Peganum harmala L. (ÜZERLİK) TOHUMLARINDA HARMOL, HARMALOL, HARMİN VE HARMALİN ALKALOİTLERİNİN YBSK YÖNTEMİ İLE ANALİZİ

Transkript

1 14. Bitkisel İlaç Hammaddeleri Toplantısı, Bildiriler, Mayıs 2002, Eskişehir, Eds. K.H.C.Başer ve N.Kırımer Web de yayın tarihi: Haziran 2004 ISBN Peganum harmala L. (ÜZERLİK) TOHUMLARINDA HARMOL, HARMALOL, HARMİN VE HARMALİN ALKALOİTLERİNİN YBSK YÖNTEMİ İLE ANALİZİ M. Kartal, M. L. Altun, S. Kurucu Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi, Farmakognozi Anabilim Dalı, Tandoğan-Ankara ÖZET Harmol, harmalol, harmin ve harmalin alkaloitlerinin ayırımı ve tayini için basit ve duyarlı bir yöntem geliştirilmiş ve geçerliliği kanıtlanmıştır. Bu alkaloitlerin 1.5 ml/dak. akış hızında, Metasil ODS YBSK kolonu (5 µm, 150 mm x 4.6 mm I.D.;MetaChem Technologies Inc.) kullanılarak ayırımı sağlanmıştır. Solvan sistemi olarak İzopropil alkol- Asetonitril- Su- Formik asit (100:100:300:0.3) (h/h/h/h) kullanılmış ve ph'sı trietilamin ile 8.6'ya ayarlanmış olup, UV 330 nm'de ölçüm yapılmıştır. Harmol, harmalol, harmin ve harmalin'in kalibrasyon aralığı sırasıyla µg/ ml, µg/ ml, µg/ ml ve µg/ ml olarak tayin edilmiştir. Bu çalışmada, geliştirilen yönteme göre Peganum harmala L. tohumlarında harmol, harmin ve harmalin alkaloitlerinin teşhisi ve miktar tayini yapılmıştır. GİRİŞ VE AMAÇ Peganum harmala L. (Zygophyllaceae) tohumları halk arasında üzerlik olarak bilinmektedir. Ülkemizde halk arasında meyvelerinden nazarlık, tohumlarından ise nazara karşı tütsü yapılmaktadır (1, 2). Tohumlarda bulunan alkaloitler β-karbolin (trisiklik pyrido[3,4-b]indol) halka yapısı taşımaktadır (3). Bu alkaloitler; bazı gıdaların üretimi, işlem görmesi veya depolanması sırasında, indolaminler ile aldehit veya α-keto asitler arasında bir kimyasal kondensasyonla da oluşabilmektedir. Örneğin; norharman ve harman iyi pişirilmiş balık ve ette ng/g düzeyde; bazı alkollü içecekler ve gıda maddelerinde ise minör miktarlarda saptanmıştır (4). β- Karbolin türevi alkaloitlerin ayrımları ve analizleri; HPLC floresans veya UV detektör ya da bunların HPLC-MS kombinasyonları, GC ve GC-MS kullanılarak yüksek hassasiyet ve doğrulukla yapılabilmektedir (4,5). GC veya GC-MS yöntemlerini uygulamadan önce; uçucu türev hazırlanması ve türev oluştururken bazı artifact bileşiklerin oluşma ihtimali dezavantajdır. Bu nedenle HPLC veya HPLC-MS yöntemleri β-karbolin türevi alkaloitlerin analizlerinde daha çok tercih edilmektedir (4). Harman ve benzer alkaloitler; seratonin antogonisti, hallüsinojen, merkezi sinir sistemi stimulanı, ve kısa süreli MAO inhibitörüdür mg gibi küçük dozlar orta derecede merkezi sinir sistemi stimulasyonu ve 1-2 saat boyunca uyku hali ve rüya görmeye neden 228

2 olur. 750 mg a kadar büyük dozlar hallüsinojenik etkiler oluşturur ve kişiye bağlı olarak şiddeti değişmektedir (6). MATERYAL VE YÖNTEM Cihaz Fakültemiz Merkez Laboratuvar'ında bulunan Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatograf; Jasco model PU-980 pompa, Jasco UV-975 UV/VIS detektör, 7725 Rheodyne enjektör sisteminden (10 µl örnek hacimli) meydana gelmekte olup 330 nm'deki piklerin alanları Borwin software programı tarafından otomatik olarak hesaplanmıştır. Standartlar Harmol (H-1000), harmalol (H-0250), harmin (H-8646) ve harmalin (H-2256) standartları Sigma firmasından temin edilmiştir. Kromatografik Şartlar Mobil Faz: İzopropilalkol- Asetonitril- Su- Formik asit (100:100:300:0.3) (h/h/h/h) (Trietilamin ile ph'sı 8.6'ya ayarlanmıştır). İzopropilalkol (Merck ), Asetonitril (Merck ) ve Formik asit (Merck ) YBSK saflıkta, bidistile su kromatografik saflıkta kullanılmıştır. Solvanlar 0.45 µm filtreden (Milipore, Milfod, USA) geçirilip ultrasonik su banyosunda degaze edilmiştir Akış Hızı: 1.5 ml/dak. Detektör: 330 nm Basınç: 350 kg/cm 2 Hassasiyet: 0.02 AUFS Kolon: Metasil ODS (5 µm, 150 mm x 4.6 mm I.D.;MetaChem Technologies Inc.) Analizler eksternal standart yöntemi kullanılarak yapılmıştır. Bitki Materyali Bitki materyali tarihinde Van-Çavuştepe Kalesi'nden toplanmıştır (AEF 21702). Ekstrenin Hazırlanışı 2g kurutulmuş ve toz edilmiş Peganum harmala'nın tohumları 1 saat süre ile 4 defa 50'şer ml metanolle, 50 C'de su banyosunda masere edildi. Tüm metanollü ekstreler birleştirilip kuruluğa kadar uçuruldu. Yoğun ekstre 50 ml %2 'lik HCl'de çözüldü ve süzüldü. Süzüntü 2 kez 20'şer ml petrol eteri ile tüketilip çözeltinin ph'sı NH 4 OH ile 10'a ayarlandı. Sonra 4 defa 50'şer ml kloroform ile sıvı-sıvı ekstraksiyona tabi tutuldu ve kloroformlu faz kuruluğa kadar uçuruldu. Yoğun ekstre metanolde çözüldü, balonjojede hacim 25 ml'ye tamamlandı ve iyice çalkalandı. Bu ekstre 0.45 µm'lik filtreden geçirilip 10 µl miktarda hassas olarak YBSK kolonuna enjekte edildi. Standart Çözeltilerinin Hazırlanması Harmol (12.50 mg), harmalol (12.30 mg), harmin (12.50 mg) ve harmalin (12.40 mg) standartları 25 ml'lik balon jojede solvan sisteminde çözüldükten sonra solvan sistemi ile 25 ml'ye tamamlanarak hazırlanmıştır.. Standart Çalışma Çözeltisi 250 µg/ml harmol, 246 µg/ml harmalol, 500 µg/ml harmin ve 248 µg/ml harmalin konsantrasyonlarında standart çalışma çözeltileri hazırlandı. Kullanılan yöntemin uygunluğu kapasite faktörü (k ), rezolusyon (R), selektivite (α) ve pik asimetrisi (T) hesaplanarak kontrol edildi. 229

3 Kalibrasyon Eğrisi Solvan sistemi içinde hazırlanan harmol ( µg/ml), harmalol ( µg/ml), harmin ( µg/ml), harmalin ( µg/ml) standartlarına ait kalibrasyon grafikleri elde edildi. Her bir standardın farklı konsantrasyonlarında 3'er kez 10 µl enjekte edilmesi ile elde edilen pik alanları saptandı ve buradan y= mx + n doğru denklemleri bulundu. BULGULAR Yöntem Geliştirme Çeşitli oranlarda İzopropil alkol, asetonitril, su ve formik asitle ile hazırlanan solvan sisteminin trietilaminle çeşitli ph'larda denenen tampon çözeltileri arasında en iyi ayırım ve hassasiyet gösteren ph, 8.6 olduğu tespit edilmiştir. Buna göre de solvan sistemi olarak İzopropil alkol- Asetonitril-Su- Formik asit (100: 100: 300: 0.3) (h/h/h/h) (Trietilaminle ph 8.6'ya ayarlı) sisteminin en uygun olduğu sonucuna varılmıştır. Akış hızları ile 0.5 ml/dak. ile 1.5 ml/dak arasında çeşitli ayırımlar denenmiş, 1.5 ml/dak.'lık akışta optimum ayırım olduğu görülmüştür. Kullanılan ODS ters faz kolonunda harmol, harmalol, harmin ve harmalin standartlarının retansiyon zamanlarının ortalaması sırasıyla dak., dak., dak. ve dak. olduğu görülmüş olup toplam analiz süresi 12 dakikadır. Harmol, harmalol, harmin ve harmalin standartlarının UV'de çeşitli dalga boylarında yapılan denemelerinde 330 nm'de maksimum bir absorbans gösterdiği ve tüm piklerin tamamen ayrıldığı sonucuna varılmıştır (Kromatogram). Doğrusallık Tablo 1'de her standarda ait korelasyon değeri (r 2 ), eğim ve kesişimin bağıl standart sapmaları verilmiştir. Harmol, harmalol, harmin ve harmalin standartlarının sırasıyla µg/ml (r 2 = ), µg/ml (r 2 = ), µg/ml (r 2 = ) 230

4 ve µg/ml (r 2 = ) konsantrasyonlarda elde edilen pik alanları ile mükemmel bir doğrusallık sağlanmıştır. Teşhis Limiti ve Miktar Tayini Limitlerinin Saptanması Teşhis edilebilecek en düşük miktar (TL) gürültü sinyalinin 3 katı, miktar tayini yapılabilecek en düşük miktar (MTL) gürültü sinyalinin 9 katı olarak bulunmuştur. Buna göre de harmol, harmalol, harmin ve harmalin için 6 enjeksiyon yapılmış olup teşhis edilebilecek en düşük miktarlar sırasıyla 3.125, , ve µg/ml; miktar tayini yapılacak en düşük miktarlar da 9.375, , ve µg/ml olarak hesaplanmıştır (Tablo 1). Tablo 1. Sonuçların Doğrusallığı, Teşhis Limiti ve Miktar Tayin Limiti Bileşik λ Doğru Denklemi r 2 (%RSD) (%RSD) µg/ ml µg/ ml Eğim Kesişim MTL TL Harmol 330 Y= X Harmalol 330 Y= X Harmin 330 Y= X Harmalin 330 Y= X X= Konsantrasyon ( µg/ ml); Y= Alan; λ= Dalga Boyu; r 2 = Korelasyon değeri; %RSD= % Bağıl standart sapma; MTL= Miktar Tayin Limiti TL= Teşhis Limiti %RSD = (Standart Sapma/ Ortalama) x 100 Metodun Uygunluğu Rezolusyon (R), selektivite (α) ve pik asimetrisi (T) gibi kromatografik parametrelerin bu bileşikler için uygun olduğu görülmüşür (Tablo 2). İki pik arasındaki rezolusyon değeri 1.50'den, selektivitesi de 1.20'den düşük değildir. Kapasite faktörü (k ) harmol, harmalol, harmin ve harmalin için sırasıyla 1.160, 2.962, ve olarak hesaplanmıştır. Tablo 2. Harmol, Harmalol, Harmin ve Harmalin'in Sistem Performans Parametreleri t r (n=9, ortalama ) Bileşik Harmol (1.043) Harmalol (0.581) Harmin (1.629) Harmalin (1.367) Alan (n=9, ortalama) (3.279) 606 (4.436) (2.662) (4.790) k' R α T (2.565) (1.317) (4.503) (1.330) (3.263) (1.338) *%RSD = Parentez içinde % bağıl standart sapma değerleri verilmiştir. 231

5 Doğruluk Metodun doğruluğu harmol, harmalol, harmin ve harmalin standartlarının miktar tayini yapılabilecek en düşük konsantrasyonlarından 9 kez enjekte edilerek kanıtlanmıştır. Ayrıca harmol, harmalol, harmin ve harmalin standartlarının miktar tayini yapılabilecek en düşük miktarlardaki % bağıl standart sapmaları sırasıyla 1.680, 4.609, ve olarak hesaplanarak kullanılan bu metodun doğruluğu kesinleştirilmiştir (Tablo 3). Tablo 3. Geliştirilen Metodun Miktar Tayin Limitindeki Doğruluk Değerleri ( n= 9) Bileşik λ Pik Alanı (n=9, ortalama) %RSD Harmol Harmalol Harmin Harmalin Kesinlik Sırasıyla 125 µg/ml, 100 µg/ml, 150 µg/ml, µg/ml konsantrasyonlardaki harmol, harmalol, harmin ve harmalin standartlarından hazırlanan karışım test numunesi olarak 9 kez enjekte edilmiştir. Pik alanlarından harmol, harmalol, harmin ve harmalin standartlarının konsantrasyonları hesaplandı. Hazırlanan konsantrasyonlar ve hesaplanan konsantrasyonların % sapmaları da hesaplanarak Tablo 4'de verildi. Sonuçlar ± %5'in üstünde bir sapma göstermediğinden bu metodun kesinliği kanıtlanmıştır. Tablo 4. Geliştirilen Metodun Kesinlik Değerleri (n=9) Bileşik Hazırlanan Konsantrasyon µg/ ml Hesaplanan Konsantrasyon µg/ ml Ortalama ± SD % RSD % Sapma Harmol ± Harmalol ± Harmin ± Harmalin ± SD = Standart sapma % Sapma = ( Hazırlanan Konsantrasyon - Hesaplanan Konsantrasyon) x 100 Hazırlanan Konsantrasyon Semen Pegani Ekstresi Ters faz YBSK ile Van'dan toplanan Semen Pegani'den hazırlanan ekstredeki; harmol, harmalol, harmin ve harmalin alkaloitlerinin teşhisi yapılmış ve sonuçta bu alkaloitlerden harmol, harmin ve harmalin bulunduğu sonucuna varılmıştır. Ekstreye bu standartlar ayrı ayrı ilave edilip ayrı ayrı enjeksiyon yapılarak adı geçen alkaloitlere ait retansiyon zamanlarındaki piklerde büyüme olduğu tespit edilmiştir. Böylece harmol, harmin ve harmalin alkaloitlerinin Semen Pegani ekstresindeki varlığı kesinleştirilmiştir. Sonuçlar istatistiksel olarak ta değerlendirilerek bu alkaloitlere ait doğru denkleminden hareketle % alkaloit miktarları her üçü için de hesaplanmıştır (Tablo 5). 232

6 Tablo 5. Semen Pegani Numunesinde Bulunan % Alkaloit Miktarları Bileşik Alan (n= 3, ortalama) Harmol 8705 (0.463) Harmin (1.087) Harmalin (2.496) % Alkaloit Ortalama ± SD ± (0.453) ± (1.188) ± (2.546) *%RSD = Parentez içinde % bağıl standart sapma değerleri verilmiştir. TARTIŞMA Geliştirilen metot; biyolojik materyalden harmol, harmalol, harmin ve harmalin'in teşhisi ve miktar tayini için elverişli bulunmuştur. Metodun tekrarlanabilirlik yüzdesinin yüksek olması, basit, duyarlı, hızlı ve spesifik olan bu metodun harmol, harmalol, harmin ve harmalin içeren kombinasyonlara uygulanabileceği sonucuna varılmıştır. Van'dan toplanan Semen Pegani ekstresinde harmol miktarının harmin ve harmalin alkaloitlerine göre daha yüksek olduğu görülmektedir. Miktar olarak harmin alkaloitinin miktarı diğer ikisine göre daha düşük bulunmuştur. Harmalol çalışma materyalinde saptanmamıştır. Bunun nedeni; droğun kurutulması ve ekstraksiyon işlemleri sırasında muhtemelen harmalol un kolayca okside olarak harmol e dönüşmesidir(5). Üzerinde farmakolojik çalışmaların devam ettiği ve her geçen gün yeni aktivitelerin saptandığı Peganum harmala bitkisi alkaloitlerinin analizi için geliştirdiğimiz yöntem, bu konuyla araştırma yapacak kişilere yol gösterecektir. KAYNAKLAR 1. Baytop, T.: Türkiye'de Bitkilerle Tedavi (Geçmişte ve Bugün), 2. Baskı, s.: 357, Nobel Tıp Kitapevleri Ltd. Şti., İstanbul Küsmenoğlu, Ş.: FABAD, J. Pharm. Sci., 21(2), (1996). 3. Tanker, M., Tanker, N. :Farmakognozi Ders Kitabı, Cilt 2, s.: , Ankara Üniversitesi Basımevi, Ankara, Herraiz, T.: J. Chromatogr. A 881, (2000). 5. Al-Shalmani, S.: Pharmacognostical Researches on the Seeds of Peganum harmala L. of East Libya Originated, Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi (1999)