KOLLAJEN SENTEZİ İNHİBİTÖRLERİNDEN 5-FLOROURASİL VE HALOFUGİNON UN YARA İYİLEŞMESİ ÜZERİNDEKİ ETKİLERİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ

Transkript

1 T.C. Sağlık Bakanlığı Haydarpaşa Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi Kliniği Şef: Prof. Dr. Adnan UZUNİSMAİL KOLLAJEN SENTEZİ İNHİBİTÖRLERİNDEN 5-FLOROURASİL VE HALOFUGİNON UN YARA İYİLEŞMESİ ÜZERİNDEKİ ETKİLERİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ Deneysel Çalışma (Uzmanlık Tezi) Dr. Şevket Gökhan BEYHAN Tez Danışmanı: Doç. Dr. Mustafa TERCAN İstanbul-2008

2 ÖNSÖZ Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi uzmanlık eğitimim boyunca sahip olduğu bilgi ve deneyimle bana yol gösteren, değerli öğretilerini sabırla bizlere sunan, örnek aldığım, değerli hocam Prof. Dr. Adnan Uzunismail e sonsuz teşekkürlerimi sunmayı bir borç bilirim. Tez çalışmamın gerçekleşmesinde büyük katkıları olan, eğitimim boyunca yardımlarını esirgemeyen Doç Dr. Mustafa Tercan a teşekkürlerimi sunarım. Uzmanlık eğitimim boyunca birlikte çalışma fırsatı bulduğum ve eğitimime büyük katkıları olan, Op. Dr. Haydar İskenderoğlu, Op. Dr. Selçuk Öztunç, Op. Dr. Hasan Fındık, Op. Dr. Esra Çelik ve Op. Dr. Elif Eren Aydın başta olmak üzere tüm uzman ve başasistanlarıma, desteklerini ve dostluklarını esirgemeyen asistan arkadaşlarıma, hemşire ve personel çalışma arkadaşlarıma, değerli aileme teşekkür ederim. Dr. Şevket Gökhan Beyhan İstanbul-2008

3 İÇİNDEKİLER GİRİŞ...2 GENEL BİLGİ...4 A. Yara iyileşmesi İnflamatuar Faz Proliferatif Faz Matürasyon (Remodeling) Fazı...7 B. Keloid ve hipertrofik skar Keloid oluşumunda sorumlu tutulan sebepler Keloid ve Hipertrofik skarların tedavisinde kullanılan yöntemler...12 C. Keloid ve hipertrofik skar tedavisinde 5-Florourasil in kullanımı...16 D.Halofuginon...19 GEREÇ VE YÖNTEM...23 A. Denekler...23 B. Cerrahi teknik Preoperatif hazırlık Cerrahi araç-gereç Deney Cerrahi teknik Postoperatif takip Biyokimyasal inceleme Histopatolojik inceleme Yara tensil (gerilmeye dayanım) kuvvetinin ölçülmesi İstatistiksel Çalışma...30 BULGULAR...31 A. Makroskopik bulgular...31 B. Biyokimyasal bulgular...34 C. Tensil kuvvet ölçümü bulguları...35 D. Histolojik bulgular...36 E. İstatistiksel Bulgular...41 TARTIŞMA...50 ÖZET...56 SUMMARY...58 KAYNAKLAR

4 GİRİŞ Patolojik yara iyileşmesinin iki örneği olan hipertrofik skar ve keloidler normal skar dokusundan, aşırı kollajen üretimi ve anormal kollajen dizilimi ile ayrılırlar (1). Keloid ve hipertrofik skarların tedavisinde çok sayıda farklı yöntem tanımlanmıştır. Bu yöntemlerin etkinliği hakkında çok sayıda klinik ve deneysel çalışma mevcuttur. Tedavide en sık kullanılan ve etkinliklerini destekleyen nispeten daha fazla kanıt olan yöntemler; steroid enjeksiyonu (triamsinolon), bası tedavisi, silikon sheet uygulaması ve radyoterapidir (2). 5-Florourasil, kemoterapide başta kolorektal kanserler olmak üzere çeşitli malignitelerin tedavisinde kullanılan bir urasil analoğudur (3). Bunun yanında krem formu, Bazal Hücreli Karsinom (BCC) ve aktinik keratoz tedavisinde kullanılmaktadır. Etkisini DNA ve RNA sentezini engelleyerek göstermektedir (4). 5-Florourasil in fibroblastların proliferasyonunu, migrasyonunu, büyümesini ve kollajen üretimi ve kontraktilite gibi fonksiyonlarını azaltıcı etkisinin keşfedilmesi ve klinik çalışmalarda glokom cerrahisi sonrası skar oluşumunun önlenmesinde etkinliğinin gösterilmesi hipertrofik skar ve keloidlerin tedavisinde de 5- Florourasil den faydalanabileceğini fikrini ortaya çıkarmıştır (5,6). Fitzpatrick tarafından intralezyonel 5-Florourasil ile yapılan çalışmalar, 5-Florourasilin hipertrofik skar ve keloid tedavisinde ve eksizyonları sonrası rekürrenslerin engellenmesinde etkili olduğunu göstermiştir (7). Ancak bu geçmiş çalışmalarda, BCC ve aktinik keratoz tedavisinde sıklıkla kullanılan 5-Florourasilin krem formunun kullanımına rastlanmamaktadır. Halofuginon ilk olarak 1960 lı yıllarda sentezlenmiş olan bir febrifugine analoğudur. İlk olarak antimalaryal olarak sentez edilen bu ilaç sistemik yan etkileri nedeniyle kullanım alanı bulamamıştır. Günümüzde, veteriner hekimlikte kümes hayvanlarında koksidiyoz enfeksiyonlarından korunma amacıyla kullanılmaktadır (8). Son yıllarda Halofuginon un Tip I kollajen sentezini seçici olarak inhibe ettiğinin gösterilmesi patogenezinde aşırı kollajen sentezinin rol oynadığı skleroderma gibi hastalıkların tedavisi üzerindeki etkinliğinin araştırılmasına yol açmıştır. Bu çalışmalarda olumlu sonuçlar elde edilmiştir (9). Bunun yanında Halofuginon un MMP-2 sentezi ve anjiogenezis üzerindeki inhibe edici etkisini de ortaya konmuştur (10, 11). 2

5 Halofuginon un, aşırı kollajen sentezinin temel patogenezi oluşturduğu hastalıkların tedavisi üzerindeki etkinliğini gösteren sonuçlar, patogenezinde yine benzer mekanizmaların rol oynadığı hipertrofik skar ve keloidlerin tedavisinde de etkili olabileceğini düşündürmektedir. Diğer kollajen tiplerini etkilemeden Tip I kollajen sentezi üzerinde seçici olarak inhibe edici etki göstermesi yanında, özellikle keloidlerin normal dokuya invazyonunda rol oynayan MMP-2 ekspresyonunun ve anjiogenezin inhibisyonuna yol açması bu düşünceyi desteklemektedir. Ancak şu ana kadar bu konuda yapılmış bir çalışma mevcut değildir. Çalışmamızın amacı, keloid ve hipertrofik skarlar için olası tedavi edici etkileri olabileceği düşülen yeni bir ilaç olan Halofuginon un ve intralezyonel formu halen bu patolojik skarların tedavisinde kullanılan, ancak krem formu için literatürde bu konuda yayınlanmış bir çalışmaya rastlamadığımız 5-Florourasil in yara iyileşmesi üzerine etkilerini araştırmaktır. 3

6 GENEL BİLGİ: A. YARA İYİLEŞMESİ Doku yaralanması sonrası gelişen bir dizi olay, doku bütünlüğünü yeniden sağlamayı amaçlar. Memelilerde bu olaylar dizisi kemik ve bazı durumlarda karaciğer dokusu dışında skar ve fibrozis oluşumuyla sonlanır (2). Yara iyileşmesi inflamasyon, proliferasyon ve remodeling safhalarını içerir. İnflamatuar fazda hemostaz sağlanır ve bunu inflamatuar maddenin bölgeye göçü izler. Proliferasyon fazında, fibroplazi, granülasyon, kontraksiyon ve epitelizasyon gerçekleşir. Remodeling safhası, skar matürasyonu olarak da bilinir. 1.İnflamatuar Faz: İnflamasyon fazı, yara iyileşmesi sürecinin ilk aşamasıdır. Yaralanmayı takiben yara bölgesindeki yıkıma uğramış damarlar hemen daralır. Özellikle subendotelden olmak üzere hasarlı dokudan tromboplastik doku ürünleri dışarı salınır. Trombositler kümelenerek ilk hemostatik tıkacı oluşturur. Pıhtılaşma ve kompleman sistemleri harekete geçer. İntrinsik ve ekstrinsik pıhtılaşma sistemleri protrombinin trombine aktivasyonunu sağlar. Aktive trombin, fibrinojeni daha sonra polimerize olarak kalıcı pıhtıyı oluşturacak olan fibrine çevirir (2,12,13). Trombusün oluşumunu takiben hemostaz sağlanır. Kümelenmiş trombositler degranüle olarak, inflamatuar hücreleri yara bölgesine çekecek kemoaktif maddeleri, fibroblast aktivasyon faktörlerini ve vazokonstriktörleri ortama salarlar. Hemostazı takiben, damarlar koagülasyon ve kompleman sisteminin ürünlerinin etkisiyle dilate olur ve permabiliteleri artar. Bu, inflamatuar hücrelerin yaraya geçişini arttırır. Yara bölgesine ilk gelen inflamatuar hücreler arasında nötrofiller çoğunluktadır. Nötrofiller, hücresel yıkım maddelerini, yabancı cisimleri ve bakterileri yara bölgesinden uzaklaştırır. 2-3 gün içinde inflamatuar hücre sayısı monositlerin hakimiyetine geçer. Kanda dolaşan monositler yara bölgesine göç eder ve makrofajlara dönüşür. Bu makrofajlar doku makrofajlarıyla beraber onarım sürecini yönetir. Makrofajlar doku ve bakteri yıkım ürünlerini fagosite etmekle kalmaz aynı zamanda büyüme faktörlerini salarlar. Bu büyüme faktörleri endotelyal hücreleri, fibroblastları ve keratinositleri aktive ederek onarım sürecindeki görevlerini yerine getirmelerini sağlar. Makrofajlardan salınan 20 den fazla sitokin ve büyüme faktörü bilinmektedir. Monosit ve makrofajların yaradan uzaklaştırılması yara iyileşmesinde önemli 4

7 derecede yavaşlamaya, fibroblast proliferasyonunun gecikmesine ve anjiogenezin bozulmasına yol açar. 2. Proliferatif Faz: Granülasyon dokusu: Yaralanmadan yaklaşık 4 gün sonra, geçici ekstrasellüler matriks (ECM), granülasyon dokusuyla yer değiştirmeye başlar. Kapilerlerin invazyonuyla ilişkilendirilen bu morfolojik değişim aynı zamanda hücresel seviyede dermisin kalıcı elemanlarının bölgede oluşmasıyla kendini gösterir. Bunlar, fibroblastlar ve fibroblastlar tarafından oluşturulan kollajen ve kan damarlarıdır (14). Bunların yanında, granülasyon dokusu aynı zamanda, ürettikleri büyüme faktörleri ve sitokinler sayesinde inflamasyon fazıyla proliferatif faz arasında köprü görevi gören makrofajları da içerir. Fibroblastlar yara iyileşmesinde görev alan en önemli mezankimal hücrelerdir (15). Hem üretim hem de mekanik görevleri vardır. Fibroblastlar geçici matriksin yerini alacak olan kollajen bazlı matriksin üretiminden sorumludur. Mekanik görevleri ise kontraktil özellikleri sayesinde yara kontraksiyonunu sağlamalarıdır. Migrasyon: İnflamasyon fazından proliferatif faza geçişi sağlayan faktörlerden biri, sitokinler ve büyüme faktörleridir. Fibroblast migrasyonu, PDGF, NGF, TGF-β, CTGF ve Cyr-61 tarafından stimüle edilir (16). Aynı zamanda geçici matriksin içeriğinde yer alan fibronektin de fibroblastları yara bölgesine çeker (17). Yara bölgesine göç eden fibroblastlar, iki farklı hücre kaynağından gelirler. Bunlardan biri, yaraya yakın bölgelerde farklılaşan hücrelerdir. Diğeri ise, makrofaj ürünlerinin stimülasyonuyla fibroblastlara farklılaşan yakındaki mezankimal hücrelerdir (12,15). Hücre yüzeyinde bulunan integrinler, fibroblastlarla ekstrasellüler matriks arasındaki ilişkiyi kolaylaştırır (12). İntegrinler onarım sırasında hücre fonksiyonu kontrol eden düzenleyicilerdir. İntegrinler hücre dışına, membrana ve hücre içine uzantıları olan transmembranöz reseptörlerdir (18). Heterodimerik yapıdadırlar ve birbiriyle ilişkiye girerek aktif protein reseptörünü oluşturan α ve β alt ünitelerinden oluşur. İntegrinlerin ligandları büyüme faktörleri ve kollajen, elastin gibi ECM bileşenleridir. Ligandın bağlanmasını takiben integrin reseptörünün sitoplazmik 5

8 reseptöründe fosforilasyon meydana gelir ve bu bir dizi sinyal iletimi zincirini harekete geçirerek gen ekspresyonunu değiştirir ve yeni hücresel fonksiyonun meydan gelmesini sağlar. Fibroblastların yara bölgesine göçü düzensiz bir şekilde değildir. Fibroblastlar yara bölgesine fibrillere paralel olarak hareket ederler. Fibroblastlar bu göçleri sırasında, hücresel yıkım ürünleri ve matriks fibrilleriyle karşılaşırlar. Bu engelleri çeşitli matriks metalloproteinazları (MMP) yardımıyla aşarlar. Şimdiye kadar 24 farklı MMP tanımlanmıştır (19). Bunlardan MMP-1, MMP-2 ve MMP-3, TGF-β tarafından, MMP-19 ise TNF-α tarafından stimüle edilirler. MMP lerin anjiogenez ve fibroblast göçünde önemli rolleri vardır. Aynı zamanda yapılan çalışmalarda tümör invazyonuyla da ilişkilendirilmişlerdir (12). MMP ler bir grup olarak her türlü içeriğe sahip ECM yi seçim yapmadan tanıma ve yıkma yeteneğine sahiptirler. Bu, MMP lerin çok dikkatli bir şekilde regüle edilmelerini gerektirir. Bu düzenleme ilk olarak hücre içi üretim aşamasında gen ekspresyonunun düzenlenmesiyle olur. Hücre içinde üretilen MMP ler proenzimler ve zimojenler halinde hücre dışına salınır. Hücre dışındaki ikinci düzenleme, ekstrasellüler aktivasyon sırasında olur. Üçüncü düzenleme, doku matriks metalloproteinaz inhibitörleri (TIMP) aracılığıyla sağlanır (19, 20). Son yapılan çalışmalar anormal MMP ve TIMP oranlarını aşırı fibrozisin rol oynadığı skleroderma, keloid ve hipertrofik skar gibi durumlarla ilişkilendirmiştir. Yapılan çalışmalarda, hipertrofik skar ve keloidlerde MMP-2, MMP-3, MMP-13 seviyelerinin arttığı gösterilmiştir (21-23). Fujiwara, benzer bir çalışmada, keloid fibroblastlarında tip I kollajen ve MMP-1, MMP-2 TIMP-1 seviyelerinde artış saptamıştır (24). Fujiwara, keloid fibroblastlardaki artmış migratuar aktiviteyi, MMP seviyesindeki artışla ilişkilendirmiştir. ECM üretimi ve büyüme faktörleri: Fibroblastlar, kalıcı ekstraselüler matriks elemanlarını (kollajen, glikozaminoglikan (GAG), proteoglikan) ve büyüme faktörlerini üretmekten sorumludurlar. Kollajen üretimi, doku hasarının yaklaşık 3-5. gününde başlar ve PDGF, TGF-β, EGF, IGF1, FGF-2,CYGF, Cyr61, S1P tarafından stimüle edilirler (15). 6

9 Kollajen sentezinde ilk aşama bir kollajen prekürsörü olan prokollajenin sentez edilmesidir (12). Bu işlem membrana bağlı ribozomlarda meydana gelir. Prokollajen suda kolaylıkla çözünür ve bu özelliği onun hücre içerisinde rahatça taşınabilmesi için gereklidir. Hücre içi, prokollajen sentezinde en önemli aşama, lizin ve prolin in endoplazmik retikulumda hidroksilasyonudur. Bu aşama, prokollajen moleküllerinin sonradan hücre dışında meydana gelecek agregasyonu ve fibrillerin oluşumu için gereklidir. Prokollajen zincirleri hücre dışına salınmalarını takiben, hücre dışında bir dizi enzimatik işlemden geçerek fibrilleri oluşturmak üzere birleşirler. Proliferatif fazda gerçekleşen diğer bir olayda anjiogenezdir (13). Doku hasarının 2. gününde endotelyal hücreler, geçici ECM üzerinde, fibroblastlara benzer şekilde göç ederler. Endotelyal hücrelerin hareketi, VEGF, FGF, anjiopoietin ve TGFβ tarafından stimüle edilir (12). Ayrıca ECM nin kendisi de endotelyal hücreler için bir stimülandır. Endotelyal hücreler üzerlerinde bulunan integrin reseptörler sayesinde ECM yi tanırlar. VEGF, FGF ve TGF-β bu reseptörlerin hücre yüzeyindeki sayısını arttırır. MMP ler anjiogenezde önemli görev alırlar (19). MMP lerin görevi, bazal membranın yıkımı ve ECM nin endotelyal hücrelerin geçişine izin verecek şekilde yıkımıdır. MMP-1,MMP-2, MMP-9, MT-MMP ve MMP-19 anjiogenezde rol alan en önemli matriks metalloproteinazlardır (12). MMP-1 tip I kollajen matriks içine endotelyal hücre migrasyonu için gereklidir (25). MMP-2, endotelyal hücre yüzeyindeki integrinler sayesinde endotelyal hücrelere yapışır ve endotelyal hücreler ilerlerken önlerine çıkan, geçici ECM yi parçalayarak ilerlemelerini sağlar (12). 3. Matürasyon (Remodeling) Fazı: Matürasyon fazı, yara iyileşmesinin en uzun süren aşamasıdır Yaranın granülasyon dokusuyla dolup, keratinosit migrasyonuyla reepitelizasyon sağlanmasını takiben başlar. Yara iyileşmesinin her aşamasında olduğu gibi, bu aşama da diğerleriyle üst üste binmiştir (2). İnsanlarda yara matürasyonu, klinik olarak, yara kontraksiyonu, kızarıklık ve yara kalınlığında azalma, yara kuvvetinde artma ile karakterizedir. Yara kontraksiyonu, yaralanmayı takiben 4-5. günde başlar (2-12,13). Yara kontraksiyonu, myofibroblastlar sayesinde sağlanır. Myofibroblastlar, hücre içi aktin filamentleri 7

10 içeren fibroblastlardır ve kontraksiyon özelliklerine sahiptirler. Myofibroblastlar, üzerlerindeki integrin molekülleri sayesinde ECM ye tutunurlar. Matürasyon fazında yara kalınlığı azalırken, yaranın tensil (gerilmeye dayanım) kuvveti ters orantılı olarak artar (12). Bu ECM nin remodelizasyonuyla ilişkilidir. Net kollajen üretimi yaralanmadan sonra ortalama 21. güne kadar sürekli bir artış gösterir. Bu aşamadan sonra kollajen sentezinde bir azalma gözlenir (2). ECM deki artmış kollajen miktarının geri beslemeyle fibroblastlardaki kollajen sentezini azalttığı düşünülmektedir (26). Bunu yanında interferon-γ ve TNF-α fibroblastların kollajen sentezini azaltmada etkilidir (27). Yara iyileşmesinin 21. gününde maksimum kollajen miktarına ulaşılsa da, yaranın tensil kuvveti normalin ancak % 20 si kadardır. 6. haftada yaranın tensil kuvveti, olması gerekenin % 80 ine ulaşır. 21. günle 6. hafta arasında geçen ve yara kuvvetinin arttığı bu dönemde gerçekleşen asıl olay, kollajen yıkımı ve yeniden düzenlenmesidir (2,12). Kollajen yıkımı esas olarak MMP ve TIMP üretimi ile ilişkilendirilmiştir. MMP-2, TIMP-2, MMP-7 ECM remodelizasyonunun erken aşamalarında sentezlenir. Buna karşılık, MMP-1, MMP-9 ve TIMP-1 seviyelerinde ECM remodelizasyonu aşamasından önce bir düşme gözlenir (28). Bu sebeple, MMP lerin ve TIMP lerin uyumlu bir şekilde üretilmesi sağlıklı yara matürasyonu açısından önemli gibi görünmektedir. Matürasyon fazında ECM niteliğinde belirgin değişiklikler meydana gelir. Zamanla, Tip I kollajen miktarı artarken, Tip III kollajen, proteoglikan ve su miktarı azalır. Kollajen fibrillerinin kalınlığı, interfibriller bağlanma atar ve fibriller yeniden düzenlenir. Yara iyileşmesinin erken dönemlerine kollajen fibrilleri düzensiz şekilde dizilmişlerdir. Bu, iyileşmenin erken döneminde, yüksek kollajen miktarına rağmen, yara kuvvetindeki zayıflığı açıklar (29). Skar matürasyonuyla beraber, klinik olarak gözlemlenen kızarıklık azalışı yara içindeki kapillerlerin yoğunluğunun değiştiğini gösterir. Matür skar, granülasyon dokusuna oranla daha az kapiller içermektedir (14). B. KELOİD ve HİPERTROFİK SKAR Keloid ve hipertrofik skarlar, aşırı skar oluşumunun klinik olarak görülen iki farklı türüdür. Keloidler, genetik olarak eğilimli kişilerde, cilt yaralanmasını takiben anormal yara iyileşmesinin sonucu olarak ortaya çıkan fibröz aşırı büyümelerdir (30). Normal 8

11 skarların aksine gerileme göstermezler. Keloidler insan dışındaki diğer canlılarda görülmeyen (31), benign dermal fibroproliferatif tümörler olarak tanımlanabilir. Nasıl ve neden oluştukları kesin olarak bilinmese de yara iyileşme sürecinin sonlandırılmasındaki bir yetersizliğe bağlı olduğu düşünülmektedir. Skar bölgesinde fazla miktarda kollajen oluşur ve bu kollajen oluşumu yara sınırlarını aşar. Bazı çalışmalar, keloidlerden elde edilen fibroblastların normal fibroblastlarla karşılaştırıldığında daha fazla kollajen ürettiklerini göstermektedir (1,32). Bunun yanında hipertrofik skarlar keloidlerden, yara bölgesinin sınırları içinde kalmalarıyla ayrılırlar. Normal dokuyu etrafa doğru iterek büyüseler de yara etrafındaki normal dokuyu invaze etmezler (33,34). Hem hipertrofik skarlar hem de keloidler, her iki cinste de benzer oranlarda görülür. Her ikisinin de en sık görüldüğü yaşlar yirmili yaşlardır. Her ırkta görülebilirler ancak keloidler esmerlerde daha sık görülme eğilimindedirler. Hipertrofik skarlar zamanla regresyon gösterebilirler ancak keloidler regresyon göstermezler. Hipertrofik skarlar ve keloidlerin tedavisi için sıklıkla cerrahi eksizyon ve sonrasında steroid ve/veya silikon sheet uygulaması kullanılır. Bu tedavi sonrasında keloidlerde rekürrens % arasında görülürken, hipertrofik skarlarda rekürrens çok daha nadirdir (35). Keloid ve hipertrofik skarlar için pek çok risk faktörü ortaya atılmış olsa da, etyolojisinde şu ana kadar açıkça ortaya konmuş tek önemli risk faktörü, ailesel yatkınlıktır. Keloid hastalığında kalıtımın otozomal resesif yolla geçtiği düşünülmektedir, ancak şu ana kadar bu durumdan sorumlu tutulabilecek bir gen tespit edilememiştir (34). Histolojik olarak keloid ve hipertrofik skarlar, normal skar dokusundan zengin damarlanmaları, yüksek mezankimal hücre yoğunlukları, inflamatuar hücre infiltrasyonu ve kalınlaşmış epidermal hücre tabakası ile ayrılırlar. Her iki lezyonda da predominant aktive fibroblast türü mevcuttur, keloid lezyonunda görülenler daha hareketsizdir. Keloidler sıkıca paketlenmiş sayısız fibrilden oluşan büyük ve kalın kollajen lifleri içerirler. Hipertrofik skarlarda ise, fibroblastik hücreler, küçük damarlar ve rastgele organize olmuş ince kollajen fiberlerden oluşan nodüler yapılar görülür. Bu nodüler yapılar hipertrofik skarlarda hemen her zaman görünse de, keloidlerde nadiren görülür. Keloid ve hipertrofik skarların vasküler yapıları benzerdir. Birçok küçük oklüde damar içerirler. Sadece keloidlere özgü olan ve hipertrofik skarlarda bulunmayan ayırıcı histolojik bulgu geniş, eozinofilik, hyalin 9

12 benzeri kollajen lifleridir. Bu, keloidal kollajen ismiyle de anılır. Ancak keloidin bu ayırıcı histolojik bulgusunun her zaman görülmesi mümkün olmamaktadır. Keloidal kollajen keloid örneklerinin yalnızca % 55 inde tespit edilebilir (36). Keloid oluşumunun patogenezi hala açıklığa kavuşmuş değildir. Keloidlerden elde edilen fibroblastların aşırı miktarda Tip I prokollajen ürettiği, fazla miktarda VEGF, TGFβ1/β2, PDGFα reseptör ekspresyonu gösterdiği ve büyüme faktörlerine daha az ihtiyaç duyduğu bilinmektedir (30). Prolin hidroksilaz aktivitesiyle ölçülen kollajen sentezi hemen hemen 20 kat artmış bulunur (35). Keloid fibroblastların apoptozis yetenekleri de normale göre kısıtlıdır ve apoptozisle ilgili genlerde azalma mevcuttur. Kültüre edilmiş fibroblastların normal fibroblastlara göre daha fazla kollajen ve matriks metalloproteinazları ürettikleri gösterilmiştir (24). Keloid fibroblastlarının proliferasyon hızları hipertrofik skarlara göre daha yüksektir (37). Normal skarlarda bulunan bir negatif geri besleme mekanizması fibroblastların aşırı çoğalmasını engellemektedir. Bronson, matür skarlardan elde edilen fibroblastların normal yara iyileşmesinde fibroblast proliferasyonunu baskılayabildiğini göstermiştir (38). Bu negatif geri besleme mekanizmasının çalışmaması hipertrofik skarlarda ve keloidlerde abartılı yara iyileşmesini açıklayabilir. 1. Keloid oluşumunda sorumlu tutulan sebepler: Anormal fibroblast aktivitesi: Hipertrofik skarlardan ve keloidlerden elde edilen fibroblastlar değişik özellikler göstermektedir. Hipertrofik skarlarda bulunan fibroblastların bazal kollajen üretim seviyesinde orta dereceli bir yükselme mevcuttur. Ancak, büyüme faktörlerine olan cevapları normal fibroblastlara benzer. Bunun aksine keloid fibroblastları, yüksek seviyelerde kollajen, elastin, fibronektin ve proteoglikan üretirler. Bunun yanında, büyüme faktörlerine karşı daha hassastırlar. Keloid fibroblastları, esas olarak Tip I kollajen üretirler ve artmış bir proliferasyon kabiliyetleri vardır (13). Büyüme faktörleri ve diğer sitokinlerin seviyelerinde artma: TGF-β nın üç alt tipi mevcuttur (β1-β2-β3). TGF-β1 ve β2 seviyeleri keloid skarlarda yükselmiş olarak bulunur. TGF-β1 artmış kollajen ve fibronektin senteziyle ilişkilendirilmiştir. Ayrıca 10

13 keloid fibroblastların üzerlerinde, VEGF, TGFβ1/β2, PDGF reseptörlerinin daha fazla miktarda bulunduğu bildirilmiştir (30). Apoptoziste azalma: Apoptozis, embriyogenezde, dokuların şekillenmesinde ve hücre yenilenmesinde önemli rol oynamaktadır. Çalışmalar, apoptozis sürecinin yara olgunlaşmasında da önemli rol oynadığını göstermektedir. Keloidlerden elde edilen fibroblastların apoptozis yeteneklerinde azalma olduğu gösterilmiştir. Bunun üzerine apoptozisle ilgili genler olan p53, p63 ve p73 üzerinde durulmuştur. P53 geninin keloid ve hipertrofik skarlardaki fibroblastlarca normal skarlara göre daha fazla üretildiği gösterilmiştir. Bu ilk bakışta artmış kollajen sentezine karşı apoptozisin artması şeklinde bir cevap olarak düşülebilir. Ancak Ghassan, keloid fibroblastlarda üretilen p53 ün defektif olduğunu göstermiştir. Bu defektif p53 geninin apoptozis fonksiyonunun bozukluğu ile ilgili olduğu düşünülmüştür. Bunun yanında normal deride fark edilemeyecek miktarlarda üretilen p63 geninin keloid fibroblastlarda aşırı derecede sentezlendiği gösterilmiştir (39). Plazminojen Aktivatör İnhibitörü-1 seviyesinde artma: Fibrin, yara iyileşmesinde; inflamatuar hücrelerin migrasyonunda, kollajen sentezinde ve granülasyon dokunun oluşumunda önemli rol oynar. Plazmin tarafından parçalanır. Plazmin düzeyleri ürokinaz ve plazminojen aktivatör tarafından arttırılırken, plazminojen aktivatör inhibitörü-1 ile azaltılır. Keloid fibroblastlarda artmış seviyelerde plazminojen aktivatör inhibitörü-1, ve azalmış ürokinaz seviyeleri bulunur. Bu, kollajenin uzaklaştırılmasında bir eksikliğe yol açıp skar oluşumunu arttırabilir (40). Hipoksi: Keloidlerin histolojik incelemesinde, oklüze damarlar ve damar duvarına dizilmiş şişmiş endotel hücreleri görülür. Hipoksinin keloid skar oluşumuna nasıl yol açabileceği tam olarak netlik kazanmamıştır. VEGF, hipoksiye cevap olarak fibroblastlardan salınır. Gira, keloidlerde VEGF salınımının arttığına ait bulgular ortaya koymuştur. Ancak diğer bazı çalışmalar, bu bulguları desteklememiştir (41). Sebum a karşı immun reaksiyon: Keloid skarların sebuma karşı bir reaksiyona bağlı gelişebileceği düşünülmüştür. Bunu destekleyen bulgular; keloid skarların daha çok adolesan yaşta görülmesi, pilosebaseöz ünitelerin bulunmadığı avuç içi ve ayak 11

14 tabanında çok nadir görülmesi, sebase bezlerin aktivitesinin fazla olduğu bölgelerde spontan keloid skarların görülmesi, bazen keloid skara komşu bir bölgede yaralanma sonrası keloid oluşumu gözlenmemesidir. Bu teoriyi destekleyenler, keloid skar oluşumundan pilosebaseöz birimlerin rastgele hasarını sorumlu tutmaktadır (42). Onkojenler: Keloidler mezankimal tümörler olarak düşünülebilir. Keloid fibroblastların gli-1 onkojenini içerdiği ve Gli-1 proteini ürettiği gösterilmiştir. Bu onkojen normal dokudan ve hipertrofik olmayan skarlardan elde edilen fibroblastlar tarafından sentez edilmezler. Rapamycin ve tacrolimus keloidlere karşı etkili olduğu bilinen iki ajandır. Bu ajanların aynı zamanda Gli-1 proteinin hedefi olan cis-transprolyl izomeraz reseptörünü bağladıkları gösterilmiştir (13). 2. Keloid ve Hipertrofik skarların tedavisinde kullanılan yöntemler: Eksizyon: Keloidlerin eksizyonu tek başına başarılı bir tedavi yöntemi değildir. Rekürrens oranları % 45 ile % 95 arasında değişir. Genellikle diğer tedavi yöntemleriyle birlikte kullanılır (42). Steroidler (Triamsinolon): Kolay kullanımları, kolay elde edilebilir olmaları, kolay tolere edilebilmeleri ve semptomları azaltmadaki başarıları nedeniyle keloid ve hipertrofik skarların tedavisinde en sık kullanılan yöntemlerden birisi intralezyonel steroid uygulamalarıdır. Bu amaçla sıklıkla kullanılan steroid, triamsinolon asetonid dir. Sıklıkla 40 mg/ml lik dozu 4-6 hafta aralıklarla 3 kez uygulanır. Bu uygulamaya skarda düzleşme sağlanıncaya kadar devam edilebilir. Tek başına kullanımı keloidin ağırlığını hafifletebilse de tamamen yok etmez. Preoperatif bir veya birkaç doz sonrası keloidin cerrahi eksizyonu ve tedavinin postoperatif devam edilmesi sık kullanılan bir tedavi rejimidir. İntralezyonel steroid kullanımının yan etkileri atrofi, hipopigmentasyon, depigmentasyon, telenjektazi ve deri nekrozudur. Steroid kullanımına bağlı sistemik etkiler bu tür tedavilerde nadir görülür (2,12,13,32,33,42,43). Steroidler fibroblast büyümesini ve alpha 2-makroglobulin i inhibe ederek kollajen yıkımını arttırırlar. Carrol, triamsinolonun normal ve keloid fibroblast kültürlerinde TGF-β1 seviyelerini azaltırken, kollajen sentezi üzerine negatif etkisi 12

15 olan bfgf yi arttırdığını göstermiştir (44). Etkinliklerine dair yapılan çalışmalar yıl öncesine kadar dayanır ve genel olarak bu çalışmalarda % 50 nin altında rekürrens oranları verilmiştir (30). Bası tedavisi: Özellikle yanık sonrası oluşan keloid ve hipertrofik skarların tedavisinde etkili bir yöntemdir. Bu tedavi yöntemi genellikle diğer tedavi yöntemleriyle birlikte kullanılır. 4-6 ay boyunca günde saat kullanılması gerekir. Özellikle kulak lobülündeki keloidlerin tedavisinde bası yapıcı küpelerin başarılı kullanımları bildirilmiştir. Uygulanacak uygun basınç miktarı 24 mmhg ile 30 mmhg arasındadır (13,42). Silikon: 1982 de ilk kez ortaya çıkmasından bu yana, silikon sheet ve silikon içeren pomadlar, var olan hipertrofik skarların küçültülmesi ve yeni hipertrofik skarların oluşumunun engellenmesi amacıyla yaygın şekilde kullanılmaktadır. Tedavi edici etkileri birçok çalışmada bildirilmiştir (45). Silikon sheet kullanımının etki mekanizması halen belirgin değildir ve çeşitli hipotezler mevcuttur. Yapılan çalışmalarda silikon sheet uygulamasının yara üzerinde basınç, ısı, oksijen miktarı gibi parametrelerde değişiklik yaratmadığı bildirilmiştir. Etkisinin skar hidrasyonunun arttırılmasına bağlı olduğu düşünülmektedir. Yapılan bir çalışmada silikon içeren ve içermeyen bası giysilerinin benzer seviyede tedavi etkisi olduğu bildirilmiştir (42). Silikon içeren pomad ve kremlerin, silikon sheetin gösterdiği etkiyi göstermediği düşünülmektedir (13). Radyoterapi: Radyoterapinin keloid rekürrens oranını etkin bir biçimde azalttığı bilinmektedir. Kullanımı teorik olarak malignensiye yol açma riski nedeniyle kısıtlıdır (42). Radyoterapinin etkisini apoptozisi arttırarak gösterdiği düşünülmektedir. Shenkang, kültüre keloid fibroblast hücreleri üzerinde yaptığı çalışmada, 8 Gy dozunda verilen gamma ışınlarının keloid fibroblastlarda apoptozisi iki kat arttırdığını göstermiştir (46). Radyoterapinin tek başına kullanımının keloid tedavisindeki yeri tartışmalıdır. Rekürrens oranları % arası bildirilmiştir. Ancak keloid eksizyonu sonrası adjuvan radyoterapinin uzun dönemli takipte, rekürrensi önlemedeki etkinliği % arası bildirilmiştir (42). Ragoowansi tarafından 80 hasta üzerinde yapılan retrospektif bir çalışmada, keloid lezyonlarının eksizyonunu takiben 13

16 24 saat içinde 10 Gy radyoterapi uygulanmıştır (47). Hastaların 5 yıllık takip süresi sonrası; 1.yılda rekürrens oranı % 9; 5. yıl sonunda % 16 olarak bildirilmiştir. Ogawa, 129 hastadaki 147 keloid lezyonu üzerinde, eksizyon sonrası 15 Gy radyoterapi uygulamış ve 18 ay sonunda rekürrens oranını % 32,7 olarak bildirmiştir (48). Radyoterapinin, karsinogenez için teorik olarak risk taşıdığı bu hastalarda unutulmamalıdır (30). Literatürde radyoterapiyle keloid tedavisi sonrası gelişen malignitelerle ilgili çok az sayıda bildiri mevcuttur (49,50). Bu malignitelerin direk olarak radyoterapiyle ilişkilendirilebilmesi ise kolay değildir. Yine de, bu tedaviyi alacak hastalara potansiyel tehlike hakkında bilgi verilmelidir. Krioterapi: Zouboulis, keloid ve hipertrofik skarların tedavisi için bir intralezyonel krioterapi cihazı geliştirmiş ve 12 hasta üzerinde yaptığı çalışmada, lezyon boyutlarında ortalama % 51 oranında küçülme; ağrı, kaşıntı, lezyon sertliği ve skar rengi gibi belirtilerde gelişme saptadığını bildirmiştir (51). Tedavi öncesi ve sonrası yapılan histolojik analizlerde skar organizasyonunda gelişme görüldüğünü bildirmiştir. İnterferon: İntralezyonel interferon keloid ve hipertrofik skarların tedavisi amacıyla deneysel olarak araştırılmaktadır. İnterferonlar fibroblastların kollajen sentezleme yeteneğini engellerler (13). Özellikle IFN-α-2b, keloidlerdeki kollajen ve glikozaminoglikan seviyesini normal seviyelere getirir. Baş ağrısı, grip benzeri semptomlar ve miyalji tedavinin sık görülen komplikasyonlarıdır. İnterferon ile ilgili yapılan çalışmalar çelişkili sonuçlar içermektedir. Berman ve Flores, retrospektif bir çalışmada eksizyon ile IFN-α-2b yi karşılaştırmış ve interferon tedavisinin rekürrens oranını (% 18,7) eksizyon (% 51,1) ve posteksizyonel steroid tedavisine göre (% 58,4) anlamlı derecede azalmış olarak bulmuşlardır (52). Conejo-Mir, yaptığı çalışmada karbon dioksit lazer ve IFN-α-2b yi kombine ederek kullanmış ve 3 yıllık rekürrens oranını % 0 olarak bildirmiştir (53). Ancak daha güncel bir çalışmada, IFN-α-2b ile tedavi edilen 13 keloid lezyonunun 7 si rekürrens göstermiş (% 54), buna karşılık triamsinolon ile tedavi edilen 26 keloid lezyonunda rekürrens oranı çok daha düşük (% 15) bulunmuştur (54). 14

17 Lazer: Karbon dioksit lazer eksizyon uygulamasının keloid ve hipertrofik skarların tedavisindeki yeri savunulmuş olsa da değişik çalışmalarda bulunan % 50 üstündeki rekürrens oranları, bu yöntemin basit eksizyona kıyasla bir avantajı olmadığını göstermektedir. Maliyetinin yüksek olması; az kan kaybı ve azalmış postoperatif ağrı gibi avantajlarına rağmen kullanımını sınırlandırmaktadır. Bu konuda en umut verici sonuçlar, 585-nm pulsed dye lazer uygulamasıyla ilgili olarak bildirilmiştir. Etkinlik oranı % 75 olarak bildirilmiştir. Bu lazer uygulaması, hemoglobin moleküllerinin selektif termolizisine yol açarak mikrovasküler hasara ve koagülatif nekroza yol açmaktadır. Melanin pigmentinin hemoglobinle bu konuda yarışması, keloidlerin daha çok görüldüğü esmer renkli kişilerde bu metodun etkinliğini azaltmaktadır (13). Vitamin A: Oral vitamin A nın keloid skarların görünümünde gelişme yarattığı gözlemine dayanarak % 0.05 lik retinoik asidin yara iyileşmesine ve anormal skar oluşumuna etkisini araştıran bazı çalışmalar yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar olumlu olsa da, vitamin A nın deriden absorbe edilebilmesi ve buna bağlı gelişebilecek hipervitaminoz ve teratojenik etkiler nedeniyle kullanımı önerilmemektedir (45). İmiquimod % 5 krem: İmiquimod, genital siğiller, BCC ve aktinik keratoz tedavisi için geliştirilmiş immun sistemi modifiye edici topikal bir ajandır. Etkisi, proinflamatuar sitokinlerin, özellikle de interferon-α nın stimulasyonudur. İnterferonα, kollajen yıkımını arttırır. İmiquimod, bunun yanında apoptozisle ilgili genlerin ekspresyonunu arttırmaktadır. Bu özellikleri nedeniyle imiquimod, keloid ve hipertrofik skarların tedavisinde kullanılmıştır. Berman tarafından imiquimod krem 12 hastada keloidlerin eksizyonu sonrası rekürrensin önlenmesi amacıyla kullanılmış ve 24 hafta sonunda hastalarda rekürrens olmadığını gözlenmiştir (55,56). Yakın zamanda yapılan başka bir çalışmada, redüksiyon mammoplasti sonrası imiquimod kullanılan hastalarda, kullanılmayan hastalara göre skar kalitesinin daha iyi olduğu bildirilmiştir (57). İmiquimod % 5 krem ile yapılan çalışmalar olumlu sonuçlar vermiş olsa da, hem bu çalışmaların azlığı ve yapılan çalışmalardaki örnek yetersizliği, hem de takip süresinin görece kısalığı nedeniyle kesin etkileri hakkında karar vermek için henüz erken görünmektedir (30). 15

18 C. KELOİD ve HİPERTROFİK SKAR TEDAVİSİNDE 5-FLOROURASİL İN KULLANIMI 5-Florourasil (5-FU), yapısının C-5 pozisyonunda hidrojen yerine bir florin atomu içeren, bir urasil analoğudur. İlk kez, Duchinsky ve Heidelberger tarafından sentezlenmiştir (3,4). 5- FU, urasilin hücre içine transport yollarını kullanarak, rahatça hücre içine girer. Hücre içinde aktif metabolitlerine dönüştürülür. Bunlar: florodeoksiuridin monofosfat (FdUMP), florodeoksiuridin trifosfat (FdUTP) ve florouridin trifosfattır (FUTP). Bu aktif metabolitler, timidilat sentaz (TS) aktivitesini ve RNA sentezini bozarlar. 5-FU, hücre içinde dihidroprimidin dehidrogenaz (DPD) tarafından dihidroflorourasil e (DHFU) dönüştürülerek inaktive edilir. Bu işlem, özellikle karaciğerde meydana gelir (Resim 1). Resim 1: 5-Florourasil in metabolizması. 5-FU aktivasyonunun esas mekanizması, 5-FU nun fosforibozil pirofosfatı (PRPP) kofaktör olarak kullanan orotat fosforiboziltransferaz (OPRT) tarafından doğrudan veya uridin fosforilaz(up) ve uridin kinaz(uk) tarafından florouridin (FUR) üzerinden florouridin monofosfata (FUMP) dönüştürülmesidir. FUMP daha sonra iki kez fosforile olarak önce florouridin difosfata (FUDP) sonra da florouridin trifosfata (FUTP) dönüşür. Ayrıca FUDP ribonükleotid redüktaz (RR) tarafından florodeoksiuridin difosfata (FdUDP) dönüştürülebilir. Oluşan FdUDP fosforilasyon ve defosforilasyon yoluyla aktif metabolitler olan FdUTP ve FdUMP ye dönüştürülebilir.alternatif bir aktivasyon yolu 5-FU nun timidin fosforilaz (TP) ve timidin kinaz (TK) yardımıyla FdUMP ye dönüştürülmesidir. 5-FU nun dihidroprimidin dehidrogenaz (DPD) enzimi aracılığıyla dihidroflorourasile (DHFU) dönüştürülmesi 5-FU katabolizmansın hız sınırlayıcı basamağıdır.(ts: timidilat sentaz) 16

19 Kemoterapide, özellikle kolorektal kanserlerin tedavisinde kullanılan 5- FU nun hem DNA hem de RNA sentezine etkisi olduğu bilinmektedir. Bu etkilerini hem timidilat sentaz enzimini inhibe ederek, hem de DNA ve RNA yapısıyla birleşip fonksiyonlarını bozarak yerine getirirler. Timidilat sentaz, metil vericisi olarak 5,10-methylenetetrahydrofolate ı (CH 2 THF) kullanarak dump nin dtmp ye metilasyonunu katalizleyen bir enzimdir. 5-FU nun metaboliti olan FdUMP, bu enzim üzerindeki nükleotid bağlayıcı kısma stabil bir şekilde bağlanarak, normal substratı olan dump nin enzime bağlanması engeller. Bu, dtmp sentezinin engellenmesine neden olur. dtmp sentezinin engellenmesi, ileri aşamada dttp sentezinin engellenmesine neden olur. Bu, diğer deoksinükleotidlerin (datp, dgtp, dctp) miktarında bir artışa yol açar. Deoksinükleotid havuzunun dengesindeki bozulma (özellikle datp/ddtp oranının bozulması) DNA sentez ve onarımını bozarak, DNA üzerinde ölümcül bir hasara yol açar. TS inhibisyonu aynı zamanda dutp miktarındaki artmayı da beraberinde getirir. Hem dutp, hem de bir 5-FU metaboliti olan FdUTP, DNA ile yanlış biçimde birleşerek DNA hasarına yol açar (3) (Resim 2). Resim 2: 5- Florourasil in etki mekanizması (TS:Timidilat sentaz; TK:Timidin kinaz).. 5-FU nun etki mekanizmalarından biri de RNA üretim ve fonksiyonunun bozulmasıdır. 5-FU nun bir metaboliti olan FUTP, RNA ile birleşerek, normal RNA fonksiyonunun bozulmasına yol açar. 5-FU nun, fibroblastlar üzerinde proliferasyon azaltıcı etkisi olduğu gösterilmiştir ve glokom cerrahisi sonrası skar oluşumunu ve buna bağlı rekürrensi 17

20 engellemek için kullanılmıştır (6). Diğer çalışmalarda, 5-FU nun etkisini sadece fibroblast proliferasyonunu engelleyerek değil, aynı zamanda migrasyon, büyüme faktörlerinin, kollajen ve fibronektin proteinlerinin üretimi gibi fibroblast fonksiyonlarını inhibe ederek de ortaya koyduğu gösterilmiştir (5). Bulstrode, Dupuytren hastalarından ve normal bireylerden alınan fibroblast hücre kültürleri üzerinde yürüttüğü bir çalışmada, 5-FU nun kollajen sentezini selektif olarak inhibe edebildiğine dair bulgulara rastlamıştır (58). Kollajen sentezindeki bu azalışa, diğer nonkollajenez proteinlerin üretiminde azalma eşlik etmemiş ve 5-FU ya maruz kalan fibroblast hücre kültürleriyle, 5-FU ile tedavi edilmemiş hücre kültürleri arasında fibroblast hücre sayıları arasında bir farklılığa rastlanmamıştır. Canter, yaptığı deneysel çalışmada silikon implantlar etrafında kapsül oluşumunun engellenmesinde 5-FU nun etkinliğini araştırmış ve olumlu sonuçlar elde etmiştir (59). 5-FU nun glokom cerrahisi sonrası skar oluşumunun engellenmesi üzerindeki etkinliği ve güvenilirliğinin, çok merkezli ve uzun dönemli klinik çalışmalarla gösterilmesi, hipertrofik skar ve keloidlerin tedavisinde de 5-FU dan yararlanılabileceği fikrini ortaya çıkarmıştır. Fitzpatrick, 10 yıl içinde, 1000 hasta üzerinde yaptığı klinik çalışmada 5-FU nun hipertrofik skarlar ve keloidler üzerindeki etkinliğini ve güvenilirliğini göstermiştir (7). Bu çalışmada, 5-FU tedavisi, intralezyonel enjeksiyon yoluyla uygulanmış, haftada 2-3 enjeksiyon ile başlanan tedaviye, gittikçe uzayan aralıklarla 1-6 ay arası devam edilmiştir. Uppal, keloid skarları olan 11 hasta üzerinde yaptığı çalışmada, lezyonların eksizyonu sonrası yara bölgesinin bir kısmına 5 dakika boyunca 50 mg/ml lik 5-FU çözeltisini topikal olarak uygulamıştır (60). 6 ay sonra hastaların kendi skarları üzerinde yaptıkları keloid skar skorlaması 5-FU nun skar üzerindeki olumlu etkilerini göstermiştir. Aynı çalışmada, 5-FU ile tedavi edilen bölgelerden alınan biyopsi örneklerinin, 5-FU uygulanmayan bölgelerden alınan biyopsi örneklerine kıyasla, genel olarak daha az hücre proliferasyonu gösterdiği ve bu bölgelerden elde edilen keloid fibroblastlarının kontraksiyon yeteneklerinin azaldığı bulunmuştur. 5-FU nun keloid fibroblastların kontraktil yetenekleri üzerindeki etkisi diğer çalışmalar tarafından da doğrulanmıştır (61). Yapılan çalışmalarda, keloid ve hipertrofik skarların tedavisi için kullanılan intralezyonel 5-FU nun yol açtığı yan etkilere dair çeşitli sonuçlar bildirilmiştir. Nanda, 28 hasta üzerinde yaptığı çalışmada, hastalara 12 hafta boyunca haftada tek 18

21 doz 50 mg/ml olmak üzere intralezyonel 5-FU tedavisi uygulamış ve 24 hafta boyunca hastaları takip etmiştir. En sık görülen yan etkiler; enjeksiyon yerinde ağrı (% 100), ülserasyon (% 21,4), yanma hissi (% 7,1) olarak bildirmiştir (62). Grupta ve Karla, 24 hasta üzerinde yaptıkları çalışmada, ilginç olarak sadece bir hastada ülserasyona rastlamış ancak hastaların % 100 ünde hiperpigmentasyon geliştiğini bildirmişlerdir (63). Kontochristopoulos un 20 hasta üzerinde yaptığı başka bir çalışmada ise, hastaların tamamında ağrı ve hiperpigmentasyon, % 30 unda (6 hasta) ülserasyon görülmüştür (64). Bu yapılan çalışmalarda, hastalarda, 5-FU nun anemi, lökopeni, trombositopeni gibi sistemik yan etkilerine rastlanmamıştır (7,62-65). 5-FU nun topikal preparatları BCC ve aktinik keratoz tedavisinde kullanılmaktadır. Efudex, Valeant Pharmaceuticals North America şirketi tarafından üretimi yapılan ticari 5-FU preparatlarından biridir. Efudex krem, white petrolatum, stearyl alkol, propylene glycol, polysorbate 60 and parabens içeren vanishing krem bazı içerisinde % 5 oranında 5-FU içerir. Mevcut literatürde, 5-FU nun krem formunun keloid ve hipertrofik skarların tedavisinde kullanımına ait bir çalışma bulunmamaktadır. D. HALOFUGİNON Dichroa Febrifuga bitkisinin, antimalaryal özellikleri nedeniyle geleneksel Çin tıbbında yaklaşık iki bin yıl öncesine dayanan bir kullanım öyküsü mevcuttur. Febrifugine, bu bitkiden elde edilen etkin maddedir ve kimyasal yapısı nedeniyle quinazoline türevi olarak tanımlanmıştır (8). Yapılan hayvan çalışmalarda P. Lophurae ve P. Cynomolgi ye karşı, kinine kıyasla daha etkili bulunmuş ancak gastrointestinal sisteme ait yan etkileri nedeniyle yeterince klinik kullanım alanı bulamamıştır (66,67). Halofuginon [7-bromo-6-chloro-3-(3-hydroxy-2-piperidine)-2-oxopropyl- 4(3H)-quinazoline], bir febrifugine analoğudur ve 1960 lı yıllarda yeni antimalaryal ilaçlar geliştirme amacıyla yapılan çalışmaların sonucu olarak ortaya çıkmıştır. Antimalaryal ilaç olarak klinik kullanım alanı bulamamıştır. Ancak yaklaşık yirmi yıldır veteriner hekimlikte kümes hayvanlarında koksidiyoz enfeksiyonlardan korunma amacıyla antikoksidiyal ajan olarak kullanılmaktadır. 19

22 Yakın zamanda, Granot tarafından Halofuginon un kuş, sıçan ve insan fibroblastlarında kollajen α1 gen ekspresyonunu ve tip I kollajen sentezini inhibe ettiğinin ancak tip II ve Tip III kollajen sentezine etkisi olmadığının keşfedilmesi ilgiyi tekrar üzerine çekmiştir (9). Sonraki çalışmalarda, Halofuginon un hayvan modellerinde skleroderma ve kronik graft versus host hastalığındaki ( cgvhd ) güçlü fibrozis engelleyici etkisi gösterilmiştir (10,68). Halofuginon un aynı zamanda vasküler düz kas hücrelerinde ve mezengial hücrelerde ekstrasellüler matriks sentez ve depolanmasını da inhibe ettiği gösterilmiştir (69). Buna ek olarak, matriks metalloproteinaz 2 nin (MMP-2) üretimini ve anjiogenezi baskıladığı bulunmuştur (11,70) Pines ve arkadaşları, Halofuginon un topikal uygulandığında esas olarak fibroblastları etkilediğini ve keratinositlere etkisinin çok az olduğunu göstermiştir (68). Halofuginon un tip I kollajen sentezini baskılayıcı etkisini nasıl gösterdiği henüz tam olarak anlaşılamamıştır. McGaha, skleroderma benzeri semptomlar gösteren fibrilin-1 gen mutasyonuna sahip TSK+ ( tight skin syndrome ) sıçanlar üzerinde yaptığı çalışmada, Halofuginon u intraperitoneal olarak denekler üzerinde denemiş, sonuçta TSK+ sıçanların ciltlerinde fibrozisin azaldığı saptamıştır (71). Fibrozisteki bu azalma hidroksiprolin seviyelerinde ve kollajen tip I mrna üreten hücrelerde azalma ile bağlantılı bulunmuştur. Tip I mrna sentezinin azalması, DNA üzerinde α2 promotor aktivitesindeki azalmayla beraberdir. Aynı çalışmada bu etkinin, hücre proliferasyonu, farklılaşması ve ekstrasellüler matriks sentezi gibi çok sayıda hücre aktivitesini düzenlemekle görevli büyüme faktörlerinden biri olan TGFβ1 in sinyal transdüksiyonunun Halofuginon tarafından engellenmesiyle orta çıktığı bildirilmiştir. Bu engelleme, TGF-β1 e bağlı Smad-3 aktivasyonunun Halofuginon tarafından inhibisyonuyla oluşmaktadır (72). McGaha, daha sonra yaptığı bir çalışmada, Halofuginon un aynı zamanda kollajen gen transkripsiyonununda rol oynayan AP-1 kompleksinin bir komponenti olan c-jun un fosforilasyonunu arttırak hem TGF-β1 e bağlı kollajen promotor aktivitesini azalttığını ve hem de Smad-3 aktivitesini engellediğini göstermiştir (73). Halofuginon un Tip I kollajen sentezi üzerindeki inhibe edici etkisi, fibrozisin temel patolojiyi oluşturduğu çeşitli hayvan modelleri üzerinde araştırılmasına yol açmıştır. Bu hayvan modelleri; TSK+ ve cgvhd fareleri, abdominal, uterin ve üretral 20

23 adhezyon yaratılan sıçanları, bleomycin e bağlı pulmoner fibrozis oluşturulan sıçanları, thioacetamide ve dimethylnitrosamine e bağlı sıçanda oluşturulan sirozu içerir (71-81). Bu çalışmalarda Halofuginon, oral ve intraperitoneal uygulamanın yanında topikal olarak da kullanılmıştır. Pines, TSK+ sıçanlarda Halofuginon un % 0.03 lük kremini topikal olarak uygulamış ve Halofuginon u intraperitoneal olarak uyguladığı kontrol grubuyla karşılaştırmıştır (74). Sonuçta, Halofuginon un topikal uygulanmasının, sistemik uygulamaya benzer şekilde α1(i) gen ekspresyonunu inhibe edebildiğini ve cilt kalınlığını azalttığını göstermiştir. Bu çalışmada topikal Halofuginon un hücre proliferasyonuna etkisi de incelenmiş ve Halofuginon un dermiste bulunan ve tip I kollajen sentezleyen fibroblastların proliferasyonunu azalttığı, buna karşılık epidermiste kollajen sentezi yapmayan keratonositlere etkisinin olmadığı görülmüştür. Buradan yola çıkarak, Halofuginon un hücre proliferasyonuna etkisinin, kollajen sentezi inhibisyonuna sekonder olduğu düşünülmüştür. Diğer çalışmalar da bu savı destekler tarzdadır. Yapılan bir çalışmada, Halofuginon un damar hasarına bağlı intimal hiperplazi üzerine etkisi incelenmiş, düz kas hücrelerinde proliferasyon inhibisyonu görülürken, endotelyal hücrelerde anlamlı değişiklik olmamıştır (82). Diğer bir çalışmada, kobaylara subkutanöz olarak implante edilen C6 glioma hücrlerinin proliferasyonu Halofuginon tarafından başarı ile inhibe edilmiş, ancak kültür ortamında kollajen üretmeyen C6 glioma hücrelerinin proliferasyonuna etkisi olmamıştır (83). Başka bir çalışmada, sirotik karaciğerde, Halofuginon un etkisi, kollajen üreten esas hücreler olan stellate hücrelerin proliferasyonu üzerine olmuştur (80). Halofuginon un esas olarak Tip I kollajen üreten hücrelerin proliferasyonuna etkili olduğunu gösteren başka bir kanıtta, Tip I kollajen sentezinin bozuk olduğu Muv-13 sıçanlarda fibroblastların Halofuginon a karşı daha az hassas olmasıdır (74). Topikal Halofuginon ile yapılan insan deneyleri: 1998 yılında, Dr. S. Tamin tarafından yürütülen yayınlanmamış bir faz 1 çalışmada, Halofuginon un % 0,01'lik solüsyonu topikal olarak, 14 sağlıklı denekte denenmiştir. Sonuçlar, Halofuginon un güvenliği ve tolere edilebilirliği ile ilgili 21

24 olumlu sonuçlar vermiştir. Deride irritasyon veya sistemik absorbsiyon bulgusuna rastlanmamıştır (68). Nagler, Halofuginon un % 0,03 lük kremini, HLA uyumlu erkek kardeşinden başarılı bir kemik iliği transplantasyonu sonrası ağır kronik graft versus host (cgvhd) hastalığı gelişen 22 yaşında erkek bir hastada, cilt tutulumunun tedavisi için kullanmıştır. cgvhd ye bağlı, boyun bölgesinde sklerozis ve kontraktürler gelişen hastada, boyun bölgesinin bir yarısı topikal Halofuginon ile tedavi edilmiş, diğer yarısı kontrol olarak kullanılmıştır. Halofuginon ile tedavi edilen boyun yarısında skleroz ve kontraktürlerin azaldığı, rotasyon kabiliyetinin tedavi edilen tarafta arttığı gözlenmiştir. Alınan cilt biyopsileri topikal Halofuginon ile tedavi edilen kısımda 3. ve 6. aylarda αi (I) gen ekspresyonunun ve kollajen içeriğinin azaldığını göstermiştir. Tedavinin sonlandırılmasından 3 ay sonra bu iki parametrede eski değerlerine dönmüştür. Bu Halofuginon tedavisinin etkilerinin geri dönebilir nitelikte olduğunu düşündürmüştür. Tedavi süresince lokal veya sistemik toksisiteye ait bir bulgu saptanmamıştır. Karaciğer ve böbrek fonksiyonları için yapılan biyokimyasal testlerde, tedavi öncesi döneme göre bir farklılık saptanmamıştır ve hastanın serumunda Halofuginon a rastlanmamıştır (84). Halofuginon un güvenliği ve etkinliği araştırmak için yürütülen bir faz II klinik çalışmada, 13 hasta üzerinde Halofuginon un % 0,01 lik topikal solüsyonu kullanılmıştır (68). Sonuçlar, vital bulgularda (kan basıncı, nabız, vücut ısısı, vücut ağırlığı), hematolojik (eritrosit, lökosit, trombosit, hematokrit, hemoglobin) ve kimyasal (keratin fosfokinaz, aspartat transaminaz, glutamil transferaz, laktoz dehidrogenaz, albümin, total ve indirekt bilirubin, üre, kreatinin, glukoz, sodyum, potasyum) laboratuar testlerinde anlamlı bir değişiklik göstermemiştir. En sık görülen yan etki, değişik derecelerde meydana gelen dermatit olmuştur ve tedavinin durdurulmasını gerektirmemiştir. 22

25 GEREÇ VE YÖNTEM A. Denekler Çalışmada ağırlıkları gr arasında değişen, 24 adet yetişkin dişi Wistar-Albino cinsi sıçan kullanılmıştır. Denekler, her biri 8 er adet denekten oluşan üç gruba ayrılmıştır. I. Grup I (Kontrol grubu): Bu grupta deneklerin sırt bölgelerine birbirine paralel, vertikal yönde iki adet insizyon yapılmıştır. Takiben, bu insizyonlar 4/0 polypropilene sutür ile subkutiküler olarak sutüre edilmiştir. Denekler 28 gün boyunca takip edilmiştir. Bu süre zarfında yara bakımı için herhangi bir ilaç kullanılmamıştır. II. Grup II (5-FU grubu): Denekler birinci gruptaki teknikle opere edilmiştir. Bu gruptaki deneklerin insizyon bölgelerine 28 gün boyunca günde bir defa olmak üzere % 5 5-FU krem (Efudex ) uygulanmıştır. III. Grup III (Halofuginon grubu): Denekler birinci gruptaki teknikle opere edilmiştir. Bu gruptaki deneklerin insizyon bölgelerine 28 gün boyunca günde bir defa olmak üzere Efudex ile benzer baz madde içinde hazırlanmış % 0,03 oranında Halofuginon içeren krem uygulanmıştır. B. Cerrahi teknik 1. Preoperatif hazırlık Bu çalışma, Haydarpaşa Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi / Deney Hayvanları Araştırma Etik Kurulu onayı alındıktan sonra, Haydarpaşa Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi Eğitim Laboratuvarında gerçekleştirildi. Denekler, ısı, ışık ve hava akımının dengeli olduğu bir odada, ayrı kafeslerde barındırılıp, standart rat diyeti ile beslendiler. Her sıçanın sırt bölgesi ameliyat öncesi traş edilip ardından povidon iyotla preoperatif hazırlık yapıldı. Anestezi için Ketamine (100 mg/kg, intraperitoneal) kullanıldı. Çalışmanın tümü aynı araştırmacı tarafından yürütüldü. 23

26 2. Cerrahi araç-gereç a. Cerrahi aletler: Cerrahi işlemler sırasında, portegü, Adson penset, disseksiyon makası, küçük boy pensler, 15 no lu bisturi ve 3 no lu bisturi sapı, steril gazlı bez, steril cerrahi eldiven, serum fizyolojik, formol, 4/0 keskin iğneli polypropilene sutür materyali kullanılmıştır. Cerrahi set otoklav ile sterilize edilmiştir. b. Efudex (% 5 5-Florourasil krem) II. gruptaki deneklerin postoperatif takibi sırasında insizyon bölgelerine uygulanan 5-Florourasil preparatı, Valeant Pharmaceuticals North America tarafından üretilen ve beyaz petrolatum, stearil alkol, propilen glikol, polisorbat 60 ve parabens (metil and propil) içeren vanishing krem içerisinde %5 oranında 5-Florourasil içeren ticari ismi Efudex olan preparattır. c. Halofuginon krem (% 0,03) III. Gruptaki deneklerin insizyon bölgelerine postoperatif dönemde uygulanan Halofuginon krem, Marmara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Teknoloji Anabilim dalında hazırlanmıştır. Vanishing krem içerisinde % 0,03 oranında Halofuginon içermektedir. Vanishing Krem içeriği: Stearik asit.190 g Gliserin..25 ml Lanolin.20 g Trietanolamin...10 g Su.800 ml Kremin hazırlanması: Stearik asit ve lanolin 80 dereceye ısıtılarak eritildi ve yağ fazı oluşturuldu. Su fazını hazırlamak için ise trietanolamin, gliserin ve Halofuginon suda çözündürülerek, 80 dereceye ısıtıldı. Sulu faz karıştırılarak yağlı faza ilave edildi ve krem oda sıcaklığına gelene kadar karıştırıldı. Bu şekilde elde edilen kreme Halofuginon % 0.03 oranında ilave edildi. 24