Daha Đyi Bir Kesit Daha Đyi Bir Boya. Prof.Dr.Öner Doğan Đstanbul Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı

Transkript

1 Patoloji laboratuvarını kurduk: (Daha) Đyi bir kesit ve yayma için i in ne yapmalıyız? 8-99 Mayıs s 2010, ĐZMĐR Bu sunumda yer alan resimler yazarın n izni olmadan kullanılamaz. lamaz.

2 Daha Đyi Bir Kesit Daha Đyi Bir Boya Prof.Dr.Öner Doğan Đstanbul Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı

3 Mikrotom Kesit Sırasındaki Olumsuzluklar Đyi bir mikrotomi kaliteli bir kesitin olmazsa olmaz aşamasıdır Çok sayıda, farklı kategoride olumsuzluklar sıralanabilir Bazı nedenler sınıflandırılamayabilir Bazen nedenin saptanması veya giderilmesi mümkün olmayabilir Đyi bir kesit alma işlemi için 1-Çok iyi şekilde tesbit ve takip edilmiş kesime uygun bir parafin içine gömülmüş ve uygun şekilde soğutulmuş doku bloğu 2-Uygun bir mikrotom 3-Dokunun ve mikrotomun titreşimsiz bir bütün oluşturması. 4-Kaliteli uygun ve keskin bir bıçak 5-Tecrübeli, sabırlı, dikkatli teknisyen 6-Diğer aksesuvar ürünler ve faktörler.

4 Mikrotom Kesit Sırasındaki Olumsuzluklar Olumsuzlukların nedenlerini gruplamak gerekirse 1-Mikrotom kesit aşamasına kadar geçen sürece ait olumsuzluklar 2-Mikrotoma ait olumsuzluklar 3-Mikrotom aksesuvarlarına ait olumsuzluklar 4-Teknisyene ait olumsuzluklar Bu konudaki en önemli olumsuz etken Tecrübesiz veya beceriksiz/eğitilemez veya isteksiz teknisyen Nasıl anlaşılır? Genellikle yüzüne bakarak Nasıl önlenir? Đşten kovarak Nasıl giderilir? Başka bir teknisyene kestirilerek Konu insan kaynakları konusuna giriyor. Hiç sevmediğim bir konudur.

5

6

7 Mikrotom Kesit Sırasındaki Olumsuzluklar Bloğun yeterli düzeyde sabit tutulamaması Blok, blok yuvasına tam olarak oturmamıştır. Kaset standartlardan küçüktür. (Korsan kasetçilik sektörü) Kaset yeterince sert değildir (Oynak kasetçilik sektörü) Kaset ile kaset yuvası arasında parafin artığı vardır.(tıraşsız kaset sektörü) Mikrotom kaset yuvası formunu yitirmiştir (Sıkıştırma vidası yalama, deforme) Teknisyen bloğu iyi yerleştirmemiş, vidayı iyi sıkmamıştır.(dalgacı teknisyen) Dokunun ileri derecede sert olması, klasik mikrotom kesitine uygun olmaması Nasıl anlaşılır Teknisyelerin kesim ve bakım sırasındaki gözlemleri Kesit sırasında kesitlerin düzensiz kalınlıkta gelmesi (Đnce/kalın) Bir kesitin değişik kalınlıkta şeritler halinde gelmesi (Ekoseli kesit) Mikroskopta venedik panjuru artefaktı Nasıl önlenir Kaset satın alırken korsana dikkat et Kaset kenarlarındaki parafin kalıntılarını tıraşla, yuvayı temiz tut Kaset tutucuya nazik davran periyodik muayenesini yap, gerekirse emekli et Teknisyenle görüş, sarı kart (x2), kırmızı kart Doku ile görüş, doğrudan kırmızı kart

8

9

10

11

12 Mikrotom Kesit Sırasındaki Olumsuzluklar Bıçağın yeterince sabit olmaması Nedenleri nelerdir Baskı-sıkıştırma plakaları deformedir (Çarpma, düşürme) Bıçak yuvası kirlidir (parafin kalıntıları), bıçak tam oturmamıştır Bıçak sıkıştırma mandalı ve sıkıştırma mekanizması yetersizdir Bıçak taşıyıcı sistemi sabitleyen mekanizmalarda aksaklık vardır Teknisyen, sistemi sabitleyen işlemleri yapmayı ihmal etmektedir Bıçak, yuvaya uygun değildir, standarttan daha incedir Doku, bu mikrotomla kesilemeyecek derecede serttir. Nasıl anlaşılır Teknisyelerin kesim ve bakım sırasındaki gözlemleri Kesit sırasında kesitlerin düzensiz kalınlıkta gelmesi (Đnce/kalın) Bir kesitin değişik kalınlıkta şeritler halinde gelmesi (Ekoseli kesit) Mikroskopta Venedik panjuru artefaktı Nasıl önlenir Đlgili parçaların günlük ve periyodik bakımlarla kontrol edilmesi, bakılması Teknisyenle görüş, sarı kart, kırmızı kart (2xsarı, doğrudan) Doku ile görüş, faklı mikrotom/farklı bıçak, high profil bıçak, doğrudan kırmızı

13

14

15

16

17 Mikrotom Kesit Sırasındaki Olumsuzluklar Kesit kalınlığının değişkenlik göstermesi, ince kesit alamama, kesitin hiç gelememesi Nedenleri nelerdir Pekçok neden olabilir, mikrotomi işleminden kaynaklananlar şunlardır. Mikron ilerletme mekanizmasındaki kalıcı hatalar Mikron ilerletme mekanizmasının kalibrasyon yetersizliği Ortam sıcaklığındaki değişikliklere bağlı olarak bloğun genleşmesi/ büzülmesi Nasıl anlaşılır Kesit sırasında veya mikroskop başında gözlemle anlaşılır Bir türlü kesit gelmez (ilerletme mekanizması çalışmıyor) Đnce kesit hiç alınamaz (ilerletme mekanizmasında hata) Düzensiz kalınlıkta kesitler (ilerletme mekanizmasında hata) Zamanla kesitin kalınlaşması (bloğun ısınması) Kesitin giderek incelmesi veya alınamaması (bloğun buz ile soğutulmuş olması) Nasıl önlenir-giderilir Mikrotom bakımında mikron ilerletme fonksiyonlarının kontrolü, ayarlanması Blok sıcaklığının değişimlerinde duruma göre davranılması (Bloğu soğut)

18 Mikrotom Kesit Sırasındaki Olumsuzluklar Bıçağın dayanıksız olması Neden kaynaklanır Bıçağın üretim/pazarlama aşaması ile ilişkili sorunlar (tüketim ekonomisi, rekabet, tekelcilik, kar vb) Bıçağın türü ile kesilecek dokunun uyumsuz olması (Bıçak açısı, yüzey kaplama malzemesi vb) Kesim açısının uygunsuz olması, (sert dokuların kesiminde yüksek kesim açısı kullanımı) Bıçak açısının düşük olması (22º bıçak açılı bıçaklar) Traşlama işleminin hatalı yapılması (Blok ilerleme eylemi ile kesi vurusu eylemi aynı anda) Blok ve bıçağın yeterince sabit olmaması Nasıl anlaşılır Bıçak başına düşen kesit/blok sayısı alışılmışın altındadır Alışılmış nedir? (her laboratuvara, teknisyene, doku ve takip özelliklerine göre değişir) Nasıl önlenir-giderilir Bıçak firmasına telefon et, farklı üretim serili ürünleri iste Doku türüne uygun bıçak kullanın Kesim açısını değiştirin Bıçak açısı yüksek bıçak kullanın Traşlama işlemimi kurallara uygun yapın Bıçak ve bloğun sabitliğinden emin olun Traşlama ve kesim için bıçağın farklı kısımlarını kullanın

19 Mikrotom Kesit Sırasındaki Olumsuzluklar Kesitin çok kırışık- katlı gelmesi suda yeterince düzgün açılamaması Nedenleri nelerdir Tesbit-takip ile ilişkili nedenler söz konusudur Aşırı ince kesmeye çalışıyorsun Bıçağın körlenmiştir Kesim açısı çok düşüktür. Bıçak açısı fazladır Bıçak türü uygun değildir Doku serttir. Doku çok kurudur Parafin gereğinden fazla yumuşaktır Parafinin elastikiyet derecesi yetersizdir. Ortam sıcaklığı yüksektir; bıçak, blok ve kesit kaydırma plakası ısınmıştır Bıçak veya kaydırma plakasında kesitin açılmasını engelleyen kalıntı vardır Kesim vuru hızı uygun değildir(genellikle yavaştır)

20 Mikrotom Kesit Sırasındaki Olumsuzluklar Kesitin çok kırışık- katlı gelmesi suda yeterince düzgün açılamaması Nasıl önlenir-giderilir Tesbit-takip ile ilgili sorunları gider Kesiti çok ince almaya çalışıyorsun, kendini kanıtlamaktan vazgeç Đnad etme bıçağı değiştir Kesim açısını arttır Bıçak açısı düşük bıçak dene (22º) Kullandığın bıçak türünü değiştir Sert dokulara uygun mikrotomda dene Doku çok kuru ise buz sür, gliserol sür Parafini buzla soğut. Uygun parafin kullan Daha elastik parafin kullan Parafini, bloğu, plakayı, ortamı soğut Bıçak ağzı ve kaydırma plakasını temiz tut Kesim vuru hızını değiştir Kesitin başlangıç ucu pensetle tutulup kesit yukarı geriye kaldırılır Suda açma işleminde alkolve yüzey gerilimini azaltıcı sistemler kullan

21 Sert, kırılgan parafin; kesitte ince çatlaklar

22 Kenarları traşlanıp kesit yapmaya hazır hale gelmiş blokların kesim anına kadar soğuk olarak muhafazası önerilir

23

24

25

26

27

28 Mikrotom Kesit Sırasındaki Olumsuzluklar Kesitin rulo oluşturacak şekilde gelmesi Neden Kaynaklanır Kesim açısı; doku türü, parafin sertliği ve vuru hızı açısından gereğinden fazladır Parafin gereğinden fazla yumuşak Ortam, parafin gereğinden fazla sıcak Kesit gereğinden fazla kalındır Nasıl anlaşılır Gelen kesit kendi üstüne dönerek rulo yapma eğilimi gösterir Nasıl önlenir-giderilir Kesim açısını azalt Daha ince kesit al

29 Mikrotom Kesit Sırasındaki Olumsuzluklar Seri kesit/kurdale kesit alınamaması Nedenleri nelerdir Tesbit ve takip ile ilgili sorunlar Blok kenarlarının birbirine paralel olmaması Traşlamanın asimetrik olması, bloğun üst ve alt kenarların paralel olmaması Bıçak kenarının kirli olması Blok kenarlarının pürüzlü oluşu Kesit kaydırıcı plakanın kirli, pürüzlü veya sıcak olması Bıçakta hata (pürüzlü, deforme, körleşmiş odak) Parafin özelliğinin seri kesit almaya uygun olmaması Ortam sıcaklığının ve parafinin özelliğinin seri kesit için uyumsuz olması Kesim açısının fazla veya az olması Mikrotomda retraksiyon fonksiyonunun olmaması Kesitlerde statik elektrik vardır, kesit geri dönen bloğa yapışır, kesit dizisinden ayrılır Kesit alma hızının ve vuru hızının uygun olmaması

30 Mikrotom Kesit Sırasındaki Olumsuzluklar Seri kesit/kurdale kesit alınamaması Nasıl önlenir-giderilir Tesbit ve takip ile ilgili sorunları çöz Blok kenarları birbirine paralel değilse bisturi ile düzelt Traşlamatı derinleştir veya blok düzlemini bıçağa göre düzelt (x-y düzlemi) Bıçak kesim kenarını temiz tut Blok kenarlarındaki parafin kalıntılarını temizle Kesit kaydırıcı plakanın yüzeyini temizle ve soğut Bıçağın yerini değiştir veya yeni bıçak tak Parafin cinsini değiştir. Daha elastik daha yumuşak parafin seç Ortam ve blok sıcaklığının aşırı düşük olmaması gerekir, bloğu parmakla?! Kesim açısını düzelt Retraksiyon fonksiyonu olan mikrotom kullan Mikrotomu toprakla, ortamı nemlendir, odayı ionize eden klima sistemi kullan sakin ol, plastik ayakkabı giyme, bunzen beki kullan Kesit alma hızı ve vuru hızını değiştirerek denemeler yap

31 Mikrotom Kesit Sırasındaki Olumsuzluklar Kesitin çizikli-yarıklı gelmesi Nedenleri nelerdir Bıçak körelmiştir, çentiklenmişti, çapak vardır, Bıçağın üretimi hatalıdır Dokuda sert partiküller vardır: (kalsiyum, kemik, kıkırdak, yabancı cisim vb) Parafin içinde yabancı partiküller vardır Nasıl anlaşılır Kesit yaparken veya mikroskopik inceleme sırasında anlaşılır Bıçak kesim yüzeyinin homojen olmayışına bağlı artefaktan nasıl ayrılır. Nasıl önlenir-giderilir Bıçağı kaydır, yeni bıçak tak Bıçağın seri numarasını kaydet, üretici firmaya bildir, bıçağı değiştir Partikülü dokuya fazla zarar vermeden çıkart veya traşlayarak derinleş, Mümkün değilse asit uygulaması veya geri takiple asit uygulaması yap Yabancı partikülü çıkart, traşlayarak derinleş, temiz parafin kullanarak yeniden göm

32

33 Mikrotom Kesit Sırasındaki Olumsuzluklar Kesitte Venedik panjuru artefaktı Neden kaynaklanır Blok mikrotoma sıkıca yerleşmemiştir (blok sabit değildir) Bıçak ve/veya bıçak tutucu sabit değildir Doku mevcut mikrotom ile kesilemeyecek derecede serttir Nasıl anlaşılır Mikroskopik incelemede dokunun, kesim doğrultusuna dik, birbirine paralel ince ve kalın şeritler halinde görülmesi ile anlaşılır Nasıl önlenir-giderilir Mikrotomun blok yuvası, blok tutucusu, bıcak tutucu sistemi kontrol edilmeli Blok ve bıçağın sabit olarak sisteme monte edilmesini önleyen etkenler giderilmeli

34 Mikrotom Kesit Sırasındaki Olumsuzluklar Kendinden şeritli (birbirine paralel ince-kalın şeritler halinde) kesit Nedenleri nelerdir Bıçak kesim kenarının homojen kalınlıkta olmaması (üretim/kaplama hatası) Dokuda sert ve yumuşak alanların yan yana/ard arda dizi halinde bulunması Nasıl anlaşılır Bıçak hatasında, kesim doğrultusuna paralel seyreden ince ve kalın kesim şeritleri Doku sertlik heterojenitesinde kesim doğrultusuna dik veya paralel seyreden ince ve kalın kesim şeritleri gözlenir Nasıl önlenir-giderilir Bıçak değiştir, bıçak türünü değiştir Mümkünse ek kaplamalar içermeyen bıçak kullan Dokunun yapısına bağlı olgularda kesim açısını düşür, bloğun mikrotomdaki pozisyonunu değiştir (genellikle 90º) Başarılı olunamazsa sert dokuların kesimine uygun parafin (plastik gömme ) ve mikrotom kullan

35

36 Bu dokuya neler olmuş

37 Kesitin sudan alma aşaması ile ilgili olumsuzluklar Nedenleri nelerdir Su sıcaklığının gereğinden yüksek olması Su sıcaklığının gereğinden düşük olması Su banyosunun yabancı kesitlerle kontamine olması Suyun kirli olması Parafinizasyon yetersizliği nedeniyle nedeniyle kesitin dağılması Nasıl anlaşılır Kesit suya atıldığı anda dağılır, bütün halinde lama alınamaz Kesit yeterince açılamaz, açılma süresi uzundur,lama alınan kesit kırışıktır Mikroskopta yabancı-ilişkisiz kesitler görülür, tanı hatasına yol açabilir Mikroskopta, özellikle müsinöz alanlarda pigmet birikimleri Kesit dağılır, parafin ve doku bütün halde kalamaz Nasıl önlenir-giderilir Su sıcaklığını düşür Su sıcaklığını arttır veya alkolle açma yöntemi kullan veya sabret Her kesit alımından sonca su yüseyini filtre ederek temizle Filter edilmiş su, distile su kullan, mikrobiyolojik üremelere karşı timol kristali Takip ve parafinizasyon hatası var, geri takip yap

38

39

40 Kesitin kurutulması aşamasındaki olumsuzluklar Nedenleri nelerdir Nemli kesitlerin yüksek sıcaklıktaki inkübasyon etüvlerine konması Nemli kesitlerin sıcak plakalarda kurutulması Aşırı yüksek sıcaklıkta kurutma Kurutma süresinin yetersiz olması, kurutmanın yetersiz yapılması Nasıl anlaşılır Mikroskopta kesitte buharlaşma, nukleuslarda bubbling artefakları Benzer artefaklar daha belirgin olarak görülür, toz kontaminasyonu, ksilenler çabuk kirlenir Kavrulma artefakları Kesitin iyi yapışmaması, boya sırasında dökülme artefakları Nasıl önlenir-giderilir Kesitler öncelikle oda sıcaklığında eğik pozisyonda bekletilmeli Đnkübasyon etüvlerinde değil, kurtma etüvlerinde kurutulmalı Kurutma için yeterli süre ayrılmalı, kesit yüzeyinde nem kalmamalı

41 Kesitlerin Kurutulması Sudan lam üzerine alınankesitler dik konumda, oda sıcaklığında dakika bekletilerek yüzeyindeki suyun sızması beklenir Daha sonra 35-40ºC derecedeki kurutma etüvlerine alınır.

42 Kesitlerin Kurutulması Patoloji laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılan ve etüv olarak adlandırılan cihazlar aslında sıcak hava inkübatörleridir ve parafin kesitlerin kurutulması işlemine tam olarak uygun değildir.

43 Yüksek sıcaklıkta hatalı kurutma artefaktı

44

45 Kesitlerin deparafinizasyonu aşamasındaki olumsuzluklar Nedenler nelerdir Parafinin tam olarak giderilememiştir yetersiz ksilen inkubasyon süresi yetersiz ksilen banyo sayısı, kirli ksilen, kalitesiz ksilen kötü parafin Nasıl anlaşılır Lam absolu alkole girildiğinde kesit yüzeyinde parafin kalıntıları fark edilir Boya homojen olmaz, lekeli olur boyanmayan veya yetersiz boyanan yama tarzında alanlar olur ya da tüm kesit yetersiz düzeyde boyanır-boyanmaz. Nasıl önlenir-giderilir Yeterli sayıda ve yeterli sürede ksilen banyosu kullan Ksilenler temiz ve kaliteli olmalı Kullanılan parafin yeterince saflaştırılmış olmalı, katkı maddeleri ksilende erimeli Erken saptanırsa ksilen inkubasyonuna geri dön

46 Hidrasyon aşaması ile ilişkili olumsuzluklar Nedenleri nelerdir Su bazına girmeden önce preparattaki ksilenin tamamen giderilmesi gerekir Ksileni giderecek aşama absolü alkol istasyonlarıdır Absolü alkol istasyon sayısı yetersizse Absolü alkol inkübasyon süresi yetersizse Absolü alkol kirli ise, absolü özelliğini yitirmişse Preparat yüzeyindeki ksilen giderilemez Nasıl anlaşılır Kesit suya geldiğinde preparatın yüzeyinin damlacıklar halinde yer yer yağlı(ksilenli)olduğu görülür Ksilenin giderilemediği alanlar boya ile boyanmaz, mikroskopta boyanmamış benek şeklinde alanlar halinde izlenir Nasıl önlenir-giderilir Giriş alkollerinin ilk ikisi mutlaka absolü alkol olmalı, sık sık yenilenmeli Absolü alkol süreleri yeterli olmalı Suya girerken kesit yüzeyi kontrol edilmeli, ksilen artığı varsa absolü alkole geri dönülmeli, temiz absolü alkolde yeterince beklenmeli

47 Hidrasyon aşaması ve su ile ilişkili sorunlar Nedenleri nelerdir Suyun çok fazla miktarda metal-ion-partikül içermesi Suyun ph sının aşırı yüksek veya aşırı düşük oluşu Nasıl anlaşılır Suyun makroskopik görünümü Mikroskopta bazı doku ve hücrelerde yoğunlaşan partiküller Bu partiküller bazı yanlış yorumlara yol açabilir Partiküllerin hangi aşamadan geldiğini nasıl anlarım ph uyumsuzlukları dokunun dökülmesini kolaylaştırabilir ph uyumsuzlukları hematoksilen ve eosine olan afiniteyi bozar Nasıl önlenir-giderilir Kullanılan suyun kimyasal analizi yapılabilir Bu analize göre, filtre edilmiş su kullanmaya çalış Su kötü veya standardı düşükse, değişkense distile su kullan

48 Hematoksilen aşaması ile ilişkili sorunlar Amaca uygun olmayan hematoksilen seçimi Nedenler nelerdir Sitolojik materyal için yoğun hematoksilen kullanımı Hematopatolojik materyalde yoğun hematoksilen kullanımı Rutin çalışmalarda zayıf hematoksilen kullanımı Dekalsifikasyonu uygulanmış dokuda, asidik fiksatifle, eskimiş formalinle fikse dokularda kimyasal oksidasyonlu hematoksilen kullanımı Nasıl anlaşılır Hematoksilen kontrastlığı çok fazladır Hematoksilen kontrastlığı çok fazladır Hematoksilen kontrastlığı yetersizdir Hematoksilen kontrastlığı yetersizdir Nasıl önlenir-giderilir Sitolojik ve hematopatolojik materyal için Mayer, Gill I vb kullan Rutin çalışmalarda Harris, Gill II-III kullan Asidik dokularda doğal oksidasyonlu hematoksilen kullan

49 Hematoksilen aşaması ile ilişkili sorunlar Aşırı okside hematoksilen kullanımı Nedenleri nelerdir Oksidasyon sağlayan kimyasalların miktarı fazladır Okside edici kimyasal katıldıktan sonra geçen süre fazladır (eskimiş hematolsilen) Hematoksilenin ışık ve hava ile temas süresi fazladır (eskimiş hematoksilen) Nasıl anlaşılır Hematoksilenin boyama gücü azalmıştır, istenen kontrastta boyanma olmaz Yüzeyde oksidasyon tabakası oluşur Nasıl giderilir-önlenir Hematoksilen hazırlarken tartımlara dikkat et Okside edici kimyasalları kaliteli ürünlerden seç Hazırladıktan sonra en çok bir ay içinde tüket, her ay hematoksilen hazırla Hazırlanmış hematoksileni ışık ve hava ile temastan mümkün olduğunca koru Hematoksileni her gün süz

50 Hematoksilen aşaması ile ilişkili sorunlar Hematoksilen kontrastlığının düşük olması, zayıf boyanma Nedenleri nelerdir Otolize uğramış doku Yetersiz fiksasyon, asidik formalin fiksasyonu, kötü fiksasyon Aşırı dekalsifikasyon Kesit aşırı derecede incedir Kesit yeterince deparafinize edilmemiştir Preparat boya öncesi suda yeterince yıkanmamış, alkol tam olarak giderilmemiştir Uygun olmayan hematoksilen ve boyama sistemi kullanılmaktadır Hematoksilenin boyama gücü azalmıştır (kalıtesiz, fazla okside, eski, çok kullanılmış) Boyama süresi yetersizdir. Morartma işlemi yetersiz yapılmıştır Yıkama suyunda veya çıkış serilerinde dekolerasyona yol açan özellikler vardır Destaining işlemi gereğinden uzun veya şiddetli yapılmıştır. Nasıl anlaşılır Tümünde ortak sonuç, hematoksilen kontrastlığının zayıf-yetersiz oluşudur. Bazı özelliklere bakılarak ve kontroller yapılarak yukarıdaki sebepler araştırılır

51 Hematoksilen aşaması ile ilişkili sorunlar Hematoksilen kontrastlığının düşük olması, zayıf boyanma Nasıl önlenir-giderilir Otolize izin verme Yeterli, kaliteli fiksasyon yap Dekalsifikasyonu nazik yap Kesit çok ince ise hematoksilen süresini normalden daha uzun tut Kesitte parafin artığı var mı bak, deparafinizasyonu dikkatli yap Hematoksilene girmeden önce preparatın tam olarak su fazına gelmesine dikkat et Uygun bir hematoksilen ve boyama sistemi seç (Harris, Gill II-III) Hematoksileni değiştir Hematoksilen süresini arttır Yıkama suyunu alkali yap (Scott çözeltisi, amonyaklı su, lityum karbonat) Yıkama suyunu kontrol et, dekolere edici nitelikte ise bu özelliklerini gider Çıkış serilerinde dekolerasyona yol açaçak ortamları gider Destaining işleminin süresini kısalt, asit oranını düşür, alkol bazlıları tercih et, alkol oranını arttır

52 Đnce kesit Kalın kesit

53 Đnce kesit, hematoksilen kontrastı zayıf Kalın kesit hematoksilen kontrastı fazla

54 Đnce kesit, hematoksilen kontrastı zayıf Kalın kesit hematoksilen kontrastı fazla

55 Hematoksilen aşaması ile ilişkili sorunlar Hematoksilen kontrastlığının fazla olması, aşırı boyanma Nelerden kaynaklanır Koter artefaktları Dokunun takip sırasında aşırı ısıya maruz kalması Kesitlerin yüksek sıcaklıklara uzun süre maruz kalması Kesitlerin hematoksilene girmeden önce havada kurumuş olması Kesitin kalın olması Hematoksilenin çok kuvvetli olması Boyama süresinin uzun olması Destaining işleminin yetersiz yapılması Kesit yapıştırıcı maddenin aşırı kullanımı Zamanla yüzeyde oluşan metalik tabakanın yarattığı boyanmalar. Nasıl anlaşılır Ortak sonuç nükleus ayrıntılarının incelenmesine olanak tanımayan koyu boyanmadır. Bazen nukleus dışı alanlarda ve lam üzerinde de boyanma vardır Nedeni işaret eden bazı özellikler saptanabilir, koyu boyanmanın nedeni spesifi olarak anlaşılabilir.

56 Hematoksilen aşaması ile ilişkili sorunlar Hematoksilen kontrastlığının fazla olması, aşırı boyanma Nasıl önlenir-giderilir Cerrahlara söyleyin aşırı koter kullanmasınlar (Emriniz olur komutanım, başüstüne) Dokuları, özellikle küçük dokuları aşırı yüksek sıcaklıkta takip etme Kesitleri kuruturken aşırı yüksek sıcaklık kullanma Hematoksilene girmeden önce kesitlerin kurumasına izin verme Đnce kesit almaya çalış (Đnce kesit alamazsa hileye başvur, hematoksilen süresini azalt, kesitin inceymiş gibi görünsün) Hematoksilenin boyama gücü fazla, boyama süresini azalt, destaining i arttır Boyama süresini kısalt Destaining işleminin süresini arttır, asit oranını, su oranını arttır Pozitif elektrik yüklü lam kullan Boya yüzeyindeki metalik tabakayı gider

57 Boyanın Havadan /Sudan nedenlerle kötü olması Nedenleri nelerdir, nasıl anlaşılır Boyanın kötülüğü bazen açıklanamaz Bugün hava çok sıcaktı, bugün hava çok soğuktu Bugün benim havam iyi değildi, bugün makinanın havası yok Bugün sular kötüydü Çoğu zaman bahanedir, bazen gerçeklik payı olabilir. Suda aşırı demir bulunması Demir morartıcıdır. Hematoksilen beklenenden koyudur. Kesitte granüler artefak Suda aşırı sülfür varlığı Ağartıcıdır. Kesit suda morarmaz rengi açılır Suda aşırı klorür, florür, ozon vb dekolorizan madde bulunması Ağartıcıdır, kesit suya girince morarmaz rengi açılır Dokuda aşırı miktarda partiküllü madde, metal ve diğer iyonların varlığı Mikroskopta artefak kristaloid veya amorf granüller bulunur Suyun asidik phda olması Ağartıcidır, kesit suya girince morarmaz rengi açılır Suyun phsının yüksek olması Kesitlerin lamdan dökülmesine yol açar

58 Morartma/mavileştirme aşaması ile ilişkili sorunlar Mavileştirme işlemi nedir, ne değildir Mavileştirme işleminin yetersiz yapılması Nedenleri nelerdir Kullanılan çözeltinin phı yeterince alkali değildir Đşlemin çok kısa yapılması Nasıl anlaşılır Kesitin rengi mavileşmemiştir, kızıl-mor renktedir Mikroskopta, hematoksilen kontrastlığı yetersizdir, renk istenen mavilikte değildir Nasıl önlenir-giderilir Kullanılan suyun veya morartma çözeltisinin phı 8 en az 8 düzeyinde olmalıdır Musluk suyu bu işlem için yetersiz veya standart değilse Scott çözeltisi, amonyaklı su, Lityum karbonatlı su kullan Đşlemin süresi bir miktar uzatılabilir

59 Morartma/mavileştirme aşaması ile ilişkili sorunlar Mavileştirme işleminin gereksiz yere fazla yapılması Nedenleri nelerdir Mavileşmenin artması umudu ile işlemin gereksiz yere uzatılması. Mavileşmenin gerçekleştiği noktadan sonra işleme devam edilmesi yarar sağlamaz Mavileşmenin, hematoksilen kontrastlığının artmasını sağlamaz Su-mavileştirme çözeltisinin phı gereğinden fazla yüksek Su-mavileştirme çözeltisinin phı mavileşme sağlayamayacak derecede düşük Nasıl anlaşılır Mavileşme artmaz Kesitte dökülmeler başlayabilir Nasıl önlenir-giderilir Asıl neden kesitteki hematoksilen miktarının azlığıdır. Buna yol açan nedenleri gider Mavileştirme çözeltisinin phsını ayarla Mavileştirme işleminin süresini gereksiz yere uzatma

60 Renk giderme işlemi ile ilgili sorunlar Aşırı hematoksilenin asidik çözeltiler ile giderilmesi işlemidir Đşlemin aşırı düzeyde yapılması Nedenleri nelerdir Çözeltinin asit konsantrasyonu yüksektir. Çözelti agresif asitlerle yapılmıştır Alkol bazında hazırlanan çözeltilerde su oranı yüksektir. Uygulama süresi uzundur. Dekolorasyon çözeltisi daha sonra yeterince yıkanıp giderilmemiştir. Nasıl anlaşılır Çözeltiden çıkılınca mavilik istenenden fazla düzeyde azalmıştır Mikroskopta hematoksilen yetersizliği vardır Đşlem çok uzun ve agresif yapılmışsa kesit dökülmeleri olabilir. Nasıl önlenir-giderilir Asit konsantrasyonu düşürülür Daha yumuşak asitler kullanılabilir(asetik asit) Alkol bazlı çözeltiler kullanılır veya alkol oranı arttırılır Süre kısaltılır Çözeltiden çıkıldıktan sonra yıkama çözeltisinde asit artıkları iyice giderilir

61

62

63 Renk giderme işlemi ile ilgili sorunlar Yetersiz renk giderme işlemi Nelerden kaynaklanır Asit konsantrasyonu düşüktür, çözelti eskimiştir Uygulama süresi kısa Slide üzerinde aşırı albumin/ jelatin vardır. Alkol bazlı çözeltilerde alkol konsantrasyonu yüksek/su oranı düşüktür Nasıl anlaşılır Kesit gereğinden fazla (koyudur)koyu mavidir Mikroskopta nükleuslar çok koyudur, kromatin-nukleolus ayrıntısı seçilemez Nukleus dışı kompartmanlarda, hematoksilenin boyamaması gereken yerlerde lamın kesit dışı alanlarında hematoksilen boyanmaları gözlenir Nasıl önlenir-giderilir Çözeltinin konsantrasyonu arttırılır, çözelti yenilenir Uygulama süresi uzatılır Lam kaplama işlemi hatalıdır, sudan kesit alma banyo suyu hatalıdır, lma kontaminedir, temiz değildir. Lamları değiştir Renk giderme çözeltisinde su oranını arttır, alkol oranını düşür.

64 Renk giderme işlemi ile ilgili sorunlar Aşırı renk giderme işlemi Nelerden kaynaklanır Asit konsantrasyonu yuksektir Uygulama süresi uzundur Çözelti tamamen su bazlıdır veya alkol oranı düşüktür Nasıl anlaşılır Kesitin rengi istenenden daha fazla açılmıştır-solmuştur, uçuk mavidir Mikroskopta nükleuslar zayıf boyanmıştır, kontrastlık yeterli değildir Nasıl önlenir-giderilir Çözeltinin konsantrasyonu azalt Uygulama süresi kısalt Renk giderme çözeltisinin su azalt, alkol oranını arttır.

65 Eosin boyama ile ilgili sorunlar Eosin kontrastlığı-yoğunluğu patoloğun tercihine ve vakanın özelliklerine göre laboratuvardan laboratuvara değişkenlik gösterir Eosine Y (eosine yellowish, watersol.) Ethyl eosine (eosine s, alcohol sol.) Eosine B (eosine bluish, erythrosin B) Eosin boyanmanın istenilen düzeyden fazla olması Nedenleri nelerdir Kesit kalındır Boyanma süresinin uzun olması Eosin ph ının çok düşük olması Boyanın kuvvetli-konsantre olması (hazırlama şekli veya buharlaşmaya bağlı) Civalı fiksatif kullanımı Çıkış serilerinde su ve sulu alkol istasyonunun olmaması, varsa kalış süresinin kısalığı Çıkış serilerinde serilerinde isopropil alkol kullanımı Nasıl anlaşılır Ksilene getirilen kesit alışılmıştan daha pembedir Mikroskopta nüve dışında hemen her yer pembedir. Tonlama farkı azdır, yetersizdir

66 Eosin boyama ile ilgili sorunlar Eosin boyanmanın istenilen düzeyden fazla olması Nasıl önlenir-giderilir Daha ince kesit kullan Eosinde kalma süresini kısalt Eosinin daha az asidik olmasını sağla Eosini daha düşük konsantrasyonda hazırla, laboratuvarı klimatize et Civalı fiksatif kullanıyorsan eosini daha hafif yap Çıkış serilerine su ve sulu alkol istasyonu koy, varsa kalış süresini uzat Çıkış serilerinde isopropil alkol kullanıyorsan eosin süresini kısalt

67 Eosin boyama ile ilgili sorunlar Eosin boyanmanın istenilen düzeyden az olması Nedenleri nelerdir Kesitin çok ince olması Boyama süresi yetersizdir. Eosinin ph ı çok yüksektir Eosinden sonra girilen çalkalama ve alkol serilerinde su oranı yüksektir. Eosinden sonraki çalkalama ve alkolik dehidratasyon serilerinde gereğinden fazla süre kalınmıştır. Nasıl anlaşılır Boyadan çıkış serilerinde pembe rengin çok hafif olması Mikroskopta eosinin yetersiz olduğunun görülmesi Nasıl önlenir-giderilir Kesit daha kalın alınabilir Eosinde kalma süresi arttırılır Eosine asetik asit katılarak asidite arttırılır Eosinden sonra su ve sulu alkollerden hızlı geç

68 Boyama sonrası Dehidratasyon serisi ile ilişkili sorunlar Dehidratasyonun yetersiz yapılması Nelerden kaynaklanır Alkollerin sulu oluşu, absolu alkolün bulunmayışı-yetersizliği Absolu alkolde bekleme süresinin kısa olması Đsopropil alkol kullanılması Denatüre alkol içindeki ek maddelerin boyaya etkileri Nasıl anlaşılır Preparattaki su giderilemez, suyu ksilen de gideremez, kapatmada bulanıklık Mikroskopta bulanık buzlu cam görünümü, çift kırıcılık oluşur Alkoller içinde ilerlerken boyanın giderek solduğu görülebilir Nasıl önlenir-giderilir Son alkoller mutlaka absolu olmalı, sık değiştirilmelidir, ortam neminden koru Son alkolde kalma süreleri yeterli olmalı Absolu alkolden çıkan kesitler gözle kontrol edilmeli, gerekirse geri dönülür Denatürasyonu sağlayan maddeler boyaları solduruyorsa kullandığın alkol markasını değiştir

69 Kapatma öncesi şeffaflandırma işlemi ile ilişkili olumsuzluklar Şeffaflandırmanın yetersiz yapılması Nedenleri nelerdir Başarılı bir şeffaflandırma için öncelikle absolu alkol ile tam bir dehidratasyon sağlanmalıdır. Yeterli dehidratasyon sağlanmamışsa (absolu alkolde yeterince beklememişse) ksilende bekletmekle şeffaflandırma olamaz Ksilende bekleme süresi yetersizdir, ksilen istasyon sayısı yetersizdir, bu yüzden kesitteki absolü alkol tam olarak giderilememiştir Ksilen yeterince saf değildir Nasıl anlaşılır Ksilenden çıkarılan preparat homojen olarak şeffaf değildir, küçük damlalar şeklindeki alanlarda bulanıklık, matlık vardır, bulanıklık kapatma maddesi ile kapatıldıktan sonra da devam eder, mikroskopta ise çift kırıcılık vardır. Alkol özellikle eosin olmak üzere boyanın sabitliğini bozar, kapatmadan sonra eosin dağılır solmaya başlar. Ksilenin içindeki maddenin türüne göre boyada bozulma, solma meydana gelir

70 Kapatma öncesi şeffaflandırma işlemi ile ilişkili olumsuzluklar Şeffaflandırmanın yetersiz yapılması Nasıl önlenir, giderilir Absolu alkolde yeterince beklemeden (dehidrate etmeden) ksilene geçme, eğer geçtiysen preparatı absolu alkole geri al, yeterince bekleyerek tam dehidratasyonu sağla daha sonra ksilene ve kapatmaya geç Ksilende yeterince beklemeden (şeffaflaştırmadan)kapatmaya geçme, eğer geçtiysen ksilene geri dön, yeterince bekleyerek alkolü gider, daha sonra kapatmaya geç Ksilenin saflık derecesinden emin ol, kaliteli ksilen kullan

71 Kapatma işlemi ile ilişkili olumsuzluklar Nedenler nelerdir, Nasıl anlaşılır, Nasıl önlenir-giderilir Dehidratasyon işlemi yetersiz yapılmıştır. Preparat parlamaz, mattır, yer yer buzlu cam görünümü vardır, çift kırıcıdır Dehidratasyon aşamasına geri dön, yeni-absolu alkolde yeterince bekle Seffaflaştırma işlemi yetersiz yapılmıştır Preparat parlamaz, mattır, boyada bozulmalar yayılmalar oluşur Temiz ksilene geri dön yeterince bekle Kapatma maddesinin viskozitesi çok yüksektir (hava ile temas, kuruma) Damlatılması, preparata yayılması zordur, yavaştır, bazı bölgeler kapanmadan katılaşır Kapatma maddesinin kapağını açık bırakma, az ksilenle sulandırıp kullanmayı dene.

72 Kapatma işlemi ile ilişkili olumsuzluklar Nedenler nelerdir, Nasıl anlaşılır, Nasıl önlenir-giderilir Kapatma maddesi kısmen kristalize olmuş-opaklaşmıştır (havada kuruma) Kapatma imkansız hale gelir, mikroskopta incelenemez Kapatma maddesini at, sulandırmaya kalkma Kapatma maddesinde aşırı miktarda çözücü vardır.(ksilen ile sulandırma yapılmıştır) Hızla yayılı, preparattan taşabilir, kuruduktan sonra hava kabarcıkları oluşur Ksilene dön, kaliteli kapatma maddesi ile kapat Kapatma maddesinin kırma indeksi uygun değildir. Mikroskopta çift kırıcılık gözlenir Kapatma maddesini değiştir

73 Kapatma işlemi ile ilişkili olumsuzluklar Nedenler nelerdir, Nasıl anlaşılır, Nasıl önlenir-giderilir Kapatma maddesi kalitesizdir, zamanla değişim gösterir Kapatma maddesi zamanla sararır, matlaşır, opaklaşır, kristalize olur, hava girer Kapatma maddesini değiştir, üreticiye bildir, nedenini araştır Kapatma işleminde dikkatsizlik Hava kabarcıkları Kapatma tekniğini iyi öğren, dikkatli uygula, preparatı aç-tekrar kapat Kapatma maddesinin gereğinden fazla veya az kullanılması Preparattan taşma, çevreye yapışma; tam kapatmama, hava kabarcığı oluşumu Kapatılacak alanın miktarı, kesitin kalınlığı, kapatma maddesinin viskozitesi göz önüne alınarak uygun miktarda kapatma maddesi damlatılır

74 Formaldehid Çözeltileri Bu konuda ülkemizdeki patoloji topluluğu yeterince bilgilendirilmiş değil Konuyla ilgili yazılmış Tükçe literatürde de hatalar var Burada aldehid fiksasyonunun tartışmalı moleküler mekanizmalarına girilmeyecek, pratikte gerekli bazı temel özelliklere değinilecektir Aldehitler Formaldehitin yer aldığı organik bileşikler grubudur Yüksek sıcaklıkta alkollerin dehidrojenasyonundan elde edilebilir Birincil alkollerin yükseltgenmesi ile de aldehitleri verir Formaldehitten farklı olarak güzel kokulu doğal aldehitler de vardır. (benzaldehit bademde, vanilin vanilyada, sinnamaldehit tarçında) Kimyasal reaksiyonlara çok kolay girerler. Yükseltgenerek karboksilli asitleri, indirgenerek alkolleri verirler Kolayca polimerleşirler Formaldehid ile fenolün polimerik ürünü bakalit Formaldehit ile ürenin polimerik ürünü formikadır

75 Formaldehid Çözeltileri Aldehitlerin en küçük üyesidir. IUPAC sistemindeki ismi metanaldir Kimya endüsrisinde formik aldehit ve metil aldehit de denilir. Karbonil grubunun boş olan iki bağına H bağlanmıştır. CH2O Erime noktası -29, kaynama noktası -21ºC dir. Normal sıcaklık ve basınçta renksiz,özel kokulu bir gazdır. Ticari olarak metanol buharının hava oksijeni ile oksitlenmesi, Metan gibi doğal gazların uygun oksidasyonu sonucu elde edilir. Metanol ise karbonmonoksit ve hidrojenin reaksiyonundan elde edilip magnezyun kullanılarak suyu çekilir Ticari piyasada %35-40 lık sulu çözelti halinde bulunur ve depolanır. Bu çözeltiye formalin denilir. Formaldehid miktarı %35-38 w/w, %39-41 w/v değişkendir Mol ağ özgül ağırlığı 1,07/1,09g/ml Değişik oranda metanol vardır. (%8-12) Değişik oranda formik asit içerir (%0,03-%0,1) Değişik oranda metilen glycol içerir

76 Formaldehid Çözeltileri Piyasada satılan formalin kimyasal olarak ne durumda Formaldehit molekülü stabil bir madde değil, Polimerleşir, küçük veya büyük polimerleri oluşur (polioksimetilen) Su ile reaksiyona girer ve metilen glycol halini alır. H2C=O+ H2O CH2(OH)2 Đndirgenerek metanole dönüşür Yükseltgenerek formik aside dönüşür. Đçinde neler var Formaldehit monomerleri Formaldehit polimerleri Metilen glycol Metanol Formik asit Az miktarda diğer kimyasallar Neler yaparlar Monomerleri çapraz bağ fiksasyonu Polimerler, fiksasyon?, beyaz çökelti Metilen glycol, fiksasyon? Metanol, koagulatif ve dehidratan etki Formik asit, ph düşüşü, koagülasyon Diğerleri, takip ve boyamada etkili olabilir

77 Formaldehid Çözeltileri Kullanmakta olduğumuz formalinin özellikleri nedir Đçindeki serbest aldehit miktarını bilmiyoruz Üretim aşamasındaki formaldehit konsantrasyonuna güven yoktur Beklemekle serbest aldehitin bilemediğimiz bir miktarı dönüşür Serbest aldehit miktarı giderek düşer Đçinde stabilizatör olarak metanol vardır (%8-12?) Üretim aşamasındaki nedenlerle metanol miktarına güven yoktur Beklemekle metanol miktarı artar Beklemekle aldehit fiksasyonu yerine koagulatif fiksasyon ve dehidratan etki Bilmediğimiz oranda metilen glycol bulunur Üretim aşamasında bilmediğimiz miktardadır Beklemekle giderek artar Fiksatif etkisi var mı? Varsa bile çapraz bağ oluşturarak değil Bilmediğimiz oranda polimerik aldedit molekülü bulunur Beklemekle polimerik moleküller artar Fiksasyon gücü çok düşüktür Bilmediğimiz oranda formik asit bulunur Beklemekle formik asit miktarı artar Tamponlama işlemi formik asit oluşumunu önler, geciktirir.

78 Formaldehid Çözeltileri Ne yapalım, fiksasyon için ne kullanalım 1-Formalinden vaz geçelim 2-Mümkün olduğunca daha kaliteli-daha standart formalin kullanalım Kaliteli standart formalini nasıl temin edelim 1-Paraformaldehitten taze hazırlayıp kullanmak 2-Güvenilir firmaların güvenilir? ürünlerini alıp tamponlayarak kullanalım 3-Güvenilir firmaların tamponlanmış ürünlerini alıp kullanalım Paraformaldehit nedir, paraformaldehitten formalin nasıl elde edilir Formalin çözeltisinden düşük basınç altıda suyu buharlaştırarak elde edilen beyaz bir toz.formaldehitin özel bir polimeridir. (CH2O)n olarak formüllenir. Polimerdeki formaldehit molekül sayısını belirten n değeri 30 civarındadır. %2,26 lık NaH2PO4 41,5 ml %2,52 lik NaOH 8,4 ml Kapalı kapta 60-80ºC ye kadar ısıt Paraformaldehit (analitik grade) 2gr ekle Tamamen çözünüp berrak bir çözelti haline gelinceye kadar karıştır Filtre et, soğut, ph ını 7,2-7,4 e ayarla ve o gün kullan

79 Formaldehid Çözeltileri Güvenilir firmaların güvenilir ürünlerinin kullanılması Kısmen geçerli bir yöntemdir. Ancak başka da yapacak birşey yoktur. 1-En güvenilir yol, havası alınmış ampuller içinde pazarlanan 100ml lik ürünler. Bir kullanımlık. Ampul kırılıp çıkan çözelti hemen kullanılır. Ülkemizde yok. ABD de var, doku fiksasyonu amacı ile üretilmiş. Pahalı. Klasik şekilde pazarlanan ürünlerden almak durumundayız. 2-Üretici firmaların katologları gözden geçirilmeli Firma ve ürünlerin, kalite sertifika programlarından onayı var mı? Katologda saflık derecesi, içerik özellikleri incelenmeli Mutlaka w/v, w/w olarak konsantrasyon verilmiş olmalı Metanol oranı belirtimiş olmalı Formik asit oranı belirtilmiş olmalı 3-Satınalma işlemini küçük partiler halinde yap.( 4-6 aylık ihtiyaçlar halinde) Mümkün olduğunca küçük şişeler halinde al 100ml-2,5lt lik şişeler halindedir. Günlük ihtiyacı belirle. Bu ihtiyaca uygun şişeler halinde satınal

80 Formaldehid Çözeltileri Güvenilir firmaların güvenilir ürünlerini hangi ambalajlarda almalıyım 4 litre kazanlı 300 kasetlik makinayı her akşam çalıştırıyorsun. Her gün 2x4=8 litre %10 formalin kullanıyorsun Bu durumda her gün 800ml formalin e ihtiyacın var Formalin alımını 1 litrelik şişeler halinde yapmalısın Pahalı geliyorsa en çok 2,5 lt lik şişelerle al, üç günde bitirirsin Uzun sürede tüketilebilecek büyük volümlü ürünlerde, şişe açıldıktan sonra zaman içinde kalite bozulacaktır.(10, 25, 50 litrelik ambalajlarda alma) Sulandırdığın ürünü o gün kullan Mümkünse kliniklere her gün taze sulandırılmış %10 formalin gönder veya Klinikler her sabah kendi kullanacakları kadar %10 formalini kendileri hazırlasınlar Bunu başarabilir misin? Hayır!, Zaten başarmama da gerek yok. Şu andaki takibimden memnunum Kendi fiksasyonuma ve sonuçlarıma alıştım. Yaptığım aldehit fiksasyonu olmayabilir. Đlla ki aldehit fiksasyonu yapmam mı gerekiyor! Formalin patoloğu gibi görünüp etanol patoloğu olmaya alıştım, beni rahatsız etme! Kısmen! Patoloji laboratuvarımda uygularım ama klinikleri kontrol etmem güç

81 Formaldehid Çözeltileri Piyasadan küçük partiler halind sertifikalı formalin aldım, her gün bir şişe açtım Bundan sonra ne yapayım 1- Tamponsuz %10 formalini günlük olarak hazırlayıp günlük tüket. Sulandırmada kullandığın suya dikkat et Ara sıra phını ölç. Kullandığın suya da bağlı olarak ph 5-6 düzeyindedir 2-Nötral tamponlu %10 luk formalini günlük olarak hazırla, günlük tüket Tamponsuz %10 formaline göre 2 kat pahalıya gelir. Hazır tamponlu formalinin maliyeti ise yaklaşık 20 kat fazladır. Kullanıma hazır tamponlu formalin almak pek uygun değildir. Sertifikalı formalin al, günlük tamponlu %10 formalini kendin hazırla Takip makinalarında tampon tuzları kanalları tıkayabilir, uyanık ol, bakım yaptır. Tamponlu formalin veya formalin salin vb deki tuzlar, alkol ile karşılaşınca çökerler. Bazı ticari formalin ürünlerinde istenmeyen bu etkinin giderilmişolduğu belirtilmektedir 3-Katkılı %10 formalin hazırla, günlük tüket Formol-kalsiyum (Litreye 1 gr CaCl2 ekle, formen pigmentini önler) Formalin zink (Litreye 10 gr ZnCl2.7H20 ekle, antijenik ve morfolojik iyileşme)

82 Etanol-Etil alkol C2H5OH olarak formüle edilir. Kaynama derecesi 78ºC dir Patolojide doku takibinde dehidratan olarak kullanılır Konsatrasyon ve saflık derecesine göre türleri bulunur Konsantrasyona göre, %70 v/v, %96v/v ve absolute (%99.8v/v) formda bulunur. Doğal formu ve endüstriyel olarak metillenmiş/denature edilmiş formları vardır. Metilasyon işleminde eklenen maddeler çeşitlidir (metanol, butanan, diethyl phthalate, Đsopropanol,cyclohexane vb) Doğal formlarının üretim ve pazarlaması özel lisanslarla mümkündür, pahalıdır Patolojide denatüre alkol kullanılır. Metanol oranını yüksek olmamasına dikkat et Patolojide doku takibinde %70lik (bazen %30 luk) etanol ile dehidratasyon başlar Derecesi yükselen alkollerden geçilir. En sonunda mutlaka absolute alkolden geçirilerek dehidratasyon tamamlanır. Dokunun sulu kalması durumunda şeffaflandırma ve parafinizasyon yeterince gerçekleşemez Alacağınız alkol iki tür olacaktır 1-%95-96 etanol 2-Absolute alkol (En az %99,5)

83 Etanol-Etil alkol 1, 2.5, 5,10, 25 litrelik ambalajlarda satılmaktadır Eskiden Tekel idaresi resmi üretimin ve piyasanın tek hakimiydi Absolu alkol oldukça pahalıydı. Bu nedenle patolojide dehidratasyonun son aşamasında absolu alkol kullanım geleneği yaygınlaşamadı. Bu özellik boya çıkışlarında da kendini halen belli etmektedir Günümüzde ithali ve pazarlaması alkol kurulunun denetiminde serbest bırakılmıştır. Fiatlar ucuzlamıştır. Piyasadan etanol alırken alkol piyasası kurulundan sertifikalı firma ve ürünleri alın. Đthal ürünlerde üretici firmanın yerel resmi otoriteden aldığı sertifikayı isteyin Şişe ve etiketlerin orjinal olduğuna kanaat getirin. (Nasıl olacaksa?) Ürün ve firmaya ait özellikleri içeren etiket olmasına dikkat edin Alkolometre ile kabaca dansitesini ölçün Mümkünse bir analiz laboratuvarı ile anlaşın. Özellikle konsantrasyon ve metanol yoğunluğu konusuna dikkat edin

84 Etanol-Etil alkol 1, 2.5, 5,10, 25 litrelik ambalajlarda satılmaktadır Özellikle absolu alkol absolu özelliğini çok çabuk yitirir. Bu nedenle günlük kullanımınızı karşılayacak küçük ambalajlarda satın alın Günlük kullanım miktarınızı belirlerken Doku takibinin son alkolü Boya giriş serisinin ilk alkolü Boya çıkış serisinin son alkolü Mümkünse absolu düzeyinde, yüksek konsantrasyonda olmalıdır. Bu nedenle bu alkoller kullanım yoğunluğuna bağlı olarak arttırılmak üzere günde en az bir kez değiştirilmelidir. Alkollerin değiştirilmesi gerektiğini nasıl anlarız. Alkolometre Susuz bakır sülfat testi Dokuyu sıkarak suyunu çıkarma testi Bulanıklık/şeffaflık testi

85 Etanol-Etil alkol C2H5OH olarak formüle edilir. Kaynama derecesi 78ºC dir Patolojide doku takibinde dehidratan olarak kullanılır Konsatrasyon ve saflık derecesine göre türleri bulunur Konsantrasyona göre, %70 v/v, %96v/v ve absolute (%99.8v/v) formda bulunur. Doğal formu ve endüstriyel olarak metillenmiş/denature edilmiş formları vardır. Metilasyon işleminde eklenen maddeler çeşitlidir (metanol, butanan, diethyl phthalate, Đsopropanol,cyclohexane vb) Doğal formlarının üretim ve pazarlaması özel lisanslarla mümkündür, pahalıdır Patolojide denatüre alkol kullanılır. Metanol oranını yüksek olmamasına dikkat et Patolojide doku takibinde %70lik (bazen %30 luk) etanol ile dehidratasyon başlar Derecesi yükselen alkollerden geçilir. En sonunda mutlaka absolute alkolden geçirilerek dehidratasyon tamamlanır. Dokunun sulu kalması durumunda şeffaflandırma ve parafinizasyon yeterince gerçekleşemez Alacağınız alkol iki tür olacaktır 1-%95-96 etanol 2-Absolute alkol (En az %99,5)

86 Etanol-Etil alkol Alkol serilerini kaydırarak kullanıyorsanız ve absolu alkol alabiliyorsanız %95-96lık alkole fazla ihtiyacınız olmayabilir. Đhtiyacınızın %80 kadarını absolu alkol %20 kadarını %96 lık alkol olarak karşılayabilirsiniz. Özellikle geri dönüşüm makinanınız varsa %95 alkol ihtiyacınız çok azalacaktır Eğer absolu alkol fiatı yüksek ve temininde güçlük varsa yerine aseton kullanabilirsiniz. Aseton daha güçlü bir dehidratandır. Đnkubasyon süreleri alkole göre kısa tutulmalıdır Aseton da kullanmıyorsanız %96 lık alkolle idare edilecektir. Bu durumda absolu alkol yerine kullanacağınız alkolleriniz mutlaka daha önce kullanılmamış alkol olmalıdır. Bu alkollerde bekleme süreleri uzun tutulmalıdır. Gerekirse bu alkol istasyonların sayısı ikiye çıkarılmalıdır Absolu alkol kullanmayanlar için diğer bir seçenek şu andaki geleneksel uygulamayı aynen devam ettirmek, Patoloji kuru kuruya hiç çekilmez, biraz sulu olmasında sakınca yoktur. demektir

87 Etanol-Etil alkol Önemli bir uyarı, takip makinası firmalarının uyguladıkları takip şemalarında son alkollerin süresi uzun tutulmuş. Absolu alkole göre değil %96 lık alkole göre düzenlenmiş. Bu programları doğrudan alıp son alkolleri %96 yerine absolu alkol olarak uygularsanız özellikle küçük dokularda kuruma artefaktı oluşuyor. Absolu alkol kullanan şemalarda absolu alkol süresi 1 saatten fazla olmamalıdır. Aksi durumda özellikle küçük dokular takırdar

88 Etanol-Etil alkol Etil alkolün denatürasyonunda kullanılan pekçok madde vardır Bu katkı maddeleri boyama işleminin değişik kademelerinde beklenmeyen etkilere ve sonuçlara yol açabilir. Boyanın sonradan solması, boyanın zayıf olması söz konusu olabilir. (denaturan maddelerin oksidasyon veya reduksiyona yol açması sonucu). Denaturant maddenin suda erimeyen özellikte olması sonucu sulandırılmış alkollerin bulanıklaşması söz konusu olabilir. Eğer denature alkol kullanılıyorsa formülasyonu bilinmeli. Yapabileceği etkiler test edilerek gözlenmelidir.

89 Xylene Hem dehidratan alkollerde hem de parafinde eriyebilen ara maddeler gerekiyor Bunlar hidrokarbon çözücülerdir. Bu maddelerin ışığı kırma indeksi proteinlere çok yakındır. Bu nedenle doku yeterince doyduğunda doku ışığa tutulunca şeffaflaşmış görünür Bu maddelere clearing agent, şeffaflandırıcı denilir Patolojide kullanılacak madde Alkol ve parafinle hızla yer değişimi yapabilmelidir. Dokuya mümkün olduğunca az zarar vermelidir Parlayıcılık tehlikesi ve toksisite düzeyi düşük olmalıdır Ucuz olmalıdır Tüm koşulları tam olarak yerine getiremese bile geleneksel uygulamada en çok kullanılan ürün xylen dir

90 Xylene C6H4(CH3)2, C8H10 formülünde bir hidrokarbon. Kaynama derecesi 138 º Parlayıcı bir maddedir Toksik özelliği fazladır, kötü kokuludur Tinercilere sormayın, bu hoş bir kokudur, kafa buldurması önemlidir P, m, o isoformları bulunur. Patolojide kullanılan çözelti bir karışımdır MW takip için uygun değildir. (Polar özellik az, kaynama derecesi yüksek) Klasik takip sisteminde şeffaflandırıcı olarak yaygın kullanılıyor Toksik etkileri önemli. Suda erimiyor, lavaboya dökemiyoruz Ancak takip ve boyama makinelerindeki düzenekler sayesinde bu etki kalktı Đnkubasyon süreleri arttıkça dokularda sertleşme ve kırılganlık artışı gözlenir Parafinizasyon sırasında vakum uygulaması ksilenin dokudan uzaklaştırılmasında yararlı olabilir Sonuç olarak Klasik takipte ve boyada şeffaflandırıcı ve deparafinizan olarak olarak ksilen kullanılır Sertifikalı, etiketli ürünler alınmalıdır En az, doku takibinde 2 istasyon, boya çıkışında 3 istasyon uygundur Đnkubasyon süresi şeffaflık testi ile belirlenebilir Çözeltiler ne sıklıkla değiştirilmelidir?

91 Đsopropil alkol C3H7OH, (CH3)2-CH-OH, kaynama derecesi 82 ºC dir. Hem dehidratan etkiye hem de şeffaflaştırıcı etkiye sahiptir. Dehidratan etki etanole göre daha zayıf ve yavaştır Dokuya penetrasyon hızı etanole göre düşüktür Polar yağların giderilmesinde etanole üstündür Dezavantajları nedeniyle klasik takipte dehidratan olarak yaygınlaşmadı Ancak etanolün pahalı olduğu ve kullanımının kanuni olarak kısıtlandığı ülkelerde kullanılmaktadır Ayrıca dezavantajlı özellikleri MW ışınlama ile ortadan kalkabilmektedir Aynı zamanda şeffaflandırıcı özelliği vardır. Ksilene göre daha az toksik olması nedeniyle tercih edilebilir Ancak reaksiyon hızının yavaş olması nedeniyle klasik takipte kullanımı kısıtlıdır Ancak MW takipte ksilenin bipolar özelliğinin zayıf olması, ve kaynama derecesinin çok yüksek olması sorun yaratmıştır. Bu nedenlerle isopropil alkol klasik takip sisteminden ziyade MW takipte yaygınlık kazanmıştır

92 Parafin wax Mikrotom kesiminde, gerekli destek ortamını sağlayan bir maddye ihtiyaç vardır Đki aşamada gerçekleşir. Infiltration/impregnation ve embedding Günümüzde bu amaç için kullanılan ürün parafin ve türevleridir Petrol-mineral yağ rafinerizasyonu sırasında elde edilen hidrokarbon karışımıdır. Kömürden sentetik olarak da elde edilir Patoloji laboratuvarında kullanımını daha uygun hale getirmek amacıyla 1-Üst düzeyde saflaştırılmalıdır. Bu işlem sırasında yağ oranı belirgin şekilde düşer 2-Bazı maddeler eklenir

93 Parafin wax 1-Erime derecesi 50-64ºC arasında olmalı (56-58 ºC) Takip ve gömme makinalarının önerdiği sıcaklık değerleri göz önüne alınmalıdır Sert dokular için yüksek, yumuşak dokular için düşük erime sıcaklığı uygundur Erime ve donma süreleri çok uzun olmamalı Sıcak iklim koşullarında yüksek erime derecesi tercih edilir 2-Çok iyi filtre edilmiş olmalı, partikül içermemeli 3-Saflaştırma işleminden geçmiş olmalı, yağsız, kokusuz, renksiz olmalı 4-Eridiğinde berrak olmalı, gömme sırasında bulanıklık oluşmamalı 5-Donduğunda içindeki dokunun kısmen de olsa izlenebileceği şeffaflıkta olmalı 6-Donduğu zaman zeminden kolay ayrılabilmeli, yapışmamalı, temizliği kolay olmalı 7- Base mold dan kolayca ayrılabilmeli 8-Sıcaklık değişimine uyum sağlamalı. Donunca ve soğuğa maruz kalınca çatlamamalı 9-Kullanılan plastik kaset ile genleşme özelliği açısından uyumlu olmalı 10-Sıcaklık artışı, aşırı ve hızlı genleşmeye yol açmamalı

94 Parafin wax 11-Seri kesit verebilmeli 12-Đnce kesit verebilmeli 13-Kesim sırasıda kırılma ve rulo oluşturma eğilimi az olmalı 14-Boş blok kesim testi yeterki olmalı 15-Kullanılan bıçak ile uyumlu olmalı 16-Bıçak ve baskı plakası üzerinde kayabilmeli 17-Su banyosunda dağılmamalı 18-Deparafinizasyon işleminde sorun yaratmamalı, kısa sürede kolayca deparafinizasyon sağlanmalı, artık kalmamalı, boyaya etkisi olmamalı 19-Pellet/granül şeklinde olmalı 20-Tercihan kücük paketler halinde olmalı 21- Blok arşivlemede ve stoklanmada sorun yaratmamalı 22-Fiatı uygun olmalı Böyle parafin bulursanız bana da haber verin

95 Parafin wax Tüm koşulları tam olarak yerine getiren tek bir parafin bulmak mümkün değil Đlk yapılması gereken mümkün olduğunca saf bir parafin elde etmektir Bu tür bir parafin, erime sıcaklığı da uygunsa pekçok isteğe cevap verebilecektir. Özel istek ve işlevlilik için parafinin içine katkı maddeleri eklenir Erime sıcaklığı yüksek parafinler donunca sert, Erime sıcaklığı düşük parafinler daha yumuşak bir doku oluştururlar Sert dokular sert, yumuşak parafinlerler yumuşak parafinle daha iyi kesilir. Parafin içine polimerik bazı maddeler katılarak sertlik arttırılmış, erime sıcaklığı sabit kalmıştır. Polimerik madde miktarı arttıkça ince kesit olanağı artar, seri kesit imkanı azalır Bu parafinler gömme ve kesim için elverişlidir. Ancak bu parafinlerin diffüzyon hızı düşüktür. Doku takibinde avantaj sağlamaz. Doku takibinde saf-rafine-katkısız parafinler önerilir

96 Parafin wax Paraffin wax Saflaştırılmış kaliteli parafin Parafin infiltrasyonu iyi ve hızlıdır Sorunsuz dokularda seri kesit verir Paraplast Saflaştırılmış kaliteli parafin içine polyisobutylene katılmıştır. Parafin infiltrasyonu daha iyi ve hızlıdır Kesim normal parafine göre daha başarılıdır. 4 µmlik seri kesit verir Paraplast plus Saflaştırılmış kaliteli parafin içine polyisobutylene ve %0,8 oranında DMSO katılmıştır Parafin infiltrasyonu daha iyi ve hızlıdır Kesim normal parafine göre daha başarılıdır 1 µmlik kısa seri kesitler, 2 µmlik uzun seri kesitler alınabilir Paraplast X-tra Saflaştırılmış kaliteli parafin içine düşük molekül ağırlıklı mikrokristal mum konur Parafin infiltrasyonu için uygun değil Kesimde 2µmlik seri kesit sağlayabilir