SİBUTRAMİN İN GC-FID KROMATOGRAFİSİ METODU İLE FARMASÖTİK PREPARATLARDA MİKTAR TAYİNİ

Transkript

1 SAÜ Fen Edebiyat Dergisi(2012-II) A.KÜÇÜK TUNCA, E.İMAMOĞLU SİBUTRAMİN İN GC-FID KROMATOGRAFİSİ METODU İLE FARMASÖTİK PREPARATLARDA MİKTAR TAYİNİ Aysel KÜÇÜK TUNCA, Esin İMAMOĞLU Sakarya Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü, Sakarya, 54187, Türkiye ÖZET Ticari bir antiobezite ilacının etken maddesi olan Sibutramin için literatürde yer almayan yeni bir Gaz Kromatografisi-Alev İyonlaşma Dedektörü (GC-FID) miktar tayini yöntemi geliştirilmiş ve ticari preparatlarda mevcut bulunan miktarlar bu yöntemle belirlenmiştir. Sibutramin için geliştirilen bu yöntemin biyonalitik yöntem validasyonu da yapılarak bütün parametreler belirlenmiştir. Sibutramin için 5-30 μg ml -1 lik konsantrasyon aralığında seçilen çalışma standart çözeltilerinin oldukça iyi bir lineerlik gösterdiği tespit edilmiştir. Bu aralıktaki LOQ değerinin 9,08 μg ml -1 ve LOD nin ise 2,72 μg ml -1 olduğu da hesaplanmıştır. Anahtar Kelimeler: Sibutramin, GC-FID kromatografisi 1

2 A.KÜÇÜKK TUNCA, E.İMAMOĞLU SAÜ Fen Edebiyat Dergisi(2012-II) QUANTITATION OF SIBUTRAMINE IN PHARMACEUTICAL PREPARATIONS BY GC-FID CHROMATOGRAPHY METHOD ABSTRACT A new GC-FID quantification method with flame-ionization detector not available in the literature for Sibutramine which is the active ingredient of a commercial antiobesity trade drug was developed and the amounts present in commercial preparations was determined via this method. Bioanalytical method validation of this method developed for Sibutramine was realised and all the validation parameters were determined. Working standard solutios chosen at the concentration range of 5-30 mg ml -1 for Sibutramine were found that showed quite good linearity. It was also calculated that LOQ value in this range was 9,08 mg ml -1 and LOD was 2,72 mg ml -1. Key words: Sibutramine, GC-FID chromatography 1. GİRİŞ Sibutramin, kilo vermede, verilen kilonun korunmasında ve obezite tedavisinde kullanılan bir maddedir (Şekil 1.) [1]. İlaçlarda, Sibutramin Hidroklorür Monohidrat olarak kullanılmaktadır. Şekil 1. Sibutramin Hidroklorür ün molekül formülü (C17H29C12NO.HCl) 2

3 SAÜ Fen Edebiyat Dergisi(2012-II) A.KÜÇÜK TUNCA, E.İMAMOĞLU Yapılan literatür araştırmaları sonucunda, iştah azaltıcı bir madde olan Sibutraminin miktar analizine yönelik, yeni yöntemler geliştirilmesi ile ilgili çeşitli çalışmalara ulaşılmıştır; UVspektroskopisi ile ticari kapsüllerde *2-5+, UV dedektörlü HPLC ile tabletlerde ve fare serumunda [6-8], kiral kromatografi ile Sibutramin enantiyomerleri için *9], Tandem Mass Spektroskopisi ile insan plazmasında *10], LC-ESI-MS ile insan plazmasında *11, 12], LC-ESI-TMS ile insan plazmasındaki Sibutramin metabolitleri için *13, 14] ve idrarda GC-MS ile Sibutraminin ana metabolitleri için *15] gibi. Ancak, ticari kapsüllerde bulunan Sibutramin in GC- FID yöntemiyle miktar analizine yönelik literatürde yer alan bir çalışmaya henüz rastlanılmamıştır. Bu maksatla, Sibutramin için bir GC-FID miktar tayini yöntemi geliştirilmiş ve bu yöntemle ticari preparatlarda bulunan miktarları belirlenmiştir. 2. DENEYSEL KISIM 2.1. Cihaz Shimadzu marka FID dedektörlü GC cihazı, yeni bir CBM-102 iletişim modülüyle güncellenmiştir. Bu sistem GC-17A Gas Chromatograph, AOC-20s Autosampler, AOC Power Supply Module, CBM-102 Communications Bus Module, FCM Kesintisiz Güç Kaynağı ve bunlara bağlı bir HP masaüstü bilgisayardan oluşmaktadır. Kolon olarak Fused-silika 0,25 μm capillar optima-1 kolon (25 m-0,25 mm), % 99 saflıkta kuru hava, azot ve hidrojen gazları ve software olarak da bilgisayara yeni yüklenmiş olan GC solution yazılım programı kullanılmıştır. Sibutramin in uygun kromatogram piklerini elde edebilmek için çeşitli sıcaklık 3

4 A.KÜÇÜKK TUNCA, E.İMAMOĞLU SAÜ Fen Edebiyat Dergisi(2012-II) programları denenmiştir. Bu denemeler sonucunda, sıcaklık programı olarak; başlangıçta kolon sıcaklığı direkt 185 C ye çıkarılıp, daha sonra 25 C/dk hız ile 260 C ye çıkarılmıştır, orada 1 dk tutularak, en son da 50 C/dk hız ile 290 C ye çıkarılarak yine orada da 1 dk tutulmuştur. Kromatografik şartlar ise; 1 ml/dk kolon akış hızı, 1 μl enjeksiyon hacmi, split modda (oranı 10), 185 C kolon sıcaklığı, 200 C dedektör sıcaklığı ve 107 kpa basınç olarak ayarlanmıştır Kromatografik Parametreler ve Optimizasyon Sibutramin in kromatografik analizi için sistem uygunluk parametreleri de hesaplanmıştır: Kapasite faktörü, ks : 1,48 (1 ml dk -1 akış hızında), toplam teorik plaka sayısı, NS: 4733, plaka yüksekliği, HS: 5, cm. Ayrıca bu parametreler CDER inkilerle de (Center for Drug Evaluation and Research) kontrol edilmiştir [16]. Kromatogramların iyileştirilmesi için başlangıçta kromatografik koşullar optimize edilerek, ön denemeler yapılmış ve en uygun şartlar bulunmuştur. Bu maksatla, GC-FID için, kapiler kolonda, uygun sıcaklık programı bulunarak, uygun gaz akış hızları, enjeksiyon hacmi ve enjektör, dedektör ve fırın sıcaklıkları seçilerek en iyi yöntem geliştirilmeye çalışılmıştır. Geliştirilen yöntem, spesifiklik, hassaslık, kesinlik, doğruluk ve lineerlik gibi bütün validasyon parametreleri kullanılarak valide edilmiştir. 4

5 SAÜ Fen Edebiyat Dergisi(2012-II) A.KÜÇÜK TUNCA, E.İMAMOĞLU 2.3. Stok ve Standart çözeltilerin hazırlanması Gaz Kromatografisi-FID cihazı ile Sibutramin Hidroklorür monohidrat içeren ticari bir kapsül için yeni bir miktar tayini yöntemi geliştirilmesi maksadıyla, elde edilen Sibutramin içeren stok çözeltiden bir seri standart çözeltiler hazırlanarak, öncelikle kalibrasyon eğrileri oluşturulmuştur. Bunun için Sibutramin stok çözeltisinden 5-30 μg ml -1 lik konsantrasyon aralığında seçilen çalışma standart çözeltileri, sabit bir hacime metanol ile seyreltilerek hazırlanmıştır. Kalibrasyon eğrileri de bu stok çözeltiden 6 farklı konsantrasyondaki çalışma standart çözeltileri ile hazırlanmıştır. Ana stoktan hazırlanan 5, 15 ve 25 μg ml -1 lık standartlar ile gün-içi ve günler-arası kesinlikler için ölçümler alınmış ve aynı standartlar ile tekrarlanabilirlik çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Kalibrasyon eğrisi, konsantrasyonlara karşı pikler altında kalan alanlar işaretlenerek hazırlanmıştır (n=6). Veriler, en küçük kareler yöntemi kullanılarak, lineer regresyon modeli ile analiz edilmiş (regresyon denklemi: y=90,278x-68,56) ve elde edilen regresyon katsayısının (r=0,9951) oldukça iyi bir lineerlik gösterdiği tespit edilmiştir. Regresyon analizinden kesişimin standart hatası, Sa: 61,52 ve eğimin standart hatası Sb ise: 3,16 olarak bulunmuştur. Şekil 2. de yaklaşık 3,4 dk civarında gelen 30 μg ml -1 lik Sibutramin standardına ait piki gösteren bir GC kromatogramı görülmektedir. Şekil 3. de ise 5-30 μg ml -1 lik konsantrasyon aralığındaki tüm Sibutramin standartları için elde edilmiş bir kromatogram görülmektedir. 5

6 A.KÜÇÜKK TUNCA, E.İMAMOĞLU SAÜ Fen Edebiyat Dergisi(2012-II) Şekil μg ml -1 lik Sibutramin standardına ait bir GC kromatogramı Şekil μg ml -1 lik konsantrasyon aralığındaki tüm Sibutramin standartları için elde edilmiş kromatogram 3. TARTIŞMA Yapılan gün-içi ve günler-arası kesinlik çalışmaları sonucunda, bulunan RSD değerlerinin oldukça iyi kesinlikler verdiği ortaya çıkmıştır (Bkz. Tablo 1.). Kesinlik tayini için gün-içi ve günler-arası ölçümlerdeki RSD lerin < % 10 ve LOQ nin de < % 20 olması gerektiği ve doğruluk için ise günler-arası ortalama değer X, 6

7 SAÜ Fen Edebiyat Dergisi(2012-II) A.KÜÇÜK TUNCA, E.İMAMOĞLU gerçek değerinin ± % 15 içinde olduğu ve LOQ nin de ± % 20 den fazla sapmaması koşulunu sağladığı da tespit edilmiş, buna uygun olarak LOQ değerinin 9,08 μg ml -1 ve LOD nin ise 2,72 μg ml -1 olduğu hesaplanmıştır. Tablo 1. Sibutramin için gün içi ve günler arası kesinlik değerleri (n=6) Sibutramin içeren (Reductil kapsül) (15 mg) ticari ilaç için de uygulaması yapılmış ve elde edilen geri kazanımlar kontrol edilmiştir. Bunun için 15 mg Sibutramin Hidroklorür içeren ticari Reductil kapsülden 150 μg ml - 1 lik bir ana stok çözelti hazırlanmıştır. Daha sonra, bu stoktan alınarak seyreltilen 5, 15 ve 25 μg ml -1 lık numuneler üzerinde gün içi ve günler arası ölçümler gerçekleştirilmiş ve oldukça iyi RSD değerleri elde edilmiştir (Tablo 2.). Tablo 2. Metanol ortamında Sibutramin içeren ticari kapsüllerden elde edilen gün içi ve günler arası kesinlik değerleri (n=6) Kesinlik Gün-içi Günler-arası Konsantrasyo n (µg ml -1 ) Ortalama Değer (X) Standart Sapma (SD) RS D (%) Ortalama Değer (X) Standart Sapma (SD) RS D (%) 5 449,50 6,28 1,40 446,17 7,63 1, ,80 22,46 2, ,50 26,55 2, ,17 25,75 1, ,33 20,39 1,22 7

8 A.KÜÇÜKK TUNCA, E.İMAMOĞLU SAÜ Fen Edebiyat Dergisi(2012-II) Ticari kapsülden hazırlanan 15 μg ml -1 lik bir standardın kromatogramı ise Şekil 4. de görülmektedir. Şekil 4. Ticari kapsülden elde edilen 15 μg ml -1 lik standardın kromatogramı Tablo 4. e bakıldığında, ticari kapsülden hazırlanan standartlardan elde edilen geri kazanım ve bağıl hata verileri hesaplanmıştır. Buradan da elde edilen geri kazanımların % 75 oldukları görülmektedir. Tablo 4. Sibutramin içeren ticari kapsülden elde edilen doğruluk ve geri kazanım değerleri (n=6) Bilinen Ortalama Kons. (µg ml -1 ) Bulunan Ortalama Kons. (µg ml -1 ) Doğruluk Bağıl Hata* (%) Geri Kazanım** (%) 5 5,03 0,60 100, ,19-18,73 81, ,01-23,96 76,04 *Bağıl Hata= Bulunan miktar - Bilinen miktar/ Bilinen miktar x 100 **Geri Kazanım= Bulunan miktar/bilinen miktar x 100 Ticari kapsül numuneleri, etken maddesi Sibutramin Hidroklorür Monohidrat olan 15 mg lık Reductil ticari kapsülünden elde edilen stok çözeltiden seyreltilerek ve tekrarlanabilirlik için 6 kez yeniden 8

9 SAÜ Fen Edebiyat Dergisi(2012-II) A.KÜÇÜK TUNCA, E.İMAMOĞLU standartlar hazırlanarak elde edilmiştir. Elde edilen kesinlik ve tekrarlanabilirlik değerleri olan SD, RSD ve % Geri kazanım, Tablo 5. de özetlenmiştir. Standart çözeltilerin 6 kez ölçümü sonucunda, elde edilen RSD değerinin oldukça iyi bir kesinlik sağladıkları da görülmektedir. Tablo 5. Ticari kapsülden elde edilen değerler (n=6) Sibutramin Alanı (µg ml -1 ) Ortalama Alan 968 Standart Sapma (SD) 18,52 Bağıl Standart Sapma 1,91 (%RSD) Bulunan Konsantrasyon 12,21 (µg ml -1 ) Geri Kazanım (%) 81,40 4. SONUÇ Başarılı bir şekilde geliştirilen yöntemin geçerliliğinin test edilmesi için spesifiklik, hassaslık, kesinlik, doğruluk ve lineerlik gibi bütün validasyon parametreleri uygulanarak, biyoanalitik yöntem validasyonu yapılmış ve yöntemin geçerliliği değerlendirilmiştir. Aynı zamanda, yöntemin Sibutramin in ticari kapsüllerdeki rutin analizi için hem az masraf hem de kullanım kolaylığı açısından pratik olarak uygulanabilir olduğu sonucuna da varılmıştır. Ayrıca, Sibutramin için geliştirilen bu ilk GC-FID yöntemi, diğer farklı yöntemlere nazaran kullanım kolaylığı açısından da bir alternatif oluşturacaktır. 9

10 A.KÜÇÜKK TUNCA, E.İMAMOĞLU SAÜ Fen Edebiyat Dergisi(2012-II) Bu çalışma, TÜBİTAK kurumu hızlı destek programı (1002) tarafından 12 ay olarak desteklenen 109T555 numaralı projenin bir bölümü kapsamındadır. 5. KAYNAKLAR [1]. Hansen, D.L., Troubro, S., Stock, M.J., Macdonald, L.A., Astrup, A., The effect of sibutramine on energy expenditure and appetite during chronic treatment without any dietary restriction, International Journal of Obesity, 23, , [2]. Maluf, D.F., Farago, P.V., Barreira, S.M.W., Pedreso, C.F., Pontarolo, R., Validation of an analytical method for determination of sibutramine hydrochloride monohydrate in capsules by UV-Vis spectrophotometry, Latin American Journal of Pharmacy, 26(6), , [3]. Diefenbach, I.C.F., Friedrich, M., Bittencourt, C.F., Santos, M.R., Escarrone, A.L.V., Development and validation of an analytical methodology for determination of sibutramine in capsules, Latin American Journal of Pharmacy, 27(4), , [4]. Quin, Z.H., Tan, R., Pu, L.J., Fading spectrophotometric method for determination of sibutramine hydrochloride with Congo red and its reaction mechanism, Chinese Journal of Analytical Chemistry, 34(3), , [5]. Valarmathi, R., Karpagam, K.S.S., Revathi, R., Spectrophotometric determination of sibutramine hydrochloride using folin-ciocalteu reagent, The Indian Pharmacist, 25(3), 71-72, [6]. Segall, A.I., Collada, E.A., Ricci, R.A., Pizzorno M.T., Reversed-Phase HPLC determination of sibutramine hydrochloride in the presence of its oxidatively-induced degradation products, Journal Of Liquid Chromatography & Related Tecnologies, 26(6), , [7]. Chandorkar, J.G., Kotwal, V.B., Dhande, N.S., Pachpor, M.P., Pande, V.V., Development and validation of high performance liquid chromatography method for analysis of sibutramine hydrochloride 10

11 SAÜ Fen Edebiyat Dergisi(2012-II) A.KÜÇÜK TUNCA, E.İMAMOĞLU and its impurity, Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences, 21(2), , [8]. Um, S.Y., Kim, K.B., Kim, S.H., Ju, Y.C., Lee, H.S., Oh, H.Y., Choi, K.H., Chung, M.W., Determination of the active metabolites of sibutramine in rat serum using column-switching HPLC, Journal of Separation Science, 31, , [9]. Radhakrishna, T., Lakshmi Narayana, CH., Sreenivas Rao, D., Vyas, K., Reddy, G.OM., LC method for the determination of assay and purity of sibutramine hydrochloride and its anantiomers by chiral chromatography, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 22, , [10]. Bhatt, J., Shah, B., Kamli, S., Subbaiah, G., Singh, S., Ameta, S., Rapid and sensitive method for the determination of sibutramine active metabolites in human plasma by reversed-phase liquid chromatography-tandem mass spectroscopy, Journal of Chromatographic Science, 45(2), 91-96, [11]. Ding, L., Hao, X., Huang, X., Zhang, S., Simultaneous determination of sibutramine and its N-desmethyl metabolites in human plasma by liquid chromatography electrospray ionization-mass spectrometry method and clinical applications, Analytica Chimica Acta, 492, , [12]. Huang, Z.Q., Xiao, S., Luo, D., Chen, B., Yao, S.Z., Simultaneous determination of sibutramine and N-didesmethylsibutramine in dietary supplements for weight control by HPLC-ESI-MS, Journal of Chromatographic Science, 46(8), , [13]. Chen, J., Lu, W., Zhang, Q., Jıang, X., Determination of the active metabolite of sibutramine by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography B, 785, , [14]. Jain, D.S., Subbaiah, G., Sanyal, M., Shrivastav, P.S., Pal, U., Ghataliya, S., Kakad, A., Patel, H., Shah, S., Liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass 11

12 A.KÜÇÜKK TUNCA, E.İMAMOĞLU SAÜ Fen Edebiyat Dergisi(2012-II) spectrometry validated method for the simultaneous quantification of sibutramine and its primary and secondary amine metabolites in human plasma and its application to a bioequivalence study, Rapid Communications in Mass Spectrometry, 20, , [15]. Rossi, S., Colamonici, C., Botre, F., Detection of sibutramine administration: a gas chromatography/mass spectrometry study of the main urinary metabolites, Rapid Communications in Mass Spectrometry, 21, 79-88, [16]. Reviewer Guidance: Validation of Chromatographic Methods, Centre for Drug Evaluation and Research (CDER), Food and Drug Administration, November