Akademik Sosyal Araştırmalar Dergisi, Yıl: 5, Sayı: 44, Nisan 2017, s

Transkript

1 Akademik Sosyal Araştırmalar Dergisi, Yıl: 5, Sayı: 44, Nisan 2017, s Yayın Geliş Tarihi / Article Arrival Date Yayınlanma Tarihi / The Publication Date Evrim TEKELİ Ankara Üniversitesi, Sosyal Bilimler Enstitüsü, Paleoantropoloji Anabilim Dalı Doktora Öğrencisi tevrim@gmail.com Prof.Dr. Timur GÜLTEKİN Ankara Üniversitesi, Dil ve Tarih- Coğrafya Fakültesi, Antropoloji Bölümü, Fiziki Antropoloji Anabilim Dalı tgultekin@ankara.edu.tr GİRESUN/KHALKERİTİS ADASI BİZANS DÖNEMİ BİREYLERİNDE MORFOLOJİK VE GENETİK ÇALIŞMALAR İLE CİNSİYETİN BELİRLENMESİ 1 Öz Antropoloji, insanı ve günümüz toplumları ile geçmiş toplumların biyolojik ve sosyo-kültürel benzerliklerini ve farklılıklarını inceler. İnsanı biyolojik olarak inceleyen bu bilim dalı ile arkeolojik ve antropolojik kazılardan çıkartılan biyoarkeolojik materyallerin genetik çalışmalarda kullanılması ile antik DNA (adna) çalışmaları başlamıştır. Özelliklede antropoloji alanı içerisinde adna çalışmalarının yer alması ile insan tarihine ait merak edilen sorular cevaplanmaya başlanmıştır. Genetik alanında teknolojinin gelişmesiyle birlikte moeküler biyoloji gibi fen bilimleri ile antropoloji gibi sosyal bilimler arasında multidisipliner çalışmalar ortaya çıkmıştır. Bu çalışmalar içerisinde kimliklendirmenin temelini oluşturan cinsiyet belirleme, antropoloji için oldukça önemlidir. Bu çalışmada Giresun Adası/Khalkeritis Kazısı nekropol alanından çıkartılmış olan ve Bizans Dönemi olarak tarihlendirilmiş olan insan iskeletlerinden 10 birey üzerinde morfolojik incelemeler ve genetik analizler yapılarak bireylerin cinsiyeti araştırılmıştır. Morfolojik incelemeler sonucunda 5 birey erkek 5 birey dişi olarak belirlenmiştir. Genetik analizler sonucunda ise 4 bi- 1 Bu makale, Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri tarafından desteklenen ve yürütücülüğünü Prof.Dr. Timur Gültekin in yaptığı, 15L kodlu Arkeolojik Kazılardan Çıkarılan Kemiklerden Antik DNA Çalışması başlıklı projeden üretilmiştir. Çalışmada kullanılan materyaller, Evrim Tekeli nin doktora tezinde kullanılmıştır.

2 reyde amplifikasyon oluşmadığı için cinsiyet belirlenememiştir. DNA analizleri ile morfolojik incelemeler karşılaştırıldığında ise %50 oranında bir uyum olduğu bulunmuştur. Anahtar kelimeler: antik DNA, antropoloji, Bizans Dönemi, cinsiyet belirleme, Giresun Adası THE DETERMINATION OF SEX WITH THE MORPHOLOGICAL AND GENETIC STUDIES ON INDIVIDUALS OF GIRESUN/KHALKERITIS ISLAND DURING THE BYZANTINE PERIOD Abstract Anthropology examines the biological and socio-cultural similarities and differences of mankind and today's and past's societies. The ancient DNA (adna) studies started with the use of bio-archeological materials being taken out in the archeological and anthropological excavations in the genetic studies with this science which examines people biologically. Especially, the questions which are wondered on the people history started to be answered as adna studies took the place in the field of anthropology. The multi-disciplinary studies have occurred between the sciences such as biyolog and social sciences such as anthropology with the development of technology in the field of genetic. The determination of sex which is the base for the identification in these studies is very important for anthropology. The gender of persons were searched as the examinations and genetic analyses were done on 10 persons from the people's skeletons which were taken out of the Giresun Island/ Khalkeritis Excavation necropolis area and which were dated as Byzantine Period in this study. As a result of morphological examinations, 5 individuals were determined as male and 5 of them were determined as female. As a result of genetic analyses, the sex couldn't be determined as the amplification didn't occur in 4 individuals. When DNA analyses and morphological examinations were compared, it was found that there was a conformity at 50%. 539 Keywords: ancient DNA, anthropology, Byzantine Period, sex determination, Giresun Island 1.GİRİŞ Türkiye de yapılan arkeolojik ve antropolojik kazılardan çıkartılan insan ve hayvana ait iskeletler ile bitki kalıntılarının materyal olarak kullanılması ile fen bilimleri ve sosyal bilimler arasında koordinasyonlu bir çalışma yapılmaya başlanmıştır. Yapılan bu çalışmalarda arkeologlar için kazılardan çıkarılan materyaller geçmişin aydınlatılması için önemli olurken, antropologlar için de kazıdan çıkarılan iskelet örnekleri üzerinde yapılan morfolojik çalışmalar merak edilen birçok soruyu cevaplamaktadır. Kazılardan çıkartılan iskeletler üzerinde antropologlar morfolojik inceleme yaparak bireyin cinsiyetini, yaşını, tahmini boy uzunluğu belirlenebildikleri gibi (Ubelekar, 2008), iskelet ve diş üzerinde bırakılan işaretlerden yola çıkılarak tarih öncesi hastalıklar hakkında da bilgi elde edebilmektedirler (Ortner ve Putschar, 1981). Bunun dışında kemik örneklerinden kimyasal analizler yapılarak geçmişte yaşamış insanların beslenme şeklilleri belirlenebilmektedir (Kaestleve Horsburg, 2002).

3 Antropoloji alanında özelliklede kimliklendirmeye dayalı çalışmalarda cinsiyetin belirlenmesi çok önemli bir kriterdir. Tarih öncesi dönemde yaşamış toplumların demografik yapısının belirlenmesi için öncelikle cinsiyet tespitinin yapılması gereklidir. Kazıdan çıkarılan iskeletler üzerinde antropologlar tarafından yapılan morfolojik incelemeler ile yaş ve cinsiyet belirlenmektedir (Çırak,2009). İskeletler üzerinde morfolojik incelemelerde kafatası ve pelvis ile birlikte cinsiyet farklılığı gösteren diğer kemiklerde kullanılarak cinsiyet belirlenebilmektedir (Ubelekar,2008). Ancak bazı durumlarda özelliklede cinsiyetin belirlenmesi zor olmaktadır. Kazıdan çıkartılan iskeletin parçalanmış olması durumunda veya seksüel farklılıkların tam olarak belirmediği yaşlardaki bireylere ait iskeletlerde morfolojik ve metrik yöntemler ile cinsiyetin belirlenmesi mümkün olmamaktadır (Malaver ve Yunis, 2003). Özelliklede toplu gömülerde birden fazla birey aynı mezar içerisinde yan yana gömüldüğü için cinsiyet belirlemede sorunlar yaşanmaktadır. Bunun dışında bebek ve çocuklarda cinsiyetin belirlenmesi zor olduğu için kesin bir tespit yapılamamaktadır (Stone, 1996). Morfolojik incelemeler ile cinsiyet tespiti yapılamayan antropolojik örneklerde DNA analizlerinin yapılması önemli olmaktadır (O Rourke ve ark., 2000; Pääbo ve ark., 2004). Arkeolojik ve antropolojik materyallerin biyoloji alanında yapılan çalışmalar içine dahil edilmesiyle birlikte antik DNA (adna) çalışmaları ortaya çıkmıştır. Geçmişleri hakkında bilgi sahibi olmak isteyen tarihçiler, arkeologlar, paleontologlar, antropologlar, biyologlar, dil bilimcileri adna çalışmaları ile tarih öncesi döneme ait bilgilere ulaşmaları mümkün hale gelmiştir yılında California Üniversitesi nden Higuchi ve arkadaşları, Güney Afrika da yaşamış ve soyu tükenmiş olan bir zebraya ait (Equus quagga quagga) deri kalıntılarından DNA elde ederek, dizileme yapmış ve modern zebra ile filogenetik yakınlığını belirlemişlerdir. Bu çalışma literatürde geçen ilk antik DNA çalışmasıdır (Higuchi ve ark., 1984).Bu çalışmadan sonra, Pääbo ve arkadaşları tarafından 1985 yılında yaklaşık 2340 yıllık bir çocuğa ait mumyadan DNA elde edilmiştir (Pääbo ve ark., 1985).Moleküler biyoloji ve genetik alanında teknolojinin ilerlemesi ile birlikte 1985 yılında Polimeraz Zincir Reaksiyonu nun (PZR) keşfedilmesi ile (Mullis ve ark., 1986) birlikte antik DNA alanında yapılan araştırmaların kapsamı artmıştır ve çalışmalar daha hızlı bir şekilde yapılmaya başlanmıştır. 540 Antik DNA çalışmalarında materyal olarak saç, mumyalanmış deri kalıntısı, yumuşak doku, bitki kalıntıları,hayvan ve insana ait kemik ile dişler kullanılmaktadır (Pääbo ve ark., 2004; Singh ve Garg, 2014). Bu alanda yapılan çalışmalarda en çok kemik ve diş kullanılmaktadır. Kazıdan çıkarılan iskelet buluntularından DNA analizi yapılacak ise örnek seçiminin iyi yapılması önemlidir. Kemik çalışılacak ise femur, tibia, humerus ve kafatası kemiği gibi kalın ve sert olan kortikal kemiklerin seçilmesi çalışmanın başarısını artırmaktadır (O Rourke ve ark.;daskalaki, 2004). Dişin mine tabakası, insan vücudundaki en sert dokudur ve doku; sıcaklık, UV, ışık, nem ve mikrop gibi çevresel şartlara karşı fiziksel bariyer oluşturarak diş hücrelerini korumaktadır. Ayrıca dişn mine tabakası kontaminatların içeri girmesine engel olduğu için, kontaminasyon riski daha az olmaktadır (Higgins ve Austin, 2013).Antik DNA çalışmalarında materyal olarak diş çalışılacak ise; morfolojik olarak iyi korunmuş, patolojik bulgusu olmayan, aşırı derecede aşınmış ve çürük olmayan dişler tercih edilmelidir (Kemp ve Smith, 2005). Modern DNA çalışmaları ile aynı prosedüre sahip olmasına rağmen adna çalışmaları daha dikkatli ve sabırlı bir şekilde yapılması gerekmektedir. Antik DNA çalışmalarında kontaminasyon ve degredasyon çok önemli bir problemdir (Daskalaki, 2004; Yang ve Watt, 2005). Konta-

4 minasyon riski sadece adna çalışmalarında değil, modern DNA çalışmalarında da görülmektedir. Ancak eski örneklerde degredasyondan dolayı çok az miktarda endojen DNA bulunduğu için oluşabilecek kontaminasyon riski, sonuçların yanlış yorumlanmasına neden olmaktadır (Kemp ve Smith, 2005). Kontaminasyon riski laboratuvar ortamında DNA izolasyonu veya PZR aşamasında olabileceği gibi kazı alanında kazı ekibi tarafından da oluşabilmektedir (Akbaba, 2012). Bunun için adna çalışmalarının her aşaması çok dikkatli bir şekilde çalışılmalıdır. Kontaminasyon riskini en aza indirgemek için bazı önlemlerin uygulanması gereklidir. Kazı alanında kazıyı yapan arkeologlar ve kazı ekibine DNA çalışması yapılacak ise bu durum kazıya başlanmadan kazı başkanına bildirilmelidir. Kazı işlemleri sırasında mutlaka eldiven ve maske kullanılmalıdır. Her bir örnek için kullanılan eldivenler ayrı olmalıdır. Kazı işlemleri olabildiğince hızlı bir şekilde yapılmalı ve örnekler güneş ışığına maruz bırakılmamalıdır. Toprak altından çıkartılan herbir örnek ayrı ayrı paketlenmelidir. Toprak altından çıkartılan iskeletler laboratuvar ortamına getirilinceye kadar kuru ve serin bir ortamda muhafaza edilmelidir (Burger ve ark., 1999;Daskalaki, 2004; Bollongino, 2008). 2.MATERYAL VE METOT Materyal Giresun ili içinde yer alan ve Doğu Pontus Bölgesi nin yerleşim alanlarından biri olan Giresun/Khalkeritis Adası nda (Doksanaltı, 2011) 2011 yılında, Giresun Müze Başkanlığı ile Selçuk Üniversitesi arkeoloji bölümü ile birlikte arkeolojik kazılar başlatılmıştır. Yapılan kazılarda ada içerisinde bir kiliseye ait kalıntılar ve seramik parçaları, divit takımı, bronz sikke, pişmiş toprak kapları bulunmuştur. Günümüze ulaşan bu kalıntılar M.S. 5-6.yüzyıl, Bizans Dönemi olarak tarihlendirilmiştir ve 2012 yıllarında yapılan bu arkeolojik kazı çalışmalarında nekropol alandan 2011 yılında 83 adet mezar açılmış ve bu mezardan 72 adet iskelet çıkartılmıştır yılında yapılan kazıdan ise 52 adet iskelet çıkarılmıştır (Acar,2015). Bu çalışmada kazılardan çıkartılan iskeletlerden 10 farklı bireye ait femur ve diş morfolojik ve genetik çalışmalar yapılmıştır.bu çalışmada materyal olarak Giresun Adası Kazısından yıllarında çıkartılmış olan iki farklı bireye ait femur kemiği ile mandibula üzerinde bulunan dişler ve 7 farklı bireye ait diş, bir bireye ait femur kemiği çalışılmıştır (Tablo-1). DNA analizleri, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Adli Tıp Anabilim Dalı nda bulunan DNA Laboratuvarı nda yapılmıştır. 541 Tablo-1 Giresun Adası Kazısından çıkartılmış olan iskelet buluntuları Örneklerin Dönemi Kazı Yılı Buluntu Türü Sıra Numarası Bizans 2011 Femur, Mandibula 17 Bizans 2011 Femur, Maxilla 19 Mandibula Bizans 2011 Maxilla 21 Mandibula Bizans 2011 Mandibula 22 Bizans 2012 Maxilla 23 Mandibula Bizans 2012 Diş 33 Bizans 2012 Diş 35

5 Bizans 2012 Diş 36 Bizans 2012 Femur, Diş 38 Bizans 2012 Femur 40 Metot Giresun Adası bireylerinin cinsiyetleri hem moleküler yöntemler ile hem de morfolojik incelemeler ile belirlenmiştir. Morfolojik incelemelerde pelvis kemikleri ve kafatası kemiklerindeki cinsiyet karakterlerinden yararlanılmıştır (WEA,1980; Krogman ve İşcan 1986; Buikstra ve Ubelaker,1994). Laboratuvara getirilen kemik ve diş örneklerine DNA izolasyonundan önce, kontaminasyonu önlemek amacı ile dekontaminasyon işlemleri uygulanmıştır. Dekontaminasyon işlemleri fiziksel, kimyasal ve ultroviyole ışınına maruz bırakma aşamalarından oluşmaktadır. Dekontaminasyon işlemleri sonrasında örnekler toz haline getirilmiştir ve dekalsifikasyon işlemleri yapılmıştır. Dekalsifikasyon aşamasından sonra DNA izolasyonu yapımıştır. Elde edilen DNA ların miktar ve saflığını tespit edildikten sonra X-STR (Short Tandem Repeat) kiti kullanılarak PZR yapılmıştır. Dekontaminasyon İşlemleri Çalışmada kullanılan dört farklı bireye ait femur kemiğinin dış kısmında bulunan kaba toprakları temizlemek amacıyla fiziksel dekontaminasyon işlemi uygulanmıştır. Çalışmaya başlamadan önce temizliğin yapılacağı alan çamaşır suyu ile temizlenmiştir. Femur kemiklerinin dış kısmı yumuşak diş fırçası kullanılarak kaba topraklar uzaklaştırılmıştır (Şekil-1). Her bir örnek için ayrı diş fırçası kullanılmıştır. Daha sonra zımpara kullanılarak örneklerin dış yüzeyi temizlenmiştir (Şekil-2). 542 Şekil-1 Femur kemiklerinin dış yüzeyinde bulunan topraklar diş fırçası kullanılarak uzaklaştırılmıştır

6 Şekil-2 Giresun Adası Kazısından çıkartılmış olan femur kemiklerinin dış kısmı zımpara kullanarak temizlenmiştir Fiziksel olarak temizliği tamamlanan femur kemiklerine kimyasal dekontaminasyon işlemi uygulanmıştır.kimyasal dekontaminasyon işleminde tek kullanımlık diş fırçası ve Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) kullanılarak yapılan çözelti ile temizlenmiştir. Fiziksel ve kimyasal temizlik işlemleri tamamlanan örnekler ultroviyole ışını altında 5 er dakika bekletilmiştir. Diş örneklerinde ise sadece kimyasal temizlik işlemi yapılmıştır (Şekil-3) 543 Şekil-3 Giresun Adası Kazısından çıkartılmış olan 23 numaralı bireye ait mandibula SDS çözeltisi kllanılarak kimyasal temizliği yapılmıştır Pulverizasyon (Toz Haline Getirme) Pulverizasyon işleminden önce femur kemiklerinin distal kısmından demir testeresi kullanılarak kesit alınmıştır. Herbir örnek için demir testeresinin ucu değiştirilmiştir. Kesilmiş parçalar hassas terazide tartıldıktan sonra porselen havanda sıvı azot kullanılarak toz haline getirilmiştir (Şekil-4).Toz haline getirilen örnekler 50 milimetrelik (ml) tüplere konulmuştur ve dekalsifikasyon işlemine geçilmiştir. Dişlerden DNA izolasyonu yapmak için ise diş hekimleri tarafından dişten pulpa çıkarılımıştır ve 2 ml lik tüplere konulmuştur.

7 Şekil-4 Femur kemiklerinden kesit alındıktan sonra sıvı azot kullanılarak toz haline getirilmiştir Dekalsifikasyon Aşaması Toz haline getirilmiş femur kemikleri 50 ml lik tüplere koyulduktan sonra üzerine 30 ml. kadar hazırlanmış olan 0,5 M (ph 7,5) Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) eklenmiştir. Tüpün kapağı parafilm ile sarılarak,4( )C de buzdolabında karıştırıcının içine konulmuştur ve 3 gün boyunca dekalsifiye edilmiştir. Dekalsifikasyon işleminde ilk gün sonunda kemik tozunun olduğu tüp 3000 rpm de 15 dakika santrifüj edilmiştir. Üst kısım pipet ile çekilerek atıldıktan sonra 30 ml EDTA eklenerek tekrardan inkübasyona bırakılmıştır.3.gün sonunda su ile yıkama işlemi yapılarak dekalsifikasyon aşaması tamamlanmıştır. Pulpa elde edilen diş örneklerine ise 0,5 M (ph 7,5)EDTA eklenerek 3000 rpm de 10 dakika santrifuj edilmiştir. Üst kısım atılarak, distile su ile yıkama yapılmış ve dekalsifikasyon işlemi tamamlanmıştır. 544 DNA İzolasyonu Dekalsifikasyonu tamamlanan örneklere fenol/kloroform DNA izolasyon yöntemi uygulanmıştır. 1. Dekalsifikasyonu tamamlanan örnekler 2 ml. lik ependorfa aktarılarak üzerine Tris EDTA çözeltisi, Sodyum Klorür (Nacl) Triton X 100, Proteinase K eklendi. 2. Örnekler 1 gece 56 C de bekletildi. 3. Ertesi gün çalışılacak örneklere Proteinase K ve DTT (Dithiothreitol) eklendi. 4. Örnekler 1 gece 56 C de bekletildi. 5. Ertesi gün örnekler üzerine eşit hacimde fenol kloroform izoamilalkol eklenerek karıştırıldı rpm de santrifüj edildi. 7. Üst kısım temiz bir ependorfa alınarak eşit hacimde soğuk isopropil alkol ve 1/10 oranında Na-Acetate eklendi C de 5 saat bekletildi rpm de 20 dakika santrifuj edildi ve üst kısım pipet ile atıldı. 10. Örnek üzerine soğuk etanol eklendi ve rpm de santrifuj edildi. 11. Etanol pipet ile dikkatli bir şekilde atıldı.

8 C de kurumaya bırakıldı. Kuruyan pellet su ile çözdürüldü ve -80( )C de muhafaza edildi. DNA nın Miktar ve Kalitesinin Belirlenmesi DNA nın saflığı ve miktarı spektrofotometre kullanılarak değerlendirilir. Bu amaçla Nanodrop ND 1000 spektrofotometre cihazı kullanılarak DNA izolasyonu yapılan örneklerin 230/260 nanometredeki (nm ) ve 260/280 nanometredeki ölçümleri yapılmıştır. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) Kemik ve diş örneklerinden DNA izolasyonu yapıldıktan sonra QIAGEN Investigator Argus X- 12, X-STR kiti kullanılarak PZR mixi hazırlanmıştır ve PZR işlemi GeneAmp PZR Sistemi 9700 cihazında gerçekleştirilmiştir. 94( ) C de 4 dakika denatürasyon aşamasından sonra 96 ( ) C de 30 sn.(saniye), 63 ( ) C de 120 sn., 72 ( ) C de 75 sn., 5 döngü, 94 ( ) C de, 30 sn, 60 ( )C de, 120 sn, 72 ( ) C de 75 sn., 27 döngü ve 68 ( ) C de 65 sn. son uzama olacak şekilde ayrlanarak yapılmıştır.pzr işleminden sonra elde edilen ürünler, kapiller elektroforez cihazı (ABI Prism 310 Genetik Analizi) kullanılarak yürütme işlemi gerçekleştirilmiştir. 3.BULGULAR Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Adli Tıp Anabilim Dalı DNA Laboratuvarın a getirilen kemik ve diş örneklerine kontaminasyonu engellemek amacıyla öncelikle dekontaminasyon işlemleri uygulanmıştır. Fiziksel ve kimyasal dekontaminasyon işlemleri sırasında 19 numaralı femur kemiğinin distal kısımında kırık olduğu gözlemlenmiştir (Şekil-5) ve bu kırık kısımda kontaminasyon riskinin olduğu düşünülerek, kırık olmayan kısımdan kesit alınmıştır. Diğer femur kemiklerinde kırık veya çatlak gözlenmemiştir. 545 Şekil-5 Fiziksel ve kimyasal dekontaminasyon işlemleri sırasında 19 numaralı femur kemiğinde kırık olduğu gözlemlenmiştir Femur kemikleri sıvı azot kullanılarak kolay bir şekilde toz haline getirilmiştir. Çalışma kapsamında materyal olarak kullanılan 4 farklı maxilla-mandibulada üzerinde bulunan diş örneklerinden pulpa çıkarılmadan önce örnek seçimi yapılmıştır. Mandibula üzerinde bulunan diş örenklerinin kullanımı tercih edilmiştir. Femur kemiği ve diş örneklerinden fenol/kloroform yöntemi ile DNA izolasyonu yapılmıştır.dna izolasyonundan sonra DNA miktar ve saflığı ölçülmüştür ve elde edilen değerler ile kullanılan pulpa ve kemiklerin toz miktarı Tablo-2 de verilmiştir.

9 Tablo-2 DNA İzolasyonunda kullanılan kemik tozu ile pulpa miktarları ve DNA izolasyonu sonucunda elde edilen DNA miktar ve saflık ölçümleri Örnek Numarası Miktar ng/ µl 260/280nm 260/230nm DNA İzolasyonu için Kullanılan Kemik Tozu (gr) 17 5,4 1,22 0, Femur Buluntu Türü 17 17,4 1, Mandibula 19 56,7 1,42 0,12 0,30 Femur 19 37,9 1,45 0,52 0,17 Mandibula 21 44,9 1, Mandibula 22 17,6 1,45 0,08 0,13 Mandibula 23 77,7 1,34 0,27 0,14 Diş 33 66,0 1,39 0,45 0,08 Diş 35 46,1 1,29 0,33 0,42 Diş 36 18,5 1,33 0,10 0,15 Diş 38 5,09 2,09 0,10 0,04 Diş 38 46,1 1,29 0,33 0,42 Femur 40 8,5 1,41 0,05 0,42 Femur 546 DNA izolasyonundan sonra QIAGEN X-STR Kiti kullanılarak PZR mixi hazırlanmıştır. Çalışmada toplamda 4 adet femur,4 adet mandibula üzerinde bulunan diş örnekleri ve çene üzerinde bulunmayan 5 adet diş örneği kullanılmıştır. Yapılan PZR sonrasında femur kemiklerinde ve toplamda 5 adet diş örneğinin amelogenin gen bölgesinde amplifikasyon olduğu bulunmuştur ve şekil-6 da erkek bir bireye ait, şekil-7 de dişi bir bireye ait X-STR PZR sonucunda oluşan elektroforez görüntüsü verilmiştir. Moleküler analizler ile antropolojik incelemeler sonucunda elde edilen bulgular toblo-3 te verilmiştir). Şekil-6 X-STR sonucunda 33 numaralı bireyin diş örneğinde amelogenin gen bölgesinin X ve Y kromozomlarında amplifikasyon oluşmuştur ve cinsiyeti erkek olarak belirlenmiştir

10 Şekil-7 X-STR sonucunda 40 numaralı bireyin femur örneğinde amelogenin gen bölgesinin sadece X kromozomunda am plifikasyon oluşmuştur ve cinsiyeti dişi olarak belirlenmiştir Tablo-3 Kemik ve diş örneklerinden elde edilen moleküler ve antropolojik bulgular Örnek Numarası Antropolojik Bulgu Moleküler Bulgu 17 Femur Erkek Dişi 17 Mandibula Erkek Dişi 19 Femur Erkek Dişi 19 Mandibula Erkek Dişi 21 Mandibula Erkek Belirlenemedi 22 Mandibula Dişi Belirlenemedi 23 Diş Dişi Dişi 33 Diş Erkek Erkek 35 Diş Dişi Belirlenemedi 36 Diş Dişi Belirlenemedi 38 Diş Erkek Belirlenemedi 38 Femur Erkek Dişi 40 Femur Dişi Dişi 4.TARTIŞMA VE SONUÇ 547 Bu çalışmada Giresun Adası Kazısından çıkartılan femur ve diş örnekleri adna çalışması yapılması amacıyla Giresun Müze Müdürlüğü tarafından gerekli izin belgesi alındıktan sonra laboratuvarda çalışmalara başlanmıştır. Antik DNA çalışmalarında uygulanması gereken prosedürler modern DNA çalışmaları ile aynıdır,ancak çalışılan örnekler tarih öncesi döneme ait olduğundan dolayı DNA degredasyonu meydana gelmektedir.antik DNA çalışmalarında oluşabilecek kontaminasyon riski yanlış sonuçlara neden olacağı için Yang ve Watt ın (2005) çalışmaları dikkate alınarak fiziksel,kimyasal dekontaminasyon ve ultroviyole ışını bütün örneklere uygulanmıştır. Uzun süre toprak altında kalmış olan kemik ve diş örneklerinde Ca ve Mg iyonunun birikmesiyle kalsifikasyon oluşmaktadır ve bu durumda DNA elde etmeyi güçleştirmektedir (Cemper-Kiesslich, 2014). Yapılan PZR sonuçlarına göre 4 adet femur kemiğinde amelogenin gen bölgesinde amplifikasyon oluşmuştur,ancak çalışılan 9 adet diş örneğinin 5 inde amplifikasyon oluşmamıştır. Dişlerde pulpa içerisinde DNA nın çok iyi korunduğuna dair

11 çalışamalar mevcuttur (Pfeiffer, 1999; Alakoç 2007; Higgins ve Austin, 2013). Bu çalışmada dişlerden elde edilen pulpa miktarı yeterli olmadığı için DNA izolasyonu tekrar edilememiştir. Kemik ve diş örneklerine uygulan dekalsifikasyon işleminin dişlerde DNA kaybının olabileceğini düşündürmektedir. Antik DNA çalışmalarında degredasyon ve kontaminasyon sorunu önemli olduğu kadar eski örneklerden DNA elde edilmesinde uygulanan DNA izolasyon yöntemi de oldukça önemlidir.bu çalışmada kullanılan fenol/kloroform DNA izolasyon yöntemi sonucunda Bizans döneminde yaşamış toplamda 13 örnek ile çalışılmıştır ve %61,5 oranında bir başarı sağlanmıştır.dna izolasyonu kadar kullanılan PZR kiti de bu çalışmada önemli olmaktadır.kullanılan PZR kitinde 1ng DNA yeterli olmaktadır,ancak eski örneklerde DNA miktarı kadar DNA kaliteside önemli olmaktadır ve nanadrop ölçümünde insan ait saf DNA dışında ekzojen DNA da ölçülmektedir. X-STR kiti ile ekzojen DNA veya kontaminasyonun olup olmadığı belirlenmektedir.özelliklede antik DNA çalışmalarında uygulanan protokoller bu noktada çok önemlidir. Çünkü antik örneklerde az miktarda bulunan DNA, kontaminasyon oluştuğu zaman PZR da ekzojen DNA amplifiye olacaktır ve kapiller elektroforez yerine agaroz jel kullanımında görülecek olan bantlar aslında kontamine DNA ya ait olmaktadır ve bu durumda bize yanlış sonuç verecektir. X-STR PZR kitinin ve kapiller elektroforez kullanımında 12 gen bölgesinden modern DNA örneklerinde tüm bölgelerde amplifikasyon oluşurken başarılı bir DNA izolasyonu ve PZR sonucunda antik örneklerde amelogenin gen bölgesinde amplifikasyon oluşmaktadır. Amelogenin gen bölgesinin bir alleli 106 bç., diğer alleli de 112 baz çifti uzunluğundadır (Sullivian ve ark., 1993; Faerman ve ark., 1997). Yapılan bu çalışmada amplifikasyon oluşmayan diş örneklerinde hiçbir pik görülmemiştir ve amplifikasyon oluşan bireylerde de sadece amelogenin bölgesinde amplifikasyon oluşmuştur. Bu durum laboratuvar personelinden veya dış ortamdan kaynaklı ekzojen DNA nın olmadığını göstermektedir. Moleküler çalışmalar sonucunda elde edilen veriler, iskeletler üzerinde yapılan morfolojik incelemeler sonucunda elde edilen cinsiyet sonuçları ile karşılaştırılmıştır.17 ve 19 numaralı bireye ait femur kemiği ile diş örnekleri çalışılmıştır. Bu örneklerde amplifikasyon oluşmuştur ve 17 ve 19 numaralı bireyin cinsiyeti moleküler çalışmalar sonucunda dişi, morfolojik incelemeler sonucunda ise cinsiyetin erkek olduğu belirlenmiştir. 38 numaralı bireye ait diş örneğinde amplifikasyon oluşmadığı için cinsiyet belirlenememiştir, ama femur kemiğinde 106 baz çiftinde bir pik oluştuğu için cinsiyet dişi olarak belirlenmiştir. Bu üç bireya ait antropolojik ve moleküler cinsiyet sonuçları birbirini desteklememektedir. Bu örneklerin PZR sonucunda yapılan elektroforez görüntülerinde sadece amelogenin gen bölgesinde amplifikasyonun oluşması, diğer gen bölgelerinde hiçbir pik vermemesi kontaminasyondan dolayı yanlış sonuç ihtimalini ortadan kaldırmaktadır. Toplu gömülerde bireylerin yan yana veya üst üste düzensiz bir şekilde gömülmüş olması morfolojik incelemeler ile cinsiyet belirlemede yaklaşık olarak %12 oranında bir hataya neden olmasını belirten çalışmalar vardır (Kaestle ve Horsburgh, 2002). Morfolojik cinsiyet tayini ve DNA ya göre yapılan cinsiyet tespiti farklılıklarının ortaya çıkması beklenmedik bir bulgudur. Giresun Adası / Khalkeritis Nekropolü kazısından çıkartılan ve moleküler analizler için laboratuvara getirilen kemikler genel olarak iyi korunmuştur. Ancak, iskeletlerin yan yana gömülü olması ve kemiklerin karışık durumda olması birey tayininin yapılmasını zorlaştırmıştır. Ayrıca kazılarda bazen iskelet materyalleri parçanmış şekilde ve bazen de bireylerin kemiklerinin eksik olmasından cinsiyet tespitini zorlaştırmaktadır. Bu gibi durumlarda kimliklendirmenin temelini oluşturan cinsiyet tespitinde DNA analizlerinin önemini ortaya koymaktadır. Ayrıca fen bilimlerinde araştırma yapan moleküler biyologlar ile sosyal bilimlerde araştırma 548

12 yapan arkeolog ve antropologlar arasında kurulan iletişim ve yapılan ortak çalışmalar ile tarih öncesi dönemde yaşayan insanlar hakkında ortak bir verini sağlanması açısından multidisipliner çalışmaların önemli olduğu ortaya konulmuştur. Teşekkürler Giresun/Khalkeritis Adası Kazısından çıkartılan iskeletleri DNA analizleri için izin veren Doç.Dr. Ertekin Doksanlatı ya, iskeletlerin morfolojik incelemeleri ile ilgili bilgileri veren Yrd. Doç.Dr. Seda Karaöz Arıhan a ve arkeolog Emel ACAR a teşekkürler. Ayrıca doktora tezi kapsamında yapılan bu çalışma Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri tarafından desteklenmiştir.(proje Numarası: 15L ) KAYNAKLAR Akbaba, Ali, (2012),Moleküler Antropolojide Antik DNA (adna) Çalışmaları ve Kontaminasyon Problemleri, Yüksek Lisans Tezi, Ahi Evran Üniversitesi, Kırşehir. Acar, E., (2015),Giresun/ Khalkeritis (Aretias) Adası Nekropolü ve İskeletlerin Paleoantropolojik Analizi, Yüksek Lisans Tezi, Selçuk Üniversitesi, Sosyal Bilimler Enstitüsü, Konya. Bollongino,R., Vigne,JD.,(2008), Temperature monitoring in archaeological animal bone samples in the Near East arid area, before, during and after excavation,journal Archaeological Sciences, 34 (4), Buıkstra, JE., UBELAKER, DH., (1994). Standards for data collection from human skeletal remains. Arkansas: Arkansas Archeological Survey Research Series No.4. Burger,J., Hummel,S., Herrman,B., Henke,W., (1999), DNA preservation: A microsatellite- DNA study on ancient skeletal remains.electrophoresis, 20, Cemper-Kiesslich,J., Coy,MR., Kanz,F.,(2014), Ancient DNA and Forensic Mutual Benefits:A Practical Sampling and Laboratory Guide Through a Virtual Ancient DNA Study,Adli Tıp Bülteni,19(1)-14. Çırak, Asuman, (2009), Kelenderis İskeletlerinin Paleoantropolojik Analizi ve Anadolu Toplumları Arasındaki Yeri, Doktora Tezi, Ankara Üniversitesi, Sosyal Bilimler Enstitüsü, Antropoloji Anabilim Dalı, Ankara. Daskalaki,E., (2004), Archaeological Genetic-Approaching Human History through DNA Analysis, Digital Comprehensive Summaries of Uppsala Dissertations from the Faculty of Science and Technology 1101,Uppsala Univercity,Swedish. Doksanaltı, EM.,Mimiroğlu,ĠM.,Güleç,H.,(2011),Giresun (Aretias-Khalkeritis) Adası Kazısı Ön Rapor:Anadolu ve Çevresinde Ortaçağ, AKVAD, Ankara, s:

13 Faerman,M., Filon,D., Kahila,G., Greenblatt,CL.;Smith,P., Oppenheim,A., (1995), Sex identification of archaeological human remains basen on amplification of the X and Y amelogenin alleles,genetics,29;167(1-2): Higuchi, R., Bowman, B., Freiberger, M., Ryder, OA., Wilson, AC., (1984), DNA sequences from the quagga, an extinct member of the horse family,nature. 312: Krogman, WM., İşcan, MY., (1986). The Human Skeleton in Forensic Medicine.Illionis, Charles C. Thomas Kaestle, FA.ve Horsburgh, KA., (2002).Ancient DNA in anthropology: Methods, applications, and ethics, American Journal Pysical Anthropology, Suppl. 35: Kemp,BM.,Smith,DG., (2005), Use of eliminate contaminating DNA from the surface of bones and teeth. Forensic Science İnternational, 154 s: Malaver,PC., Yunıs,JJ., (2003), Different dental tissues as a source of DNA for human identification in forensic cases, Croatian medical Journal.44: Mullis,K.,Faloona,F.,Scharf,S.,Horn,G;Erlich,H.,(1986), Spesificenzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction, Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 51: Ortner,DJ., Putschar,WGJ.,(1981), Identification of Pathological Conditions in Human Skeletal Remains,Washington.DC.,Smithsonian Institution Press. Pääbo,S., (1985), Molecular cloning of Ancient Egyptian mummy DNA,Nature 314, ,10,1038/314644a. Pääbo,S., Poinar,H., Serre,D., JaenickeDespres,V., Hebler,J;,Rohland.,N.;Kuch,M., Krause,JVigilant,L., Hofreiter,M., (2004), Genetic analyses from ancient DNA,Annual Review Genetics, 38: O Rourke,DH.,Hayes,MG.,Carlyle,SW., (2000), Ancient DNA studies in physical anthropology,annual Review Anthropoogical Stone,A.;Milner,GR.;Pääbo,S.;Stoneking,M., (1996), Sex Determination of Ancient Human Skeletons Using DNA,American Journal of Physical Anthropology 99: Singh,J.;Garg,A., (2014), Ancient DNA Analysis And Its Probable Applications In Forensic Anthropology,Journal Punjab Acad Forensic Medicine Toxicology, 14. Tekeli,E.;Elma,C.,(2016), Antropolojik Kemik Örneklerinden Antik DNA Çalışması,Ankara Üniversitesi Dil ve Tarih Coğrafya Fakültesi Antropoloji Dergisi,Sayı:2,s

14 Ubelaker,DH., (2008), Biological Anthropology of the Human Skeleton.Second Edition, Edited by M.Anne Katzenberg and Shelley R.Saunders, s: Yang,DY.,Watt,K.,(2005), Contamination controls when preparing archaeological remains for ancient DNA analysis,journal of Archaeological Science 32, Workshop of European Antropologists (WEA) (1980),Recommendations for Age and Sex Diagnoses of Skeletons, Journal of Human Evolution, 9 (7):