MERS-SARS CoV Real-TM El Kitabı

Transkript

1 IVD Sadece in Vitro Diagnostic Kullanım için MERS-SARS CoV Real-TM El Kitabı Şiddetli Akut Solunum Sendromu Koronavirüsler (SARS) ve Orta Doğu Solunum Sendromu (MERS-CoV) ayırt etme ve tespiti için Real Time PCR kiti. REF V65-50FRT 50

2 İSİM MERS-SARS CoV Real-TM AÇIKLAMA Koronavirüsler, insanları ve bazı hayvan türlerini enfekte edebilen ribonükleik asit (RNA) virüslerin büyük bir familyasıdır. Koronavirüsler, insanlarda yaygın soğuk algınlığından, şiddetli akut solunum sendromuna(sars) kadar bir dizi hastalığa neden olabilirler. Orta Doğu Solunum Sendromu(MERS), bir viral solunum yolu hastalığıdır ve ilk olarak 2012 yılında Suudi Arabistan'da raporlanmıştır. Buna MERS-CoV olarak adlandırılan bir koranavirüs neden olur. İlk raporlarda virus, şiddetli akut solunum yolu sendromu (SARS) ile karşılaştırılmış ve SARS benzeri Suudi Arabistan virusu olarak bahsedilmiştir. MERS-CoV enfeksiyonu olduğu teyit edilen birçok kişide, akut ağır solunum hastalığı gelişmiştir. 31 Ekim 2013 itibariyle, Dünya Sağlık Örgütü, dünya çapında 149 kişinin MERS'e yakalandığını ve bunların 63 'ün öldüğünü doğrulamıştır. Etkilenen ülkeler arasında Orta Doğu'da, Ürdün, Suudi Arabistan Krallığı(KSA), Birleşik Arap Emirlikleri(UAE), Kuveyt ve Katar; Avrupa'da Fransa, Almanya, Birleşik Krallık (UK) ve İtalya; Kuzey Afrika'da ise Tunus yer almaktadır. Enfeksiyonlar muhtemelen Ortadoğu'da meydana gelen insan dışı kaynaklara maruz kalma yoluyla edinilmiş; Avrupa ve Kuzey Afrika ülkelerinde ise Orta Doğu'dan songünlerdeki yolcuların yakın teması ile oluşmuştur. KULLANIM AMACI MERS-SARS CoV Real-TM kiti, Şiddetli Akut Solunum Sendromu Koronavirüsler (SARS) ve Orta Doğu Solunum Sendromu (MERS-CoV) ayırt etme ve kalitatif tespiti için Real Time PCR testidir. TAHLİL PRENSİBİ MERS-SARS CoV Real-TM Testi üç ana proses esasına dayanır: numunelerden virus RNA izolasyonu, RNA'nın reverse (ters) transkripsiyonu ve cdna'nın Real Time amplifikasyonu. Coronavirus 'ün polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile tespiti, spesifik primerler kullanılarak patojen genom spesifik bölgesinin amplifikasyonu ve floresan boyalar vasıtasıyla tespiti esasına dayanır. Bu boyalar, amplifiye ürüne spesifik olarak bağlanan oligonükleotit probları ile bağlantılıdır. Floresan yoğunluklarının Real Time PCR ile izlenmesi, PCR çalışmasından sonra reaksiyon tüplerinin kapaklarının yeniden açılmaksızın, biriken ürünün tespitine olanak sağlar. MERS-SARS CoV Real-TM PCR kiti Internal (iç) Kontrol içeren, kalitatif bir testtir. Bu,izolasyon prosedüründe her biri ayrı ayrı işlenmiş numune ekstraksiyon prosesinde ve ayrıca olası inhibasyon reaksiyonunu belirlemek için kontrol olarak kullanılmalıdır.

3 SAĞLANAN MALZEMELER Part N 1 Reverta-L : RNA Reverse(ters) transkripsiyon RT-G-mix-1, 5 x 0,01 ml; RT-mix, 5 x 0,125 ml; Reverse transcriptase (M-MLV), 0,03 ml; TE-buffer, 1,2 ml. 60 test için reaktifler içerir Part N 2 MERS-SARS CoV Real-TM : Real Time Amplifikasyon kiti PCR-mix-1-FL, 0,6 ml; PCR-mix-2-FL, 0,3 ml; TaqF Polymerase, 0,03 ml; Pos cdna MERS/SARS/IC C+, 0,2 ml; DNA-buffer, 0,2 ml; Negative Control, 1,2 ml*; Internal Control RNA (IC), 5 x 0,12 ml**; 55 test için reaktifler içerir. *izolasyon prosedürü esnasında Ekstraksiyon Negatif Kontrolü olarak kullanılmalıdır. 10 µl Internal (iç) Kontrol RNA'yı, RNA purifikasyon prosedürü esnasında doğrudan numune/lysis karışımına ekleyin.

4 SAĞLANMAYAN GEREKLİ MALZEMELERr Alan 1 : Numune Hazırlama RNA ekstraksiyon kiti Biyogüvenlik kabini "eppendorf" tip tüpler için masaüstü mikrosantrifüj 60 C ± 5 C kuru ısı bloğu Vorteks mikser Aeresol bariyerli pipetler 1,5 ml polypropylene steril tüpler (Sarstedt, QSP, Eppendorf), Atılabilir, tek kullanımlık eldivenler, pudrasız Tüp rakları Buzolabı Dondurucu Alan 2: RT ve amplifikasyon Real Time Thermalcycler Çalışma istasyonu Aeresol bariyerli pipetler Tüp rakları MUHAFAZA KOŞULLARI MERS-SARS CoV Real-TM kiti -20 C'de muhafaza edilmelidir. Kit, 2-8 C de 3-4 gün içerisinde nakliye edilebilir, ancak alındıklarında hemen -20 C ye getirilmelidirler. STABİLİTE MERS-SARS CoV Real-TM etiketinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Ürün etiketinde basılı kontrol tarihine kadar performansını koruyacaktır. Işık, ısı veya neme maruz kalma kitin bazı bileşenlerinin raf ömrünü etkileyebilir, bunlardan kaçınılmalıdır. Hassasiyet azalabileceğinden, reaktiflerin tekrarlanan çözülme ve dondurma işlemlerinden kaçınılmalıdır. KALİTE KONTROL Her lot, tutarlı ürün kalitesini sağlamak için; Sacace ISO Sertifikalı Kalite Yönetim Sistemine uygun olarak, önceden belirlenmiş özelliklere karşı test edilmektedir.

5 UYARILAR VE ÖNLEMLER In Vitro Diagnostic Medikal Cihaz Sadece In Vitro Diagnostic Kullanım için Kullanıcı her zaman aşağıdakilere dikkat etmelidir: MERS vak'alarında gelen klinik örnekler, kategori B biyolojik maddeler olarak dikkate alınmalıdır. Aeresol bariyerli steril pipet ucuları kullanın ve her prosedür için yeni pipet ucu kulanın. Ekstrakte pozitif malzemeleri (numuneler, kontroller ve amplikonlar) diğer reaktiflerden uzak tutun/mufaza edin ve bunları reaksiyon karışımına ayrı bir alanda ekleyin. Bütün bileşenleri tahilile başlamadan önce oda sıcaklığında iyice çözün. Bileşenler çözündüğünde karıştırın ve kısa bir süre santrifüjleyin. Reaktif ve örnekler kullanın. İşlem sonrası ellerinizi iyice yıkayın. ile çalışırken, atılabilir eldiven, laboratuar önlüğü ve göz koruyucu Laboratuar çalışma alanlarında, sigara içmeyin, herhangi birşey yemeyin- içmeyin, kozmetik uygulamayın veya kontakt lenslere elle dokunmayın. Son kullanım tarihlerinden sonra kitleri kullanmayın. Tüm numuneleri ve kullanılmayan reaktifleri,yerel yönetim kurallarına uygun olarak imha edin. Örnekler potansiyel enfeksiyöz olabilir, işlemleri uygun biyogüvenlik uygulamaları ile bir güvenlik kabini içerisinde gerçekleştirin. Dökülen/ saçılan tüm numune veya reaktifleri temizleyin ve %0.5 lik sodyum hipoklorit veya diğer uygun dezenfektanlarla dezenfekte edin. Numune veya reaktiflerin deri, göz veya mukoza zarları ile temasından kaçının. Deri, göz veya mukoza zarları ile temas olması halinde, hemen su ile yıkayın ve acilen tıbbi yardım alın. Malzeme Güvenlik Bilgi Formları (MSDS) istek üzerine verilebilir. Bu ürünün kullanımı, DNA amplifikasyonu teknikleri konusunda eğitimli personel ile sınırlı olmalıdır. Laboratuvar süreci tek yönlü olmalı; Ekstraksiyon Alanında başlamalı ve sonra Amplifikasyon ve Tespit alanlarına gidilmeli/ yönlenmelidir. Örnekleri, ekipmanları ve reaktifleri önceki adımın yapıldığı bölgeye/alana geri döndürmeyin.

6 ÜRÜN KULLANIM SINIRLARI Tüm reaktifler sadece in vitro diagnostic kullanılabilir. Bu ürünün kullanımı, DNA amplifikasyonu teknikleri konusunda eğitimli personel ile sınırlı olmalıdır. Kullanım kılavuzu ile sıkı uyum optimum PCR sonuçları için gereklidir. Kutu ve tüm bileşenlerin etiketleri üzerinde yazılı olan son kullanım tarihlerine dikkat edilmelidir. Son kullanım tarihlerinden sonra kitleri kullanmayın. NUMUNE TOPLAMA, MUHAFAZA VE TAŞIMA MERS-SARS CoV Real-TM aşağıdakilerden ekstrakte RNA analizi yapabilir: nazofarenks swablar :swab alanı ve yeri 0,5 ml tuzlu su veya PBS steril (Sacace Transport medium önerilir) içeren Eppendorf tüptür. Kuvvetlice çalkalayın. Aynı tüp içerisinde swab ve çalkalamayı tekrarlayın. 5000g/dk.'da 5 dk. santrifüjleyin. RNA ekstraksiyon için yaklaşık 100 µl solüsyon bırakın ve süpernatantı atın. aspirat, bronşiyal lavaj, nasal yıkama: 10000g/dk.'da dk. santrifüjleyin. Eğer pellet görünmezse 10 ml likit ekleyin ve tekrar santrifüjleyin. Süpernatantı kaldırın ve atın. Pelleti, 100 µl tuzlu suda resüspanse edin. Plazma : EDTA'ya alınan tam kanın, altı saat içerisinde, 20 dakika boyunca x g'de santrifüjlenerek plazma ve hücre bileşenleri ayrılmalıdır. Izole edilmiş plazmanın, steril bir polipropilen tüp içine transfer edilmesi gerekir. Plazma ilave 3 gün için 2-8 C'de muhafaza edilebilir. Alternatif olarak, plazma -18 C 'de 1 aya kadar veya -70 C'de 1 yıl muhafaza edilebilir. dışkı:5 ml'lik tüpe (aynı 2,0 ml tüp içinde yapılabilir) 4 ml tuzlu su ve 1,0 gr (yaklaşık 1,0 ml) dışkı ekleyerek, %10-20'lik dışkı süspansiyonu hazırlayın. RNA purifikasyon hemen yapılmalıdır, eğer bu mümkün değilse %20 Gliserol steril solüsyonu ( hücre içi ve dışı donmaya karşı koruma sağlayan soğuk önleyici ajan) eklayin ve -20 C'de muhafaza edin.homojen bir süspansiyon elde etmek için vorteksleyin ve 5 dk g/L'de santrifüjleyin. Virel DNA/RNA ekstraksiyonu için süpernatantı kullanın. doku: 1,0 gr (parenchimatous organlar, trakea, akciğer, beyin) mekanik homojenleştirici veya neşter, cam çubuklar, teflon havan tokmaklarının ile homojenize edilir ve 1,0 ml tuzlu su veya PBS steril içinde çözülür. Kuvvetlice vorteksleyin ve oda sıcaklığında 30 dk. inkübe edin. Süpernatantı yeni bir 1,5 ml'lik tüpe aktarın. Numuneler 12 saatten fazla olmamak koşulu ile +2-8 C de muhafaza edilir ya da 20/-80 C dondurulur. Klinik örneklerin taşınması, etiyolojik ajanların taşınmasına yönelik ülke, federal, eyalet ya da yerel yönetmeliklere, uymak zorundadır.

7 RNA İZOLASYON Herhangi bir ticari RNA / DNA izolasyon kiti, burada belirtilen IVD-CE "NUMUNE TOPLAMA, MUHAFAZA VE TAŞIMA" paragrafındaki örnek türleri için valide ise, kullanılabilir. Sacace Biotechnologies aşağıdaki kitleri kullanmanızı önerir: DNA/RNA Prep (Sacace, REF K-2-9); SaMag Viral Nucleic Acids Extraction kit (Sacace, REF SM003) Lütfen, RNA ekstraksiyonunu, üreticinin talimatlarına uygun olarak gerçekleştirin. 10 μl Internal (iç) Kontrol 'ü DNA izolasyon prosedürü esnasında doğrudan numune/lysis karışımına ekleyin. RT VE AMPLİFİKASYON Reverse (Ters) Transkripsiyon: 1. Reaction Mix Hazırlanması : 12 reaksiyon için ;RT- mix içeren tüpe 5,0µl RT-G-mix-1 ekleyin ve en az 5-10 sn. vortekleyin, kısa bir süre santrifüjleyin. Bu karışım -20 C.'de 1 ay stabildir. Reagent Mix içeren tüpe 6 µl M-MLV ekleyin, pipetlemeyle karıştırın, 3 sn vortekleyin, 5-7 sn. santrifüjleyin (hazırlandıktan hemen sonra kullanılmalıdır) (12'den daha az numunenin test edilmesi gerekirse, her numune için (N) yeni bir steril tüpe 10*N µl RT-G-mix-1 ile RT-mix ve 0,5*N µl M-MLV ekleyin). 2. Her numune tüpüne 10 µl Reaction Mix ekleyin. 3. Uygun tüplere 10 µl RNA örneklerini pipetleyin. Pipetleme yoluyla dikkatlice karıştırın. 4. Tüpleri thermalcycler 'a yerleştirin ve 37 o С 'de 30 dk. inkübe edin. 5. Her elde edilen cdna örneğini TE-buffer (her tüpe 20 µl TE-bufferekleyin) ile 1:2 oranında dilüe edin. cdna örnekleri -20 o С de 1 hafta, -70 o С 'de 1 yıl boyunca muhafaza edilebilirler. Real Time Amplifikasyon Reaction Mix 25 µl 1. Gereken miktardaki tüpleri veya PCR plate'leri hazırlayın. 2. Her numune için yeni bir steril tüpte, 10*N µl PCR-mix-1, 5*N µl PCR-mix- 2-FRT ve 0,5*N of TaqF Polymerase hazırlayın 3. Her tüpe 15 µl Reaction Mix ekleyin. 4. Reaction Mix.'li uygun tüplere 10 µl cdna örneği ekleyin. 5. Her panel için 4 kontrol hazırlayın: Amplifikasyon Negatif Kontrol etiketli tüpe, 10 µl DNA-buffer ekleyin; Negatif Ekstraksiyon Kontrol (NCE) etiketli tüpe, 10 µl ekstrakte DNA of Neg Control ekleyin.

8 C posdna etiketli tüpe 10 µl cdna MERS/SARS/IC C+ ekleyin. Amplifikasyon 1. Enstrümanınızda aşağıdaki gibi bir sıcaklık profili oluşturun: Rotor-tip Enstrümanlar 1 Plate -tip enstrümanlar 2 Adım Sıcaklık, С Süre Cycling Sıcaklık, С Süre Cycling dk dk sn sn sn sn sn sn. 10 sn. 20 sn sn. Floresan Tespiti sn. Floresan Tespiti Örneğin; Rotor-Gene 3000/6000/Q (Corbett sn. Research, Qiagen) sn. 2 örneğin,sacycler-96 (Sacace), CFX/iQ5 (BioRad); Mx3005P /Mx300oP (Agilent), ABI 7300/7500/StepOne Real Time PCR (Applied Biosystems), SmartCycler (Cepheid) MERS-Cov Rox (Orange) kanalda, SARS JOE (Yellow) kanalda, IC FAM (Green) kanalda tespit edilir. ENSTRÜMAN AYARLARI Rotor-tip enstrümanlar Calibrate/Gain Diğer Ayarlar/ Kanal Eşik Çizgisi Slope Correct Optimisation Outlier Removal FAM/Green 5 FI ila 10 FI 0,1 % 10 Kapalı JOE/Yellow 5 FI ila 10 FI 0,1 % 10 Kapalı ROX /Orange 5 FI ila 10 FI 0,1 % 10 Kapalı Plate- veya modüler tip Enstrümanlar Eşik çizgisi, yalnız pozitif örneklerin sinyal birikiminin sigmoid eğrilerini geçmeli ve taban çizgisini geçmemelidir; aksi takdirde eşik çizgi seviyesi yükseltilmelidir. Eşik çizgisini, floresan eğrilerinin linear ve negatif numunelerin eğrilerinin geçmediği yerde ayarlayın.

9 SONUÇLARIN ANALİZİ 1. Eğer Rox(Orange) kanaldaki Ct değeri sıfırdan farklı (33 ten küçük olmalı) ise, numune MERS için pozitif olarak dikkate alınır. Eğer Ct değeri 33'ten büyük ise, tahlil tekrarlanmalıdır ve sonuçların tekrarı veya 33'ten küçük olmaları durumunda numune pozitif olarak kabul edilmelidir. 2. Joe (Yellow) kanaldaki Ct değeri sıfırdan farklı ise (33'ten küçük olmalı), numune SARS için pozitif olarak dikkate alınır. Eğer Ct değeri 33'ten büyük ise, tahlil tekrarlanmalıdır ve sonuçların tekrarı veya 33'ten küçük olmaları durumunda numune pozitif olarak kabul edilmelidir. 3. Fam (Green) kanalda değer tespit edilmemişse ( floresan eğri eşik çizgisini geçmez) ve sonuç tablosundaki Fam (Green) kanal Ct değeri 28'den düşük ise numune MERS & SARS için negatif olarak dikkate alınır. Tablo. Kontrol Sonuçları Kontrol Kontrol Evresi Ct kanal FAM (Green) Ct kanal JOE (Yellow) Ct kanal ROX (Orange) Sonuçlar NCE RNA izolasyon, PCR Pos (< 30) Neg Neg Geçerli sonuç NCA PCR Neg Neg Neg Geçerli sonuç Pos cdna PCR Pos (< 28) Pos (< 28) Pos (< 28) Geçerli sonuç PERFORMANS KARAKTERİSTİKLERİ Hassasiyet MERS-SARS CoV Real-TM kiti, 500 kopya/ml den az olmayan hassasiyetli testlerin %100 ünde MERS-CoV ve SARS tespitine olanak sağlar. Özgünlük MERS-SARS CoV Real-TM PCR kitinin analitik özgünlüğü, kitinin analitik özgünlüğü, sıkı reaksiyon koşullarıyla birlikte spesifik primerler ve probların seçimiyle sağlanır. Primerler ve problar, sekans karşılaştırma analizi ile gen bankalarında yayınlanan tüm sekanslara mümkün olan homolojiler açısından kontrol edilmiştir. Özgünlük, aşağıdaki mikroorganizma suşlarında teyit edilmiştir: Coronaviruses (Cov-E229, Cov-OC43, Cov-HKUI, Cov-NL63, FC0, FC1, CCV ), Enterovirus strains, Adenovirus; influenza virus А ve В; rhinovirus; RS viruses; Parainfluenza Virus, Streptococcus spp., Staphylococcus aureus, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniaе, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Legionella pneumophila. Kitinin özgünlüğü, RNA MERS-CoV (hcov- EMC upe-assay: IVT-RNA) pozitif kontrol örnekleri test edilerek teyit edilmiştir SARS RNA pozitif kontrol örnekleri ve (University of Frankfurt, Germany) ve tarama testleri için (Institute of Virology, University of Bonn Medical Centre, Germany) WHO tarafından önerilir.

10 SORUN GİDERME 1. Zayıf ya da olmayan IC (Fam(Green) kanal) sinyali: numunenin tekrar test edilmesi gereklidir. PCR inhibe edilmiştir. Önerilen RNA ekstraksiyon metodunu kullandığınızdan ve üreticinin talimatlarını izlediğinizden emin olun. Reaktif muhafaza koşulları talimatlara uygun değil. Muhafaza koşullarını kontrol edin. PCR koşulları talimatlara uygun değil. Protokolde belirtilen IC tespit floresan kanalını seçin ve PCR koşullarını kontrol edin. IC, reaktif pipetleme esnasında numuneye eklenmemiş. RNA ekstraksiyon prosedürü esnasında dikkatli olun. 2. Joe (Yellow)/Cy3/HEX ve Rox/TexasRed kanalda zayıf sinyal : numunenin tekrar test edilmesi gereklidir. 3. Ekstraksiyon Negatif Kontrol ile Joe (Yellow)/Cy3/HEX veya Rox/TexasRed sinyal. RNA ekstraksiyon prosedürü esnasında kontaminasyon. Tüm sonuçlar geçersizdir. Bütün yüzeyleri ve enstrümanları sodyum hipoklorid ve etanol ile dekontamine edin. Ekstraksiyon prosedürü esnasında sadece filtre pipet uçlarını kullanın. Tüpler arasında pipet uçlarını değiştirin. Yeni reaktif setleriyle RNA ekstraksiyonunu tekrarlayın. 4. Negatif PCR Kontrol ile herhangi bir sinyal yok. PCR hazırlama prosedürü esnasında kontaminasyon. Tüm sonuçlar geçersizdir. Bütün yüzeyleri ve enstrümanları sodyum hipoklorid ve etanol veya özel DNA dekontaminasyon reaktifleriyle dekontamine edin. Pozitif Kontrolü en son pipetleyin. Yeni reaktif setleriyle PCR hazırlamayı tekrarlayın.

11 KULLANILAN SEMBOLLERİN ANLAMLARI Liste Numarası Dikkat! Lot Numarası <n> testleri için yeterlilik içerir in Vitro Diagnostic için Kullanım Versiyon..'de muhafaza NCA Amplifikasyon Negatif Kontrol Amplifikasyon Üretici NCE Ekstraksiyon Negatif Kontrol Ekstraksiyon Kullanım için talimatlara bakınız C+ Pozitif Kontrol Amplifikasyon Son Kullanım Tarihi IC Internal (iç) kontrol * SaCycler Sacace Biotechnologiestescilli markasıdır. * CFX and iq5 Bio-Rad Laboratories tescilli markasıdır. * Rotor-Gene Qiagen tescilli markasıdır. *MX3005P ve MX3005P Agilent Technologies tescilli markasıdır. * ABI Life Technologies tescilli markasıdır. * SmartCycler Cepheid tescilli markasıdır. Sacace Biotechnologies Srl via Scalabrini, Como Italy Tel Fax mail: info@sacace.com web: info@sacace.com web: