Biyofilm ve Biyofilme Yaklaşım. Prof.Dr.Ayşe Willke UDAİS 2016, İstanbul

Transkript

1 Biyofilm ve Biyofilme Yaklaşım Prof.Dr.Ayşe Willke UDAİS 2016, İstanbul

2 Biyofilm tanımı Cansız ya da canlı yüzeylere Geri dönüşümsüz olarak tutunup çoğalan Ekstrasellüler polimerik yapıdaki matriks (slime ya da glikokaliks) içindeki mikroorganizma topluluğudur 2

3 Biyofilm tanımı Kolonizasyondan farklı olarak m.o.lar matriks içindedir Birbirleriyle haberleşme, gen transkripsiyonu gibi özellikleri ile Planktonik mikroorganizmalardan farklı bir fenotip oluştururlar 3

4 Biyofilmin basitçe tanımı Yüzeylere tutunarak ekstra sellüler matriks içinde birlikte yaşayan mikroorganizma topluluğu

5 Antonie von Leeuwenhoek 17.yüzyıl Kendi diş (plağı) kazıntılarını kendi yaptığı mikroskopta inceleyerek bakterileri gösteren bilim adamı

6 Biyofilm özellikleri Hidrotermal kayalarda, fosillerde 3.2 milyar yıldır varlığı gösterilmiştir Mikroorganizmlar sanıldığının aksine %65-80 oranında biyofilmler oluşturarark yaşarlar, enfeksiyon oluştururlar

7 Biyofilm özellikleri Mikroorganizmaların varlığını sürdürmesinin evrensel stratejisi biyofilm oluşumudur Oysa mikrobiyolojik çalışmaların çoğu planktonik (serbest) yaşayanlarla yapılmıştır

8 Biyofilmin oluştuğu yerler Sıvı ve nemli ortamla teması olan yerlerde Mikroorganizmaların yaşadığı yumuşak dokuda Hava ile sıvının temas ettiği yüzeylerde

9 Biyofilm özellikleri Medikal önemi yanında endüstriyel sorunlara da yol açar Her türlü borunun tıkanması Yüzeylerin korozyonu Gıda tezgahlarının kontaminasyonu

10 Biyofilm özellikleri Bakteriler dışında funguslar, protozoonlar, viruslar, algler de biyofilm oluşturur Genellikle birden fazla tür hatta cins birliktedir Sanayide bazan toksik maddelerin temizlenmesinde kullanılır

11 Biyofilmin Soğutma suyu önemi Gıda üretimi Gemi tekneleri Dişler Petrol çıkarma Kağıt imalatı İçme suyu

12 Biyofilmle ilişkili hastalıklar Dental plaklar Kateter (trakeal, damar, üriner, şant) enfeksiyonları Eklem ve kalp protez enfeksiyonları Endokardit Kistik fibrozis Kontak lens enfeksiyonları Böbrek taşları

13 Biyofilmle ilişkili hastalıklar Osteomiyelit Kronik sinüzit Kronik otitis media Vajinal tamponlara bağlı TSS Prostatit Kronik enfeksiyonlar, diyabetik ayak enf.

14 Biyofilmle ilişkili hastalıklar Nekrotizan fasiit Safra yolu enfeksiyonları Kolera gibi gastrointestinal enfeksiyonlar CAPD peritoniti Greft enfeksiyonu Penil protez enfeksiyonu Safra yolu stent obstrüksiyonu Sütür enfeksiyonu

15

16 Biyofilm Mikroorganizmaların doğada varlığını sürdürmek için de kullandıkları bir yaşam tarzıdır; Leptospira Legionella Vibrio spp

17 Biyofilm nasıl oluşur? Medikal anlamda biyofilm oluşumu 5 basamakta gerçekleşir Buna geçmeden önce m.o.lar olay yerine nasıl ulaşmaktadır Sağlıklı bir bireyin günde ortalama 30 kez kanına bakteri karışmaktadır. Diş fırçalarken, traş olurken, kaşınırken veya bir yere çarpınca vb 17

18 Biyofilm nasıl oluşur? Yani her gün defalarca bakteriyemi geçirmekteyiz, normal vücudun savunma sistemleri bunları yok eder. Ama vücutta bakterilerin tutunacağı yüzeyler varsa, örn: Katater, stent, yapay kalp kapağı, ortopedik protez veya ölü dokular varsa Örn: Diyabetik ayak veya cerrahi alan enf.u gibi Bu bakteriler tutunma şansı bulur 18

19 Biyofilm oluşma basamakları: Birbirini izleyen 5 evre Biyofilm morfolojisi Tutunma İrreversibl bağlanma Tabaka oluşumu Tabakaların kalınlaşması Planktonik formda kopmalar

20 Biyofilm oluşumunun 1. basamağı Saniyeler sürer Yüzeye reversibl bağlanma vardır, bazı hücreler ayrılabilir Logaritmik çoğalma fazındadır m.o.lar

21 Biyofilm oluşumunun 2. basamağı Birinci basamaktan dakikalar sonra başlar Bağlanma irreversibldir, adezinler rol oynar Bakteriler yüzey adezinleri ile diğer hücrelere de bağlanır

22 Biyofilm oluşumunun 2. basamağı Bu evrede çoğalma devam eder, QS gen aktivasyonu Hücreler arası iletişimi sağlayan kimyasal sinyaller göndermeye başlar (QUORUM SENSING) Sinyal yoğunluğu belli bir düzeye ulaşınca ekzosellüler polimerik madde (EPS: slime) salınımı sağlayan genetik mekanizmalar aktive olur

23 Biyofilm oluşumunun 2. basamağı(devam) Mikroorganizma agregatları oluşur, çevresi matriks ile sarılıdır Matriks yapısının %50-90 nını EPS, kalanı proteinler, edna vb moleküllerden oluşur EPS yapışkan oldukça hidrate bir maddedir, EPS planktonik bakterileri, gıdaları, mineral, kristal, korozyon maddelerini yakalar Giderek bu yapı tabakalar halinde kalınlaşır

24 Biyofilm oluşumunun 3. basamağı Biyofilm kalınlığı 10μm yi aştığında başlar I. Matürasyon basamağı da denir Tipik olarak biyofilm mikrokolonileri %10-25 i bakteri hücrelerinden %75-90 ı EPS matriksten oluşur

25 Biyofilm oluşumunun 4.ve 5. basamağı Biyofilm kalınlığı100μm yi aştığında 4. basamak ve 2. olgunlaşma dönemi denir Biyofilmin 5.basamağında hücre ayrılmaları görülür 4.aşamadan birkaç gün sonradır Bakterilerin bazısı planktonik forma dönüşür Biyofilmi terkeder, yeni yüzeylere doğru yola çıkar Biyofilm bir mikroorganizma yuvasıdır

26 Biyofilm bakterilerinin yayılması Biyofilmden ayrılan bakteriler sadece kan yoluyla değil; Kayarak, Yuvarlanarak, Saçılarak ve Akarak da yakın dokulara yayılırlar 26

27 Biyofilm hareketleri: Koparak ayrılma dışında, kayarak, yuvarlanarak, saçılarak, akarak da yayılır

28 Biyofilm yapısı Biyofilm içindeki bakteri topluluğu serbest yaşayan bakterilere göre farklı bir fenotip çizer Matriks içindeki bakteriler homojen değildir; En alttakiler ölü bakterilerdir Onun üstünde durağan (sesil) diyebileceğimiz açlık sınırında yaşayan yavaş çoğalanlar vardır 28

29 Biyofilm yapısı Onun üzerinde anaerop/mikroaerofil üreyenler En üstte de normal, hızlı üreyenler bulunur Biyofilm yapısı içinde su ve besinlerin dolaştığı küçük kanallar vardır 29

30 Biyofilm oluşumunun şematik çizimi Sarı: Ölü bakteriler, Siyah: dormant bakteriler, Mor: aerop, Kırmızı: anaerop/mikroaerobik

31 Bu kanallar Besinlerin dağıtılmasında Atıkların temizlenmesinde rol oynar Biyofilme ait adeta ilkel bir dolaşım sistemidir 31

32 Biyofilm morfolojisi

33 Biyofilm içindeki m.o.lar Birbiriyle işbirliği içinde İş bölümü yaparak Gıda paylaşımı ile Koordine bir şekilde yaşarlar Kendine ait metabolizması ile biyofilm çok hücreli canlıları taklit eder. 33

34 Safra yolu stendinde biyofilm Kan kültüründeki ile aynı E.coli üremiş Intern J Antimicrob Agents 35 (2010)

35

36 Biyofilm bakterileri Açlık sınırında yaşar Yavaş çoğalır, antibiyotik etkisinden korunur Gıdaları su kanallarından molekül difüzyonu ve sıvı akımı ile temin eder Sıvı akım gücü bakteri üreme kontrolünde rol oynar Çevreye yakın olanlar daha hızlı ürer Çevrelerindeki matriks bunları dış etkilerden korur Antibiyotik Antikor Toksik maddeler

37 Quorum sensing Bakterilerin sosyal bir yaşamları olduğu ilk defa1970 lerin başında bir deniz bakterisi olan Vibrio fischeri üzerinde yapılan çalışmalar sırasında ortaya çıktı

38 Bu bakteride biyolüminesens (biyoışıma) in kollektif bir çalışma ile oluşturulduğu keşfedildi Vibrio fischeri kökenleri yalnız olduklarında ışık üretemeyip ancak çoğalıp belli bir sayıya ulaştıklarında, hepsi birden aynı anda ışık üretmeye başlıyorlar Denizde yaşayan kafadan bacaklı (bobtail squid gibi) canlılar üzerinde

39 Quorum sensing Hücreler arası sinyal sistemi Hücre dışı kimyasal moleküllerle, feromonlarla hücreler arası iletişim ağı Yüzeye tutunan bakteriler çevrede kaç bakteri olduğunu anlayabilir bu sistemle Çevresinde yoğun bakteri olan bir bakteri o topluluğa katılma eğilimi gösterir Hücre dışı enzim ve hücresel lizinlerin üretimini düzenler Biyofilm oluşumunda temel bir rolü var

40 Quorum sensing molekülleri biyofilm oluşumunu düzenler Koloni oluşumunu kontrol eder Üreme hızını düzenler Türler arası iletişimi sağlar Toksin üretiminde rol alır İnvazif özellikleri belirler

41 Quorum sensing Birçok gram negatif Gram pozitif bakteriler İnsan, hayvan ve bitki patojeni tarafından yaygın olarak kullanıldığı anlaşıldı

42 Bakteriler birbirleriyle haberleşme amacıyla 3 tip sinyal molekülü kullanıyor 1. Acyl-homoserine lactones (AHLs) Gram negatif 2. Autoinducer peptides (AIPs) Gram pozitif 3. Autoinducer-2 (AI-2) Gram negatif ve gram pozitif

43 Gram (-) bakterilerin sinyal molekülleri

44

45 Biyofilm enfeksiyonlarının tanısı Tanı sorunludur, enfeksiyon kliniği varsa ve; Kültür negatifse Mikroskopi pozitif kültür negatifse Koloni sayısı az ise Antibiyotik direnci varsa

46 Çıkarılan kateterde biyofilm saptama yöntemleri Kateter ucu Gram boyama (Cooper) Kateter ucu akridin orange boyama Scanning E/M Maki yöntemi

47 Biyofilm gösterme yöntemleri TCP metodu (doku kültürü plak yöntemi) Tüp yöntemi Kongo kırmızısı agar yöntemi Biolimunesans inceleme Reflecting spectroscopy Piezoelektrik sensor

48 Biyofilm içindeki mikroorganizmalar dirençlidir Antimikrobiyal ilaçlar Dezenfektanlar Germisidler güç etkiler

49 Bakteri Antibiyotik Planktonik fenotip MIC/MBC (mg/l) Biyofilm fenotipi MIC/MBC (mg/l) S.aureus NCTC P.aeruginosa ATCC E.coli ATCC Vankomisin 2 (MBC) 20 (a) İmipenem 1 (MIC) > 1024 (b) Ampisilin 2 (MIC) 512 (b) P.pseudomallei Seftazidim 8 (MBC) 800 (c) Streptococcus sangius 804 Doksisiklin (MIC) 3.15 (d) (a): %99 azaltan konsantrasyon, (b): Minumum biofilm eradikasyon konsantrasyonu (c): yaklaşık %99 azaltan konsantrasyon, (d): %99.9 azaltan konsantrasyon Clinical Microb Rev 15(2):167, 2002

50 Acinetobacter baumannii nin biofilm yapan ve yapmayan kökenlerinin aby direnci Indian J Crit Care Med. 2013; 17(4):214

51 Pseudomonas aeruginosa nın biofilm yapan ve yapmayan kökenlerinin aby direnci Indian J Crit Care Med. 2013; 17(4):214

52 Biyofilm içindeki bakteriler Yüzeyde olan bakteriler antibiyotikten etkilenir Derindekiler bir enfeksiyon odağı olarak kalır

53 Neden daha dirençliler? Matrikse aby penetrasyonundaki güçlük Üreme hızının yavaşlaması Biyofilme bağlı fizyolojik değişiklikler 53

54

55

56 Matriks aby difüzyonunu engeller P.aeruginosa enf.da siprofloksasin: Biyofilm yoksa 40sn.de Biyofilm varsa 21 dk.da enf. yerine ulaşır Pseud aljinatını eriten aljinat liyaz eklenirse ulaşım kolaylaşır 56

57 Biyofilm bakterilerinin üreme hızı Bakteri ne kadar hızlı ürerse aby o kadar etkili Bir çalışmada biyofilm içeren balgamda P.aeruginosa üreme hızı 2-3 saat bulunmuştur Yeni (<10 gün) oluşmuş biyofilm bakterileri aby etkisine daha duyarlı Cerrahi profilaksi etkili

58 Fizyolojik çevre değişiklikleri Biyofilm bakterileri stres durumundadır DNA harabiyeti Reaktif oksijen varlığı Osmotik baskı stres yaratır Gıda azlığı Toksik metabolitler

59 Fizyolojik çevre değişiklikleri Stres durumunda gen regülasyonunu sağlayan rpos (RNA polimeraz sigma) genleri aktive olur rpos mikroorganizmanın çoğalması yavaşlayınca aktive olur Aşırı mutasyona uğrayan yeni fenotip ortaya çıkar

60 Fizyolojik çevre değişiklikleri Endojen reaktif oksijen (ROS)yükü artar Enflamasyonla p.n.l lerin ROS maruz kalır Mutasyon artışı aby direncini indükler AmpC tipi beta laktamazlar Beta laktam gyra mutasyonları Kinolon Eflux pompa sistemi artışı Çoklu ilaç eflux pompa sistemi Tobramisin Pmr sistem mutasyonları Kolistin Intern J Antimicrob Agents 35 (2010)

61 Kolistin ve tobramisin Kolistin P.aeruginosa nın bölünmeyen formuna etkili tek aby. Biyofilm yüzeyindekilere etkili olmayabilir, bunlara da kinolonlar etkili İn vitro kolistin+siprofloksasin tüm tabakalara etkili Bu kombinasyon kistik fibrozisli hastalarda da etkili Intern J Antimicrob Agents 35 (2010)

62 Yeşil renk: Canlı bakteriler Kırmızı renk: Ölü bakteriler Intern J Antimicrob Agents 35 (2010) 322

63 Yeşil renk: Canlı bakteriler Kırmızı renk: Ölü bakteriler Intern J Antimicrob Agents 35 (2010) 322

64 Kistik fibrozisli hastada akciğerde P.aeruginosa enf profilaksi ve tedavisi Hijyen ve izolasyon Erken eradikasyon tedavisi Oral siprofloksasin Nebülüze kolistin 3 hafta Nebülüze tobramisin: 3 ay Nebülüze DNaz Sürekli antibiyotikle baskılama tedavisi

65 Biyofilm eradikasyon yöntemleri Mekanik (sonikasyon vb) harabiyet/uzaklaştırma İmmün modülasyon (düşük doz azitromisin, doksisiklin) Lokal antimikrobikler (gümüş veya tobramisin) Biyofilm penetrasyonu iyi olan ilaçlar (Örn: Rifampisin (kombine), daptomisin, ekinokandinler

66 Biyofilm varlığında aby tedavi süresi daha uzun mu olmalı? Olgun bir biyofilm tabakası çıplak gözle bile görülebilen yapışkan bir oluşumdur Biyofilm varlığında enfeksiyonun sadece aby tedavisi ile iyileşmesi olanaksızdır 66

67 Biyofilm varlığında aby tedavi süresi daha uzun mu olmalı? Tedavide enfeksiyonun yerine göre Örn; Kateter varsa çıkarılması Diyabetik ayak ve diğer deri yumuşak doku enfeksiyonlarında cerrahi debridman Yabancı cismin çıkarılması, uzaklaştırılması gerekir 67

68 Biyofilm varlığında aby tedavi süresi daha uzun mu olmalı? Bazan da kalıcı kateterlerin ve biyomedikal protezlerin çıkarılması olanaksızdır Her iki durumda da biyofilm varlığında aby tedavi süresi daha uzundur 68

69 Quorum sensing inhibisyonu için kullanılan stratejiler Sinyal molekülünün (AHL autoinducer) üretiminin önlenmesi Sinyal molekülünün yıkılması ( AHL sinyal molekülünün hidrolizi) Sinyalinin alınmasının önlenmesi (LuxR- Tipi reseptör proteine bağlanacak analogların geliştirilmesi)

70 QS inhibitörleri 1- Doğal İnhibitörler 2- Sentetik Analoglar 3- Bazı İlaçlar

71 QS inhibitörleri P.aeruginosa QS molekülleri; Azitromisin ve siprofloksasin sub inhibitör dozlarında inhibe ediliyor Bu iki aby kistik fibroziste kombine kullanılıyor Sarımsak ekstraktları dirençli biyofilm bakterilerini antibiyotiklere duyarlı hale getiriyor

72

73 1- Doğal İnhibitörler Gram-negatif bakterilerde çevreyi algılama sistemini bloke ettiği tespit edilen ilk bileşik, kırmızı bir deniz algi olan Delisea pulchra dan izole edilen halojenlenmiş furanonlardır.

74 Patulin Penicillic asit 4-nitro-pyridine-N-oxide (4-NPO) cinnamaldehyde vanillin catechin sarımsak özütü p-coumaric acid gibi birkaç doğal bileşiğin daha Gram-negatif bakterilerin çevreyi algılama sistemini etkilediğini rapor edilmiştir.

75 Ancak bu bileşiklerin çoğunun ya toksik olmaları ya da tolere edilebilir dozlarda etki gösterememeleri nedeniyle insan kullanımına çok uygun olmadıkları görülmüştür.

76 2- Sentetik Analoglar ve Sentetik Bileşikler Hücreler arası iletişimi sağlayan sinyalin alınmasını önlemek amacıyla reseptöre (LuxR karşı yarışan sentetik moleküller P. aeruginosa sinyal molekülü

77 Bilgisayar destekli molekül dizaynı ile QSI molekül taraması çalışmaları ile yapısal olarak AHL lara benzerlik göstermeyen bazı moleküllerin de bazı bakteri türlerinde QS sistemini inhibe ettiği görülmüştür.

78 3- Bazı Bilinen İlaçlar İlaç pazarındaki bazı ilaçların kullanımlarına neden olan biyolojik etkilerine ilave olarak quorum sensing aktivitesine de sahip olduları gösterilmiştir Bazı makrolid ve non-makrolid antibiyotiklerin sub-mic değerlerinde, Gram (-) bakterilerin quorum sensing sistemi üzerine etkileri bildirilmiştir Salicylic acid, nifuroxazide ve chlorzoxazone un P. aeruginosa quorum sensing sistemini inhibe ettiği görülmüştür.

79 Tobramycinin, P. aeruginosa da elastaz üretimini azalttığı gözlenmiştir. Bilinen ilaç moleküllerinin bakteriyel QS üzerindeki etkileri onların farklı medikal uygulamalarda kullanılma potansiyelleri olduğunu göstermektedir

80 Eğer insan kullanımına uygun QS inhibitörler geliştirilebilirse, bu moleküllerin antibiyotiklerden farkı ne olacak? Üremeyi direk olarak etkilemeyeceklerinden, dirençli bakterilerin gelişimine neden olmayacakları, konakta mevcut faydalı bakteri komünitelerini yok etmeyecekleri umulmaktadır.

81 QS inhibitörlerinin mevcut antibiyotiklerle birlikte kullanılarak onların etkisini artıracakları ve raf ömrünü uzatacağı umulmaktadır.

82

83

84 TEŞEKKÜR EDERİM.