SHAL N LABORATUVAR TANIMI

Transkript

1 Eğitimi Etkinlikleri.Ü. Cerrahpafla T p Fakültesi Sürekli T p E itimi Etkinlikleri Yaz shalleri - Besin Zehirlenmeleri 8-9 Haziran 1998, stanbul, s Sürekli Tıp İ.Ü. Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Sürekli Tıp Eğitimi Komisyonu SHAL N LABORATUVAR TANIMI Doç. Dr. Recep Öztürk Baflta infeksiyonlar olmak üzere de iflik nedenler akut ve kronik ishale neden olmaktad r. Akut, kendi kendini s n rlayan ishalde tan m için laboratuvar metodlar na pek baflvurulmaz; zaten bu durumda pekçok hasta hekime müracaat etmemektedir. Bununla birlikte hasta hekime müracaat etti inde olas etkeni belirlemek, hem gereksiz antimikrobik kullan m na engel olur, hem de epidemiyolojik verilerin sa lanmas na katk da bulunup halk sa l aç s ndan gerekli önlemlerin al nmas na imkan sa lar. Özellikle ba fl kl k yetmezli i olanlarda, ishal öldürücü olabildi inden do ru bir tedavi karar n n ancak etken belirlenerek yap labilmesi, etken bazl tan m n önemini daha da art r r. Do al olarak ayr nt l bir anamnez ve klinik muayene ishalde etyolojinin belirlenmesinde ana noktay oluflturur ve gereksiz tetkiklerin istenmesi bu flekilde engellenmifl olur. 1,2 Akut ishalde laboratuvar tan s rutin biokimya analizleri ile birlikte basit mikroskopik incelemeler, bakteri kültürleri, immunolojik metodlar (antijen veya antikor arama) ve moleküler analizleri (DNA problar, PCR...) içerir. Özellikle, kronik ishalde endoskopik incelemeler, al nan biopsilerin histopatolojik incelenmesi ve görüntüleme teknikleri (direkt bat n grafisi, bat n BT) gere inde baflvurulan yöntemlerdir. 1,9 shal tan m nda uygun bir algoritma yap labilirse gereksiz masraf ve zaman kayb önlenecektir. yi bir klinik ve laboratuvar iflbirli i etkeni bulma imkan n çok art r r; aksi durumda etkenin belirlenme ihtimali çok düflük kal r ve daha fazla zaman ve masraf yap lmas na sebep olur. Ne yaz k ki, ülkemizde di er klinik örneklerde oldu u gibi d flk da hiçbir bilgi verilmeden laboratuvara gönderilmekte, adeta içinde ne varsa bul yanl fll yap lmaktad r. shal tan m nda de iflik incelemelere baflvurulur: 113

2 ÖZTÜRK, R 1. Genel laboratuvar incelemeleri Tam kan say m Salmonella ve Shigella infeksiyonlar nda lökosit say s yükselebilir (dehidratasyona ba l yalanc yükselmelere dikkat edilmelidir). Protozoonlardan Isospora ve Blastocystis hominis ve baz helmint ishallerinde eozinofili görülebilir. Hemolitik üremik sendromda formülde eritrositlerin parçalanm fl flekilleri, flistositler görülebilir. Gere inde (özellikle kronik ishalde), eritrosit sedimantasyon h z, BUN, elektrolitler, CPK, LDH, protrombin zaman..., tam idrar tahlili istenir (kronik ishalde de iflik testlere baflvurulmas gerekir, bunlar afla da özetlenmifltir. 2. D flk n n incelenmesi shalde en çok d flk örne i incelenir. Ayr ca, rektum sürüntüsü, duodenum aspirasyon s v s da incelenebilir. A. Makroskopi: K vam (sulu, az sulu, flekilli, flekilsiz...), mukus, kan (d flk da az miktarda mukus irritabl barsak hastal nda, fazla miktarda mukus invazif bakteri ishallerinde görülür; d flk da kan varl kolon mukozas n n inflamatuvar hastal klar n öncelikle düflündürür; ayr ca iskemik barsak hastal, divertikülit, radyasyon koliti ve di erleri ay r c tan mda dikkate al n r). B. Mikroskopik inceleme: i. Yafl preparat shalli d flk 1-2 damla serum fizyolojik içinde kar flt r larak lam-lamel aras nda fl k mikroskopunda incelenir. Ayr ca d flk 1-2 damla metilen mavisi ve lugolle muamele edilip mikroskopik inceleme için haz rlan r. Bu flekilde d flk da lökosit, eritrosit, parazit yumurtas aran r (x10 ve x40 büyütmelerle). X40 objektifle protozoon trofozoti ve kistleri araflt r l r. Serum fizyolojik, lugol, metilen mavisi (lökositlerin varl n ve polimorf veya mononükleer hücrelerden bask n olan tipi belirlemeye yarar) preparatlar yan nda d flk dan Gram boyama yap larak mikroskopla incelenir. Beklemifl, buzdolab nda saklanm fl veya dondurulmufl d flk örneklerinde lökositler parçalanaca ndan böyle örnekler d flk da lökosit aranmas için kullan lmaz. Parazit yumurtas, protozoon kist ve trofozoitlerinin ço u serum fizyolojik ve lugollu preparatlarda görülür. 114

3 SHAL N LABORATUVAR TANIMI D flk da lökosit görülmesi halinde Shigella, Salmonella, Campylobacter, enteroinvazif E.coli (E EC), Yersinia, Clostridium difficile (olgular n %50 sinde d flk da lökosit var), Vibrio parahaemolyticus, inflamatuvar barsak hastal klar (ülseratif kolit ve Crohn hastal ), radyasyon koliti, iskemik kolit öncelikle düflünülür. 1,4 As l damla veya lam-lamel aras yafl preparatta ok gibi f rlayan tarzda hareket eden bakterilerin varl Campylobacter jejuni için karakteristiktir. ii. Boyanm fl preparat Gram boyama ile, Vibrio (k vr ml gram negatif çomakç klar) ve Campylobacter (mart kanad fleklinde soluk boyanm fl, gram-negatif çomakç klar) ve S.aureus (d flk da afl r miktarda gram pozitif kok ve bol lökositler) kolitini tan mada yararl d r. Gram boyama ile de erlendirilen preparatta bir bakterinin veya mayalar n bask n oldu u, s k bakteriel etkenler gram negatif çomaklar n azald veya olmad fleklinde ön izlenimler de edinilebilir. 3,9 C. Özel parazit boyalar : Crytosporidium, Isospora, Cyclospora için modifiye EZN boyamas, Cryptosporidium için auramin-rodamin floresans boyama, Microsporidium lar için trikrom boyama yap l r. Mikroskopik inceleme ile ayr ca, serum fizyolojikli preparatta kas liflerinin varl araflt r l r. Lugollu preparatta niflasta taneleri fark edilip, sindirim hakk nda ön fikir edinilir. D flk da laktoferrin (lökositlerin parçalanmas sonras nda aç a ç kan bir üründür ve özellikle bekleyen d flk larda lökositler parçalanaca ndan laktoferrin varl lökosit olufluna iflaret eder; lateks aglütinasyon yöntemiyle kolayca bak labilmektedir) inflamatuar ishallerin ço unun saptanmas nda katk da bulunur. 10,11,12 3. Mikrobiyolojik incelemeler a. Bakteriyolojik incelemeler b. Virüs incelemeleri c. Parazitolojik incelemeler d. Mantar incelemesi Mikrobiyolojik incelemede ilk olarak direkt mikroskopi, de iflik boyama metotlar kullan l r. Kültür yöntemi etkenin üretimi ve antimikrobiklere duyarl l n incelenmesi için en önemli metottur. Ayr ca, s ras nda immunolojik 115

4 ÖZTÜRK, R metotlara (antikor veya antijen arama teknikleri: LA, ELISA, IFA, DFA) ve moleküler tan m tekniklerine de (nükleik asip problar, PCR, LCR...) baflvurulur. Nükleik asit problar ile ETEC, E EC, Campylobacter, Rotavirüs, Entamoeba histolytica vb. araflt r labilmektedir. Son y llarda giderek önem kazanan PCR tekni i ile ishal etkenlerinin ço- u araflt r labilir. PCR ile V.cholerae; EHEC, E EC, ETEC, C.difficile (toksijenik geni amplifiye edilir), Yersinia enterocolitica, Rotavirüs, Adenovirüs tip 40,41, Norwalk virüs, E. histolytica, G.lamblia araflt rmas nda duyarl ve özgül sonuçlar al nmaktad r. 0.5 g d flk örne inde 10 koloni oluflturan birim (KOB) say s nda patojen bakterinin bile PCR ile saptanabildi i bildirilmifltir. Yaln z d flk ile çal fl rken de iflik inhibitörler sebesiyle yalanc negatif sonuç al nmamas için gerekli önlemlerin al nmas gerekti i bildirilmektedir. 3,4,8,13 Elektron mikroskopi ve immun elektron mikroskopi: Özellikle etyolojide virüslerin (rotavirüs, adenovirüs, Norwalk virüs..) araflt r lmas nda önemli bilgiler sa lar. Akut ishallerde, en s k etkenin de iflik infeksiyon yapan mikroorganizmalar oldu u dikkate al n rsa mikrobiyolojik incelemelerin de eri anlafl l r. 1. Bakteriyolojik incelemeler Bu amaçla en çok d flk örne i kullan l r. Gere inde hemokültür (özellikle hasta ateflli ise), idrar, kusmuk.. örnekleri al n r. Besin zehirlenmesinde olaya sebep olan g da temin edilebilirse mikrobiyolojik inceleme buradan da yap lmal d r. Hastadan temiz, a z genifl ve s k ca kapanabilen bir kaba al nan d flk örne i hemen laboratuvara ulaflt r lmal d r. Örne in al nd kapta koruyucu özellikte bir madde, deterjan ve metal iyonlar bulunmamal d r. D flk örne ine idrar kar flmamas na dikkat edilmelidir. Yenido anlarda ve afl r düflkün eriflkinlerde eküvyonla al nan rektum sürüntüsü de inceleme için uygundur. Rektum sürüntüsü so u a ve kurulu a dayan ks z Shigella ve nozokomiyal diyarelerde C.difficile araflt r lmas nda özellikle tercih edilir. Al nan d flk materyali en geç 1 saat içinde ekilmeli, aksi halde uygun bir tafl y c besiyerine konulmal d r (eflit miktarda M sodyum fosfat tamponu ve gliserol; Cary-Blair tafl ma besiyeri vb); çünkü d flk so udukça ve zamanla ph i düfltükçe pek çok Shigella suflu ve baz Salmonella bakterileri inhibe olacakt r. Vibrio spp kuflkusu varsa tafl ma vasat olarak alkali peptonlu 116

5 SHAL N LABORATUVAR TANIMI su (APS) tercih edilir. D flk örne i buzdolab na konmamal veya içine koruyucu maddeler ilave edilmemelidir. 4,6 Her bölgede yerel flartlar dikkate al narak olas en s k etkenler araflt r l r. Laboratuvar en s k rastlanan 3-4 etkeni çal fl r. Ülkemizde s k rastlanan etkenleri dikkate ald m zda Salmonella, Shigella, Campylobacter rutin olarak araflt r lmal d r. stanbul da oldu u gibi (s kl %3 ün üzerinde) s k rastlanan yerlerde Aeromonas rutin araflt r lmaya dahil edilmelidir. Çocuklarda Enteropatojenik E.coli (EPEC) de aranacak etkenler tablosuna kat lmal d r. Çok afl - r miktarda ve pirinç suyu gibi sulu d flk lama varl nda Vibrio spp ve ETEC aranmal ; özellikle g da büfelerinde yemek yedi ini ifade edenlerin kanl d flk lamalar varl nda EHEC de aranmal d r. Kanl -mukuslu dizanterik bir ishalde Shigela, Campylobacter ürememiflse üreyen E.coli bakterilerinin E EC olabilece i dikkate al n p gerekli araflt rma yap lmal d r; deniz ürünleri yedi- ini ifade eden kiflide V.parahaemolyticus üreyebilece i dikkate al nmal d r. Özellikle iskandinavya ülkeleri gibi baz ülkelerde s k bir etken olarak izole edilen Y.enterocolitica n n s kl ülkemizde %1 den düflük olarak bildirilmektedir; bundan dolay rutinde araflt r lmas fiyat-etkin de ildir. 4-6,14,15 Klinisyen baflka bir etken düflünüyorsa laboratuvar mutlaka uyarmal d r. Hastanede 3 günlük süreden daha fazla bir süredir yatanlarda rutin etkenler yerine C.difficile toksini aranmas yla iflleme bafllan r. 3-6 Baz özel durumlara göre etken arama spektrumu de iflir; örne in homoseksüellerde proktit, proktokolit etkeni olarak Neisseria gonorrhoeae aranmas gerekebilir. Kültür ifllemlerinde örnek do rudan kat besiyerlerine ekilebilir, ama genelde ön zenginlefltirme gerekir. Ön zenginlefltirme besiyerlerine ekim: GN buyyona ekim, Vibrio lar için alkali peptonlu suda (APS) zenginlefltirme, tyoglikolatl buyyona ekim, Yersinia için +4 C de tamponlu ortamda bekletme ifllemleri yap l r. Zenginlefltirme için GN buyyonda 4-8 saat, selenit buyonda 8-12 saat bekletme uygundur; daha fazla bekletilirse barsak flora bakterileri de ço alma a bafllay p seçicilik azal r. Seçerek üretici besiyerlerine ekim: SS, MacConkey agar, Endo agar, TCBS, IBB (inozitollu, parlak yeflilli, safra tuzlu agar; Plesiomonas ve Aeromonas için), Campy-BAP gibi özel besiyerlerine ekim yap l r. Genelde 48 saat inkübasyon yap l r ve üremeler günlük olarak kontrol edilir. Campylobacter için daha uzun süre (72 saat) inkübasyon yap l r. 117

6 ÖZTÜRK, R Üreyen mikroorganizman n ayr m : Üretilen bakteriler biokimya, seroloji ve di er yöntemlerle türlerine ve serotiplerine ayr l r. shallerdeki s kl dikkate al narak rutinde aranmas gereken bakterilerin tan m üzerinde ayr nt l flekilde duraca z. Daha az rastlanan etkenler özet bir flekilde ele al nacakt r. D flk da çok de iflik cinste flora bakterileri bulundu undan, patojen bakteriler de iflik inhibitörler ve çevre flartlar de iflikli i ile sa lanan selektif ve / veya seçici kültür vasatlar nda üretilir. Bu amaçla en s k MacConkey agar, Hektoen enterik agar, Campylobacter kanl agar, (CIN agar, TCBS agar (tiosulfat-sitrat-safra tuzlar -sukroz içeren besiyeri), sikloserin-sefoksitin-fruktoz agar (CCFA) ve kanl agar kullan l r. 3,4,8,13 Bu besiyerleri d fl nda de iflik baflka besiyerleri de kullan labilir. Bunlardan s k kulland m z SS agar basiyerinde Salmonella cinsi bakteriler genellikle H2S yap m na ba l siyah merkezli renksiz koloni yapar; Shigella üremesi SS agarda genellikle bask lan r. Ayr ca feniletil alkollu veya kolistin+nalidiksik asitli agar yenido an ve genifl spektrumlu antimikrobik kullanm fl olanlarda d flk dan stafilokok ve mayalar n üretimi için uygundur. 4-6,16 Afla da s k rastlanan etkenlerin laboratuvar tan mlar ayr ayr ele al nm flt r. Genellikle gram negatif çomaklar de iflik besiyerlerinde üretimden sonra hareket, oksidaz, karbonhidrat (glükoz, laktoz, sukroz) fermentasyonu, glükozdan gaz yap m, H2S, indol, üreaz, fenilalanindeaminaz yap m gibi de- iflik testlerle tiplendirilmektedir. Üretim sonras ayr mda en çok üç flekerli demirli agar (TSI), lizin-demira ar (LIA) kullan labilir. Unat n tarif etti i üçlü besiyeri de bu amaca uygundur. 4-6,16-18 Shigella 4-6,8,16-18 Dünyan n pek çok yerinde oldu u gibi ülkemizde de bakteri etkenli ishaller aras nda en s k rastlanan bir bakteridir. S.dysenteriae, S.flexneri, S.sonnei ve S.boydii diye 4 türü mevcuttur. Shigella üretiminde ard fl k 2-3 d flk kültürü al nmas üretim flans n art - r r. Bekleyen d flk da asidite art fl Shigella lar inhibe edece inden d flk n n k sa sürede, tercihen yar m saat içinde ekimi gereklidir. Aksi halde d flk tamponlu bir tafl ma besiyerine al n r. D flk makroskopik olarak kanl ve mukusludur. Mikroskopik incelemede büyük ço unlu unu nötrofillerin oluflturdu u lökositler, lökosit kümeleri ve eritrositler görülür. 118

7 SHAL N LABORATUVAR TANIMI Kültür için d flk n n kanl ve mukuslu k s mlar ndan al n r. GN buyyon, MacConkey, SS gibi besiyerlerine ekilir. GN den kat vasatlara 6-8 saat sonra tekrar pasaj al n r. MacConkey, SS de üreyen laktozu fermentlemeyen (baz S.sonnei kökenleri laktozu geç olarak fermente eder), hareketsiz, glükozdan gaz yapmayan (baz S.flexneri kökenleri gaz yapabilir) ileri analize al n r. Biokimya metotlar yla (ONPG yap m, ornitin dekarboksilaz, karbonhidrat laktoz, sukroz, mannitol, ksiloz.. fermentasyonu, indol yap m ) 4 türe ayr lan Shigella cinsi bakteriler, antiserumlarla serogruplara ayr l r (S.dysenteriae A grubu, S.flexneri B grubu, S.boydii C grubu; S.sonnei D grubu). Serolojik olarak, antiserumlarla bakteriler alt tiplerine ayr labilir. De iflik noktalar (virülans plazmidleri, Shiga toksini dizesi...) hedeflenerek d flk da PCR ile Shigella cinsi bakterilerin DNA lar amplifiye edilebilmektedir. DNA problar PCR e gere daha duyars zd r. Saha taramalar nda daha kolay kullan mlar avantajl yönünü oluflturur. Plazmid analizi ve kolisin tiplemesi epidemiyolojik araflt rma amaçl yöntemler olarak kullan l r. Salmonella 1-6, Salmonella bakterileri genetik analizlere göre S.enterica diye tek tür; biokimya analizlerine göre ise S.typhi, S.choleraesuis ve S.enteritidis diye üç tür olarak bildirilmektedir. S.enteritidis in 2000 i aflk n serotipi vard r. Ülkemizde en s k S.enteritidis, S.typhimurium izole edilmektedir. S.typhi baz bölgelerde halen salg nlar yapabilmektedir. Salmonella lar, 1-gastroenterit (besin zehirlenmesi), 2-enterik atefl (tifo), 3-bakteremi, 4-tafl y c l k (portörlük) tablolar yaparlar. Salmonella gastroenteritlerinde klinik örnek olarak en s k d flk iflleme tabi tutulmaktad r. D flk da makroskopik olarak kan ve mukus genellikle görülmez. mikroskopik incelemede ço unhlu unu mononükleer hücrelerin oluflturdu u lökositler görülür. Eritrosit fazla ve s k görülmez. Besin zehirlenmesi durumunda flüpheli g da da incelemeye al n r. Bakteremik hastalarda kan veya kemik ili- i kültürleri de al n r. Örnek, seçerek üretici bir s v besiyeri olan GN, tetrationat buyyon veya selenit-f besiyerlerinden birine ekilir. Tercihen 6-8 saatte (gere inde 18 saat sonra) bu besiyerlerinden MacConkey, SS, HE agar ve XLD gibi besiyerlerine pasaj al n r; kat vasatlara do rudan ekimde yap l r. Salmonella lar için da- 119

8 ÖZTÜRK, R ha seçici besiyerleri olan bizmüt sulfit agar veya parlak (brillant) yeflilli agar, özellikle Salmonella kuflkusu yüksekse ekim için tercih edilebilecek di er seçici besiyerleridir. Üreyen bakterilerden oksidaz negatif, laktozu fermente etmeyen, H2S yapabilen, indol, fenil alanin, üreaz, asetoin oluflumu (Voges-Proskauer testi) negatif olanlar seçilip ileri düzey araflt rmalara geçilir. Biotipleme ile Salmonella cinsi oldu una karar verilebilece i gibi k sa sürede sonuç veren polivalan O ve H serumlar yla ya da 01 faj ile Salmonella diye ayr lan izolatlar n do rulamas yap l r (polivalan serumlar baz Enterobacteriaceae üyeleri ile çapraz reaksiyon verebilir). Daha sonra gerekirse, bakterinin faktör serumlar yla serotiplendirilmesi yap l r. Klasik yöntemlerle biotipleme uzun zaman alabilir. Bu amaçla de iflik ticari ayr m kitleri üretime sunulmufltur. Bunlarla manual veya otomatik sistemlerle bakteriler belli bir olas l k çerçevisinde tür düzeyinde tan nabilmektedir. 4-6,16,-19 Epidemiyolojik çal flmalarda faj tiplemesi ve plazmid analizi de yap lmaktad r. Salmonella infeksiyonlar nda serolojik tan : Gruber-Widal aglütinasyon testi Salmonella bakterileriyle oluflan infeksiyonlar tan lamak amac yla kullan l r. Salmonella bakterilerinde 2000 un üstünde serotip bulundu undan ülkeler kendilerinde en s k rastlanan kökenleri deneylerde kullan r. Salmonella bakterilerinde H (kirpik-flagella), O (somatik-lipopolisakkarit) antijenleri bulunur (S.typhi de ayr ca kapsül- Vi antijeni vard r). Gruber-Widal testi, Salmonella O ve H antijenlerine karfl oluflan antikorlar saptamaya yarayan bir aglütinasyon testidir. Bölgede yayg n olan 3-4 serotipe karfl antikor aranmas pratikte en s k kullan l r. Ülkemizde genellikle S.typhi, S.paratyphi A ve B ve S.typhimurium a karfl antikorlar araflt r lmaktad r. Son y llarda Türkiye deki veriler dikkate al nd nda S.paratyphi A ve B s kl nda azalmayla birlikte, S.enteritidis s kl ndaki art fl dikkate alarak buna karfl antikor varl da araflt r lmal d r. Bu testin duyarl l k ve özgüllü- ü düflüktür; olgular n %50 sinde 1. haftadan sonra seropozitiflik geliflir; olgular n %90-95 kadar 4. haftaya do ru seropozitifleflir; tepe antikor seviyeleri 6. haftada oluflur. Daha önce infeksiyon geçirmemifl ve Salmonella afl s uygulanmam fllarda titre, anti-o: 1/100 ve üstü ve anti-h: 1/200 ve üstü ise akut infeksiyon olarak yorumlan r. 120

9 SHAL N LABORATUVAR TANIMI Evvelce infeksiyon geçirmifl ve afl lanm fllarda anti -0: 1/200, anti-h 1/400 olmas pozitif de er olarak kabul edilir. Yaln z H:1/100-1/200 olmas geçirilmifl bir infeksiyonu, afl lanm fl olmay veya anamnestik bir reaksiyonu gösterir. Gruber-Widal deneyi, ayr ca anamnestik reaksiyonlar, s tma, milyer tüberküloz, E.coli nin etken oldu u sistit ve pyelonefrit, baz hepatitlerde, kronik karaci er hastal klar nda yalanc pozitif olabilir. Yalanc negatif sonuçlar veya düflük titreler erken devrede antibiyotik kullananlarda ve ba fl kl k yetmezli i olanlarda saptanabilir. S.typhi için anti-vi antikorlar araflt rmas da yap l r; pozitif sonuçlar (titrenin 1/5 den yüksek oldu u durumlar) tafl y c l gösterir. S.paratyphi C, Citrobacter freundii ve baz E.coli kökenlerinde de Vi antijeni bulunur. Vi antikorlar n tayin etmek için aglütinasyon, karfl l kl immunoelektroforez (C E), ELISA yöntemleri kullan l r. S.typhi portörlerinde %90 kiflide anti-vi pozitif bulunabilir. Bu nedenle tafl y c l saptamada duyarl l çok düflük d flk kültürü yerine daha k sa zamanda ve daha ucuz flekilde sonuç al nan anti-vi aranmas ye lenmelidir. Escherichia coli 3-6,17,20 Kolonun normal floras olan E.coli haricinde barsa hastaland rma yetene ine sahip 5 tip E.coli ishale neden olmaktad r: Enterotoksijenik E.coli (ETEC), enteropatojenik E.coli (EPEC), enteroinvazif E.coli (EIEC), enterohemorajik E.coli (EHEC) ve enteroadherent E.coli (EAEC) ,20 Diyare yapma potansiyelinde olup farkl olarak kategorize edilen E.coli ler de bulunmaktad r. 20 Her birinde de iflik tan lama teknikleri yan nda son y llarda ortak tan m metodu olarak DNA problar ve PCR temelli testler daha yayg n kullan lmaktad r. 17,20 Enterotoksijenik E.coli (ETEC) Afl r sulu, bol miktarda bir d flk lama durumunda (kolerada oldu u gibi ) ürüyen E.coli ler ETEC yönünden araflt r l r. S k rastlanan serotipler antiserumlarla saptanabilirse de bu her köken için mümkün de ildir. S k rastlanan serotipler 06, 08, 015, 020, 025, 027, 063, 078, 080, 085, 092, 0115, 0128ac, 0139, 0148, 0153, 0159, 0167 dir. Üreyen kökenin bakteri f iltrat tavflan barsak lupuna injekte edilirse s v toplanmas na neden olur; ayr ca hücre kültüründe de ifliklikler yapar. 121

10 ÖZTÜRK, R D flk da veya kültür filtrat nda s ya duyarl toksin (LT)ve/veya s ya dirençli toksin (ST) de iflik immunolojik metotlarla (ELISA, R A) ve hücre kültürü metotlar yla saptanabilir (YI adrenal hücre kültürü veya Çin hamsteri ovaryumu hücre kültüründe). 17,20 D flk ve çevre örneklerinde enzim iflaretli oligonükleotit bir probla veya toksin genlerini (LT, ST) hedef alan primerlerle PCR (de iflik patojen tipleri saptamaya elveriflli multipleks PCR metodlar tarif edilmifl) ile ETEC kökenlerini saptamak mümkündür. 17,20 Üretim sonras nda koloni blotlama metoduyla üremifl bakterinin ETEC oldu u kolayca do rulanabilir. Bu metod d flk n n do rudan nitrosellüloz membranlara sürülüp besiyeri üzerine konmas ve ard ndan bir gecelik üretim sonras nda da yap labilir (d flk blotlama). 20 Enteropatojenik E.coli (EPEC) Özellikle 1 yafl alt nda olmak üzere, çocuk yafl grubu ishallerinde üreyen E.coli kökenlerinde polivalan antiserumlarla tarama yap l p aglütinasyon yapan kökenler EPEC olarak rapor edilir. Son zamanlarda sadece serotiplemeye dayal EPEC tan mlamalar na, patojenite karakterlerinin de de erlendirilmesi gerekti i noktas nda itiraz edilmektedir. Epidemiyolojik amaçl ileri düzeyde serotip tayini monovalan serumlar kullan larak yap labilir. 3-6,16,7,20 S k rastlanan serotipler 055, 086, 0111, 0126, 0127, 0128ab, 0142 dir. ELISA ve hücre kültürü yöntemi ile de tan nabilirler. 17,20 Enteroinvazif E.coli (EIEC) 16,17,20 Biyokimya özellikleri bak m ndan Shigella cinsi bakterilere benzemektedir. Ço u kökeni hareketsizdir ve laktozu fermente etmez veya geç fermente eder. Lizin dekarboksilaz deneyleri negatiftir. En s k rastlanan serotiplerin antiserumlar yla, üreyen bakteri aglütinasyon verirse ön tan m olarak EIEC düflünülür, ileri tan m için deneye al n r. En s k rastlanan serotipler 028ac, 029, 0112ac, 0124, 0136, 0143, 0144, 0152 ve 0164 tür. Serotip 0124 ve 0152 laktoz negatiftir. Antijenik olarak EIEC, Shigella spp. antiserumlar yla çapraz reaksiyon verebilir. Üreyen bakterinin invazif özelli i Sereny testi ile de araflt r l r. Bu amaçla üreyen bakterinin kültüründen 1 damla kobay gözüne damlat l r ve keratokonjuktivit geliflirse üreyen bakterinin EIEC oldu una karar verilir. nvaziflik özelli i tek kat Hep-2 hücre kültüründe de araflt r labilir. 122

11 SHAL N LABORATUVAR TANIMI Daha kolay bir yöntem, EIEC kökenlerini d flk larda taramak amac yla kullan lan DNA problar d r. nvazifli i sa layan lokusa yöneltilen primerlerle yap lan PCR ile duyarl sonuçlar al nmaktad r. Enterohemorajik E.coli (EHEC) 16,17,20 EHEC in baflka serotipleri olmas na ra men ABD de en s k rapor edilen 0157:H7 serotipidir. De iflik ülkelerden 50 den fazla serotip bildirilmifltir: 026:H11; 048:H21, 0103:H2, 0111:NM (hareketsiz:nonmotile), 0113:H21, 0145:NM serotipleri gibi. Bu bakteri iki tip sitotoksin yapar (verotoksin I ve verotoksin II). Laboratuvarda verotoksin yapan EHEC kökenleri üç yöntemle saptanmaktad r: 1- Ço u EHEC kökeni sorbitolu fermente etmez; bu özelli e dayanarak materyel (lökositsiz, kanl kolit tablosu varsa veya hekim istem yaparsa) sorbitollu (laktoz yerine) MacConkey agara ekilir, buradan 48 saat içinde sorbitolu fermente etmeyen renksiz koloniler izole edilir. Elde edilen E.coli, 0157 ve H7 antiserumlar yla denenir (özgül olmayan aglütinasyonlar negatif kontrol kullanarak d fllan r) ve do rulama yap l r serumuyla pozitif olan kökenlerde verotoksin araflt r l r (ço u köken yüksek miktarda verotoksin oluflturur). Besiyeri olarak sefiksimli veya sefiksim+tellüritli sorbitollu MacConkey agar da kullan lmaktad r. Kültürün erken dönemde yap lmas gerekir; çünkü kanl ishal bafllang c nda kültürde üreme %100 e yak n iken bir hafta sonra üreme flans %30 lar seviyesine düflmektedir. Ticari olarak mevcut MUG testi (4-methylumbelliferyl β-d glucuronide), sorbitol fermentasyonuna ek olarak 0157:H7 serotiplerini taramak amac yla kullan lmaktad r. 0157:H7 serotipleri nadiren β-glukuronidaz olufltururken di er kökenlerin %92 si bu enzimi oluflturur. Enzim mevcutsa, MUG parçalan r ve UV fl kta görülebilen fluoresans verici bir madde oluflur. 2- D flk filtrat nda verotoksin saptanmas : Hemorajik kolitlilerde EHEC kökenlerinin d flk yla at l m k sa sürede sonlan r, ama d flk da verotoksin saptanabilecek düzeyde bulunmaya devam eder. 3- Verotoksin nötralize eden antikor titresinde dört kat veya daha yüksek titrede art fl n gösterilmesi: Hemolitik üremik sendromu olanlarda ve verotoksin veya verotoksin yapan E.coli saptananlar n serumunda verotoksin nötralize eden antikorlar n dört kat veya daha fazla artt saptanm flt r. 123

12 ÖZTÜRK, R EHEC, DFA yöntemiyle de d flk da saptanabilmektedir. Verotoksini kodlayan bölgeye yöneltilmifl primerlerle yap lan PCR ile de iyi sonuçlar rapor edilmektedir. Farkl serotipler (0111, 0157 gibi) için de iflik virulans faktörleri gen bölgeleri hedeflenerek yap lan multipleks PCR ile duyarl ve güvenli sonuçlar al nd bildirilmektedir. 13,20,21 Enteroadherent E.coli (EAEC) Hep-2 ve HeLa hücrelerine özgül bir flekilde adhere olur. Hep-2 hücre testi halen alt n standartt r. Mueller-Hinton s v kültür ortam nda kümeleflme (clump aggregation test) deneyi ile de saptan rlar. Bu testtekine benzer tarzda, bakteriler polystyrene kültür tüpü veya petride bir gece boyunca çalkalamaks z n üretilirse, polystyrene yüzeyde bir bakteri filmi oluflur ve bu Giemsa boyas ile boyanarak kolayca görülebilir. Tan m için DNA problar ve PCR kullan labilir. 17,20 Campylobacter 1-9,15,22-24 Campylobacter cinsi bakteriler insanda akut gastroenterit etkenleri aras nda s k rastlanan mikroorganizmalardand r. S kl k olarak Salmonella ve Shigella dan sonra 3. s rada, bazen 1. ve 2. s kl kta rastlanmaktad r. K vr ml, mart kanad fleklinde gram-negatif bir çomakt r. Yapt ishalde d flk da eritrosit ve lökositler bulunur. D flk erken olarak (1-2 saat içinde) karanl k saha veya faz kontrast mikroskobuyla incelenirse oksu hareketler gösteren ve h zl bir flekilde e ilip bükülen Campylobacter ler görülebilir. shalli d flk dan yap lan preparat gram yöntemiyle boyama ile %50 nin üzerinde duyarl l k saptanm flt r (soluk pembe boyanan k vr ml, mart kanad fleklinde çomakç klar görülür). Kültür selektif besiyerlerine (Campy-BAP, Skirrow, Butzzler) yap l p s k rastlanan termofilik Campylobacter ler için 42 C de, mikroaerofilik (bir gas pak yard m yla %5 oksijen, %10 CO2, %85 N2 lu ortam sa lan r) ortamda inkübe edilir. Camplobacter cinsi bakteriler, bu besiyerlerinde yay lan tarzda, mukoid pembemsi-gri renkli koloniler yapar. Bir di er yöntem, kanl agar (brucella agar, triptik soy agar...) üzerine µm porlu sellüloz asetat bir filtre konulur. Bunun üzerine suland r lm fl d flk örne inden 2-3 damla damlat l r. Oda s s nda yar m saat beklenir, bu esnada Campylobacter cinsi bakteriler filtre porlar ndan agar yüzeyine geçer. Filtre kald r l p at l r, besiyeri mikroaerofilik olarak C de 72 saat inkübe edilir. 22,24 124

13 SHAL N LABORATUVAR TANIMI Aktif kömürlü besiyeri de Campylobacter üretimine imkan verir. Üreyen bakterinin gram preparat yap l r; k vr ml, soluk gram-negatif, oksidaz pozitif bir bakteri oldu u saptan rsa, Campylobacter düflünülüp, TSI de H2S yap m, hipurat hidrolizi, indoksil asetat hidrolizi ( AH), C de üeme, %3.5 NaCl lu veya %1 glisinli veya MacConkey agarda üreme, nalidiksik asit ve sefalotine duyarl l k araflt r larak veya ticari ayr m kitleriye tiplendirilir. En s k C.jejuni rastlanmaktad r (H2S negatif, hipurat hidrolizi ve AH pozitif, C de üremez, 42 C de ürer, nalidiksik asit duyarl, sefalotin dirençli). C.coli di er s k rastlanan türdür (%5-10). Tan mda DNA problar ve PCR ile de baflar l sonuçlar al nmaktad r. 23 Son zamanlarda de iflik türler ishal etkeni olarak bildirilmektedir. Eskiden Campylobacter cinsi olarak bildirilen, Arcobacter butzleri, oda s s nda üreyebilen ve hipürati hidrolize etmeyen bir bakteridir ve ishal yapt - bildirilmektedir. Campylobacter için antikor arama ELISA metoduyla yap labilir (epidemiyolojik araflt rmalarda de erli). Aeromonas 1-5,14,22 S kl kla sulardan bulaflan ve baz ülkelerde s kl yüksek ( stanbul da s kl s rada) bir ishal etkendir. D flk do rudan 10 µg/ml ampisilin içeren kanl besiyerine ekilir (oksidaz deneyi kanl besiyerinden bak l r). nozitol, parlak yeflil ve safra tuzlar içeren (IBB) agar, MacConkey agar, CIN agar da bu bakterinin üremesi için uygun vasatlard r. Burada üreyen oksidaz pozitif, gram negatif çomaklar ileri deneylere al n r (beta hemoliz yap m, eskülin hidrolizi, dekarboksilaz deneyleri...). Vibrio Vibrio cholerae (klasik tip ve El Tor tipi) hayat tehdit eden boyutta su kayb na neden olan sekretuvar bir ishale neden olur. D flk birinç suyu gibidir, lökosit ve eritrosit içermez. Direkt mikroskopik incelemede bol say da, k vr ml hareketli bakterilerin varl dikkat çeker. Karanl k alan incelenmesi ile tan t c sonuçlar al nabilir. DFA ile de %90 duyarl l kta sonuçlar al nd bildirilmifltir. Etken olarak Vibrio düflünülüyorsa Carry-Blair veya alkali peptonlu su (APS) besiyeri tafl ma amac yla kullan l r. Ekim yap lan APS den, 6-12 saat sonra TCBS (thiosulfat-sitrat-safra tuzlar bile salts -sukroz agar) besiyerle- 125

14 ÖZTÜRK, R rine pasaj al n r. 35 C de 24 saat inkübe edelip üreyen koloniler incelemeye al n r (k vr ml, hareketli, oksidaz pozitif). Bu besiyeri Vibrio için oldukça seçicidir. V.cholerae bu besiyerinde sar renkli, düz, büyük koloniler oluflturur. TCBS besiyerindeki kolonilerden oksidaz bak lmas uygun de ildir (kanl agarda üretilmifl koloniler tercih edilir). Oksidaz pozitif koloniler, O1 polivalan serumuyla denenir. O1 serumuyla aglütinasyon vermeyen, O1 d fl Vibrio lar da daha hafif seyirli kolera benzeri hastal k oluflturur. V.cholerae kolonilerinden al nan örnek %0.5 sodyum deoksilolatla emülsiyon yap l p, bir bakteriyolojik i ne ucuyla bu emülsiyon kar flt r l p kald r - l rsa bir ip gibi uzama oldu u gözlenir. 5,22 Üretimde TCBS yoksa, MacConkey agar veya sorbitollu MacConkey agar kullan labilir. Aronson, Mansour, Alk fl besiyerleri de kullan labilir. Hindistan d fl nda rastlanan V.cholerae kökenleri genellikle E1 Tor biotipi oldu u için tan m buna yöneltilmelidir. 4,18,22 O1 Vibrio lar n anti-inaba, anti-ogawa ve anti-hikojima anti-serumlar yla serotipleri belirlenir. Üretilen bakterinin vibriostatik bir madde olan 0129 a duyarl l, tuzlu buyyonda üreme özellikleri incelenir. O1 d fl nda 0139 tipinin de salg nlara sepep oldu u son y llarda rapor edilme e bafllanm flt r. Deniz ürünleri yiyenlerde, V.parahaemolyticus ishale neden olmaktad r. TCBS besiyerinde yeflil-mavi koloniler oluflturur. Hastalardan izole edilen kökenlerin %96 s nda Kanagawa reaksiyon pozitif bulunmaktad r (yüksek tuz yo unluku kanl agarda bir hemolizin oluflumu). Üreyen Vibrio lar n toksin sal p salmad n saptayan lateks aglütinasyon gibi ticari kitlerde bulunmaktad r. Serolojik olarak akut nekahat devre serumlar nda aglütinan veya vibriosidal antikorlar n art fl sapanabilirse de bunun akut hastal n tan m na katk s yoktur. O1 V.cholerae, d flk, su ve g dadan PCR ile saptanabilmektedir. 25 Plesiomonas shigelloides 22 nozitollu- parlak (brillant) yeflilli- safra tuzlu besiyerine d flk ekilir, üreyen bakterilerden oksidaz pozitif olanlar ileri deneylere (O129 a duyarl l k, tuzlu ortamda üreme, karbonhidat fermentasyonu, jelatini eritme...) al n r. Yersinia 4-6,17 Yersinia spp., 25 C de iyi ürer. Bakterinin +4 C de üremesi sebebiyle, fosfat tamponlu suda veya izotonik tuzlu suda bekletilen klinik örnekte Yersinia say s artar (so ukta zenginlefltirme) ve bakteri daha kolay izole edi- 126

15 SHAL N LABORATUVAR TANIMI lir, ama bu metodun 3 hafta sürmesi pratikli ini engeller. Bakteri için CIN agar selektif üreme sa lar. Oda s s nda hareketli, 37 C de hareketsiz oluflu bakterinin tan tt r c özellikleri aras ndad r. CIN agar yoksa MacConkey agarda kullan labilir. 35 C de 24 saat, oda s s nda (22-25 C de) 48 saat inkübasyon yap l r. Kandan antikor aranmas, Yersinia enterocolitica aglütinasyonu ile yap labilir ve serolojik tan m özellikle seroepidemiyolojik çal flmalar için uygundur. Clostridium difficile 4-6,26 Antibiyotikle iliflkili ishal, antibiyotikle iliflkili kolit ve psödomembranöz enterokolite neden olur. Hastal ktan bakterinin toksinleri sorumludur. Bakterinin kültürü d flk veya rektal sürüntüde çal fl l r. Materyalin vakumlu anaerop toplama kab na al nmas üretim için tercih edilir. CCFA (sikloserin sefoksitin-yumurta sar l egg yolk fruktoz agar) besiyeri üretim için uygun bir besiyerdir. D flk da üretilen kökenlerin yaklafl k %25 i toksin salg lamaz. Üstelik hastanede yatanlar n %20 kadar n n bu bakteriyle kolonize olmas nedeniyle tek bafl na bakteriyi üretmek etkeni bulmakla efl anlaml de ildir. Toksin A ve/veya B araflt r lmas zorunludur. Etkenin izolasyonu epidemiyolojik çal flmalar için yararl d r (üretilen kökenler de iflik moleküler tekniklere incelenebilir). Antibiyotikle iliflkili ishal veya kolit tan m nda, bakterinin CCFA besiyerinde üretilmesi (anaerobik flartlarda saat inkübasyon) ve üreyen bakterinin toksin yapt n n saptanmas ; d flk dan hücre kültürleri kullan larak sitotoksisite deneylerinin yap lmas (laboratuvarda haz rlanan WI-38 insan diploit fibroblastlar veya HeLa hücreleri yan nda bu amaca yönelik, mikroplaklarda haz rlanm fl ticari kültür sistemleri de yap lm flt r); ELISA ile toksin A ve / veya B aranmas (duyarl l k: %60-80, özgüllük: %90 üzerinde) ve PCR ile C.difficile toksijenik geninin amplifiye edilmesi 26 tan mda en s k kullan lan güvenilir metotlard r. Bakteri duvar proteinlerini saptayan lateks aglütinasyon kitleri ile elde edilen pozitif sonuçlar her zaman toksijenik sufl varl na iflaret etmez. Di er etkenler Bask n bakteriler Özellikle genifl spektrumlu antimikrobik kullananlarda S.aureus ve P.aeruginosa yo un olarak ürerse bu do rudan ishal etkeni olarak de il, iligili bakterinin bask n olarak üredi i rapor edilir. 127

16 ÖZTÜRK, R Nötropenik hemorajik enterokolit etkeni olarak bildrilen C.septicum ilgili olgulardan üretilebilmektedir. Klebsiella, Citrobacter, Bacteroides cinsi bakterilerden baz türler ishal yapabilmektedir. Bunlar n etken oldu unu belirlemek, konuda deneyimli ileri düzey laboratuvarlarda yap l r. D flk da mikobakteri aranmas 3,46-9 M.tuberculosis ve M.bovis barsa hastaland rabilir. AIDS lilerde M.avium-intracellulare inatç bir ishal yapabilir. D flk örne inden yap lan preparatta, aside dirençli basil görülürse kültür yap lmas öenirilmektedir. Bu amaçla 1 g d flk 5 ml Middlebrook 7H9 besiyerine konup, NaOH ile balgamda oldu u gibi ifllenip dekontamine edilir. Buradan s v veya kat mikobakteri üretim vasatlar na ekim yap l r. Gerekirse bu örnekten PCR ile mikobakteri DNA s amplifikasyonu da yap labilir. AIDS lilerde sistemik tutulum yapan M.avium-intracellulare infeksiyonlar nda hemokültürden basil üretilebilmektedir. G da zehirlenmesi etkenleri 3,6,9,27,28 G da ile bulaflan mikroplar son y llarda üzerinde önemle durulan konulardan biridir. Hem insan sa l, hem de ekonomik yönden çok önem arz eden bu konuda tan mda h zl metotlar gelifltirilme e devam etmektedir. Üretilen g dalar n emniyeti için mikrobiyolojik kontrolün önemi aç kt r. G dadan ve zehirlenme durumunda insan örneklerinden çal fl l r. Konuyla ilgili çal flmalarda genel olarak rutin üretim besiyerleri yan nda seçici besiyerleri kullan larak indikatör ve patojen miroorganizmalar araflt r - l r. Toksin yapan bakteriler için, g dada etkenin / g say s nda olmas durumunda ilgili g dan n zehirleyici nitelikte oldu u kabul edilmektedir. ELISA, lateks aglütinasyon gibi h zl immunolojik metotlar, DNA teknikleri (DNA problar, PCR, LCR, Qβ-replikaz, SDA...) de iflik mikroskopik teknikler (DEFT; BACTOSCAN, CHEMSCAN...), canl bakteri varl n de- erlendiren ATP metotlar, bakteri aktivitesini ölçen teknikler (impedans, CO2 oluflumu...) tan mda kullan lmaktad r S. aureus 3-6,9,27,28 A, B, C, D, E, F gibi enterotoksinleriyle besin zehirlenmesi yaparlar. En s k rastlanan besin zehirlenmesi etkenidir. 128

17 SHAL N LABORATUVAR TANIMI nceleme için flüpheli yiyecek maddesi, hastan n kusmuk ve d flk s, g da sektöründe çal flanlar n deri yaralar ve burun sürüntüsü örnekleri uygundur. Üretim için kanl agar, tuzlu ve mannitollu agar uygundur. Üretilen bakterinin toksin yapt FA, ters pasif lateks aglütinasyon, ELI- SA vb yöntemlerle araflt rabilir. G da zehirlenmesi durumunda, de iflik kaynaklardan üretilen S.aureus un faj tiplemesi epidemiyolojik araflt rmalar için yararl d r. Yo un antimikrobik kullananlarda S. aureus, kolitte yapabilir. Bu taktirde d flk da lökositler, bol küme yapm fl gram-pozitif koklar görülmekte ve S.aureus kültürde bask n organizma olarak üremektedir. Bacillus cereus 3,69,27,28 shal yapt r c ve kusturucu iki toksin yapar. nceleme amac yla g da, d flk, mutfak kaplar ve yüzeyleri uygundur. Üretim için kanl agar ve feniletilalkollu kanl agar besiyerleri uygundur. fiüpheli besin maddesinin 1 g ndan 10 5 veya daha fazla basil saptanrsa tan desteklenmifl olur. Enterotoksin deneysel olarak tavflan barsak lupunda toksinin etkisinin gösterilmesiyle veya de iflik immunolojik metotlarla saptan r. Clostridium perfringens 3,6,9,27,28 C.perfringens tip A besin zehirlenmesi ve nekrotizan kolit, seyrek olarak tip C ve F nekrotizan enterit yapar. Bakteri, g da ve d flk dan kantitatif üretim yöntemleriyle aran r. Üretimde kanl agar ve yumurta sar l agar kullan l r. Etken izole edilerek ve toksin gösterilerek tan m yap l r. Klinik örnekte basil bulunuflu olay n C.perfringenes e ba l oldu unu kan tlar. C.perfringens toksini d flk da da gösterilebilir. Listeria monocytogenes 3-6,9,27-29 D flk dan ve varsa flüpheli g dadan araflt rma yap l r. L. monocytogenes, araflt r lacak örnek için de iflik zenginlefltirme teknikleri tarif edilmifltir. Bunlardan biri de so ukta zenginlefltirme metodudur. Bakterinin üretiminde kanl agar gibi genel bir üretim besiyeri yan nda selektif vasatlarda (PALCAM, LPM agar) kullan l p bakteri üretilir. Üretim sonras nda, beta hemoliz, CAMP testi, hipurat hidrolizi vb yap larak veya haz r ticari tiplendirme kitleriyle bakterinin tan m yap l r. 129

18 ÖZTÜRK, R ELISA gibi metotlarla antijen arama DNA problar ve PCR tan mda kullan labilir. Tablo 1 shale neden olan parazitler a. Helmintler Trichuris trichiura Hymenolepis nana Teania saginata Strengyloides stereoralis Trichinella spiralis b. Protozoonlar Entamoeba histolytica Giardia lamblia Cryptosporidium parvum sospora belli Cyclospora cayatensis, Balantidium coli Blastocystis hominis Dientamoeba fragilis Microsporidiumlar 2. Parazit aranmas 3,4,9,30,31 Protozoon ve helmintlerden de iflik etkenler ishale neden olabilir (Tablo 1). D flk da parazitolojik araflt rma için, a z genifl, s k kapanan bir kaba d flk örne i, rektum sürüntüsü al nabilir. E.vermicularis için selofanl bant yöntemi uygundur. Giardiyaz ve strongyloidaz olgular nda d flk da etkeni göremeyebiliriz; bunlarda duodenum ve jejunum aspirasyon örne inde etken bulunabilir ve bu amaçla ticari düzeneklerde haz rlanm flt r (string test). Genel olarak parazitik inceleme ard fl k günlerde al nan 3-6 örnekte yap l r. D flk önce makroskopik olarak incelenir. D flk da kan, mukus varl ve eriflkin helmintler görülebilir. Al nan d flk ya su veya idrar kar flmamal d r; bunlar trofozoitlerin hareketini kaybettirir veya lizise u rat r. Mineral ya, bizmut, de iflik kimya maddeleri protozoonlar n yap s n bozar. Baryumlu incelemelerden ancak 10 gün sonra parazitolojik inceleme uygun olur. Ayr ca antibiyotikler ve malarya ilaçlar parazitlerin görülmesine engel olur, bu durumda ilaçlar kesilip inceleme 1 hafta sonra yap l r. Tedaviden sonra etkinlik de erlendirilmesi için 3-4 hafta, tenya için 5-6 hafta sonra kontrol örnekleri al n r. 130

19 SHAL N LABORATUVAR TANIMI Makroskopik incelemeden sonra, al nan d flk örne i mikroskopik olarak ( slak preparat ve boyal preparat) incelenir. Amip trofozoitleri için d flk 1/2 saat içinde incelenmelidir. Aksi halde trofozotiler hareketini kaybedip tan nmalar güçleflir veya parçalan rlar. Yar kat d flk larda inceleme 1 saat içinde yap labilir. Özellikle sulu d flk lar, parazitolojik inceleme için polivinil alkol (PVA) veya %5-10 formalin gibi (%0.85 tuzu suda) bir koruyucu ile muamele edilir. %5 formalin protozoonlar n fleklini fazla bozmad ndan tercih edilebilir. Formalinin dezavantaj örne in kal c boyanmas na engel olmas d r; PVA hem yo unlaflt rma hem de kal c boyama için engel teflkil etmez. Kanl d flk örnekleri bekletmeden Entamoeba histolytica yönünden incelenir. Do rudan yafl preparatlar (serum fizyolojik, lugollu preparatlar) etkenlerin ço u için tan ma katk sa lar. Bu yolla Giardia lamblia, E. histolytica, Balantidium coli, Isospora belli, Blastocystis hominis rahatça tan n r. Baz protozoonlar rahatça görmek için özel olarak boyanmalar gerekir. Bu amaçla Cryptosporidium ve Cyclospora için modifiye aside dirençli boyama, Microsporidium lar için trikrom boyama önerilmektedir. Parazitleri yo unlaflt rmak amac yla, 500 xg de 10 dak çevrilen d flk örne i Cryptosporidium parvum ve Cylospora cayatensis için uygundur. Isospora spp için rutin formalin etil asetat gibi konsantrasyon teknikleri uygulanmal d r. Sulu veya yumuflak d flk lar için pratik incelemede 1) direkt yafl preparat, 2) yo unlaflt rma preparat, 3) kal c boyal preparat haz rlan r. Tuzlu su ile yap lan direkt inceleme ile hareketli trofozoitler, helmint yumurtalar ve larvalar, protozoon kistleri de görülebilir; protozoon kestleri için lugollu preparat (1 g potasyum iyodur, 1.5 g kristal iyot ve 100 ml su) tercih edilir. Sulu d flk lar için örne in santrifüj edilerek çökeltinin incelenmesi yeterlidir; kistler sedimentte görülür, bununla birlikte trofozoitlerin sulu d flk larda yeterince yo unlaflt r lamad klar hat rda tutulmal d r. D flk da helmint yumurtalar ve protozoonlar (kist ve trofozoitleri) az say da bulunabilmektedir. Bu amaçla d flk örne inin yo unlaflt r lmas parazitin görülme flans n artt r r. Yar m flekilli ve kat d flk larda yo unlaflt rma ifllemi yeterlidir.yo unlaflt rma, yüzdürme ve çöktürme diye iki metotla yap labilir. Yüzdürme tekni inde 1.18 gibi yüksek özgül a rl kl çinkosülfat 131

20 ÖZTÜRK, R solüsyonunun üzerinde yumurta ve kistler yüzer. Debris olmamas tekni in avantaj d r. Kapakl trematod ve sestod yumurtalar n n aranmas nda bu teknik uygun de ildir. Çöktürerek yo unlaflt rma metodu ile protozoonlar, yumurta ve larvalar görülebilmektedir. Tekni in mahzurlu yan debris varl d r. Konunun teknik yönleri parazitoloji kitaplar nda bulunabilir. 30,31 Kal c boyal preparatlar için 3-4 damla PVA ile 1-2 damla d flk kar flt r - l r, bu örnekten lama yayma yap l r ve havada kurutulur veya eflit miktarda d flk Schaudin tespit edicisi ile kar flt r l r. Bu amaçla en çok 1) Demirli hematoksilen boyama, 2) modifiye (Wheatley) Goomori nin trikrom boyamas yap l r. S k görülen parazitlerin tan m ile ilgili özet bilgiler afla da verilmifltir. Entamoeba histolytica Sulu d flk lar, daha s cakken, en geç yar m saat içinde trofozoitler aç s ndan incelenir. Hareketli, eritrosit fagosite etmifl trofozoitler kolayca seçilir. Tecrübeli olmayanlar, barsak makrofajlar n amip zannedebilir. Amipli dizanteride d flk da lökosit olmay fl veya fazla bulunmay fl bu durumda yard mc olabilir. Böl lokosit varl nda, amip rapor ederken bu duruma dikkat edilmelidir. Kat d flk larda trofozoit bulunmaz. Bunlarda kistler lugolle boyanarak tan n nr. Endoskopik inceleme ve bu yolla al nan biopsi örne inin histopatolojik incelenmesi ile de, yüksek duyarl l kta tan m mümkündür. E.histolytica tan m nda antijen aranmas baflar yla kullan labilen bir tekniktir (duyarl l k %85). PCR ile de iyi sonuçlar al nmaktad r (duyarl l k %87). Üstelik bu yöntem kommensal bir parazit olan E.dispar dan invazif bir parazit olan E.histolytica y ay rabilmektedir (PCR ürünü restriksiyon enzimle kesilerek bu sa lan r; bu ayr m izoenzim analizi ile de yap labilir). Amipli dizanteri tan m nda serolojik metotlardan da yararlan labilir: En s k indirekt hemaglütinasyon (IHA) ve ELISA kullan l r. HA, aktif barsak infeksiyonunda %80-90, barsak d fl amöbiyazda %92-98 pozitiftir, ama kist ç karan asemptomatik tafl y c larda tan ma fazla bir katk sa lamaz. Giardia lamblia 30,31 Ard fl k olarak 3-6 d flk örne i al n p lugolle muamele edilirse tipik Giardia lamblia kistleri görülür. Akut ishallerde d flk da Giardia lamblia trofozo- 132

21 SHAL N LABORATUVAR TANIMI itlerine de rastlanmaktad r. Bazen d flk da Giardia saptanamaz, ama duodenum veya jejunum aspirasyon s v s nda (bu amaca uygun ticari strin test denen sistem var) veya buradan al nan biopsi örneklerinde görülebilir. Antijen aramak amac yla iyi sonuçlar al nan ELISA ve DFA yöntemi de bildirilmifltir. ELISA ile antijen aramak %95-98 duyarl bulunmufl, %100 özgüllük saptanm flt r. Mikroskopiyle negatif bulunan, ama antijeni pozitif olan olgular da saptanm flt r. Giardin genine yöneltilen primerlerle yap lan PCR ile iyi sonuç al nm flt r; üstelik bu yöntem kistlerin ölülük veya canl l k durumunu yans tmaktad r (canl kistlerde mrna yüsek miktarda saptanmaktad r). Dolaflan IgM özgül antikorlar n saptayan ELISA sistemi %96 duyarl bulunmufltur. Cryptosporidium parvum 4,30,31,32,32a C.parvum AIDS liler ve di er immun sistem yetersizli i gösterenlerde kronik ishallere neden olur. Özellikle küçük çocuklar baflta olmak üzere ba - fl kl normal olanlarda da ishal yapabilmektedir. stanbul da akut ishalle bafl vuran 5 yafl alt grupta (ba fl kl k yetersizli i olmayan çocuklarda) s kl n %2 olarak saptad k 32a Modifiye aside dirençli boyama teflhiste en s k kullan l r (renk gidermede %1-3 sulfurik asit kullan l r). Taze d flk n n konsantre edilmifl sedimenti veya formalinle korunmufl d flk örne i çal flma için uygundur (uzun süre formalinle beklemifl d flk daki Cryptosporidium ookistleri aside dirençlilik özelli ini yitirebilir; modifiye aside dirençli boyama s tma yöntemiyle yap l rsa bu mahzur kalkar). PVA ile koruma, Cryptosporidium için uygun de ildir. Ard fl k zamanlarda al nan 3-6 d flk örne inin incelenmesi önerilmektedir. Oldukça ince yay lan bir preparat örne i haz rlanmal d r. D flk çok mukuslu ise sedimente %10 luk, 10 damla KOH ilave edilir, ard ndan vortekslenip homojenize edilir; %10 formalinle y kan p 500 xg de 10 dak. çevrilip sedimentten preparat haz rlan r. Boyama sonunda içte 4 sporozoit içeren 4-6 µm çapl ookistlerin görülmesiyle teflhis konur. K rm z boyanan mantar sporlar, ya globulleri ve baz artefaktlar yanl fl pozitif sonuçlar bildirilmesine neden olmaktad r; bu nedenle preparat tecrübeli birince incelenmelidir. Ticari DFA kitleri, ookistlerin görülmesi ve modifiye aside dirençli preparatla bildirilecek sonuçlar n do rulanmas amac yla kullan labilir. ELISA ile de antijen aranabilir. 133

22 ÖZTÜRK, R Antikor aranmas seroprevalans için de er tafl yabilir, akut hastal n tan - m nda yarar sa lamaz. PCR ile, klinik örneklerde bu parazit yüksek duyarl l kla saptanmaktad r. Cylospora cayatensis 4,32 Ba fl kl k yetmezli i olanlarda ve normal konaklarda ishale neden olur. Nepal e seyahat edenlerde turist ishal etkeni olarak saptanm flt r. Ookistleri modifiye aside dirençli boyamada çok de iflkenlik gösterir (boyut olarak Cryptosporidium dan daha büyüktür: 8-10 µm); baz lar boyanmazken, di erleri koyu pembe boyan r. PCR ile tan m mümkündür. Isospora belli shale sebep oldu u hastalarda periferik eozinofili görülmektedir. mmatur ookistler modifiye aside dirençli boyan r; olgun ookistler, sporokist ile ookist duvar aras nda boyanmam fl aç k berrak bir alan ve boyal ookist duvar içinde boyanan iki sporokist gösterir. Boyanma yo unlu u aç s ndan ookistler aras nda farklar vard r; hepsi homojen boyanmaz. Blastocystis hominis Normalde d flk da görülebilen B.hominis, ishal etkeni oldu unda her alanda (x40 büyütmede) 5 veya daha fazla görülmektedir. Normal flah slarda ve AIDS lilerde ishal yapabilmektedir. nfeksiyon varl nda eozinofili de yapabilmektedir 4,31-33 Dientamoeba fragilis Kistleri olmay p, yaln z trofozoit flekli bulunan bir protozoondur. Tan m için en az üç inceleme önerilmektedir. D flk hemen taze olarak veya bir fiksatifle muameleden sonra incelenmelidir. Tuzlu su ile yap lan direkt incelemede görülebilir; ama hareketsiz ise gözden kaçabilir. Kal c preparatlar yapmak zorunludur. demirli hematoksilenle yap lan boyamalarla görülebilir (genellikle 2 çekirdekli). 31 Microsporidium lar Özellikle AIDS liler gibi ba fl kl bask lanm fllarda ishale neden olurlar. Barsak mikrosporidiyozuna Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon intestinalis, Encephalitozoon spp, Nosema spp, Vittaforma spp, Pleistophora spp, Trachipleistophora spp neden olmaktad r. Bu mikroorganizmalar n sporlar µm gibi küçük çapl d r. 134

23 SHAL N LABORATUVAR TANIMI Genellikle biopsi örneklerinin elektron mikroskopla incelenmesi tan mda ye lenmektedir. Her yerde bu olana n olmay fl nedeniyle pratik metodlar gelifltirilmifltir. Bu amaçla uygun bir yöntem taze veya formalin veya SAF ile korunmufl d flk örne inden yap lan preparatlar n modifiye trikrom (Weber- Green formülü) ile boyan p incelenmeleridir. Bu yöntemle (Weber) yeflil zemin üzerinde, spor duvar pembemsi-k rm - z boyanan, içi aç k renkte görülen (içerdeki polar tubul enlemesine veya çapraz bir çizgi fleklinde görülebilir) oluflumlar görülecektir ( fl k mikroskobunda, x100 immersiyon objektifiyle). Görülenlerin yorumunun zorlu u nedeniyle, tecrübeli birinin inceleme yapmas yanl fl sonuçlar önleyecektir. Her çal flmada pozitif ve negatif kontrol örnekleri kullan lmal d r. Modifiye trikrom boyaman n Ryan-Blue, Kokoskin gibi araflt r c larca tarif edilmifl baflka çeflitleri de vard r. De iflik Microsporidium lar PCR ile saptama araflt rmalar devam etmektedir. Bir çal flmada EM ile pozitif bulunmufl örneklerde PCR ile E.bieneusi aranm fl ve metodun baflar l oldu u görülmüfltür Mantar aranmas 36 Mantarlar (özellikle Candida), hematolojik malinite, AIDS ve di er ba - fl kl bask layan hallerde; genifl spektrumlu antimikrobik madde kullananlarda, yafll larda ve yenido anlarda ince ve kal n barsaklar hastaland r p ishale sebep olabilir. Candida ve Torulopsis glabrata yenido anlarda nadiren invazif enterokolit yapabilir. Tan mda direkt inceleme ve Gram boyamada maya elemanlar n n göreceli olarak artt görülür. Ayr ca suland r l p Saboraud dekstroz agara yap lan ekimlerde maya koloni say s n n 10 5 dan fazla oldu u saptan r. 4. Virüs aranmas Özellikle 2-3 yafl alt çocuklar n ishallerinde Rotavirus ve Adenovirus tip 40, 41 s k rastlanan iki etkendir. Eriflkin yafl grubunda ise Norwalk ve benzeri virusler önemli etkenlerdir. EM ile tan nabilen ishal etkeni viruslerden, ELISA ve LA gibi h zl ve kolay metodlarla saptanabilenleri rotavirus ve adenoviruslerdir. PCR gibi moleküler metodlar son y llarda tan m amac yla (deneysel çal flmalar) kullan lmaktad r. Rotavirus Özellikle 6 ay - 2 yafl aras çocuklarda ciddi seyirli ishallerin en s k rastlanan etkenidir. 135

24 ÖZTÜRK, R Üretimi mümkünse de pratik de ildir. ELISA ve LA yöntemleriyle etken aranabilmektedir. Ticari ELISA ve lateks aglütinasyon kitleri mevcuttur. ELISA; LA a göre daha duyarl d r. Bu yöntemler genel olarak A tipi rotavirusleri saptamaktad r. Monoklon antikor kullanan kitler, poliklon antikor kullanan kitlerden daha güvenli sonuç vermektedir (duyarl l k %100, özgüllük %97). RNA elektroforezi tan mda kullan labilir: 11 segmentli genom poliakrilamit jel elektroforezinde özgül bant paterni oluflturur. EM ile 70 nm boyutlu, özgül görünüfllü (araba tekerle i fleklinde) bir yap olarak görülüp teflhis edilir. Ülkemizde çocuk ishallerinde s kl genelde %20 oranlar nda bulunmaktad r PCR ile de virusun A, B, C tipleri belirlenebilmektedir. Elektron mikroskopik araflt rma yap lmadan, ticari ELISA ve LA kitleriyle genelde Rotavirus A saptan r; bu nedenle sporadik ve salg n diyare yapabilen B ve C grubu rotavirusler için PCR ile araflt rma bir avantajd r. 39 Adenovirus tip Süt çocu u ishallerinin rotavirusten sonraki 2. s k nedenidir (virus etkenleri aras nda). Ülkemizde 2 yafl alt çocuk ishallerinde %10 oran nda saptanmaktad r ELISA ve LA ile rutinde aranabilir. PCR ile de iyi sonuçlar al nmaktad r. Norwalk ve Norwalk benzeri virusler Karakteristik morfolojisi elektron mikroskopla saptanmaktad r. Norwalk virus antijen arama teknikleri deneysel olarak baflar l d r, ama henüz ticari bir kit yoktur. PCR ile güvenilir sonuçlar al nmaktad r. Epidemiyolojik amaçl antikor arama teknikleri de ticari kit halinde sunulmam flt r. shal yapan di er virüsler için ticari immunolojik kitler henüz gelifltirilmemifltir. Deneysel amaçla PCR in bu etkenleri saptamada baflar l oldu u bildirilmektedir. KRON K SHAL N LABORATUVAR TANIMI Kronik ishalde infeksiyon d fl nedenler daha s k rastlan r. Bununla birlikte AIDS gibi ba fl kl k yetmezli i olanlarda infeksiyöz etkenler yine en s k olarak görülür. yi bir anamnez ve klinik muayene sonras nda ak lc bir algoritmayla hastaya fazla masraf yüklemeden gerekli tetkikler bafllat l r. 136

25 SHAL N LABORATUVAR TANIMI Çocuk ve eriflkine göre, varsa altta yatan hastal klar dikkate al narak tetkiklerin öncelikle s ras belirlenir. Basitçe d flk da lökosit varl, sindirim fonksiyonunu (niflasta, kas lifleri ve ya varl -Sudan III ile boyama ile-), triptik aktivite, redüktan madde varl, d flk da laksatif aranmas (baz hastalar laksatif ald n gizler) laktoz tolerans testi, d flk osmolalitesi, malabsorpsiyon testleri (ya da eriyen vitaminlerin malabsorpsiyonu, anormal protrombin zaman, düflük serum kalsiyumu, düflük karoten ve anormal serum alkalen fosfataz de erlerine sebep olur) tam kan say m (anemi; malabsorpsiyon sendromlar -vitamin B12, folat, demir... - ve inflamatuvar durumalrda görülür), serum elektrolitleri (derin sekretuvar diyarelerde hiponatremi oluflur), karaci er fonksiyon testleri, kalsiyum, fosfor, albumin (hipoalbuminemi, malabsorpsiyon, protein kaybettiren enteropati, ve inflamatuvar hastal klarda görülür), TSH, total T4, beta-karoten ve protrombin zaman ölçülür. Sekretuvar diyare durumunda serum VIP (vipoma), gastrin (Zollinger-Ellison sendromu), kalsitonin (medullar tiroid karsinomu,), kortizol (Addison hastal ), ve idrarda 5-HIAA (karsinoid sendrom) seviyeleri ölçülmelidir. Mikrobiyolojik araflt rmalar konuda tecrübeli bir laboratuvarda yapt r l r. En az 3-6 kez parazitolojik inceleme yap l r (Cryptosporidium dahil). Bakteriyolojik araflt rma anamnez ve klinik çerçevesinde geniflletilebilir. Antibiyotik kullanm fllarda C.difficile toksini aranmas ihmal edilmemeli, gere inde Mycobacterium, klinik kuflku durumunda Whipple hastal (etkeni Tropheryma whippelii adl bir bakteridir, henüz üretilememifl olan bu etkenin yapt hastal n tan m al nan biopsi örneklerinin özelli i PAS pozitif makrofajlar ve bakteri DNA s n n PCR ile amplifiye edilmesiyle yap l r) da araflt r l r. 1-9,40 Kronik ishalde direkt bat n grafisi (kalsifikasyon görülmesi kronik pankreatite iflaret eder), kolon grafisi, mide-duodenum grafisi, ince barsak grafisi, bilgisayarl tomografi, ince barsak biopsisi, endoskopik incelemeler (proktosigmoidoskoi C.difficile ve E.histolytica kolitleri, inflamatuvar barsak hastal klar tan m nda oldukça yararl d r) de mutlaka yap lmal d r. SONUÇ Akut ishallerde laboratuvar ne kadar geliflmifl olursa olsun %30-50 oran nda etken saptanamamaktad r. Her ishal olgusunda epidemiyolojik amaçl bir araflt rma yap lmad sürece ve hasta ba fl kl k yetmezli i olan birisi de il- 137

26 ÖZTÜRK, R se, bütün etkenleri aramak fiyat etkin de ildir. Hekimin özel bir iste i olmad sürece laboratuvara gelen ishalli bir hastan n d flk s için afla dakilerin yap lmas yeterlidir. 1-9,41 1. D flk makroskopik olarak incelenir: d flk n n k vam, kan, mukus, eriflkin helmint varl kaydedilir. 2. Mikroskopik inceleme: Lökosit varl, protozoon kistleri ve/veya trofozoitleri, helmint yumurtalar veya larvalar aran r. Karanl k alan ve faz kontrast mikroskobu, Campylobacter görülmesinde yarar sa lar. Gram ile florada oluflan afl r de ifliklikler, Campylobacter görülebilir. stendi inde, Cryptosporidium, Cylospora protozoonlar için modifiye aside dirençli boyama, Microsporidium lar için modifiye trikrom boyama yap l r. 3. Kültür için, duruma göre davran l r. Çok sulu pirinç suyu gibi d flk da V.cholerae, ETEC aranmas ön plana al n r. Lökositli d flk larda Salmonella, Shigella, Campylobacter araflt r l r. Bölgede Aeromonas s k rastlan yorsa, rutin araflt rmaya dahil edilir. shali bafllay nca kendi bafl na antibiyotik alanlarda üreme oranlar çok düflüktür, klinik seyir a r olmad kça bunlardan kültür istenmeyebilir. 37 Hastanede edinilmifl veya antibiyotik kullan m sonras nda geliflen ishallerde sitotoksisite deneyi veya ELISA ile C.difficile toksini araflt r l r. 4. Çocuk yafl grubu ishallerinde rotavirüs ve adenovirüs, LA veya ELISA yöntemiyle araflt r l r. Sonuç rapor edilirken sadece araflt r lan etkenler hakk nda bilgi verilmeli, patojen bakteri üremedi denmemelidir. deal olarak bir laboratuvar sonuç raporu d flk n n k vam, kan ve mukus içerip içermedi i, mikroskopik bak da lökositlerin varl ; helmint yumurtas, protozoon kist ve trofozoiti olup olmad ve sadece çal fl lan bakterilerin sonucunu yans tacak bilgi vermelidir. KAYNAKLAR 1. Butterton JR, Calderwood SB. Acute infectious diarrheal diseases and bacterial food poisoning, in Fauci AS, Braunwald E, Isselbacher KJ, Wilson JD, Martin JB, Kasper DL, Hauser SL, Longo DL (eds), Harrison s Principles of Internal Medicine, 14 th ed, vol: 1, McGraw-Hill, New-York, 1998: Guerrant RL. Inflammatory enteritides, in Mandel GL, Bennett JE, Dolin R (eds), Mandell, Douglas and Bennett s Principles and Practice of Infectious Diseases, vol. 1 Churchill Livingstone Inc, New York, 1995: Reese RE, Hruska JF. Gastrointestinal and intraabdominal infections, in Reese R, Betts RF (eds)., Practical Approach to Infectious Diseases, 4th ed, Little, Brown and Company, Boston, 1996: Isenberg HD. Essential procedures for clinical microbiology, ASM Press, Washington, D.C., 1998: Sack RB, Tilton RC, Weisfeld AS, Cumitech 12, Laboratory diagnosis of bacterial diarrhea, Rubin SJ (coordinating ed.), American Society for Microbiology, Washington, D.C.,

27 SHAL N LABORATUVAR TANIMI 6. Forbes BA, Granato PA, Processing specimens for bacteria, in Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH (eds), Manual of Clinical Microbiology, 6th ed, ASM Press, Washington, D.C, 1995: Steele PE, Fenoglio-Preiser C. Laboratory performance in the diagnosis of gastrointestinal infections, in Surawicz C, Owen RL (eds), Gastrointestinal and Hepatic Infections, W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1995: Thorne GM, Greatorex GS. Evaluation of diarrhea, including molecular diagnostic methods and interpretation of diagnostic tests, in Surawicz C, Owen RL (eds), Gastrointestinal and Hepatic Infections, W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1995: Goodman LJ, Manuselis G Jr, Mahon CR. Gastrointestinal infections and food poisoning, in Mahon CR, Manuselis G Jr (eds) Textbook of Diagnostic Microbiology, W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1995: Quiroga T. Garcia P. Goycoolea M., Potin M. Rodriguez L. Vial P. Fecal lactoferrin as a marker of fecal leukocytes. J Clin Microbiol 32: , Choi SW, Park CH, Silva TM, Zaenker EI, Guerrant RL, To culture or not to culture: fecal lactoferrin screening for inflammatory bacterial diarrhea. J Clin Microbiol 34: , Hoshiko M, Laboratory diagnosis of infectious diarrhea. Pediatr Ann 23: , Takeshi K. Ikeda T. Kubo A, Fujinaga Y. Makino S. Oguma K. Isogai E, Yoshida S, Sunagawa H, Ohyama T. Kimura H. Direct detection by PCR of Escherichia coli 0157 and enteropathogens in patients with bloody diarrhea. Microbiol Immunol 41: Öztürk R, Midilli K, Okyay K, Ero lu C, Ayg n G, Kenani Y, Çaflkurlu H, Samast M. Aeromonas bakterilerinin ishalli hastalardaki s kl. Klimik Derg 7: 45-47, Öztürk R, Midilli K, Okyay K, Ero lu C, Aygün G, Kenani Y, Sarsan A. Çocuk ve eriflkin yafl grubu ishal olgular nda Campylobacter jejuni ve Campylobacter coli s kl n n araflt r lmas. Türk Mikrobiyol Cem Der 24: 42-45, Mahon CR, Manuselis G Jr. Enterobacteriaceae, in Textbook of Diagnostic Microbiology, Mahon CR, Manuselis G Jr (eds), W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1995: Gray LD. Escherichia, Salmonella, Shigella, and Yersinia in Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH (eds), Manual of Clinical Microbiology, 6th ed, ASM Press, Washington D.C, 1995: Unat EK. T p bakteriyolojisi ve virolojisi, 2. Bask, cilt 1 ve cilt 2, stanbul, Dergah Yay nlar, 1986 (kitab n de iflik bölümlerinden yararlan lm flt r). 19. Öztürk R, Parlakgül D, Okyay K, Aygün G. Salmonella O-1 faj n n klinik mikrobiyoloji için önemi, Türk Mikrobiyol Cem Derg 24: 19-21, Nataro JP, Kaper JB. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin Microbiol Rev 11: , Paton AW, Paton JC. Detection and characterization of Shiga toxigenic coli by using multiplex PCR assays for stxl, stx2, eaea, enterohoemorrhagic E. coli hlya, rfbo111, and rfbo157. J Clin Microbiol 36: , Carnahan AM, Kaplan RL. Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas, and Campylobacter, in Mahon CR, Manuselis G Jr(eds), Textbook of Diagnostic Microbiology, W.B. Saunderrs Company, Philadelphia, 1995: Stonnet V, Sicinschi L, Megraud F, Guesdon JL. Rapid detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli isolated from clinical sepcimens using the polymerase chain reaction. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 14: , Nachamkin I. Campylobacter and Arcobacter, in Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH(eds), Manual of Clinical Microbiology, 6th ed, Washington, D.C, ASM Press, 1995: Arzese A, Trani G, Riul L, Botta GA. Rapid polymerase chain reaction method for specific detection of toxigenic Clostridium difficile. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 14: 719, Notermans S, Beumer R, Rombout F. Detecting foodborne pathogens and their toxins, conventional versus rapid and automated methods, in Doyle MP, Beuchat LR, Montville TJ(eds), Food Microbiology-Fundamentals and Frontiers, ASM Press, Washington, D.C, 1997: Barbour WM, Tice C. Genetic and immunologic techniques for detecting foodborne pathogens and toxins, in Doyle MP, Beuchat LR, Montville TJ (eds), Food Microbiology-Fundamentals and Frontiers, ASM Press, Washington, D.C., 1997: Swaminathan B, Rocourt J, Bille J. Listeria, in Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH (eds), Manual of Clinical Microbiology, 6th ed, ASM Press, Washington, D.C, 1995: Unat EK, Yücel A, Altafl K, Samast M. Unat n T p Parozitolojisi, nsan n Ökaryonlu Parazitleri ve Bunlarla Oluflan Hastal klar, 5. Bask, Cerrahpafla T p Fakültesi Yay nlar : 15, stanbul, 1995 (kitab n de iflik bölümlerinden yararlan lm flt r). 31. Garcia LS, Bruckner DA. Diagnostic Medical Parasitology, 2nd ed, American Society for Microbiology, Washington, D.C, 1993 (kitab n de iflik bölümlerinden yararlan lm flt r). 32. Haque R, Ali IK, Akther S, Petri WA Jr. Comparison of PCR, isoenzyme analysis, and antigen detection for diagnosis of Entamoeba histolytica infection. J Clin Microbiol 36: ,

28 ÖZTÜRK, R 32(a). Öztürk R, Ero lu C, Çaflkurulu H, Civano lu D, Pala Ö. stanbul da akut ishalli çocuklarda Cryptosporidium s kl. Klimik Derg 7: , Sheehan DJ, Raucher BG, McaKitrick JC. Association of Blastocytis hominis with signs and symptoms of luman disease, J Clin Microbiol 24: , Weber R, Bryan RT, Owen RL, Wilcox CM, Gorelkin L, Visvesvara GS, and The Enteric Opportunistic Infections Working Group. Improved light detection of microsporidia spores in stool and duodenal aspirates. N Eng J Med 326: , Talal AH, Kotler DP, Orenstein JM, Weiss LM. Detection of Enterocytozoon bieneusi in fecal specimens by polymerase chain reaction analysis with primers to the small-subunit rrna. Clin Infect Dis 26: Sobel JD. Vazquez JA. Fungal infections of the gastrointestinal tract, in Surawicz C. Owen RL (eds). Gastrointestinal and Hepatic Infections, W.B. Saunders Company, Philadelphia. 1995: Baysallar M. Haznedaro lu T, Baflustao lu A, Baylan O, Albay A yafl aras çocuk akut gastroenterit olgular nda rotavirüs ve adenovirüs s kl n n araflt r lmas. 5. Ulusal nfeksiyon Hastal klar Kongresi 4-6 Eylül 1995, stanbul, Kongre Kitab. s: Jiang B, Dennehy PH, Spangenberger S, Gentsch JR, Glass RI. First detection of group C rotavirus in fecal specimens of children with diarrhea in the United States. J Infect Dis 172: 45-50, Jang B, Dennehy PH, Spangenberger S, Gentsch JR, Glass RI. First detection of group C rotavirüs in fecal specimens of children with diarrhea in the United States. J Infect Dis 172: 45-50, Maiwald M, Meier-Willersen HJ, Hartmann M, von Herbay A. Detection of Tropheryma whippelii DNA in a patient with AIDS. J Clin Microbiol 33: , Rohner P, Pittet D, Pepey B, Nije Kinge T, Auckenthaler R. Etiological agents of infectious diarrhea: implications for requests for microbial culture. J Clin Microbiol 35: ,