalşmakta DNA ipliğindeki her bir nükleotit için fosfat salınımı gerçekleştirilmektedir. 91 Yaklaşık 30 yıldır sanger sekans tekniği DNA sekanslama metodları arasında en çok kullanılan ve altın standart olan başarılı bir yöntemdir ten bu güne kullanımı yaygınlaşan pirosekanslama teknolojisi yeni nesil DNA dizi analizi metodudur. 103 Moleküler yöntemlerin geliştirilmesi devam etmekte ve böylece hem zaman hem maliyet açısından da daha fazla tercih edilen yöntemler ön plana çıkmaktadır. Pirosekans yöntemi Sanger dizi analiz tekniğine göre daha hızlı uygulaması basit, değerlendirmesi kolay bir yöntem olması ile avantaja sahiptir. Hızlı ve real-time (gerçek-zamanlı), işaretli primerler, işaretli nükleotidler ve jel elektroforezi kullanılmadan daha kolay otomatize olabilen bir tekniktir. RFLP yöntemi ile Blastocystis genotiplendirmesinde mutasyon bölgelerinin ve mix enfeksiyonların saptanmasında zorluklar yaşanmaktadır. 23 Sreekumar ve ark. göre göre pirosekans, tek nükleotid polimorfizmi (SNP) saptanmasında PCR-RFLP ye göre üstün olduğu gösterilmiştir. 104 Pirosekans yöntemi zaman açısından da Sanger tekniğine göre daha avantajlıdır. Birçok tür, tek bir PCR ürünü kullanılarak tanımlanabilmektedir. Her bir tür için çift işaretli prob yerine, bir sekans primeri kullanarak fazla sayıda tür tanımlanabilir. Dolayısı ile rutin PCR 82

96 uygulaması ile birlikte kullanılabilmektedir. Mikrobiyolojik tanımlamada pirosekanslama hız, kolaylık ve kesinlik gibi avantajları olan bir teknolojidir. Pirosekans tekniği hızlı, kalitatif ve SNP tespiti durumunda, kantitatif dizileme tekniği için idealdir. Neonatal sepsis ve Neisseria gonorrhoeae tanısında yüksek verimlilik ile hastalık tanısında etkili olmuştur. 105 Pirosekans büyük viral genomların dizilenmesinde başarılı bir bir yöntemdir. Özellikle HCV tanısında yaygın olarak kullanılmaktadır. 106 Frias ve ark. pirosekansın küçük HCV mutantlarının tespitinde güçlü bir teknoloji ve klinik olarak anlamlı ilaca dirençli HBV varyantları tespiti başarılı bir yöntem olduğu ayrıca doğal tedavi başlamadan önce ilaca dirençli mutantların tespiti için en uygun ajan veya antiviral ajanların daha rasyonel kombinasyon seçerek tedavi stratejileri geliştirilmesi için son derece yararlı olabileceği sonucuna varmışlardır. 107 Toxoplasma gondii enfeksiyonlarının tespiti ve tanımlanmasında 104, Plasmodium falciparum un insanlardan izolesinde kullanılmış ve başarılı sonuçlar elde edimiştir. 108 Blastocystis in alttür tayini için moleküler tanısında pirosekans teknolojisi kullanılarak yapılmış halihazırda tek çalışma bulunmaktadır. Çalışmada 48 hasta örneği çalışılmış RSBHpyro2F 5- GCG AAA GCA TTT ACC AAG GAT GT-3 ve RSBHpyro2R 5-Biotin-CCG GAA CCC AAA GAC TTT GAT-3 primerleri kullanılarak örneklerin 170bp olan bölgesinin amplifikasyonu yapılmıştır. RSBHpyro2S 5-TAG ATA CCC TCG TAG TCT TA-3 primeri kullanılarak kısa sürede sekanslaması gerçekleştirlmiştir

97 Blastocystis alttür tayininde pirosekans yönteminin kullanılması büyük ölçekli epidemiyolojik çalışmalar için hızlı bir şekilde genotip tespitinde oldukça faydalı olacaktır. Blastocycstis genotiplendirilmesinde RFLP ve PZR yöntemleri kullanıldığında oluşabilecek mutasyonlar dizilerin yanlış okunarak çoğaltılmasına neden olabilmektedir. 109 Meloni ve ark. real time kullanarak 186 Blastocystis izolatı üzerinde yaptıkları çalışmada dizileme yöntemini mikroskobi ve kültür ile karşılaştırmış ve daha başarılı sonuçlar aldıklarını belirtmişlerdir. 110 Klinik yaygınlık çalışmalarda kullanılan bazı moleküler teknikler örneğin PCR-RFLP, Blastocystis in MGI yorumlanmasında dikkate alınan genetik heterojenitesinin çok zor yorumlanmasına sebep olabilir. 100 Hızlı ve yüksek verimli bir teknoloji olmasının yanı sıra, pirosekans yöntemi SNP analizi prensibine dayalı birden fazla enfeksiyonu saptama yeteneğine sahiptir. 104 Çalışmamızın amacı, Blastocystis izolatlarının alt tiplerinin spesifik polimorfizimlerine dayalı genotipleme için kullanılan PZR ile pirosekans yöntemlerini Blastocystis çalışmaları karşılaştırmaktır. Çalışmada, Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Araştırma Laboratuarı ve Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarına Eylül Kasım 2012 dönemleri arasında farklı parazitolojik inceleme amacıyla gönderilen dışkı 84

98 örneklerinden izole edilen Blastocystis konvansiyonel PZR ve pirosekans yöntemleriyle ile genotiplendirilmiştir. Örnekler mikroskobi ile pozitifliği saptanmış ve çoğaltma amaçlı kültüre alınan örnekler DNAzol yöntemi ile DNA izolasyonu yapılmıştır. DNA miktarının varlığı nanodrop ile ölçülmüştür. Doğruman ve ark. Manisa da çocuk ve yetişkin 286 semptomatik ve asemptomatik hastada yürüttükleri çalışmada Konvansyonel PzR ile Blastocytis izolatlarının genotiplendirmesinde en yaygın görülen subtip suptip 3 olarak saptamış asemptomatik hastalarda yaygın olan subtip 2 olarak belirlemişlerdir. 5 Özyurt ve ark. Türkiye de Blastocystis moleküler epidemiyolojisini araştırmak amacıyla yapılan çalışmalarında 1, 2, 3, 4 subtiplerine rastlandığı en yaygın oranda görülenin subtip 3 olduğunu onu sırasıyla subtip 1,2,4 ün izlediğini vurgulamışlardır. 37 Biz de çalışmamızda kullandığımız 60 örnekten her iki moleküler yöntemle de genotiplendrme sonrasında en yaygın subtipi subtip 3 olarak saptadık. Subtip 3 ü subtip 2 ve subtip 1 takip etti. Çalışmada konvansiyonel PZR yöntemi ile üç örneğimizde mix subtip saptadık. Konvansiyonel metodlar ile bir Blastocystis örneği subtip1-2, iki örnek de subtip2-3 mix enfeksiyon seklinde tiplendirilmiştir. Mix enfeksiyonların oranı konvansiyonel PZR ile % 5 olarak saptandı. Ülkemizde en yaygın olarak subtip 1, subtip 2, subtip 3 ve mix enfeksiyonlarına rastlanmaktadır. 9 Çalışmamızdaki subtip dağılımı da ülkemizdeki epidemiyolojik yaygınlıkla uyumludur. 85

99 Diğer ülkelerdeki epidemiyolojik yaygınlığa bakıldığında Yununistan ve Çin de subtip 1,subtip 2, subtip 3, subtip 4 ve mix enfeksiyonları; Danimarka da subtip 1,subtip 2, subtip 3, subtip 4; Mısır da subtip 1,subtip 2, subtip 6 ve subtip 7; Almanya da subtip 1,subtip 2, subtip 3, subtip 4 ve mix enfeksiyonları; Fransa da subtip 1,subtip 2, subtip 3, subtip 4, subtip 6 ve 7 ; Japonya da subtip 1,subtip 2, subtip 3, subtip 4,subtip 6 ve 7 yaygın olarak gözlemlenmektedir. 9 Christopher ve ark. karın ağrısı ve halsizlik semptomları taşıyan 19 hastanın 5 inde Blastocystis spp. pozitifliği saptanmış ve subtipleri 1, 2, 3, 4, 8 olarak bildirmişlerdir. 111 Filipin de hayvan ve insanlardan izole 12 Blastocystis suşunun RNA (SSU rrna) gen sekansına göre subtip 1 subtip 2 subtip 3 subtip 6 olmak üzere 4 subtip tespit edilmiştir. 116 Meloni ve ark. İtalya da Rome ve Sassari şehirlerinde semptomatik hastalar üzerindeki çalışmalarında 34 hastada ST3 %47.1, ST2 %20.6, ST4 %17.7, ST1 %8.8, ve ST8 %2.9 olarak belirlemişlerdir. En yaygın görülen subtipleri subtip 3 ve subtip 5 olarak saptamışlardır. 110 Günümüze kadar bir çok çalışmada, PZR ile mix genotip enfeksiyonlarının rapor edildiği çok sayıda yayın bulunmaktadır. 112 Doğruman ve ark. semptomatik ve asemptomatik olgularda genotip ile patojenite arasında ilişki tespit edilemediği fakat genotip olarak en fazla subtip 3, subtip 1 ve subtip 4 ün saptandığı belirtilmiştir. Blastocystis in kökenlerinin genotiplendirmesinde subtip 3 ve subtip 1 in, en fazla saptanan genotip olduğu ve subtip 1 in semptomatik hastalarda subtip 3 ten daha fazla bulunduğu saptanmıştır. Aradaki fark istatistiksel 86

100 olarak anlamlı olarak belirlenmiş bu bulgular ışığında subtip 1 in patojenite ile ilişkisi olabileceği ileri sürülmüştür. 113 Çalışmamızda Konvansiyonel PZR yöntemiyle 60 örneğin yedisi subtip 1, dokuzu subtip 2, kırkbiri subtip 3 olarak tanımlanmıştır. Daha sonra bu örnekler pirosekans yöntemiyle dizi analizi ile tanımlanarak karşılaştırılmıştır. Pirosekans yöntemiyle 60 örneğin altısı subtip 1, onbiri subtip 2, kırkı subtip 3 olarak tanımlanmıştır. Pirosekans ile konvansiyonel PZR sonuçları kıyaslandığında, pirosekans ile subtip 2 olarak tiplendirilen 2 örnekten bir tanesi konvansiyonel PZR ile subtip 1, diğeri de subtip 3 olarak genotiplendirilmiştir. Ayrıca pirosekans ile subtip 3 olarak genotiplendirilen bir örnek de konvansiyonel PZR ile subtip1 olarak genotiplendirilmiştir. İki yöntemin uyumluluğuna bakıldığında sadece 3 örnekte farklı genotiplendirme yaptıkları görülmüştür. Pirosekansın dizi analiz yönteminin mix subtipleri saptayamaması konvansiyonel PZR ile mix subtip olarak saptanan 3 örnek hariç istatistiksel analizi yapılmış kappa testi ile uyumluluğa bakılmış ve % 88 oranında uyumlu çalıştıkları gösterilmiştir. Pirosekans yöntemi altın standart olarak kabul edilip ve konvansiyonel PZR yönteminin özgüllük ve duyarlılığı hesaplandığında Pirosekans yöntemine göre % 95 duyarlılığa ve %95,2 özgülüğe sahip olduğu tespit edilmiştir. Konvansiyonel metodlar ile bir Blastocystis örneği subtip1-2, 2 örnek de subtip2-3 mix enfeksiyon seklinde tiplendirilmiş ve bu 87

101 örneklerden pirosekans ile subtip1-2 nin subtip 2, subtip 2-3 olanların da subtip 3 olarak belirlediği saptanmıştır. Blastocystis genotiplendirilmesinde kullanılan moleküler yöntemlerden olan konvansiyonel PZR yönteminin zaman alıcı, yoğun emek harcanan ve kontaminasyona açık olan bir yöntem olması zaman zaman güvenilir sonuçlar verememesi nedenleriyle son yıllarda dizi analizi temelli yöntemler araştırmalarda sıklıkla kullanılmaya başlanmıştır. Fazla sayıda Blastocystis izolatının moleküler yöntemlerle alttür tayini için spesifik sonuçlar veren zaman almayan maliyeti düşük yöntemlerin kullanılması gerekmektedir. Pirosekans bu açıdan bakıldığında konvansiyonel PZR ve DNA dizi analiz teknikleri arasında son zamanlarda verim alınan en kullanışlı yöntemlerden biridir. Bir Blastocystis örneğini PZR reaksiyonu ile tiplendirilmesi yapıldığında ortalama olarak mix hazırlanışı PZR döngüsü ve elektroforez jel ile yürütülmesini de içine alan süreç yaklaşık olarak 3 saati geçmektedir. Her iki yöntem arasında subtip belirlemede çok büyük fark olmadığı konvansiyonel PZR ile % 11,6 oranında subtip 1, %15 oranında subtip 2, %70 oranında subtip 3 ve %1,6 oranına mix subtip1-2,%3,3 oranında da mix subtip 2-3 saptanmıştır. Pirosekans yöntemi ile %10 oranında subtip 1, %18,3 oranında subtip 2,% 70 oranında da subtip 3 saptanmıştır. Stensvold ve ark. Blastocystis in genotiplendirmesi üzerine dideoksi sekanslama ve pirosekans ile yaptıkları çalışmada yaptıkları %94 oranında her iki çalışmanında aynı subtipi verdiğini saptamışlardır. 88

102 Yapılan bu çalışmada Blastocystis in konvansiyonel PZR ve pirosekans yöntemi ile yaptığımız genotiplendirilmesinde %94,7 oranında konvansiyonel PZR nin pirosekans ile aynı sonucu verdiğini saptanmıştır. Çalışmamızın sonuçları Stensvold ve ark. sonuçları ile uyumlu olduğu tespit edilmiştir. Pirosekans analizi daha pahalı bir yöntem olmasına karşın kısa sürede daha kesin sonuçlar sağlanması yoğun emek harcanan ve zaman alıcı olan konvansiyonel yöntemlere kıyasla daha büyük avantaj sağlamaktadır. Ayrıca pirosekanslama yönteminin test birim fiyatı DNA dizi analizi yöntemlerinin test birim fiyatına yakın olup, ters hibridizasyon testlerine kıyasla ucuzdur. 10 Montero ve ark. yaptıkları çalışmada mayalar için pirosekans yöntemi geleneksel moleküler yöntemlerle karşılaştırıldığında moleküler tanımlanmasında örnek başına işlem süresinde en az 4 saatlik bir azalma sağladığını belirtmişlerdir. 11 Sanger sekans tekniği günümüzde de altın standart olarak kullanılan geniş gen bankasına veri tabanına sahip bir teknoloji olması ile binlerce nükleotidlik bir DNA nın dizilimi birkaç saatte çözümlenmektedir. Böylece çok büyük DNA dizilim çözme projeleri geliştirilmektedir. Pyrosekans yöntemi sanger sekans tekniğinden yola çıkarak geliştirilmiş DNA sentezini gerçek zamanlı yaparken (Real Time) dizi analizini gerçekleştirme yöntemidir. Sekanslama alanında en son keşfedilen ve kullanılan yöntemdir. İleriki yıllarda kullanım alanları daha da yaygınlaşacaktır. 89

103 6. SONUÇ Parazitlerin tanısında klasik yöntemler identifikasyon için halen altın standart olarak kabul edilmektedir. Günümüzde moleküler yöntemler henüz klasik yöntemlerin yerini alabilecek durumda olmayıp, geleneksel yöntemlerin tamamlayıcısı niteliğindedir. Çalışmamızın amacı, Blastocystis izolatlarının alt türlerinin spesifik polimorfizimlerine dayalı genotipleme için kullanılan konvansiyonel PZR ve pirosekans DNA dizi analiz yöntemini Blastocystis çalışmaları karşılaştırmaktır. Çalışmada, Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Araştırma Laboratuarı ve Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarına 12 aylık dönemde farklı kliniklerden parazitolojik inceleme için gönderilen 60 izolat konvansiyonel PZR ve pirosekans ile genotiplendirilmiştir. Örnekler mikroskobi ile pozitifliği saptanmış ve çoğaltma amaçlı kültüre alınan örnekler DNAzol yöntemi ile DNA izolasyonu yapılmıştır. DNA miktarının varlığı nanodrop ile ölçülmüştür. Bu yöntemle izole DNA örneğinin DNA dizi analizi ile tanımlanması amacıyla yeterli miktarda DNA elde edildiği saptanmıştır. Konvansiyonel PZR yöntemiyle 60 örneğin yedisi subtip 1, dokuzu subtip 2, kırkbiri subtip 3 olarak tanımlanmıştır. Daha sonra bu örnekler pirosekans yöntemiyle dizi analizi ile tanımlanarak karşılaştırılmıştır. Pirosekans yöntemiyle 60 örneğin altısı subtip 1, onbiri subtip 2, kırkı subtip 3 olarak tanımlanmıştır. 90

104 Pirosekans ile konvansiyonel PZR sonuçları kıyaslandığında, pirosekans ile subtip 2 olarak tiplendirilen 2 örnekten bir tanesi konvansiyonel PZR ile subtip 1, diğeri de subtip 3 olarak genotiplendirilmiştir. Ayrıca pirosekans ile subtip 3 olarak genotiplendirilen bir örnek de konvansiyonel PZR ile subtip1 olarak genotiplendirilmiştir. İki yöntemin uyumluluğuna bakıldığında sadece 3 örnekte farklı genotiplendirme yaptıkları görülmüştür. Pirosekansın dizi analiz yönteminin mix subtipleri saptayamaması konvansiyonel PZR ile mix subtip olarak saptanan 3 örnek hariç istatistiksel analizi yapılmış kappa testi ile uyumluluğa bakılmış ve % 88 oranında uyumlu çalıştıkları tespit edilmiştir. Pirosekans yöntemi altın standart olarak kabul edilip ve konvansiyonel PZR yönteminin özgüllük ve duyarlılığı hesaplandığında Pirosekans yöntemine göre % 95 duyarlılığa ve %95,2 özgülüğe sahip olduğu tespit edilmiştir. Konvansiyonel metodlar ile bir Blastocystis örneği subtip1-2, 2 örnek de subtip2-3 mix enfeksiyon seklinde tiplendirilmiş ve bu örneklerden pirosekans ile subtip1-2 nin subtip 2, subtip 2-3 olanların da subtip 3 olarak belirlediği saptanmıştır. Bu çalışmada Blastocystis in konvansiyonel PZR ve pirosekans yöntemi ile yaptığımız genotiplendirilmesinde %94,7 oranında konvansiyonel PZR nin pirosekans ile aynı sonucu verdiğini saptanmıştır. Fazla sayıda suş kullanımında ve geniş çaplı epidemiyolojik çalışmalarda alttür tayini kısa sürede yapılması önem taşımaktadır. STS primerleri ile yapılan konvansiyonel PZR ile her subtip için ayrı PZR 91

105 reaksiyonu gerekmesi uzun süre almakta ve yoğun emek harcanmaktadır. Her seferinde de başarılı sonuçlar elde edilememekte ve işlemeler defalarca tekrar yapılması gerekebilmektedir. Pirosekans yönteminin kontaminasyon riskinin çok düşük olması tek seferde 96 örneğe kadar izolatı genotiplendirebilmesi jel görüntüleme gibi ayrı işlem basamaklarını gerektirmemektedir. Blastocystis alttür tayininde pirosekans yöntemi konvansiyonel PZR yöntemine göre daha hızlı ve doğru sonuçlar elde edilebileceği sonucuna varılmıştır. 92

106 7.ÖZET Belirlenmesi Blastocystis Türlerinde Pirosekans Yöntemiyle Alttür Blastocystis uzun yıllar sınıflandırılamamış, kimi yazarlarca mantar, kimi yazarlarca protozoon sınıflamasına dahil edilmiş olan bir mikroorganizmadır. Brump tarafından 1912 yılında Blastocystis hominis olarak olarak isimlendirilmiştir. Günümüzde Blastocystis alttürleri insan ve hayvanlarda da enfeksiyona neden olduğu bilinmektedir. Blastocystis enfeksiyon, fekal-oral yolla bulaşmaktadır; genellikle asemptomatiktir. Blastocystis gelişmekte olan ülkelerde yaşayanlarda gelişmiş ülkelere oranla daha sık görülmektedir. Özellikle tropikal ve subtropikal ülkelerde daha sık olarak rastlanılan tüm dünyada yaygın olarak bulunmaktadır. Çalışmamızın amacı, Blastocystis izolatlarının alt tiplerinin spesifik polimorfizimlerine dayalı genotipleme için kullanılan PZR ile pirosekans yöntemlerini karşılaştırmaktır. Çalışmada, Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Araştırma Laboratuarı ve Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi mikrobiyoloji Laboratuvarına Eylül Kasım 2012 dönemleri arasında farklı parazitolojik inceleme amacıyla gönderilen dışkı örneklerinden izole edilen Blastocystis konvansiyonel PZR ve pirosekans yöntemleriyle ile genotiplendirilmiştir. 93

107 Çalışmamızda konvansiyonel PZR yöntemiyle 60 örneğin yedisi subtip 1, dokuzu subtip 2, kırkbiri subtip 3 olarak tanımlanmıştır. Pirosekans yöntemiyle 60 örneğin altısı subtip 1, onbiri subtip 2, kırkı subtip 3 olarak tanımlanmıştır. Pirosekans ile konvansiyonel PZR sonuçları kıyaslandığında, pirosekans ile subtip 2 olarak tiplendirilen 2 örnekten bir tanesi konvansiyonel PZR ile subtip 1, diğeri de subtip 3 olarak genotiplendirilmiştir. Ayrıca pirosekans ile subtip 3 olarak genotiplendirilen bir örnek de konvansiyonel PZR ile subtip1 olarak genotiplendirilmiştir. Konvansiyonel metodlar ile bir Blastocystis örneği subtip1-2, 2 örnek de subtip 2-3 mix enfeksiyon şeklinde tiplendirilmiş ve bu örneklerden pirosekans ile subtip1-2 nin subtip 2, subtip 2-3 olanların da subtip 3 olarak belirlediği saptanmıştır. Konvansiyonel PZR ve pirosekans yönteminin uyumluluğuna bakıldığında sadece 3 örnekte farklı genotiplendirme yaptıkları görülmüştür. İki yöntemin %94,7 oranında aynı sonucu verdiğini saptanmıştır. İstatistiksel analizi yapılmış kappa testi ile uyumluluğa bakılmış ve % 88 oranında uyumlu çalıştıkları gösterilmiştir. Pirosekans yöntemi altın standart olarak kabul edilip ve konvansiyonel PZR yönteminin özgüllük ve duyarlılığı hesaplandığında Pirosekans yöntemine göre % 95 duyarlılığa ve %95,2 özgülüğe sahip olduğu tespit edilmiştir. Konvansiyonel PZR ve ülkemizde ilk defa Blastocystis alttür tayininde kullanılan pirosekans yönteminin karşılaştırılmasında iki yöntemin Blastocystis saptanmasında uyumlu olduğu, Blastocystis alttür 94

108 tayininde pirosekans yöntemi konvansiyonel PZR yöntemine göre daha hızlı ve doğru sonuçlar elde edilebileceği sonucuna varılmıştır. Anahtar Sözcükler: Blastocystis, PZR, Pirosekans 95

109 8. SUMMARY pyrosequencing Determination of Blastocystis subtypes with Blastocystis is not classified for many years. Some authors are included in the classification of fungi and some authors are included in the classification of protozoa. In 1912, it has been named by Brumpt as Blastocystis hominis.today; it is known that Blastocystis subtypes caused infections both humans and animals. Blastocystis infections generally transmitted by fecal-oral route and it is usually asemptomatic. Blastocystis infections are more frequent in developing countries than the developed countries. Especially it is more comman in tropic and subtropic areas and widely available all over the word. The aim of our study is that comparision of the conventional PCR and the pyrosequencing technique for genotyping the Blastocystis. In the study, stool specimens were sent in different periods to Gazi University, Faculty of Medicine, Medical Microbiology Department s Parasitology Laboratory and Ankara Numune Training and Researche Hospital Routin Microbiology laboratory between September November 2012 for parasitological examination and Blastocystis isolates genotyping by conventional PCR and pyrosequencing technique. In our study with conventional PCR seven of 60 samples genotyped as subtype 1, nine of them genotyped as subtype 2, fourty one 96

110 of them genotyped as subtype 3 and with pyrosequencing six of 60 samples genotyped as subtype 1, eleven of them genotyped as subtype 2, fourty of them genotyped as subtype 3. When the conventional PCR and pyrosequencing results were compared; with pyrosequencing two samples genotyped as subtype 2 and with conventional PCR one of two samples genotyped as subtype 1, and the other was genotyped as subtype 3. In addition one of the sample was genotyped as subtype 3 by pyrosequencing and with conventional PCR it was genotyped as subtype 1. Blastocystis samples were identified as mix infection by using conventional PCR. One of sample was genotyped as subtype 1,2 and the other two sample was genotyped as subtype 2-3. With using pyrosequencing method, samples were identified and subtype 1,2 genotyped as subtype 2 and subtype 2-3 genotyped as subtype 3, respectively. Looking at the compatibility of conventional PCR and pyrosequencing only three of the sample was genotyped different and 94.7 % the same result was found by two methods. Statistical analysis was performed with the kappa test was 88% compliance was evaluated and shown to work compatible pyrosequencing method can be regarded as the gold standard conventional PCR method s specificity was 95%, and sensitivity was 95.2%. Conventional PCR method and pyrosequencing method which is used for the first time in our country for Blastocystis genotyping 97

111 are compatible fort the genotyping of Blastocystis. And it is conclude that pyrosequencing is more faster and accurate method than the conventional PCR. Key Words: Blastocystis, PCR, Pyrosequencing 98

112 9. KAYNAKLAR 1.Babür C, Taylan Özkan A, Kılıç S, Taştaban Ş, Danışmaz O, Esen B. Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı Parazitoloji Laboratuvarında yıllarında saptanan barsak parazitlerinin değerlendirilmesi. Türk Hijyen ve Deneysel Biyoloji Dergisi 2009; 66 (1): Kaya S, Demirci M, Demirel R, Cicioğlu Arıdoğan B, Öztürk M, Şirin C. Şehir Merkezinde Bağırsak Parazitleri Prevalansı. Türkiye Par Derg 2004; 28(2): İnceboz T, Usluca S, Över L, Yalçın G, Tuncay S, Özkoç S. Dokuz Eylül Üniversitesi Hastanesi ne Yılları Arasında Başvuran Olgularda Blastocystis hominis Epidemiyolojisinin Araştırılması. Türkiye Parazitol Derg 2011; 35: Yakoob J, Jafri W, Jafri N, Khan R, Islam M, Beg MA, Zaman V. Irritable Bowel Syndrome: in Search of an Etiology: Role of Blastocystis hominis Am. J. Trop Med Hyg 2004; 70(4): Doğruman Al F, Dağci H, Yoshikawa H, Kurt Ö, Demirel M. A possible link between subtype 2 and asymptomatic infections of Blastocystis hominis. Parasitol Res 2008; 103: Stensvold R, Brillowska-Dabrowska A, Nielsen HV, Arendrup MC. Detection of Blastocystis hominis in unpreserved stool specimens by using polymerase chain reaction. J Parasitol 2006; 92(5):

113 7.Zaman V, Howe J, Ng M. Scanning electron microscopy of Blastocystis hominis cysts. Parasitol Res, 1998; 84: Yoshikawa H, Wu Z, Kimata I, Iseki M, Karim I, Momammad B, Zaman HV, Haque R, Takahashi Y. Polymerase chain reaction-based genotype classification among human Blastocystis hominis populations isolated from different countries Parasitol Res 2004; 92: Tan KS, New insights on classification, identification, and clinical relevance of Blastocystis spp. Clinical Mic Rev 2008; 21(4): Gökahmetoğlu S, Atalay MA, Kılınç A, Hepatit C Virüs Genotiplerinin Pirosekanslama Yöntemi ile Belirlenmesi. Erciyes Tıp Dergisi 2011; 33(2): Montero CI, Shea YR, Jones PA, Harrington SM, Tooke NE, Witebsky FG, Murray R. Evaluation of Pyrosequencing Technology for the Identification of Clinically Relevant Non-Dematiaceous Yeasts and Related Species Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2008; 27(9): Stensvold CR, Traub RJ, Samson-Himmelstjerna G, Jespersgaard C, Nielsen HV, Thompson RCA Blastocystis: Subtyping isolates using pyrosequencin technology Experimental Parasitology 2007;116: Üstün Ş, Turgay N, Blastocystis hominis ve Bağırsak Hastalıkları Türkiye Parazitoloji Dergisi 2006; 30(1):

114 14.Ertuğ S, Dost T, Ertabaklar H, Gültekin B. Blastocystis hominis infeksiyonunda Trimethoprim- Sülfametoksazolün etkisi. Türkiye Parazitol Derg 2009; 33(4): Rajah Salim H, Suresh Kumar G, Vellayan S, Mak JW, Khairul Anuar A, Init I, Vennila GD, Saminathan R, Ramakrishnan. Blastocystis in animal handlers. Parasitol Res 1999; 85(12): Doğruman Al F, Hökelek M. Blastocystis hominis Fırsatçı Bir Patojen mi? Türkiye Parazitoloji Dergisi 2007; 31 (1): Patrick W, Doyle l, Marilyn M, Helgason, Richard G, Mathias, Eileen M, Proctor Epidemiology and Pathogenicity of Blastocystis hominis Journal of Clinical Microbiology 1990; 28 (1): Zierdt CH, Blastocystis hominis past and future. Clin Microbiol Rev 1991; 4(1): Köster D,Hofmann F, Berthold H, Detection of Blastocystis hominis by direct microscopy and culture 1990; 9: Stenzel DJ, Boreham PF. Blastocystis hominis revisited. Clin Microbiol Rev 1996; 9(4): Cavalier-Smith T. A revised six-kingdom system of life. Biol Rev Camb Philos Soc 1998; 73: Tan KS, Singh M, Yap EH. Recent advances in Blastocystis hominis research: hot spots in terra incognita. Int J Parasitol 1998; 32(7):

115 23.Tan KS. New Insights on Classification, Identification, and Clinical Relevance of Blastocystis spp. Clinical Microbiology Reviews 2008; 21(4): Stenzel DJ, Boreham RE, Gillepie SH, Pearson RD, eds. Principles and Practise of Clinical Parasitology. UK: John Wiley&Sons Ltd. 2001; İnceboz T, Usluca S. Blastocystis hominis bağırsak hastalığı için potansiyel bir tehlike olabilir mi? DEÜ Tıp Fakültesi Dergisi 2009; 23(1): Zierdt CH, Tan HK. Ultrastructure and light microscope appearance of Blastocystis hominis in a patient with enteric disease. Z. Parasitenkd 1976; 50: Stenzel DJ, Boreham PFL, McDougall R. Ultrastructure of Blastocystis hominis in human stool samples. Int J Parasitol 1991; 21: Mehlhorn H. Blastocystis hominis, Brumpt 1912: are there different stages or species? Parasitol Res 1988; 74: Stenzel DJ, Lee MG, Boreham PFL. Morphological differences in Blastocystis cysts - an indication of different species? Parasitol Res 1997; 83: Dunn LA, Boreham PFL, Stenzel DJ. Ultrastructural variation of Blastocystis hominis stocks in culture. Int J Parasitol 1989;19:

116 Singh M, Suresh K, Ho LC, Ng GC, Yap EH, Elucidation of the life cycle of the intestinal protozoan Blastocystis hominis. Parasitol Res 81(5): Zaman V, Zaki M, Manzoor M, Howe J, Ng M. Postcystic development of Blastocystis hominis. Parasitol Res 1999; 85: Garcia LS. Diagnostic Medical Parasitology. 4th ed. Washington: ASM Press 2001; Chen TL, Chan CC, Chen HP, Fung CP, Lin CP, Chan WL, Liu CY. Clinical Characteristics and Endoscopic Findings Associated with Blastocystis hominis in Healthy Adults. Am J Trop Med Hyg 2003; 69(2): Boreham, PF, and DJ Stenzel. Blastocystis in humans and animals: morphology, biology, and epizootiology. Adv Parasitol 1993; 32: Özyurt M, Kurt Ö, Molbak K, Nielsen HV, Haznedaroglu T, Stensvold CR. Molecular epidemiology of Blastocystis infections in Turkey Parasitology International 2008; 57: Kaya S, Sesli Çetin E, Akçam Z, Kesbiç H,Demirci M. Entamoeba coli ve Blastocystis hominis Saptanan Olgularda Klinik Semptomlar Türkiye Parazitoloji Dergisi 2005; 29 (4):

117 39.İnceboz T, Üner A. Blastocystis hominis in Epidemiyolojisinin Araştırılması. Türk Parazitoloji Dergisi 2001; 25: Aykan B, Çağlar K, Kuştimur S. Gaita örneklerindeki protozoonların Trikrom boyası kullanılarak değerlendirilmesi. Türkiye Parazitol Derg 2005; 29(1): Yazar S, Yaman O, Gözenç N, Şahin İ. Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı na başvuran hastalarda bağırsak parazitlerinin dağılımı. Türkiye Parazitol Derg 2005; 29(4): Yoshikawa H, Nagano I, WuZ, Yap EU, Singh M. Takahashi Y Blastocystis hominis strains and development of subtype-specific diagnostic primers. Mol Cell Probes 1998; 12(3): Lanuza MD, Carbajal JA, Villar J, Mir A, Borras R. Soluble-protein and antigenic heterogeneity in axenic Blastocystis hominis isolates: pathogenic implications. Parasitol Res 1999; 85(2): Tan KS, Ibrahim M, Ng GC, Nasirudeen AM, Ho LC, Yap EH, Singh M. Exposure of Blastocystis species to a cytotoxic monoclonal antibody. Parasitol Res 2001;87(7): Zuckerman MJ, Watts MT, Ho H, Meriano FV. Blastocystis hominis infection and intestinal injury. Am J Med Sci 1994; 308: Tan KS, Mirza H, Joshua DW, Teo, Binhui WU, Paul A. MacAry Current Views on the Clinical Relevance of Blastocystis spp. Curr Infect Dis Rep 2010; 12:

118 47.Iguchi A, Yoshikawa H, Yamada M, Kimata I, Arizono N. Expression of interferon gamma and proinflammatory cystokines in the cecal mocosa of rats experimentally infected with Blastocystis sp. strain RN94-9. Parasitol Res 2009;105: Puthia MK Vaithilingam A, Lu J, Tan KS. Degradation of human secretory immunoglobulin A by Blastocystis. Parasitol Res 2005; 97: Poirier P, Wawrzyniak I, Albert A, Alaoui HE, Delbac F, Livrelli V. Development and Evaluation of a Real-Time PCR Assay for Detection and Quantification of Blastocystis Parasites in Human Stool Samples: Prospective Study of Patients with Hematological Malignancies Journal of Clinical Microbiology 2011; 49(3) : Chen JL, Vaudry WL, Kowalewska K, Wenman WM. Lack of serum immune response to Blastocystis hominis. Lancet 1987; 31(2): Hussain R, Jaferi W, Zuberi S, Baqai R, Abrar N, Ahmed A, Zaman V. Significantly increased IgG2 subclass antibody levels to Blastocystis hominis in patients with irritable bowel syndrome. Am J Trop Med Hyg 1997; 56(3): Chen XQ, Singh M, Ho LC, Moe KT, Tan SW, Yap EH. A survey of Blastocystis sp. in rodents. Lab Anim Sci 1997;47(1): Chen XQ, Singh M, Ho LC, Tan SW, Ng GC, Moe KT, Yap EH. Description of a Blastocystis species from Rattus norvegicus. Parasitol Res 1997; 83(4):

119 54.Tan SW, Ho LC, Moe KT, Chen XQ, Ng GC, Yap EH, Singh M, Production and characterization of murine monoclonal antibodies to Blastocystis hominis. Int J Parasitol 1996; 26(4): Yoshikawa H, Katakiri I, Li X, Becker-Hapak M, Graves DC, Antigenic differencies between Blastocystis hominis and Blastocystis sp. Revealed by polyclonal and monoclonal antibodies. J Protozool Res 1995; 5: Kaneda Y, Horiki N, Cheng X, Tachibana H, Tsutsumi Y. Serologic response to Blastocystis hominis infection in asymptomatic individuals. Tokai J Exp Clin Med 2000; 25(2): Tan SW, Singh M, Ho LC, Howe J, Moe KT, Chen XQ, Ng GC, Yap EH. Survival of Blastocystis hominis clones after exposure to a cytotoxic monoclonal antibody. Int J Parasitol 1997; 27(8): Cirioni O, Giacometti A, Drenaggi D, Ancarani F, Scalise G. Prevalence and clinical relevance of Blastocystis hominis in diverse patient cohorts. Eur J Epidemiol 1999; 15(4): Miller SA, Rosario CL, Rojas E, JV Scorza Intestinal parasitic infection and associated symptoms in children attending day care centres in Trujillo, Venezuela Tropical Medicine and International Health 2003; 8(4): Tasova Y, Sahin B, Koltas S, Paydas S. Clinical significance and frequency of Blastocystis hominis in Turkish patients with hematological malignancy. Acta Med Okayama 2000; 54:

120 61.Pikula ZP. Blastocystis hominis and human disease. J Clin Microbiol 1987; 25: Dunn LA, Boreham PFL. The in-vitro activity of drugs against Blastocystis hominis. J Antimicrob Chemother 1991; 27: Narkewicz, MR, Janoff EN, Sokol RJ, Levin MJ. Blastocystis hominis gastroenteritis in a hemophiliac with acquired immune deficiency syndrome. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1989; 8: Hahn P, Fleischer NFK. Blastocystis hominis is it of clinical importance? Trop Med Parasitol 1985; 36: Çekin H, Çekin Y, Adakan Y, Tasdemir E, Koçlar FG Yolcular BO. Blastocystosis in patients with gastrointestinal symptoms: a case control study BMC Gastroenterology 2012, 12: Doğan N, Öz Y, Kocman NÜ, Nursal AF Bağırsak Parazitlerinin Tanısında Direkt Mikroskobik İncelemedeki Bireysel Farklılıkların Karşılaştırılması Turkiye Parazitol Derg 2012; 36: Örs OP, Güçlü YA, Yılmazer TT, Öngel K. Rutin kontrol sırasında saptanan asemptomatik bir olgu: Blastocystis hominis An asymptomatic individual detected during a routine control: Blastocystis hominis. Smyrna Tıp Derg 2011; Panagiotis G. Menounosa, Spanakosb G, Tegosb N, Vassalosc, Chrysanthi CM, Papadopoulouc, Vakalis NC. Direct detection of Blastocystis sp. in human faecal samples and subtype assignment using 107

121 single strand conformational polymorphism and sequencing. Molecular and Cellular Probes 2008; 22: Garcia LS, Diagostic Medical Parasitology. Fourth edition. Washington: ASM Press, Miller RA, Minshew BH. Blastocystis hominis: An Organism in Search of a Disease Reviews of Infectious Diseases, 1998; 10(5): Leelayoova S, Taamasri P, Rangsin R, Naaglor T, Thathaisong U, Mungthin M. In vitro cultivation: a sensitive method for detecting Blastocystis hominis. Ann Trop Med Parasitol 2002; 96(8): Kukoschke KG, Necker A, Muller HE, Detection of Blastocystis hominis by direct microscopy and culture. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1990; 9(4): Tungtrongchitr A, Manatsathit S,Kositchaiwat C, Ongrotchanakun J, Munkong N, Chinabutr P, Leelakusolvong S, Chaicumpa S. Blastocystis homin is infection in irritable bowel syndrome patients Southeast Asian J Trop Med Public Health 2004; 4(3): Zierdt CH, Zierdt WS, Nagy B. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of serum antibody to Blastocystis hominis in symptomatic infections. J Parasitol 1995; 81(1): Mahmoud MS, Saleh WA. Secretory and humoral antibody responses to Blastocystis hominis in symptomatic and asymptomatic human infections. J Egypt Soc Parasitol 2003; 33(1):

122 76. Yoshikawa H, Niichiro Abe Zhiliang Wu. PCR-based identification of zoonotic isolates of Blastocystis from mammals and birds Microbiology 2004;150: Termmathurapoj S, Leelayoova S, Aimpun P, Thathaisong U, Nimmanon T,Taamasri P. Mungthin M. The usefulness of short-term in vitro cultivation for the detection and molecular study of Blastocystis hominis in stool specimens Parasitol Res 2004; 93: Parkar U, Traub RJ, Kumar S, Mungthin M, Vitali S, Leelayoova S, Morris K, Thompson RC. Direct characterization of Blastocystis from faeces by PCR and evidence of zoonotic potential. Parasitology 2007; 134( 3): Li L, Zhou X, Dub Z, Wang X, Wang LLL, Jiang J, Yoshikawa H, Steinmann P, Utzinger J,Wu Z, Chen J, Chen S, Zhang L. Molecular epidemiology of human Blastocystis in a village in Yunnan province, China Parasitology International 2007; 56: Yoshikawa H. Molecular comparative studies among Blastocystis isolates obtained from humans and animals. J Parasitol 2003; 89: Stensvold CR, Suresh GK, Tan KS, Thompson ARC, Traub RJ, Viscogliosi E, Yoshikawa H, Clark CG. Terminology for Blastocystis subtypes a consensus Trends in Parasitology 2007; 23(3). 82.Scicluna SM, Tawari B, Clark CG. DNA barcoding of Blastocystis. 2006;157(1):

123 83.Persing D.H Polymerase Chain Reaction: Trenches to Benches Journal of Clinical Microbiology 1991; 29(7): Erlich HA. Polymerase chain reaction Journal of Clinical Immunology 1989; 9(6): Mullis KB. The unusual origin of th polymerase chain reaction. Scientific American 1990; Saiki RK, Scharf S,Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA and Arnheim N. Enzymatic amplification of B-globulin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 1985; 230: Innis MA and Gelfand DH. Optimization of PCRs, PCR Protocols Academic Press, New York 1990; Hadidi A, Levy L, Podleskis EV. Polymerase chain reaction technology in plant pathology. In: Molecular Methods in Plant Pathology, Eds. R. P. Singh, U. S. Singh. Boca Raton: CRS Press. 1995; Maxam A, Gibert W. A new method of sequencing DNA. Proceedingsof the National Academy of Science 1977; 74(4): Sanger F, Nicklen S, Coulson AR, DNA sequencing with chain- terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences 1977; 74(7):

124 91.Sambrook, Fritsch JEF, Maniatis T. Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd ed. N.Y, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Klug SW, Cummings WR, Concept of Genetics, Prentice Hall, New Jersey 2000; Ronaghi M, Nygren M, Lundeberg J, Nyre n P. Analyses of Secondary Structures in DNA by Pyrosequencing Analytical Biochemistry 1999; 267: Ronaghi M. Pyrosequencing Sheds Light on DNA Sequencing Genome Res 2001;11: Lilian TC, França, Carrilho E, Kist TBL A review of DNA sequencing techniques Quarterly Reviews of Biophysics 2002;35(2): Gharizadeh B. Method development and applications of Pyrosequencing technology. Doctoral dissertation from the Department of Biotechnology, Royal Institute of Technology, Stockholm-Sweden, Yoshikawa H, Abe N, Wu Z. Genomic polymorphism among Blastocystis isolates and development of PCR-based identification of zoonotic isolates. J Eukaryot Microbiol 2003; 50 : Silberman JD, Sogin ML, Leipe DD, Clark CG, Human parasite Wnds taxonomic home. Nature 1996; 380,

125 100.Arisue N, Hashimoto T, Yoshikawa H, Sequence heterogeneity of the small subunit ribosomal RNA genes among Blastocystis isolates. Parasitology 2003;126: Noël C, Dufernez F, Gerbod D, Edgcomb VP, Delgado-Viscogliosi P, Ho LC, Singh M, Wintjens R, Sogin ML, Capron M, Pierce R, Zenner L, Viscogliosi E. Molecular phylogenies of Blastocystis isolates from diverent hosts: Implications for genetic diversity, identiwcation of species and zoonosis. Journal of Clinical Microbiology 2005; 43: Ahmadian A, Ehn M, Hober S. Pyrosequencing: history, biochemistry and future. Clinica Chimica Acta 2006; 363: Voelkerding KV, Dames SA, Durtschi JD. Next-Generation Sequencing: From Basic Research to Diagnostics Clinical Chemistry 2009; 55: Sreekumar C, Hill DE, Miska KB, Vianna MC, Yan L, Myers RL, Dubey JP Genotyping and detection of multiple infections of Toxoplasma gondii using Pyrosequencing. Int J Parasitol 2005;35(9): Jordan JA, Butchko AR, Durso MB. Use of pyrosequencing of 16S rrna fragments to diverentiate between bacteria responsible for neonatal sepsis. Journal Molecular Diagnostics 2007, Bushman FD, Hoffmann C, Ronen K,Malani N,Minkah N, Rose HM, Tebas P, Wang GP. Massively paralel pyrosequencing in HIV research AIDS 2008; 22:

126 107.Frias FR, Tabernero D, Quer J,Esteban JI, Ortega I, Domingo E, Cubero M, Camos S, Ferrer-Costa C,Sanchez A, Jardı R, Schaper M, Homs M, Garcia-Cehic D, Guardia J, Esteban R, Buti M. Ultra-Deep Pyrosequencing Detects Conserved Genomic Sites and Quantifies Linkage of Drug-Resistant Amino Acid Changes in the Hepatitis B Virus Genome 2012; 7: Takala SL, Smith DL, Stine OC, Coulibaly, D, Thera MA, Doumbo OK, Plowe CV. A high-throughput method for quantifying alleles and haplotypes of the malaria vaccine candidate Plasmodium falciparum merozoite surface protein-1 19 kda. Malaria Journal 2006; 20: Monis P, Andrews RH. Molecular epidemiology: assumptions and limitations of commonly applied methods. International Journal for Parasitology 1998; 28: Meloni D, Sanciu G, Poirier P, El Alaoui H,Chabé M, Delhaes L, Dei- Cas E, Delbac F, Luigi Fiori P, Di Cave D, Viscogliosi E. Molecular subtyping of Blastocystis sp. isolates from symptomatic patients in Italy. Parasitol Res 2011;109(3): Christopher M, Boorom WK, Bermudez LE, & Kent ML. Molecular characterization of Blastocystis species in Oregon identifies multiple subtypes. Parasitol Res 2010; 106: Böhm-Gloning B, Knobloch, J, Walderich B. Five subgroups of Blastocystis hominis isolates from symptomatic and asymptomatic patients revealed by restriction site analysis of PCR-ampliWed 16S-like rdna. Tropical Medicine and International Health 1997; 2:

127 113.Doğruman Al F, Yoshikawa H, Kuştimur S, Balaban N. PCR-based subtyping of Blastocystis isolates from symptomatic and asymptomatic individuals in a major hospital in Ankara, Turkey. Parasitol Res 2009 ; 106(1): Windell L, Rivera Æ Michael Alfred V Tan. Molecular characterization of Blastocystis isolates in the Philippines by riboprinting Parasitol Res 2005; 96: Kenneth HS, Wong GC, Ng Raymond TP, Lin Yoshikawa H, Taylor MB, Tan KSV. Predominance of subtype 3 among Blastocystis isolates from a major hospital in Singapore.Parasitol Res 2008, 102: Windell L, Rivera. Phylogenetic analysis of Blastocystis isolates from animal and human hosts in the Philippines 2008; 156(3 4):

128 10.EKLER TEŞEKKÜR Tez konumun belirlenmesinde ve hazırlanmasında, bilgi ve deneyimleri ile desteğini hiçbir zaman esirgemeyen yüksek lisans öğrenimimim her aşamasında büyük katkıları olan çok kıymetli hocam Sayın Doc.Dr.Funda DOĞRUMAN AL a, Yüksek lisans eğitimim boyunca ilgi ve bilgileri ile bana yardımcı olan Tıbbı Anabilim Dalıʼnın değerli öğretim üyeleri, Prof. Dr. Nedim SULTAN a, Prof. Dr. Seyyal ROTAʼya, Prof. Dr. Meltem YALINAY ÇIRAKʼa, Prof. Dr. Kayhan ÇAĞLARʼ a, Doç. Dr. Gülendam BOZDAYIʼ ya, Doç.Dr. Işıl FİDAN ʼa, teşekkür ederim. Manevi desteklerini eksik etmeyen, her aşamanın yanımda olan değerli arkadaşlarım Doktora öğrencisi Merve Aydın, Yüksek Lisans Öğrencisi Ali Afandi ve Yüksek Lisans Öğrencisi İlkiz OĞUZ a teşekkür ederim. Ayrıca yüksek lisans eğitimim süresince birlikte çalıştığım tüm doktora, yüksek lisans ve tıpta uzmanlık yapan arkadaşlarıma, laboratuvar çalışanlarına bana desteklerinden dolayı teşekkür ediyorum. Yaşamım boyunca her türlü maddi ve manevi desteği esirgemeyen, bütün başarılarıma büyük katkıları olan, beni hiçbir zaman yalnız bırakmayan hayatıma anlam katan canım annem ve babama sonsuz teşekkür ederim. TUĞÇE NİL YANTIRA 115

129 116