ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ BAZI STANDART ve KİLİS İLİ ZEYTİN (Olea europaea L.) ÇEŞİTLERİNİN SSRs (Simple Sequence Repeats) MARKÖRLER ARACILIĞIYLA GENETİK TANIMLANMASI FERDA AKANSU BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ANKARA 2008 Her hakkı saklıdır

2

3 ÖZET Yüksek Lisans Tezi BAZI STANDART ve KİLİS İLİ ZEYTİN (Olea europaea L.) ÇEŞİTLERİNİN SSRs (Simple Sequence Repeats) MARKÖRLER ARACILIĞIYLA GENETİK TANIMLANMASI Ferda AKANSU Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. E. Sümer ARAS Zeytinin anavatanı olan Yukarı Mezopotamya içinde yer alan Kilis ilinden, seleksiyon ıslahı yolu ile elde edilen 13 tip ile 8 adet yerli standart ve 4 adet yabancı çeşit referans olmak üzere toplam 25 zeytin genotipi, DNA genetik kimliklerinin araştırılması amacı ile SSR analiz yöntemleri kullanılarak test edilmiştir. Her bir SSR lokusu için allel büyüklükleri Beckman CEQ TM 8800 Genetik Analiz Sistemi ile belirlenirken, allel sayısı, beklenen ve gözlenen heterozigotluk ve tanımlama olasılığı tespit edilmiştir, elde edilen sonuçlar dendogram düzeyinde değerlendirilmiştir. Ekim 2008, 51 sayfa Anahtar Kelimeler : Olea europaea L. cvs., Kilis, mikrosatellit, genetik tanımlama i

4 ABSTRACT Master Thesis GENETIC IDENTIFICATION OF SOME STANDART AND KİLİS PROVINCE (Olea europaea L. ) OLIVE CULTIVARS BY SSRs (Simple Sequence Repeats) MARKERS Ferda AKANSU Ankara University Graduate School of Natural and Applied Science Department of Biology Supervisor: Assoc. Prof. Dr. E. Sümer ARAS 25 olive genotype that consist of 13 types obtained by selection melioration from Kilis city which is in upper Mesopotamia region is homeland of olive, 8 unit domestic standard and 4 unit foreign references are analyzed by SSR method to investigate the genetic DNA identity. Each of SSR locus allel sizes are determined by Beckman CEQ TM 8800 Genetic Analyses System thus we determined the allel quantity, expected and observed heterozygote and specification probability. Moreover the obtained results are evaluated at dendogram level. October 2008, 51 pages Key Words: Olea europaea L. cvs Kilis, microsatellites, genotyping ii

5 TEŞEKKÜR Bu konuda bana çalışma olanağı veren, her konuda yardımlarını esirgemeyen, danışman hocam Sayın Doç.Dr. E. Sümer ARAS a (Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Anabilim Dalı), Biyoteknoloji Merkez Laboratuvarı nda tezimle ilgili çalışmalarımı yürütmeme izin veren, tezin oluşum sürecinde bilgilerini ve desteğini benimle paylaşan hocam Sayın Doç.Dr. Ali Ergül e (Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü) ve yazım aşamasında tecrübelerini benimle paylaşan Arş.Gör. Ebru ÇAKIR a, Uz.Bio. Canan YÜKSEL e, Zir.Yük.Müh. Funda YILDIRIM a ve Arş.Gör. Ali Emre AKPINAR a teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca, bu çalışma boyunca ve hayatım boyunca her türlü maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen, en zor anlarımda bu zorlukları benimle paylaşan ve sevgilerini hep yanımda hissettiğim tek varlığım aileme ve tezimin araştırma ve yazım aşamalarında tecrübelerinden yararlandığım canım ablam Uz.Dr. Belma KARATOKA ya ve eniştem Dr. Oliver SHARPE a teşekkürü bir borç bilirim. Ferda AKANSU, Ankara, Ekim 2008 iii

6 İÇİNDEKİLER ÖZET...i ABSTRACT...ii TEŞEKKÜR...iii SİMGELER DİZİNİ...v ŞEKİLLER DİZİNİ...vi ÇİZELGELER DİZİNİ...vii 1.GİRİŞ KURAMSAL TEMELLER Markörler Hibridizasyona dayalı moleküler markörler PCR (Polymerase Chain Reaction) a dayalı DNA markörleri Zeytinde Mikrosatellit Çalışmaları MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Yöntem DNA İzolasyonu SSR allel bölgelerinin PCR aracılığı ile çoğaltılması Çalışmada kullanılan SSR primerleri PCR ürünlerinin kapiller elektroforezi ve allel verilerinin görüntülenmesi Genetik analizler ARAŞTIRMA BULGULARI Kapiller Elektroforez Yöntemi ile Elde Edilen Allel büyüklükleri Yazılım Programları ile Sonuçların Değerlendirilmesi TARTIŞMA VE SONUÇ SSR Analizleri Genotip-SSR İlişkilendirmeleri...43 KAYNAKLAR...44 ÖZGEÇMİŞ...51 iv

7 SİMGELER DİZİNİ bp Base pair (Baz çifti) CTAB Hekzadesil Trimetil-Amonyum Bromür D Descrimination Power (Ayırma Gücü) DNA Deoksiribo Nükleik Asit dntp Deoksi-Nükleozid Trifosfat EDTA Etilen Diamin Tetra Asetik Asit H e H o MgCl 2 mm Expected heterozigosity (Beklenen heterozigotluk) Observed heterozigosity (Gözlenen heterozigotluk) Magnezyum Klorür Milimol µl Mikrolitre M Mol n The number of allelles (Allel sayısı) PCR Polymerase Chain Reaction (Polimeraz zincir reaksiyonu) PI Probability of Identity (Tespit olasılığı) PVPP Polivinilpolipirolidon RAPD Random Amplified Polymorphism DNA (Rastgele çoğaltılmış DNA farklılığı) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Kesilmiş parça uzunluğu farklılığı) RNase Ribonükleaz rpm Dakikadaki dönüş sayısı SSR Simple Sequence Repeats (Basit dizi tekrarları) TBE Tris-Borik Asit-EDTA Çözeltisi TE Tris-EDTA Çözeltisi v

8 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 1.1 Zeytinciliğinin tarihçesi ve yayılışı...1 Şekil 2.1 Rekombinant DNA teknolojisi...6 Şekil 2.2 Dünya zeytin yetiştiricilik alanları...9 Şekil 2.3 Türkiye de zeytin üretim alanları...11 Şekil 3.1 Örneklerin ezilmesi...24 Şekil 3.2 Ezilen yaprak örneklerin saklanması...24 Şekil 3.3 Ekstraksiyon aşamasında su banyosunda bekletme...25 Şekil 3.4 Ekstraksiyon aşaması santrifüj...25 Şekil 3.5 Bazı zeytin genotiplerine ait DNA ların %1 lik agaroz jeldeki görüntüleri...26 Şekil 3.6 DNA oranları-saflıkları NanoDrop ND-1000 spektrofotometre ile yapıldı...26 Şekil 3.7 SSR kapilleri elektroforez yönteminde uygulama aşamalarının genel görünümü...30 Şekil 4.1 İzolasyon sonucu elde edilen DNA ların %1 lik agaroz jel elektroforez görünümü...31 Şekil 4.2 PCR ürününün agaroz jel üzerindeki görünümü...33 Şekil 4.3 PCR ürününün agaroz jel üzerindeki görünümü...33 Şekil 4.4 CEQ TM 8000 genetik analiz sistemi...34 Şekil 4.5 Kapiller elektroforezde çoklu allel büyüklükleri...34 Şekil 4.6 Kapiller elektroforezde SSR lokusuna ait allel büyüklüğü Şekil 4.7 Kapiller elektroforezde SSR lokusuna ait allel büyüklükleri...35 Şekil 4.10 Çeşitlere ait veriler doğrultusunda çizilen dendogram...40 vi

9 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1 Dünya zeytin üretim alanları ve üretimi Çizelge 2.2 Türkiye zeytin üretimi Çizelge 3.1 DNA ekstraksiyon çözeltisi...23 Çizelge 3.2 Çalışmada kullanılan SSR primerleri...28 Çizelge 4.1 Araştırmada kullanılan zeytin genotiplerine ait DNA yoğunlukları, saflık dereceleri ve 100 ml sulandırılmış DNA hazırlamada kullanılan DNA miktarları(µl)...32 Çizelge 4.2 Kilis genotiplerinin 5 lokustaki allel büyüklükleri(bp) Çizelge 4.3 Lokuslara ait allel sayıları (N), beklenen heterozigotluk değerleri (He), gözlenen heterozigotluk değerleri (Ho) ve tespit olasılığı (PI)...37 Çizelge 4.4 Lokuslardaki alleller ve frekans değerleri...38 Çizelge 4.5 Standart ve Kilis ili zeytin çeşitlerinin genetik benzerlik değerleri...39 vii

10 1. GİRİŞ Akdeniz kültürünün bir sembolü olan zeytin (Olea europaea L.), tarih boyunca bu bölgede kurulan uygarlıkların temelini oluşturmuştur. Zeytinin anavatanının ve gen merkezinin Güneydoğu Anadolu Bölgesi ni de içine alan Yukarı Mezopotamya olduğu araştırıcılarca ifade edilmektedir (Özkaya et al. 2006). Son yıllarda yapılan çalışmalarla Hatay, Kahramanmaraş ve Mardin şeridinde zeytin ağacının en alt türüne rastlanmış olması bu yargıyı kesinleştirmektedir. Şekil 1.1 Zeytinciliğinin tarihçesi ve yayılışı (Rallo et al. 2000) Zeytin, yaklaşık olarak 30 genus (cins) ve 600 species (tür) ihtiva eden Oleaceae familyasına (ailesine) bağlıdır. Olea cinsi, europaea türü ve sativa subspecies ine (alttürüne) ait olan ve diğer bir subspecies oleaster e ait olan yabani zeytinden ayırtedilen kültür zeytini, Akdeniz çevresinde yayılmış durumdadır. Olea europaea nın özelliklerinin farklılaşması ve kendiliğinden nesilden nesile geçmesi sonucunda türediği söylenmektedir. Son çalışmalar, Oleae genusunu sınıflandırılmasını, Afrika, Asya va Avustralya da bulunan farklı türlerin heterotipik sinonimleri (aynı tipteki eşanlamlıları), hayat devreleri ve formları (habitüsü=şekli) nin tespiti yoluyla, yeniden düzenleme eğilimindedir. 1

11 Olea cinsinin bütün türlerinde 23 (2n=46) kromozom vardır. Olea europaea ye ait mevcut türler çok fazladır den fazla çeşite sahip olduğu tahmin edilen zeytin gibi, çeşit zenginliği olan çok az kültür bitkisi olduğu söylenebilir. Daha büyük meyveli, daha fazla yağ oranı içeren, zararlılara daha dayanıklı v.b. gibi verimli genetik oluşumların ıslahına izin veren kültür sistemleri gelişirken, bazı çeşitlerin kaybolduğu ve yeni çeşitlerin doğal olarak nesilden nesile geçmesi ile kendiliğinden oluştuğu da bir olasılıktır. Bununla birlikte, bilhassa belirli, zor iklim koşullarında, gerek dışarıdan gen akışı, gerekse yeni genlerle dejenere olmuş (değişmiş) özel çeşitlerin mevcudiyeti sebebiyle türler kendi kendine oluşabilmektedir. Farklı çeşitlerin aynı isimle sınıflandırılması (homonimler) veya bir çeşitin aynı veya farklı çevrelerde farklı isimlendirilmesi (sinonim) den ötürü henüz bir sisteme bağlı olmayan zeytin çeşitlerinin tanımlanması ve sınıflandırılması, çok fazla aynı isimle adlandırılan (homonim) ve genetik olarak benzer (sinonimin) bulunmasıyla karmaşık hal almıştır ten beri Yunanistan, İspanya ve Fransa da sürgünler, yapraklar ve kök uçları üzerinde yürütülen elektroforez metotlarının uygulandığı izoenzimatik çalışmalarla denenen birkaçı dışında, genetik metodların hala tam anlamıyla gelişmemiş olması farklı çeşitleri ayırt etmede başlıca zorluğu oluşturmaktadır. Bu tekniklerin uygulanmasında karşılaşılan en önemli sorun, bitkinin değişik gelişme ve büyüme safhalarında izoenzimlerin nitelik ve niceliğinin değişmesi sonucunda yeni allellerin ortaya çıkması, öncekilerin yok olmasıdır ve buna bağlı olarak örnekleme güçleşmektedir. Bugüne kadar çalışılan enzimatik sistemler, zeytinin bütün genom hattının sadece küçük bir kısmını ifade etmektedir. Bunun nedeni, bu tekniklerin sadece birkaçı için bilinmesidir. Bu yüzden, izoenzimlerle ilgili farlılıklarla karşılaşılmamış olsa bile, genetik varyasyon (çeşitlilik) tamamen reddedilemez. 2

12 İzoenzimlere ek olarak, diğer biyokimyasal işaretler çeşitlerin tanımlanması için kullanılabilir (örneğin ince tabakalı kromotografik analizler için Karetenoid Pigmentler sözkonusudur). Bununla birlikte, genlerden doğrudan üretildiklerinden, üretilen enzim sistemleri, en büyük hassasiyetle çeşitler arasındaki genetik farklılıkları belirlemektedirler. Sadece RFLP analizleri zeytinin bütün genomlarını tamamlayıcı bir bilgi sunmaktadır, fakat bu yöndeki çalışmalar hala başlangıç safhasındadır. Genetik olarak çeşitleri ayırt etmek için kullanılan analitik tekniklerin uygulanmasındaki güçlükler nedeniyle, değişik çeşitlerin morfolojik, biyolojik ve agronomik özellikleri değerlendirilmiş olmaktan çok uzaktır (Anonim 1997). Yapılan çalışmaların tümünde karşılaşılan ortak sorun elde edilen verilerin çeşit/tip tanımlandırılmasında yetersiz olmasıdır. Ekolojik koşullara bağlı olarak incelenen karakterlerin değişkenlik göstermesi en önemli neden olarak ifade edilmektedir. Bu sorunun çözümüne yönelik olarak biyokimyasal (izoenzim) ve RAPD gibi DNA tabanlı analizler çok çeşitli araştırıcı grupları tarafından yapılmıştır (Pontikis et al. 1980; Quazzani et al. 1993, Trujillo and Rallo 1995, Bagoni et al. 1994, Fabbri et al. 1995, Claros et al. 2000, Özkaya et al. 2004, Özkaya et al. 2006). İzoenzimlerin transkripsiyon sonrası değişimler göstermesi nedeniyle güvenirliliğinin az olması ve RAPD tekniğinin tekrarlanabilirliğinin düşük olması, araştırıcıları daha kesin ve güvenilir sonuçlar alabilecekleri teknikler (SSR ve AFLP gibi) kullanmaya zorlamıştır. Bunlardan SSR markörler, polimorfizm oranlarının yüksek oluşu, tekrarlanabilirliği ve kodominant karakterli oluşundan dolayı tercih edilirler. Güneydoğu Anadolu bölgesi illerimizden Kilis ilçe ve köylerindeki üstün nitelikli tiplerin ortaya çıkarılarak kaybolmasını önlemek amacıyla yürütülen bu çalışma, SSR markör yardımıyla DNA düzeyinde moleküler analiziyle, gen kaynakları sayısının belirlenmesi ve korunması amaçlanmıştır. Araştırmada, Kilis ilinden 13 zeytin genotipi ile 12 adet referans genotip olmak üzere toplam 25 zeytin genotipinin genetik tanımlamaları yapılmıştır. 3

13 2. KURAMSAL TEMELLER 2.1 Markörler Biyologlar, amino asit dizilerini ve DNA ile RNA daki nükleotid dizilerini okumak için yeni metodlar geliştirdiklerinde, filogenileri hesaplamak için yeni bir çok teknik kullanılmaya başlandı (Freeman and Herron 1999). Sistematikçiler türler arasındaki filogenetik ayrımları yapabilmek için protein ve nükleik asitlerinin karşılaştırmalarını kullanırlar. Bu protein ve nükleik asitler, markör olarak adlandırılırlar. Markörler genel olarak protein markörler (izoenzimler) ve moleküler markörler (RAPD, RFLP, AFLP, SSR vb.) olarak iki grup altında toplanabilir. Moleküler markörler ise hibridizasyona dayalı markörler, PCR (Polymerase Chain Reaction-Polimeraz Zincir Reaksiyonu) a dayalı markörler ve EST ler (Expressed Sequence Tags) olarak gruplandırılır. Moleküler ve genetik anlamıyla markör, bir DNA parçasını ifade eder. Son 10 yıldır moleküler markörler hayvan genetiğinde, DNA seviyesindeki polimorfizmleri ortaya çıkarmak için anahtar rol oynamışlardır (Vignal et al. 2002). Markörlerin kullanım amaçları çok çeşitli olmakla beraber şu şekilde sıralanabilir: - Genetik haritaların hazırlanması - Genetik parmak izi analizleri - Doğrudan gen etkilenmesi - Genlerin klonlanması - Genom analizleri ve organizasyonları - Evrimsel gelişim - Kromozomların yeniden yapılandırılması çalışmaları - Genetik kaynakların ve çeşitlerin korunması çalışmaları - Genetik varyasyon çalışmaları 4

14 - Populasyonlar arası genetik mesafenin veya filogenetik benzerliğin hesaplanması Şu anda en yaygın olarak kullanılan dört temel moleküler markör bulunmaktadır. Bunlar RFLP, RAPD, AFLP ve Mikrosatellit (ya da SSRs-simple sequence repeats-, STRs-short tandem repeats-) dir Hibridizasyona dayalı moleküler markörler RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), Restriksiyon Parça Uzunluk Polimorfizmi olarak bilinen ve çeşitli şekillerde restriksiyon enzimleri ile kesilerek işaretlenmiş DNA parçalarının (prob), araştırılan DNA örneğindeki benzer veya aynı dizilişteki DNA ile hibridizasyonuna dayalı bir sistemdir. Farklı DNA parçalarının jel elektroforez yöntemi ile koşturularak ayrıştırılmasını ve bu parçacıkların membrana aktarılması (blotting) sonucunda prob-dna hibridizasyonu basamaklarını içermektedir PCR (Polymerase Chain Reaction) a dayalı DNA markörleri Rekombinant DNA teknolojisi, 1970 li yılların başında biyoloji bilimi için bir araç olarak geliştirilmiştir (Arnheim and Erlich 1992). Rekombinant DNA terimi, doğal olarak bir arada bulunması mümkün olmayan DNA moleküllerinin birleştirilerek yeni bir kombinasyonun oluşturulmasını ifade eder. Bu teknikteki temel işlemler bir dizi basamağı içerir. Doku ya da hücrelerden izole edilen DNA moleküllerinin, restriksiyon enzimleri ile kesilerek oluşturulan parçaları vektör ya da taşıyıcı bir molekül ile birleştirilir. Kendi DNA sı ile birlikte üzerinde yabancı DNA molekülü taşıyan vektörün oluşturduğu rekombinant DNA molekülü, bir konakçı hücreye aktarılır ve burada kendini konakçı hücre DNA sı ile birlikte eşleyerek kopyalarını yavru hücreye aktarır. Klonlanmış DNA, konakçı hücrelerden izole edilip incelenebilir (Şekil 2.1). 5

15 Şekil 2.1 Rekombinant DNA teknolojisi 1984 yılında bilim adamları in-vivo koşullar yerine in-vitro koşullarda çoğaltmaya bağlı olarak bir DNA amplifikasyonu prosedürü geliştirmişlerdir. PCR (Polymerase Chain Reaction) yani Polimeraz Zincir Reaksiyonu olarak bildirilen bu metod, basit bir enzimatik reaksiyonda, kompleks bir DNA kalıbından, çok miktarda spesifik bir DNA fragmentini oluşturabilmektedir (Arnheim and Erlich 1992). PCR aracılığıyla gerçekleştirilen gen amplifikasyonu, klonlama, analiz ve nükleik asit modifikasyonları için kullanılan prosedürleri kolaylaştırarak, moleküler biyoloji, insan genetiği, evrim, gelişim ve adli vakalar gibi birçok disiplinde uygulanma olanağı bulmuştur. PCR a dayalı moleküler markerlar arasında en yaygın olarak kullanılanlar RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ve Mikrosatellit (ya da SSRs- Simple Sequence Repeats-, STRs-short tandem repeats-) dir. 6

16 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) : Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA olarak adlandırılmaktadır nükleotid uzunluğundaki primer DNA lar kullanılarak, genom üzerinde rastgele bölgelerin çoğatılması gerçekleştirilir. Bu sistemle, genom dizisi hakkında hiçbir şey bilinmeyen DNA lar çalışılır. Primer bağlanmasıyla, Polimeraz 5 3 yönünde çalışarak DNA moleküllerini çoğaltır ve bunlar agaroz jel veya poliakrilamid jel elektroforezi ile birbirinden ayrılıp uygun boyalarla boyanarak izlenebilir. AFLP : Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi denilen bu yöntem, restriksiyon enzimleri ile kesilmiş DNA parçalarının seçici çoğaltılması temeline dayanmaktadır. AFLP de dizi bilgisine gerek yoktur. RFLP ve RAPD yöntemlerine göre 10 kez daha fazla genetik lokus incelenebilmektedir ve nispeten çok daha kısa bir süre içerisinde binlerce bağımsız lokus hakkında yorum yapılabilmektedir. Mikrosatellitler : İnsanlarda, STRs (short tandem repeats) Kısa Tandem Tekrarları ya da bitkilerdeki adıyla SSRs (simple sequence repeats) Basit Dizi Tekrarları olarak da adlandırılan ve ökaryotik genomlarda bulunan ardışık tekrarlanan 2-6 nükleotidli gruplara mikrosatellit denilmektedir. (AT)n, (GT)n, (ATT)n ve (GACA)n gibi örnekler verilebilir. Burada n, ardışık tekrar sayısıdır. Mikrosatellitler kodominant markörlerdir ve Mendel kalıtımı gösterir. PCR la çoğaltılmış mikrosatellit markörler, özel lokusa sahip ve yüksek miktarda polimorfik olmanın avantajına sahiptir. Allel büyüklüğünün belirlenmesi, yüksek çözünürlü elektroforez aracılığıyla elde edilir. Bu markörler kodominanttır ve bu sayede homozigot ve heterozigotların ayrımına izin verir. Mikrosatellit profili (analiz edilen lokusta belirlenen baz çifti), verilen allel büyüklüğüyle temsil edilir. Sonuçta, pratik açıdan mikrosatellit markörlerin, tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu çok kolaydır ve bu nedenle farklı laboratuvarlar arasındaki verilerin transferi ve karşılaştırılması olanağı mevcuttur (Karaağaç 2006). 7

17 Teknik, temel olarak genom boyunca tekrarlanan dizilerin iki yanına bağlanan primerlerce bu bölgelerin PCR da çoğaltılması, agaroz jel ve poliakrilamid jel ya da otomatik dizi analizi sisteminde (kapiller elektroforez) büyüklüklerine göre sıralanması esasına dayanır. Otomatik dizi analizi sisteminde allel büyüklükleri, fluoresan işaretli primer yardımıyla, pikler şeklinde görülür. Her durumda da sonuçların değerlendirilmesi, SSR tekniğinin kullanılış amacına göre geliştirilmiş istatistik programları ile yapılır. 2.3 Zeytinde Mikrosatellit Çalışmaları Zeytin (Olea europaea L.) yetiştiriciliği M.Ö 4000 yılına kadar dayanmaktadır. Bu bitkinin odunundan, meyvelerinden, yağından özellikle kozmetik sanayisinde ve tıp alanında yüzyıllardır faydalanmışlardır. İnsanlar, zeytinin insan sağlığına ve beslenmesine olan öneminin yanında doğal hayata olan faydalarını kavrayıp, zeytin yetiştiriciliğine büyük bir ivme kazandırarak günümüze kadar gelmesini sağlamışlardır. Zeytinin anavatanının Mardin, Hatay, Suriye nin ve Filistin in batı kıyılarını içerisine alan, yani Yukarı Mezopotamya diye adlandırılan bölgenin olduğu kabul edilmektedir. Dünya üzerinde ekonomik olarak zeytin yetiştiriciğili kuzey ve güney enlemleri arasında kalan bölgede yapılmaktadır. Özellikle Akdeniz iklim kuşağının hüküm sürdüğü, yazları kurak ve sıcak, kışları ılık ve yağışlı bölgelerde zeytin bitkisi geniş yayılım alanları gösterir (Rallo et al. 1997). Dünya üzerinde 8.3 milyon ha alan üzerinde 830 milyon zeytin ağacı yetişmektedir. Dünya zeytin ağacı varlığının %98 i yaklaşık olarak 813 milyon ağaç Akdeniz havzasında bulunan ülkeler tarafından yetiştirilmektedir (FAO 2002). Türkiye ha alan ve ton zeytin üretimi ile dünya zeytin yetiştiriciliğinde söz sahibidir. Dünya genelindeki zeytin yetiştiriciliğinin dağılımına baktığımızda %90 lık bir kısmının Akdeniz havzası, geriye kalan kısmının ise Latin Amerika ülkelerinde yayıldığı gözlenmiştir (Şekil 2.7). 8

18 Şekil 2.2 Dünya Zeytin Yetiştiricilik Alanları. (Rallo et al. 2000) Çizelge 2.1. Dünya zeytin üretim alanları ve üretimi (FAO, 2006) Üretim Alanı (ha) Üretim (ton) Dünya İspanya İtalya Yunanistan Tunus Türkiye Suriye Dünyada yaklaşık 9 milyon hektar alanda 900 milyon zeytin ağacından yaklaşık 17 milyon ton dane zeytin üretimi yapılmaktadır. Önemli zeytin üreticileri sırasıyla, İspanya, İtalya, Yunanistan, Tunus, Türkiye ve Suriye gelmektedir (Çizelge 2.1). Dünyada son verilere göre yaklaşık 9 milyon hektar alanda, 900 milyon zeytin ağacından yaklaşık 16 milyon ton dane zeytin üretilmekte, 1,7 milyon tonu sofralığa işlenmekte geri kalanı yağlığa ayrılarak, ortalama 2,5-3,0 milyon ton zeytinyağı elde edilmektedir. Bunların yanı sıra son yıllarda Avustralya, Japonya ve Arjantin gibi ülkelerde de zeytin üretimine başlanılmıştır. Zeytin, genetik özelliğinin yanı sıra kültürel işlemlerin tam 9

19 olarak uygulanamayışı nedeniyle alternans (bir yıl ürün verme-diğer yıl az verme) gösterir. Ürünün alternans eğilimi, üretici ülkelerin yetiştirme politikalarında yer aldığı öneme göre değişen unsurlardan biridir. Türkiye Cumhuriyeti nde zeytinciliğin ilk resmi temelleri Atatürk ün direktifleri ile Tarım Bakanlığının Tarımda Tedrisatı Islah Kanunu ile atılarak başlayan gelişme yıllarını kapsayan teşkilatlı birinci dönemde de devam etmiştir. Bunu izleyen dönemlerinde gelişme durmamış, fakat birinci döneme göre yavaşlamıştır. Bu dönemden sonra gelen 1. Beş Yıllık Kalkınma Planı döneminde ise Türkiye ilk kez ihracatçı ülkeler arasına girerek zeytinyağı ihraç eder konuma gelmiştir. Türkiye ise 650 hektarlık alan üzerinde 130 milyon adet ağaç varlığına sahip iken, ton zeytin üretim gerçekleştirmiştir (Çizelge 2.2). Özellikle son yıllarda yapılan desteklemeler neticesinde Türkiye zeytin ağacı varlığında önemli artışlar sağlanmıştır. Çizelge 2.2. Türkiye zeytin üretimi (TUİK, 2007) Toplam Ağaç Sayısı (1000) Meyve veren / Meyve vermeyen Toplam Üretim (Ton) Sofralık / Yağlık Türkiye de ilk resmi istatistiklere göre zeytincilik 1943/ /1945 kampanyasında hektar alanda, ağaç sayısı, ton dane zeytin, ton sofralık zeytin ve ton zeytinyağı ile başlamış olup, 2004/2005 kampanya döneminde ağaç sayısı , ton, sofralık zeytin ton ve ton zeytinyağı, 2005/2006 kampanya döneminde ise ağaç sayısı tahmini olarak adet, dane üretimi tona, sofralık zeytin üretimi

20 ton, ton zeytinyağı, 2006/2007 kampanya döneminde ise ağaç sayısı adete, dane üretimi tona, sofralık zeytin üretimi ton, ton zeytinyağı üretimine ulaşmıştır. Dünyada olduğu gibi Türkiye de de üretilen dane zeytinin yaklaşık %65-70 i yağlığa, %30-35 i sofralığa işlenmektedir. Genelde tüketim zeytinyağı ağırlıklı olduğu için yağlık zeytin üretimi fazla olmaktadır. Türkiye nin zeytin üretiminde alternansın -bir yıl az, bir yıl çok- etkisi çok fazladır. Türkiye koşullarında kültürel işlemlerin yetersizliğinden kaynaklanan nedenlerle alternansa eğilim maalesef artmaktadır Ege, 2. Marmara, 3. Akdeniz, 4. Güneydoğu Anadolu, 5. Karadeniz. (numaralar bölgelerin ağaç sayısı ve üretim miktarlarına göre çoktan aza doğru verilmiştir) Şekil 2.3 Türkiye de zeytin üretim alanları (Anonim,1988) Türkiye de Aydın, İzmir, Muğla, Balıkesir, Bursa, Manisa, Çanakkale, Gaziantep ve İçel önemli zeytinci illerdir. Ege, Marmara, Akdeniz, Güneydoğu Anadolu Bölgeleri ise önemli zeytin üreten bölgelerdir (Şekil 2.8). Üretimde çok sık dalgalanmalar gözlenmektedir. Bunun en büyük nedeni, bölgeye ve ekolojiye uygun olmayan, verimsiz, soğuklama ihtiyacı yüksek olan, en önemlisi çeşit karakter özellikleri tam olarak belirlenmemiş çeşitlerle yetiştiricilik yapılmasıdır. Oysa zeytin üreticilerinin de çok rahat bir şekilde gözlemleyebildiği gibi her çeşitin içinde verimli, hastalık ve zararlılara dayanıklı, her yıl düzenli verim veren kaliteli sofralık 11

21 veya yağlık tipler bulunmaktadır. Vejetatif olarak çoğaltılan zeytinde bu tip varyasyonların olması da normaldir. Diğer yandan, çeşitlerin farklı bölgelerde farklı isimlerle çağrılması ve sinonimlerinin farklı türler kabul edilmesi, çeşit karmaşasını ortaya koymaktadır. Morfolojik, fenolojik ve pomolojik değerler karakter özelliğini belirlemede temel çalışmalardır (Barranco and Rallo 1984). Zeytin oldukça geniş bir çeşit populasyona sahiptir. Bu çeşitlerin büyük çoğunluğu geniş oranda rastgele tozlanarak çoğalan klonlardan oluşmaktadır. Önemli çeşit populasyonların içerisinde en iyi klonun seçilmesi zeytin kültüründe önemli ilerlemelere olanak sağlamaktadır. Zeytinin klonal seleksiyonunda 3 ana safha göz önünde tutulur. Bunlar: 1. Fenotipik Tanımlama: Mümkün olan en fazla sayıda yetişen zeytinden çeşitlerin keşfedilmesi safhasıdır. En az iki yıl boyunca morfolojik karakterler tanımlanır. 2. Klonların Karşılaştırılması 3. Klonların Çoğaltılması Angiolillo et al. (1999), 5 AFLP primer kombinasyonu kullanarak; dünyada Olea cinsinin coğrafik dağılımını genetik ilişkiler düzeyinde incelemişlerdir. Araştırma sonuçlarına göre yabani zeytin çeşitleri ile Kuzey-Batı Afrika çeşitleri dendogramın aynı alt grubunda dağılım gösterirken, Doğu Afrika ve Asya grupları ise birlikte ancak ilk gruptan farklı bir dağılım göstermiştir. Okyanus ve Avustralya grupları ise bu gruplardan tamamen uzak bir genetik benzerlik oluşturmuşlardır. Bandelj et al. (2004), zeytin çeşitlerinin genetik varyasyonlarının SSR ve moleküler markörlerle tanımlanması çalışmasında; zeytin çeşitlerinin farklılık ve genotip belirleme çalışmaları için 14 adet geliştirilmiş SSR markörü kullanılmıştır. Allel büyüklükleri ve mikrosatellit optimizasyonundan sonra ortalama lokus başına 6.8 allel olacak şekilde, 19 çeşitte 96 allel saptanmıştır. Mikrosatellitler genotiplerin karakteristik özelliklerini belirlemede güvenilir sonuçlar vermektedir. Kullanılan AFLP analizlerinde, 8 primer çiftinin kombinasyonu kullanılmıştır. Genotiplerde AFLP ve SSR markörlerinin karşılaştırılması yapılmıştır. Çeşitler arasındaki uzaklık Jaccards benzerlik katsayısı 12

22 kullanılarak hesaplanmış ve UPGMA metodu kullanılarak dendogramları oluşturulmuştur. Her iki moleküler teknikte de Tuscan tipleri ile Sloveia tipleri arasında belirgin bir uzaklık tespit edilmiş diğer bölgesel çeşitlerle düşük miktarda olsa bile benzerlikler tespit etmişlerdir. Barranco and Rallo (1984), İspanya da mevcut olan zeytin çeşitlerinin belirlenmesi ve kataloglanması amacıyla bir çalışma yapmışlardır. Çalışmada İspanya içerisinde bütün bölgeler incelenerek, 1000 in üzerinde ağaç işaretlemişlerdir. 500 ün üzerinde farklı çeşitin isimlendirilmesini yapmışlardır. Bu çalışmalar sırasında, aynı çeşitin farklı bölgelerde farklı isimlerle adlandırıldığını, bu yüzden çeşitlerin tanımlandırılmasında ve isimlendirilmesi sırasında her çeşit için sinonim ve temel çeşitlerle birebir karşılaştırabilmek için bir pomolojik şema hazırlamışlardır. Bu pomolojik şema içerisinde ağaç karakter özellikleri, dal, yaprak, çiçeklenme, meyve ve çekirdek karakter özellikleri yer almıştır. Çalışmalar sonucunda birbirinden farklı 262 çeşit bulmuşlardır. Belaj et al. (2003), çalışmasında zeytin tanımlamalarında en uygun markör sistemini belirlemek amacı ile İspanya ve İtalya kökenli 32 zeytin genotipini tanımlayan SSR markörleri en etkili markörler olarak bulurlarken, AFLP markörlerin reaksiyon başına oluşturduğu çok sayıdaki polimorfik bant nedeni ile zeytin tanımlamalarındaki önemini vurgulamışlardır. Kuzey İtalya bölgesinde yetiştirilen bazı zeytin çeşitlerinin morfolojik ve genetik karakterizasyonunu yapan Rotondi et al. (2003), SSR ve AFLP markör verileri ile morfolojik verilerin benzerlik gösterdiğini, morfolojik ayrımlarla tanımlanamayan sinonim ve homonimlerin DNA markörler aracılığı ile belirlenebildiğini belirtmektedirler. Bracci et al. (2006), Liguria kökenli zeytin genotiplerinin moleküler karakterizasyonu üzerinde bir çalışma yapmışlardır. Liguria bögesi İtalya nın kuzeyinde dar bir alana sahip olmasına rağmen yoğun zeytin yetiştirciliği yapılmaktadır. Bölgede yağ üretimi yönünden bölgesel ekonomide önemli bir yer tutmaktadır. Bu çalışmada en yaygın zeytin genotipleri La Spria alanından toplanmıştır. Toplanan bu genotipler SSR ve AFLP markörleri ile tanımlanmaya çalışılmıştır. Liguria bölgesi yerel genotiplerinin 13

23 genetik farklılığının fazla olduğu ve Akdeniz ve İtalya ya özgü genotipler arasında sinonim göstermemesi Liguria genotiplerinin genetik benzerliğini göstermektedir. Canözer (1991), Türkiye nin değişik zeytinci bölgelerine ait 28 çeşit ile İspanya nın Manzanilla çeşitinin karakter özelliklerini belirlemek amacıyla bir çalışma yapmıştır. Çeşitlerin coğrafi dağılımları, morfolojik, pomolojik, fenolojik ve taşıdıkları önem ve ürün değerlendirme durumlarını incelemiştir. Çeşitlerin, çiçeklenme dönemleri iklim koşullarına göre değişmekle birlikte, çiçeklenme dönemlerinin 12 Mayıs-15 Haziran tarihleri arasında değiştiğini bildirmiştir. Çeşitlere ait meyve şekilleri arasında farklılık gösterdiğini, meyve nem oranlarının %41.05 ile %61.16 arasında olduğunu, yağ oranlarının ise %16.71 ile %31.82 arasında değiştiğini saptamıştır. Carriero et al. (2002), zeytinde GA/CT ce zenginleştirilmiş kütüphanelerini kullanarak, gerçek anlamda ilk SSR lokuslarını tespit etmişlerdir. 20 SSR lokusu tespit eden araştırıcılar 20 zeytin genotipinde bunları kullandıklarında toplam 57 adet allele ulaşırlarken, 10 lokusda polimorfizm yakalamışlardır. Cipriani et al. (2002), İtalya nın bir çeşiti olan Frontoio nun genomik kütüphanelerinde AC/GT ve AG/CT zengin tekrarların olduğu 52 SSR primeri 60 klon üzerinde çalışmış, aynı zamanda parmak izi tekniğini uygulamışlardır. Gemas et al. (2004), 38 zeytin genotipinin moleküler tanımlanması çalışmasında Akdeniz havzası içerisinde 2600 den fazla çeşit bulunmaktadır ve bunların sinonimleri ve ekotipleri bulunmaktadır. Zeytin endüstrisi günümüzde iyi karakterize edilmiş çeşitlere gereksinim duymakta ya da modern tarımsal tekniklerle yetiştirilmiş çeşitlere ihtiyaç duymaktadır. Bu çalışmada Portekiz den 30 genotip Akdeniz ülkelerinden 8 genotipin genetik farklılığını belirlemek amacıyla ISSR, SSR, AFLP teknikleri kullanılmıştır. Bant görüntüleri ve allel değerleri UPGMA istatistik programına göre analiz edilmiş ve dendogram çizilmiştir. 38 genotip birbirinden ayırt edilmiştir. Genet (1999), 3 bilinen zeytin çeşitine ait 22 klondan sinonim olduğu şüphelenilen 17 klon İsrail, İtalya, Amerika ve Avustralya dan getirilmiştir. Genetik değişkenlik RAPD tekniği ile belirlenmiş ve PCR örneklerinin analizleri basit eşleştirme ile UPGMA kullanılarak sonlandırılmıştır. Manzanilla ve Kalamata kültür içinde %98 lik 14

24 benzerlikler göstermiştir. Bununla beraber Verdale diğer tiplerden %80 den daha az benzerlik ve yüksek genetik değişkenlik göstermiştir. Picual ve Nevadilo bu grubun %69 unu gruplandırmıştır. Coregiola ve Frontoio ve hatta Verdale gruplarının arasındaki ilişki genetik uzaklığın büyüklüğü göz önünde bulundurulduğunda, bu eldelerin oluşturduğu gruba ait bazı kültürlerin ayrı kültür olması muhtemeldir. Karabidj (1991), Suriye nin zeytincilik yapısını ve çeşit dinamiğini belirlemek üzere 89 çeşit üzerinde tanımlama çalışmaları yapmıştır. Tanımlama çalışmaları sırasında, ağaç yapısı, yaprak özellikleri, meyve özellikleri ve çeşitlerin ekolojik koşullara olan adaptasyon yeteneklerini incelemiştir. Çalışmaları sonucunda, sulanabilir arazi koşulları için en önemli 4 zeytin çeşiti belirlenmiştir; Al Zaiti, Al Sorani, Al Doebly, Al Khodeiry dir. Diğer önemli çeşitler ise Al Kaisi, Massabi ve Dan dır. La Mantia (2005), Sicilya zeytin genotiplerinin genetik farklılıklarını belirmek için DNA parmak izine dayalı SSR çalışmasında; Sicilya nın 7 bölgesinden toplanan 30 zeytin genotipinin yanında referans zeytin genotipleri de eklenmiştir. GAPU, UDO, DCA serisine ait 12 floresan işaretli primerler kullanılıp otomatik kapiller sekans sistemi ile fragment uzunlukları standart çeşitlere göre saptanmıştır. Elde edilen verilere göre 2 genotip sinonim olarak saptanmıştır. Veriler sonucunda oluşturulacak data, karşılaştırmalar ile bilimsel grupların yaralanması için uygundur. La Mura et al. (2006), SSR markörler ile zeytin yağı zirai-besin zincirinin karekterizasyonu başlıklı çalışma; modern tarımsal ve besin biliminde DNA parmakizinin artan uygulaması, yenilebilir ticari numunelerdeki kültürlerin ve türlerin doğruluğunun kanıtıdır. Bu çalışmada, PDO yağlarını içine alan, Campania da yaygın bir çeşit olan Pisciottana kültürüne ait zeytin yağıyla ilişkili olan ve sert çekirdeklilerin genetik doğruluğunun kanıtlanması için bir metod tanımlanmaktadır. Tanımlama birkaç polimorfik DNA mikrosatellitlerinin kapilleri elektroforezine dayanarak yapıldı. Seçilen SSR lar tekrarlanabilir olduğunu, tek anlamlı olarak ortaya çıkarmada ve burda analiz edilmiş zeytin yağındaki bileşenler gibi spesifik genetik materyalin varlığının doğrulanmasında güvenilir olduğunu ispatladılar. Sonuçlar doğruladı ki; SSR markörler zeytinyağı zirai besin zincirinde kullanılan materyal dizisinin tanımlanması için 15

25 uygundur ve bundan dolayı kullanımları, tüketicileri korumada ve kalite kontrol uygulamasında önemli bir araç olduğu düşünülebilir. La Rosa et al. (2003), zeytinde ilk haritalama çalışmaları olarak bildirdikleri araştırmalarında steroil-acp desaturaz geni ile ilgili bağlanma gruplarını oluşturmak amacı ile 95 zeytin hibritinde değişik markörleri kullanmışlardır. Araştırıcılar 21 AFLP primer kombinasyonundan 304 polimorfik bant elde ederlerken, 7 SSR lokusunun haritalanmasında kuvvetli bağlantılar oluşturduğunu belirtmişlerdir. Marra et al. (2006), Güney İtalya kökenli 39 zeytin kültüründeki genetik çeşitliliğe dayanan morfolojik ve moleküler SSR markörler İtalya daki zeytin endüstrisi yerli kültürlerden kurulmaktadır ve bu onun genetik çeşitliliğinin geniş bir bölümünü devam ettirmede katkıda bulunmaktadır; çünkü el değmemiş zeytin yağlarının kalite özellikleri, kaynak genotipinden güçlü bir şekilde etkilenmektedirler. Kültürler ve klonlar tanımlama ve karakterizasyonda, yüksek kalite standardında zeytin yağının pazarlanmasında anahtar rolü oynamaktadır. Merkezi ve kuzey İtalya da zeytin endüstrisinin birkaç zeytine dayandığı bölge genetik kaynak değişikliği neredeyse tamamlandı ve özel çabalar seçimlere göre (her bir tür içinde, en iyi klonlar) yapılmaktadır. Güneyde bu hedefe ulaşmak zordur ve özel girişim bunu bitirmek için yapılabilir. Bu hedeflerle, 4 yayınlanmış SSR markörler yaprak, endokarp ve meyvenin morfolojik özellikleri, Campania 16, Calabria 15 ve Sicilya nın 8 olmak üzere toplam 39 yerli kültürünün farkılılığının araştırılmasında kullanıldı. Genetik uzaklık dendogramlarla hesaplandı. Sonuçlar, Güney İtalya zeytin gametlerinin zenginliğini ve yüksek derecede genetik farklılığı gösterdi. Montemurro et al. (2006), Suriye genotiplerinin genetik farklılığının SSR ve AFLP markörleri ile belirlenmesi çalışmasında Suriye nin 42 yerli genotipinin toplamı 2 AFLP ve 22 SSR primeri ile analiz edilmiştir. Toplamında 48 polimorfik AFLP bantı ve 45 polimorfik SSR bantı elde edilmiştir. Elde edilen datalar JACCARD genetik benzerlik katsayısı ile SAHN gruplandırma metoduna başvurularak ayrıntılı bir şekilde incelenmiştir. Genetik akrabalık durumu oluşturulan dendogramla detaylandırılmıştır. Özkaya vd. (2003), Türkiye de yetiştirilen bazı zeytin çeşitlerinin genetik ve biyolojik özelliklerinin karşılaştırılması çalışmasında Bornova Zeytincilik Araştırma Enstitüsü 16

26 koleksiyon bahçesinden getirilen 10 zeytin çeşiti (ayvalık, Derik halhalı, domat, gemlik, Kilis yağlık, manzanilla, memecik, Nizip yağlık, sarı ulak ve tavşan yüreği) kullanılmıştır. Diğer yandan elde edilen verileri desteklemek amacıyla pomolojik ve biyokimyasal gözlem ve analizler de yapılmıştır. Mevcut çeşitler arasında Derik halhalı genetik ve biyokimyasal olarak en farklı sonucu veren çeşit olmuştur. Özkaya vd. (2004), Mardin ili Derik ilçesi zeytin tiplerinin morfolojik ve genetik özelliklerinin belirlenmesi çalışmasında yetiştiricilerin verdiği bilgiler doğrultusunda ağaçlar seçilerek meyve ve yaprak örnekleri alınmıştır. Genetik özelliklerinin belirlenmesinde de RAPD tekniği kullanılmıştır. Toplam 10 tip ve 10 primer kullanılmıştır. Tip 6 diğerlerinden uzak bir akrabalık göstermiştir. Özkaya vd. (2007), Doğu Akdeniz ve Güneydoğu Anadolu zeytin çeşitlerinin seleksiyon yolu ile ıslahı araştırması henüz sonuçlanmış olup verileri yayınlanmamıştır. Perez and Rallo (1979), zeytin çeşitlerinin tanımlanmasına yönelik yaptıkları çalışmada; meyve, yaprak, çiçeklenme ve çekirdek özelliklerinin tanımlama çalışmalarındaki etkinliklerini araştırmışlardır. Çalışmada her bir çeşit için 60 meyve, 60 çekirdek, 22 yaprak, 10 çiçeklenme ile ilgili toplam 150 parametreyi kullanmışlardır. Bu parametrelerden 32 tanesi aynı yıl ve aynı bölgeden alınan örneklerin tanımlanmasında düşük varyasyon göstermiş 9 tanesi ise farklı bölgelerde ve farklı yıllarda alınan örneklerde düşük varyasyon olduğunu ortaya koymuşlardır. Reale et al. (2006), morfolojik, biyokimyasal ve moleküler markörler kullanılarak Olea europaea L. kültürlerinin çeşit içi analizleri çalışmasının vurguladığı; zeytin gametlerinin sınıflandırılmasının çok kompleks sonuçlar verdiği, kültürlerin genetik çeşitlilikten, referans standartların ve genom karekterizasyonunun eksikliğinden dolayı ve bundan başka isimlerdeki karışıklık ile sinonim ve homonimlerin sonuçlandırılmalarıyla alakalı olduğu görüşüdür. Bu çalışma birbirlerine çok yakın olan çeşitler (Florence, Pisa, Leghorn ve Grosseto illeri) ve kendi bölgelerinden toplanan Leccino (Pistoia ili) kültürüne ait 14 tip arasındaki genetik benzerliğin tanımlanması hedefiyle gerçekleştirildi. Çekirdek, meyve, yaprak ve ağacın biyometrik indeksi, RAPD markörler kullanılarak oluşturulan elektroforetik data ve tohum zarlarından 17

27 ekstrakte edilen toplam proteinler ile karşılaştırıldı. Morfolojik, biyokimyasal ve moleküler data kültür içinde benzer akrabalıklar gösterdi. Reale et al. (2006), SSR ve SNP lerin ortalamalarıyla Molise ın yerli zeytin gametinin moleküler karakterizasyon çalışmasında; gamet ürünlerinin belgelendirilmesi ve saklanmasıyla birlikte, tipik zirai besin örneklerinin korunması ve değerlendirilmesi, ortak tarımsal politikanın ana hedefleri, dikkate alınmıştır. Bu makalede, Akdeniz bölgesinde yağ üretiminde çok önemli bir yer tutan Olea europaea L. zeytini, özellikle İtalya da kültürden daha fazla zeytinin gametleri birincil önemde bir kaynak olarak gösterilir. Bölgesel üretimin değerlendirilmesindeki en önemli basamaklar ve bölgesel kültürlerin kullanımı, genetik kaynakların bakımı ve korunumu için bir bilgidir. Molise de-mikroortamın dikkate değer çeşitleri tarafından tanımlanan bir İtalyan bölgesi-bazı zeytin kültürleri, yüzyıllar sonra yerleştirildi. Bu çalışma Akdeniz ülkelerinden en önemli ve yaygın kültürlerle yapılan karşılaştırmalarla SNP ve SSR ların analizi ile Molise e ait 19 kültürün tanımlanmasını hedeflemektedir. Ricciolini et al. (2006), İtalya ve Akdeniz, zeytinin tarımsal üretim için stratejik öneminden dolayı, odak ilgiyi ve asıl önceliği zeytin genomunun organizasyonu ve analizi oluşturduğu vurgulanmıştır. İlk yaklaşımda olduğu gibi, bir bağlantı haritalama programı, elemenin altında yatan özellikler için QTL tanımını hedef alan gruplar tarafından geliştirilmiştir. Genetik bağlantı haritası, erken gelişme hali ve Spilocaea oleagina ve Verticillium dalhiae ye karşı direnç gösterme gibi tarımsal kazancın bazı özellikleri için çelişkili fenotipli iki yüksek heterozigot kültürden elde edilen populasyon çaprazlamasında geliştirilmiştir. Genetik harita 569 AFLP, 279 RAPD, 62 SSR ve 6 SNP ye dayanarak oluşturulmuş ve önemli metabolik yol üzerinde bulunan genlerin sekansında tanımlanmıştır. İki harita-biri her iki ata içindir- MAPMARKER/EXP v.3.0 programı kullanılarak resmedilmiştir. Tüm data, 3:1 oranında ayrılan (heterozigot x heterozigot) AFLP leri ve kodominant SSR ve SNP markörleri içeren Join Map 3.0 programı tarafından sonradan analiz edilmiştir. 42 bağlantı grubu dişi atalar için, 28 i erkek atalar için elde edilmiştir. Dişi haritası için kapsam yüzdesi %68.3 iken erkekler için %67.2 bulunmuştur. Bağlanma lokusu, 9 grubu içeren O. europaea türleri için birleştirme haritasının üretimi için kullanılan 2 haritadan edinilen grupların homolog çiftlerinin katılımına izin verilmiştir. 18

28 Sensi et al. (2003), üç İtalyan zeytin çeşitine ait 12 tipi AFLP markörlerle tanımlarken, bu amaçla 6 AFLP primer kombinasyonu kullanmışlardır. Araştırıcılar, klon ve çeşit düzeyinde zeytin tanımlamalarında AFLP tekniğinin son derece etkili olduğunu vurgularlarken, tespit edilen toplam bant sayısının %59.8 nin polimorfik olduğunu belirtmişlerdir. Tous et al. (1998), İspanya nın Tarragona eyaletine bağlı Reus kasabasında bulunan 5 zeytin çeşitinin tarımsal ve ticari karakterleri açısından incelemişlerdir. Yapılan 10 yıllık çalışma sonucunda Arbequina ve Picual çeşitlerinin verimlilik ve kalite açısından diğer çeşitlerinden çok üstün olduğunu saptamışlardır. En yüksek verim Arbequina (148.6 kg/ağaç), Picual (122.5 kg/ağaç) çeşitlerinden elde edilirken, Empeltre (80.2 kg/ağaç), Morrut (79.0 kg/ağaç) ve Manzanilla (59.1 kg/ağaç) ürün alınmıştır. Araştırmacılar Manzanilla ve Morrut çeşitlerinde düzensiz ürün verdiklerini gözlemlemişlerdir. Manzanilla çeşitinden en büyük meyveleri (4.06 gr) elde ederken, en küçük meyveleri Arbequina (1.63 gr) çeşitinden elde etmişlerdir. Tous and Barranco (1990), Katalunya eyaletinde bulunan zeytinliklerin, tanımlanması için 23 pilot bölge belirlemişlerdir yıllarında yaptıkları pomolojik çalışmalar sonucunda 40 çeşitin tanımlamasını yapmışlar, sinonim özelliği gösteren çeşitleri ve yanlış adlandırılan çeşitleri bulmuşlardır. Elde edilen sonuçlar ışığında bitkisel materyali ekonomik önem düzeyine ve coğrafik dağılımlarına göre 4 gruba ayırmışlardır. 4 adet ana çeşit, 6 adet sekonder çeşit, 8 adet geniş bölgelere dağılmış çeşit ve 22 adet lokal çeşit belirlemişlerdir. Trujillo et al. (1995), Cordoba daki dünya zeytin gen bankasında bulunan çeşitlerin, izoenzim kullanılarak, çeşitlerin DNA bazında sinonim ve diğer karakterleri belirlemek için bir araştırma yürütmüşlerdir. Araştırmalarında 155 farklı orjine sahip zeytin çeşitinden alınan polen örneklerini kullanmışlardır. Çalışmada 5 değişken izoenzim sistemi, alkol dehidrojenaz, esterler, glikoz izomeraz, lösin aminopeptinaz, malikenzim sistemi üzerinde durulmuştur. Yapılan elektoforezler sonucunda, elde edilen bant kombinasyonlarından, çeşitlerin %85 inin morfolojik olarak tanımlanmasını yapmışlardır. Sadece ayrılmış gruplar içerisinde 2-3 çeşitin morfolojik olarak 19

29 tanımlanması yapılamamıştır. Ayrıca çeşitler arasında polimorfizm gözlenmediğini bildirmişlerdir. Vergari et al. (1998), DNA (RAPD) parmak izi yöntemini kullanarak gen bankasında bulunan Frantoio çeşitinin genetik yayılımını ve morfolojik karakter özelliklerini belirlemek üzere bir çalışma yapmışlardır. Çalışmalar sırasında 11 genotipin Frantoio çeşitiyle benzer genotipe sahip olduğunu saptamışlardır. Celinle di Nardo, Taggiasca, Razza, Sargano, Coreggiolo, Cima di Bionto, Ogliarola, Leccese, Minuta, Razzola, Casaliva ve Raja sabina çeşitlerinin sinonim olduğunu sunmuşlardır. Araştırmalar sonucunda, Olea europaea türleri arasında yapılan yanlış tanımlandırılmaların ve adlandırılmaların DNA markör yöntemleri ile öne geçilebileceğini bildirmişlerdir. Çeşitlerin tanımlandırılmasındaki farklılıkların fenotipik veya genotipik kaynaklı olduğunu araştırmada agronomik datalar yetersiz kalmaktadır. Son yıllarda PCR a dayalı moleküler işaretleyici (marker) teknikleri kullanılarak bu eksiklikler tamamlanmaya çalışılmaktadır. Moleküler işaretleyiciler bitki tür ve çeşitlerin genotipik özelliklerinin araştırılması çalışmalarında ağırlık kazanmıştır. SSRs (Simple Sequence Repeats ya da microsatellitler) genomlar boyunca dağılmış bulunan ve ardışık olarak tekrarlanmakta olan 2-6 nükleotit gruplarından oluşmaktadır. Bu gruplar örneğin (AT)n, (GT)n, (ATT)n veya (GACA)n şeklinde gösterilmekte ve n ardışık tekrar sayısını belirtmektedir. Mikrosatellitleri çevreleyen DNA dizileri genellikle aynı türün bireyleri arasında korunmuş olduklarından, farklı genotiplerde çakışan SSR ların PCR primerleri ile çoğaltılarak seçilimine izin vermektedir. Ardışık SSR tekrarların sayısındaki farklılık PCR sonucu farklı uzunlukta parça çoğaltımı ile sonuçlanır. Bu tekrarlar çok yakın tür ve çeşitler arasında dahi tekrarlanan ünitelerin sayısında değişikliğe yol açan mutasyonlar nedeniyle oldukça polimorfiktir (Gupta et al. 1994). SSR ları çevreleyen korunmuş DNA dizileri primer olarak kullanılarak PCR metodu aracılığı ile bir lokustaki farklı alleller tespit edilebilir. SSR tekniğinin zeytinde genetik haritalama çalışmalarındaki kullanımı avantajlarından ötürü her geçen gün artmaktadır. SSR lar yüksek oranda polimorfiktirler, taşınabilirler, çok allelli eşbaskın markörler verirler, 20

30 PCR a dayalı moleküler işaretleyicidirler. SSR ların her bir lokus için içerdikleri bilgi miktarı İzoenzim ve RAPD e göre daha fazladır. Yapılan çalışmalarda GA genomik kütüphaneleri gözlenerek 43 pozitif klon elde edilmiştir ve 13 adet mikrosatellit lokusu için primerler dizayn edilmiştir. Kullanılan bu primerler ile 46 zeytin çeşitinde SSR polimorfizmi ortaya çıkmıştır. Bu 46 çeşitten 42 tanesi 5 mikrosatellit tarafından tam olarak tanımlanmıştır. Araştırmaya göre, çeşitlerin %88 i sadece 3 mikrosatellitle bile tanımlanabilmektedir (Rallo et al. 2000). Ortaya çıkan bu ilk mikrosatellitler zeytin çeşitlerinin tanımlanmasında kuvvetli kaynaklar oluşturmaktadırlar ve kanıtlanan eşbaskın karakterleri onları akrabalık analizlerinde ideal bir sistem haline getirmektedirler. Tekniğin eksiklerinin giderilmesine yönelik, daha güvenilir sonuçlar veren AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism ) tekniği geliştirilmiştir (Vos et al. 1995). Tekniğin polimorfizm oranı çok yüksektir. Çok sayıda lokusu aynı anda taraması nedeniyle parmak izi analizine uygundur (Yıldırım ve Kandemir 2001). Özellikle RAPD analizlerinde elde edilen sonuçların doğrulanması bu yöntemle mümkün kılınmaktadır. RAPD tekniği zeytinlerde son yıllarda AFLP tekniği ile birlikte yapılmakta ve daha sağlıklı sonuçlara ulaşılmaktadır. Kompleks ve yoğun populasyonlar içerisindeki yakın bireyler arasındaki genetik varyasyon veya akrabalık ilişkileri, AFLP işaretleyicilerle daha güvenilir sonuçlar vermektedir. Yüksek polimorfizm oranının elde edilmesi, RAPD tekniğinden daha güvenilir bant dizinleri vermektedir. Jel üzerindeki bir hattan 20 şer adet heterozigot bant elde edilebilir ve bu bant dizinleri genetik haritalama için kullanılabilir (Baldoni et al. 1999, Baldoni et al. 2000, Sensi et al. 2003,). 21

31 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1 Materyal Bu çalışma yılları arasında Kilis ili ve ilçelerinde gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın materyalini oluşturan zeytinler, söz konusu ildeki mevcut zeytin üretim alanlarının yanı sıra mikroklima alanlarında kalmış olan ağaçlardan, farklı agronomik özelliklerine bağlı olarak seçilmiştir. Bu genotiplerin alınmasında yetiştiricilerin verdiği ön bilgilerden seleksiyon kriterleri göz önünde tutularak yararlanılmıştır. GPS sistemi ile örnek alınan yerler işaretlenerek kayıt altına alınmıştır ve laboratuvar çalışmaları için yaprak örnekleri alınmıştır. 3.2 Yöntem Araştırmada kullanılan SSR tekniği, DNA izolasyonu, PCR uygulaması ve SSR tekniğinin otomatik dizi analizi sistemi kulanılarak kapiller elektroforezde uygulanması ve sonuçların değerlendirilmesi şeklinde incelenmiştir DNA izolasyonu DNA izolasyonu Saghai- Maroof et al. (1984) e göre yapılmıştır. Genotiplerin genç yapraklarından alınan örneklerle DNA izolasyonu gerçekleştirilmiştir. İzolasyonda izlenen aşamalar aşağıda belirtilmiştir. Buna göre; Genç yaprak havana konulup sıvı azotla iyice ezildi, 1 gr yaprak dokusuna, 4 ml DNA ekstraksiyon solusyonu eklenir (örnek başına 1ml ekstraksiyon solüsyonu başına 10µl 2-Merkaptoetanol içerir). Örnekler 65 C 60 dk su banyosunda arasıra çalkalanarak bekletilir. Daha sonra oda koşullarına soğutulur. Üzerine 3 ml fenol kloroform/ izoamilalkol (25/24:1) eklenerek defa sallanır. 10 dk rpm de santrifüj edilir. 22

32 Üst sıvı (süpernatant) (1.57 ml) yeni bir tüpe aktarılır. Tekrar fenol kloroform izoamiloalkol ile temizlemeye devam edilir. Üzerine ~1. ml izopropanol eklenir. Bir gece -20 C de bekletilir.. 1O dk 7000 rpm de santrifüj edilir. Üst sıvı atılır. Kurutulmaya bırakılan perlet 50µl TE buffer içinde eritildi RNA, sulandırılmış RNase (10µg/µl) solüsyonu ile 1 saat içerisinde uzaklaştırıldı. İzole edilen DNA lar Nanodrop-ND 1000 spektrofotometresinde ölçülüp, görsel olarak %1 lik agaroz jelde kontrol edildi. Bazı örneklerin DNA miktarları, hata payını ortadan kaldırmak amacıyla ölçümler 2 kez ölçülüp sulandırmalar iki ölçümün ortalaması olarak alınmıştır. Çizelge 3.1 DNA ekstraksiyon çözeltisi ( 2XCTAB buffer ) Son Konsantrasyon 100 ml 100 mm TRIS ph ml 1 M TRIS ph mm EDTA ph ml 0.5 M EDTA ph M NaCl 28 ml NaCl 4M 2 % CTAB 2 gr. CTAB 1 % PVPP 1 gr. PVPP Çözeltiler : Ekstraksiyon buffer : 20 mm sodyum EDTA ve 100 mm Tris-HCL (ph: 8), 1.4 M NaCl, %20 CTAB, %0.3 2-merkaptoetanol Fenol kloroform izoamilalkol : 25 24:1 TE buffer : 10 mm Tris-HCL ve 1 mm EDTA (ph:8) RNase A (Sigma) : 10 mg/ml 23