AB CELIACHIA Kod 02-10C Kod 02-10A Kod 02-10R

Transkript

1 KULLANICI KILAVUZU AB CELIACHIA Kod 02-10C Kod 02-10A Kod 02-10R DQ2 ve DQ8 haplotipleri ile ilişkili HLA alellerinin seçici amplifikasyonu ile CELIAC Hastalığının genetik yatkınlığını belirlemek için kit R-50_ _TR.doc

2

3 1. ÜRÜN BİLGİSİ 3 2. KİT İÇERİĞİ 4 3. REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI 5 4. KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER 6 5. GÜVENLİK KURALLARI Genel güvenlik kuralları Kit hakkında güvenlik kuralları 8 6. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN MATERYALLER Reaktifler Cihazlar Materyaller REAKTİF HAZIRLAMA GİRİŞ TEST PRENSİBİ ÜRÜN TANIMI ÖRNEK TOPLAMA, MANÜPULASYON VE ÖN-MUAMELESİ PROSEDÜR DNA EKSTRAKSİYONU (taze ya da donmuş tam kandan) DNA AMPLİFİKASYONU AMPLİFİKASYON ÜRÜNLERİNİN GÖRÜNTÜLENMESİ Agaroz jel elektroforezi Örnek yükleme SONUÇLARIN YORUMLANMASI SORUN GİDERME TEST LİMİTLERİ R-50_ _TR.doc 1

4 16. TEST PERFORMANSI Özgünlük Doğruluk, Duyarlılık ve Diagnostik özgünlük BİBLİYOGRAFİK REFERANSLAR Yararlı web siteleri R-50_ _TR.doc

5 1. ÜRÜN BİLGİSİ AB CELIACHIA COMPLETE DQ2 ve DQ8 haplotipleri ile ilişkili HLA alellerinin seçici amplifikasyonu ile CELIAC Hastalığının genetik yatkınlığını belirlemek için kit Kit; DNA ekstraksiyonu, amplifikasyon ve agaroz jel elektroforezi ile görüntüleme için gerekli tüm reaktifleri, örnek amplifikasyonunun internal kontrolü ve pozitif kontrol içerir. Kod Ürün Pkg 02-10C-25 AB CELIACHIA 25 test 02-10C-50 AB CELIACHIA 50 test AB CELIACHIA DQ2 ve DQ8 haplotipleri ile ilişkili HLA alellerinin seçici amplifikasyonu ile CELIAC Hastalığının genetik yatkınlığını belirlemek için kit Kit; DNA ekstraksiyonu, amplifikasyon ve agaroz jel elektroforezi ile görüntüleme için gerekli tüm reaktifleri, örnek amplifikasyonunun internal kontrolü ve pozitif kontrol içerir. Kod Ürün Pkg 02-10A-25 AB CELIACHIA 25 test 02-10A-50 AB CELIACHIA 50 test AB CELIACHIA amplifikasyon reaktifleri DQ2 ve DQ8 haplotipleri ile ilişkili HLA alellerinin seçici amplifikasyonu ile CELIAC Hastalığının genetik yatkınlığını belirlemek için kit Kit; DNA amplifikasyonu için reaktifler, örnek amplifikasyonunun internal kontrolü ve pozitif kontrol içerir. Kod Ürün Pkg 02-10R-25 AB CELIACHIA 25 test 02-10R-50 AB CELIACHIA 50 test 02-10R-50_ _TR.doc 3

6 2. KİT İÇERİĞİ NOT: Kit içeriğinde farklı kodlarda farklı komponentler bulunur. (kısaltma: X= kit içeriğinde bulunan komponent; 0= kit içeriğinde bulunmayan komponent) KUTU P 20 C DE SAKLANIR Kod 02-10C Kod 02-10A Kod 02-10R AÇIKLAMA ETİKET TÜP RENGİ (T) ya da CAP 25 test 50 test 8 test X X sx Multiplex I tüp Renksiz (T) sx sx sx Multiplex II tüp Pembe (T) sx sx sx Multiplex III tüp Mavi (T) sx sx sx Thermostable SuperTAQ DNA polymerase AB SUPERTAQ 5 U/μL Kırmızı 1X50μL 1X100μL 1X16μL sx sx sx Protease Protease Yeşil 6X100μL 12X100μL 2X100μL KÜÇÜK ÇANTA 20 C DE SAKLANIR Kod 02-10C Kod 02-10A Kod 02-10R AÇIKLAMA ETİKET TÜP RENGİ (T) ya da CAP 25 test 50 test 8 test sx sx sx Multiplex I pozitif kontrol sx sx sx Multiplex II pozitif kontrol sx sx sx Multiplex III pozitif kontrol KUTU F Multiplex I pozitif kontrol Multiplex II pozitif kontrol Multiplex III pozitif kontrol Mavi 1X27μL 1X45μL 1X9μL Mavi 1X27μL 1X45μL 1X9μL Mavi 1X27μL 1X45μL 1X9μL +2 / +8 C DE SAKLANIR Kod 02-10C Kod 02-10A Kod 02-10R AÇIKLAMA ETİKET TÜP RENGİ (T) ya da CAP 25 test 50 test 8 test sx sx 0 Ethidium Bromide solusyonu (2,5 mg/ml) Ethidium Bromide toksik R 2368 S 36/37 45 Kırmızı 1X180μL 1X300μL 1X110μL sx sx 0 Boyut markır Boyut markır Sarı 1X190μL 1X370μL 1X90μL R-50_ _TR.doc

7 KUTU A +15 / +25 C DE SAKLANIR Kod 02-10C Kod 02-10A Kod 02-10R AÇIKLAMA ETİKET TÜP RENGİ (T) ya da CAP 25 test 50 test 8 test sx sx 0 sx sx 0 Agarose Molecular Biology grade Elektroforez buffer TRIS-Acetate-EDTA, ph 8,00 sx sx 0 Hücresel lizis solusyonu sx 0 0 Yıkama Solusyonu sx 0 0 Yıkama Solusyonu sx 0 0 Elusyon Solusyonu AGAROSE 1X20g 1X40g 1X6g 50 X TAE 1X33mL SOLUSYON 1 SOLUSYON 2 SOLUSYON 3 Elusyon Solusyonu 1X125m L 1X24mL 1X6mL 1X12mL 1X3mL 1X22mL 1X44mL 1X11mL 1X21mL 1X42mL 1X10mL 1X11mL 1X22mL 1X5mL sx 0 0 Filtre Kolonları sx ml Tüpler REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI Kitin herbir komponenti, tekli kutuların etiketlerinde belirtilen talimatlara gore saklanmalıdır. Özellikle: KUTU P Küçük çanta KUTU F KUTU A -20 C de saklanır -20 C de saklanır +2/+8 C de saklanır +15 / +25 C de saklanır Önerilen sıcaklıkta saklandığında, tüm test reaktifleri son kullanım tarihine kadar stabil kalır R-50_ _TR.doc 5

8 4. KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER Kit; moleküler biyoloji tekniklerini diagnostikte uygulama eğitimi almış ve tecrübesi olan araştırmacı tarafından kullanılmalıdır; Kit prosedürüne başlamadan önce kullanım kılavuzunu dikkatlice ve tamamen okuyun; Ürünleri ısı kaynağından uzakta tutun; Son kullanım tarihi geçmiş kitparçalarını kullanmayın; Saklama koşulları, kutu bütünlüğü ya da metod uygulaması ile ilgili herhangi bir şüpheniz olduğunda, AB ANALITICA teknik destek ile bağlantı kurun: Nükleik asitlerin amlifikasyonunda, araştırmacı aşağıdaki özel önlemleri almalıdır: Filtreli uç kullanın; Biyolojik örnekler, ekstrakte edilmiş DNA, kit içeriğindeki pozitif kontrol ve tüm amplifikasyon ürünleri, amplifikasyon reaktiflerinden farklı bir yerde saklanmalıdır. PCR öncesi ve sonrası için farklı alanlar hazırlayın ve iki alan arasında materyal (pipetler, uçlar, tüpler, vs.) paylaşımı yapmayın. Sık sık eldiven değiştirin. Benç yüzeyini %5 sodyum hipoklorit ile temizleyin R-50_ _TR.doc

9 5. GÜVENLİK KURALLARI 5.1. Genel Güvenlik Kuralları Reaktifler ve klinik örnekler ile çalışırken tek kullanımlık eldiven kullanın ve çalışma bitiminde ellerinizi yıkayın. Ağızla pipetleme yapmayın. Bilinen hiçbir diagnostik metod enfeksiyon ajanlarının yokolduğunun garantisini vermediğinden, herbir klinik örneğin potansiyel enfeksiyonlu olduğu göz önünde bulundurulup, bu şekilde çalışılması gereklidir. Klinik örnekler ile direk temasta olan cihazların kontaminasyonlu olduğu ve bu şekilde kullanılması gerektiği göz önüne alınmalıdır. Örneklerin kazara etrafa dökülmesi durumunda, %10 Sodyum Hipoklorit ile temizleyin. Temizlenmiş materyaller, kontamine ürünler için olan özel konteynerlere atılmalıdır. Klinik örnekler, materyaller ve kontamine ürünler aşağıdaki dekontaminasyondan sonra atılmalıdır: 30 dakika %5 Sodyum Hipoklorit (1 volüm %5 Sodyum Hipoklorit solusyonu herbir 10 volüm kontaminasyonlu sıvı için) solusyonuna batırılmalı YA DA en az 2 saat 121 C de otoklavlanmalı (NOT: Sodyum Hipoklorit içeren solusyonları otoklavlamayın!!) 02-10R-50_ _TR.doc 7

10 5.2. Kit Hakkında Güvenlik Kuralları Bu kit kullanımı için riskler teklikomponentler ile ilişkilidir: Tehlikeli Komponentler: ETHIDIUM BROMIDE (02-10Cve 02-10A içinde bulunur) 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridiumbromide (Ethidium Bromide) <2% Risk tanımı: T (Toksik) RİSK İBARESİ VE S İBARESİ R 23 ve R 68 S 36/37 45 İnhalasyon için toksik. Geri dönülmez etkiler riski. Laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven kullanın. Kaza veya rahatsızlık durumlarında, doktora başvurun ve paket etiketini gösterin. R ve S ibareleri kit ile sağlanan konsantre ürünlere işaret etmektedir. Özellikle Ethidium Bromide için, agaroz jelde dilusyona kadar. Konsantre Ethidium Bromide uygulamasında kimyasal dağıtıcı buharlı kabin kullanın. Seyreltilmiş Ethidium solusyonu ile çalışırken daima laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven giyin. Bu ürünler genel çöplere atılamaz. Kurutucu system kullanılmamalıdır. Atılım için yasal kuralları uygulayın. Ethidium Bromide kaza ile dökülmesi durumunda Sodyum Hipoklorit ve su ile temizleyin R-50_ _TR.doc

11 SOLUSYON 1 ve SOLUSYON 2 (0210C kitinde bulunur) Solusyon 1 ve 2 guanidinium hydrochloride içerir. Risk tanımı: Zararlı ve tahriş edici RİSK İBARESİ VE S İBARESİ R ve R 38 S Yutulursa toksiktir. Deri ve gözleri tahriş edicidir. Yiyecek ve içeceklerden uzak tutun. Gözler ile temas etmesi halinde, bol su ile yıkayın ve doktora başvurun. Koruyucu giysi ve uygun eldivenler kullanın. Kaza veya rahatsızlık durumunda, doktora başvurun ve kutuyu ya da etiketini gösterin. PROTEASE (02-10C kitinde bulunur) Risk tanımı: Duyarlılık ve tahrişe neden olabilir. RİSK İBARESİ VE S İBARESİ R 37 ve R S S 37; S 46 Yutulursa toksiktir. Deri ve gözleri tahriş edicidir. Deri ve gözler ile temasından kaçının. Gözler ile temas etmesi halinde, bol su ile yıkayın ve doktora başvurun. Koruyucu giysi ve uygun eldivenler kullanın. Kaza veya rahatsızlık durumunda, doktora başvurun ve kutuyu ya da etiketini gösterin. İstenildiğinde ürünlerin Güvenlik data sheet (MSDS) gönderilebilir R-50_ _TR.doc 9

12 6. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER 6.1. Reaktifler DNA ekstraksiyonu için reaktifler (02-10Ave 02-10R kitleri için); Steril DNase ve RNase free su; Distile su; 96% 100% Ethanol (02-10C kiti için); Agaroz jel elektroforezi ile amplifikasyon ürünlerinin görüntülenmesi için reaktifler (02-10R kiti için) Cihazlar Laminar flow kabini (kontaminasyondan korunmak için amplifikasyon premikse TAQ polymerase eklenirken kullanılması önerilir; ekstrakte DNa eklenirken başka bir laminar flow kabini kullanılması önerilebilir); Mikropipetler (aralık: 0,2-2 µl; 0,5-10 µl; 2-20 µl µl; µl); Thermalcycler; Thermoblock ya da Thermostatlı su banyosu; Mikrosantrifüj (max rpm); Tartı; Vorteks; Manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga; Kimyasal kabin (Ethidium Bromide uygulamasında kullanılması önerilir); Agaroz minijelin yatay elektroforez haznesi; Güç kaynağı ( V); UV Transilluminator; Foto kamera ya da imaj analizör Materyaller Tek kullanımlık eldivenler; Tek kullanımlık filtreli uçlar (aralık: 0,2-2 µl; 0,5-10 µl; 2-20 µl µl; µl); TAE dilusyonu için dereceli silindirler (1L); Agaroz jel hazırlamak için pyrex şişe ya da Becker; Parafilm R-50_ _TR.doc

13 7. REAKTİF HAZIRLAMA 1L 1X TAE buffer hazırlanması (reaktif 02-10A ve 02-10C kitlerinde bulunur): 20 ml 50X TAE ile 980 ml distile suyu karıştırın R-50_ _TR.doc 11

14 8. GİRİŞ Coeliac Hastalığının içerdiği HLA haplotiplerinin tanımlanması, teyit edilmesine ya da gluten duyarlı enteropathy hariç tutulumasına izin vermeyen küçük-intestin mukozanın histolojik, morfometrik (intraepitelyal lenfosit numarası) ve immunohistokimyasal değer (CD3, ab ve gd lenfosit incelemeleri) içeren hastalarında önemlidir. AB CELIACHIA kiti aşağıdaki maddelerden en az birini içeren olgularda kullanılabilir: Minimum ya da sınır çizgisinde mukozal lezyonlar görülmesi (villilerin yüksekliğinin azalması ve hiperplastik kriptlerin hafiflemesi); aşikar villus atrofisi yokluğunda serolojik antijen pozitivitesi görülmesi; histolojik doğrulama olmadan gluten-free diet ile tedaviye başlanan hastalarda normal mukoza görülmesi. Genetik araştırmalar, risk gruplarında CD hariç tutulan ilk seviye tarama testleri gibi kabul edilebilir (ilk derece göreceli, tip 1 diabetes mellitus hastaları, Down sendromundan etkilenmiş hastalar ve IgA eksikliği olan hastalar; Kaukinen ve arkadaşları,2002; Tonutti ve arkadaşları, 2001). CD, otoimmun gluten duyarlı enteropatidir; global populasyonda %0,3-1 prevalansile özellikle Kafkaslar arasında yaygındır (Tonutti ve arkadaşları, 2001);çevresel ve genetik faktörleri içeren multifaktöryel etiyoloji ile polijenik bir hastalıktır (Louka ve arkadaşlar, 2002; Sollid, 2002). CD hastanın tüm hayatı boyunca görülen (nadir istisnalar ile) klinik bir durumdur; kronik enflamasyon kendini villus atrofileri ve mukoza hasarı ile gösterir. Chromosome 6 locus DQB1 locus DQA1 locus DRB1 DQB1 DQA1 DRB1 Fig 1.: Schematic representation of chromosome 6, with evidence of the loci of HLA region (6p21.3) associated to coeliac disease. CD güçlü bir genetik yatkınlığa sahiptir: Monozigotik ikizlerde, uygunluk yaklaşık %70 ve ilk derece göreceliler arasında %5-10 dur. DQ2 heterodimer olarak da bilinen HLA-DQ2 antijen, CD ile etkilenen hastaların %90 ında bulunmuştur; antijen DQB1*02 ve DQA1*05 alelleri (αzincir ve β-zincir üreten) tarafından kodlanır; az sayıda DQ2 negatif olan R-50_ _TR.doc

15 coeliac hastasında sıklıkla DQ8 antijeni (DQB1*0302 ve DQA1*0301 tarafından kodlanan; Tonutti ve arkadaşları, 2001; Sollid ve arkadaşları, 1993; Lundin ve arkadaşları, 1993; Ploski ve arkadaşları, 1993; Sollid, 2002; Fig.2 ye bakın) için pozitivite görülür. DQB1* DQA1* DRB1* DQB1* DQA1* DRB1* *0201 *0501 *03 *0302 *03 *04 C *03 *0505 *11/12 *0202 *02 *07 HLA-DQ2 HLA-DQ8 Fig 2.: Schematic representation of the three main chromosomal patterns which are involved in the association between CD and HLA genes.. For each aplotype, both the homologue chromosomes in the region of the DQB1, DQA1 and DRB1 genic loci have been represented. A: HLA-DQ2 heterodimer encoded in cis.; B: HLA-DQ2 heterodimer encoded in trans; C: HLA-DQ8 heterodimer. Bir coeliac hastası üç farklı kromozomal patterni eksprese edebilir (Fig 2): Cis te kodlanan DQ2 heterodimer DRB1*0301-DQA1*0501-DQB1*0201 haplotipidir; trans'ta kodlanan DQ2 heterodimer DRB1*11 ya da 12- DQA1*0505-DQB1*0301 ve DRB1*07-DQA1*0201-DQB1*0202 haplotipidir; DQ8 heterodimer DRB1*04-DQA1*03-DQB1*0302 haplotipidir (Sollid, 2002). Coeliac hastalarının DQ α-zinciri, öncü peptidde bir aminoasidik tortudan farklı DQA1*0501 ve DQA1*0505 genleri tarafından kodlanır; DQ β-zinciri, membran-proksimal domaininde bir aminoasidik tortudan farklı DQB1*0201 ve DQB1*0202 genleri tarafından kodlanır. Bu farklılıklar hiçbir fonksiyonel sonuç içermez. Bu nedenle, coeliac hastaları aynı DQ antijen tarafından eksprese olan cis heterodimer DQA1*0501-DQB1*0201 ya da trans heterodimer DQA1*0505-DQB1*0202 ile karakterizedir (Sollid, 2002; Fig 1 bakın). AB CELIACHIA kiti,cdnin her üç kromozomal patterninin görülmesi ile belirlenebilir R-50_ _TR.doc 13

16 PCR-SSP tekniği ile coeliac DQ2 ve DQ8 haplotiplerinin moleküler belirlemesi AB CELIACHIA kitinde spesifiktir; dahası, hızlıdır ve kalifiye bir araştırıcı gerektirmez (serolojik teknikleriçin gereklidir); bu metod, CD de görülen sadece DQB1*02 alellerinin amplifikasyonu ve DQA1*05 alellerinin görülmesini garanti eder. Serolojik teknikler ile DQ2 fenotip tanımlaması bazen CD heterodimerlerinin görülmesini kapsamaz. 9. TEST PRENSİBİ PCR metodu (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) literatürde DNA amplifikasyonu için tanımlanan ilk metoddur (Saiki RK ve arkadaşları, 1985). Thermostable DNA polymerase ile DNA nın spesifik bir parçasının (hedef dizi) in vitro amplifikasyon reaksiyonu olarak tanımlanabilir. Reaksiyonda üç nükleik asit segmenti bulunur: Amplifiye olması için çift iplikli DNA kalıbı (hedef DNA) ve iki tek iplikli oligonükleotid primerler kalıp DNA ya spesifik olarak dizayn edilmiştir. DNA polymerase primerler tarafından işaretlenen bölgeden sentez işlemine başlar ve solusyonda serbest olarak bulunan tamamlayıcı nükleotidlerin (dntpler) eklenmesi ve bağlanması ile orjinal çift iplikli hedef DNA bölgesi ile aynı olan yeni çift iplikli DNA molekülünü sentezler. Çeşitli sikluslardan sonra, hedef diziye uygun olan milyonlarca DNA molekülü oluşturabilir. The PCR-SSP is a molecular typing technique that needs sequence-specific primers which identify an allel or a group of alleles The sensitivity of this test makes it particularly suitable for the application in laboratory diagnostics. Multipleks amplifikasyon, seçilmiş primer misklerinin kullanılması ile aynı reaksiyonda farklı DNA dizilerinin eş zamanlı amplifikasyonunu sağlar R-50_ _TR.doc

17 10. ÜRÜN TANIMI HLA alellerinin görülmesinin doğrulaması, CD yatkınlığına neden olan DQ2 ve DQ8 haplotipleri ile ilişkilidir; bu alellerin seçilmiş amplifikasyonunu gerçekleştirir: DQA1*0501, DQA1*0505, DQA1*02, DQB1*0201, DQB1*0202, DQB1*0302, DRB1*04; seçilmiş primerler, genlerin ikinci ve üçüncü eksonları içinde dizayn edilmiştir. Özellikle, bu strateji sadece üç multipleks amplifikasyon kullanılarak yedi alel amplifikasyonunu öngörür. Test, Tonutti ve arkadaşları tarafından (2001) CD yatkınlık belirlemesi için gerekli HLA antijenlerini belirten kılavuz ile gerçekleştirilir. Özellikle: 1 DQB1*0201 ve DQB1*0202 amplifikasyonu ile tanımlanan HLA-DQ2 antijen; 2 DQ2 heterodimeri α-zinciri kodlayan DQA1*0501 ve DQA1*0505 alelleri amplifiye edilmiştir. 3 DQB1*0302 amplifikasyonu ile tanımlanan HLA-DQ8 antijen. Dahası; bu kitte, DQA1*02 ve DRB1*04 alellerini tanımlayan ve amplifiye eden, trans ta kodlanan DQ2 heterodimerinin ve DQ8 heterodimerinin (sadece DQB1*0302 alelden oldukça) görülmesini doğrulayan spesifik primer çifti bulunur. Kitte, her bir multipleks için internal pozitif kontrol bulunur: Bu, 22q13.1 bölgesinde TST (thiosulfate sulfurtransferase-rhodanese) genidir; bu internal pozitif kontrolün iyi amplifikasyonu reaksiyonun doğru gidişatının garantisini verir ve bu nedenle HLA bandı göstermeyen amplifikasyon olgularında önemlidir. Belirleme sistemi, amplifikasyon ürünlerinin %3 agaroz jelde elektroforetik göçünden ve bunların UV de okunmasından oluşur. Görülen bantlar kolayca yorumlanabilecek ve CD haplotip tanımlamasına izin verecek olan elektroforetik pattern sağlar. Bu kit premiks formatındadır: Amplifikasyon için tüm reaktifler pre-mikstir ve Taq polymerase ve ekstrakte DNA eklenebilecek şekilde tekdoz test tüplerinde alikuatlanmıştır. Bu premiks formatı, kullanıcı için zaman kazancı ile amplifikasyon öncesi manipulasyon aşamalarını azaltır; reaktiflerin tekrar tekrar dondurup çözülmesini engeller ve hepsinden öte, bu format kontaminasyon riskini minimize eder, risk yanlış pozitif sonuçlara neden olur R-50_ _TR.doc 15

18 Bu amaçla, daima uygun amplifikasyon kontrolleri kullanın; özellikle, H 2 O da negatif kontrol herbir analiz bölümü için önerilir. Bu diagnostik kitin diğer bir avantajı her bir multikomplekste Cresol Red boyası görülmesidir. Yükleme buffer ekleme aşamasını engelleyerek direk jele amplifikasyon ürünleri yüklenmesini sağlar. Dahası, mineral oil kullanılmaması amplifikasyon ürünlerinin tüpten kolayca çekilmesini sağlar. PCR-SSP tekniği bazı avantajlar sağlar: İlk olarak; çok hızlı, ucuz ve kullanımı kolaydır; DQ2 ve DQ8 haplotipleri ile ilişkili alellerin spesifik ve seçici amplifikasyonuna izin verir; dahası, bir moleküler biyoloji laboratuarında normalde kullanılan cihazlara gerek duyar; eğer serolojik teknik ile karşılaştırılırsa, PCR-SSP kalifiye araştırmacıya gerek duymaz. Son olarak, PCR-SSO gibi hibridizasyon tabanlı teknikler ile karşılaştırıldığında daha hızlı, güvenilir ve doğrudur C kiti, fenol ya da kloroform gibi organik solventlerin kullanımını engelleyen hızlı DNA ekstraksiyon sistemi içerir ve bu 200 μl taze (ya da donmuş) tam kandan yaklaşık 6 μg DNA elde edilmesini sağlar R-50_ _TR.doc

19 11. ÖRNEK TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN- MUAMELESİ HLA-DQ2 ve HLA-DQ8 haplotipleriile ilişkili alellerin seçici amplifikasyonu tam kan örnekleri toplanması ile başlar. Örnek toplama tüm genel sterilite önlemlerini takip etmelidir. Kan, EDTA ya da Sodyum sitrat ile muamele edilmelidir. Heparin gibi diğer koagülasyon ajanları TAQ polymerase ın güçlü inhibitörleridir ve bu yüzden amplifikasyon reaksiyonunun verimliliğini bozar. Taze kan kısa bir süre +2 C / +8 C de saklanabilir; eğer bu kısa sürede DNA ekstrakte edilmeyecekse örneğin 20 C de saklanması gereklidir. 12. PROSEDÜR AB ANALITICA, ekstraksiyon sistemi de içeren standardize edilmiş AB CELIACHIA COMPLETE kiti (kod: 02-10C) kullanılmasını önerir. Saf ve integral DNA ekstrakte eden herhangi bir diğer ekstraksiyon yöntemi de kullanılabilir. Ekstrakte edilmiş DNA fotometrik ölçüm ile kantite edilmelidir. Her bir multiplekste kullanılacak ekstrakte DNA miktarı 120 ng olmalıdır ve bu yüzden sağlanan solusyon, herbir tüpte ekstrakte DNA miktarı 4 μl olacak şekilde seyreltilmelidir. Daha fazla detaylı bilgi için AB ANALITICA teknik destek ile irtibata geçin. laboratorio@abanalitica.it. Aşağıdaki ekstraksiyon prosedürü 02-10C kitine referanstır R-50_ _TR.doc 17

20 12.1. DNA EKSTRAKSİYONU (taze ya da donmuş tam kandan) NOT: Ekstraksiyon reaktifleri sadece 02-10C kitinde bulunur! 1. 1,5 ml tüplere 20 μl Protease koyun ve 200 μl taze ya da donmuş tam kan ekleyin. 2. Solusyon 1 i iyice vorteksleyin ve karıştırın, sonra örneklere 200 μl ekleyin. vorteks ile 15 saniye karıştırın C de 10 dakika inkübe edin. 4. Tüpteki damlacıkların çökmesi için kısa bir süre santrifüj edin, sonra 200 μl Ethanol (%96-100) ekleyin ve 15 saniye vorteksle karıştırın. 5. Kısa bir süre santrifüj edin, fltreli kolonlara miksi transfer edin, kapağını kapayın ve 8000 rpm de 1 dakika santrifüj edin. 6. Filtre kolonları başka bir 2 ml tüpe transfer edin ve filtrat içeren tarafa koyun. 7. Filtre kolonların kapaklarını açın ve 500 μl Solusyon 2 ekleyin, kapaklarını kapatın ve 8000 rpm de 1 dakika santrifüj edin. 8. Filtre kolonları başka bir 2 ml tüpe transfer edin ve filtrat içeren tarafa koyun. 9. Filtre kolonların kapaklarını açın ve 500 μl Solusyon 3 ekleyin, kapaklarını kapatın ve rpm de 3 dakika santrifüj edin. 10. Filtre kolonları 1,5 ml tüplere aktarın, filtratlı filtre alt uçlarının ıslak olmamasına dikkat edin. Eğer bu olmuşsa kısa bir süre santrifüjleyin. 11. Filtre kolonların kapaklarını açın ve 200 μl Elusyon Solusyonu ya da steril distile su ekleyin. Oda ısısında 1-5 dakika inkübe edin, sonra 8000 rpm de 1 dakika santrifüj edin. Filtratta bulunan ekstrakte ve purifiye DNA 20 C de saklanırsa en az bir yıl stabil kalır R-50_ _TR.doc

21 12.2. DNA AMPLİFİKASYONU Kpakatakitüm damlacıklar aşağı inene kadar multipleks I, II ve III kısa bir süre santrifüj etmenizi öneririz. Her bir örnek için üç test tüpünün her birine ekleyin: Komponent AB Taq Ekstrakte DNA (yaklaşık 120 ng DNA) Miktar/ reaksiyo n 0,3 μl 4 μl Her bir deneyde kontaminasyonun izlenmesi için bir negatif kontrol (mikse ekstrakte DNA erine steril su ekleyin) ve tüm markır bantlarını veren her bir multipleks için bir pozitif kontrol (pozitif kontrol kit içinde bulunur- ekstrakte DNA yerine multipleks I, II ve III İçine eklenmelidir). Kapaktaki damlacıkların tamamen tüp içine düşmesi için üç pozitif kontrol tüpünü kısa bir süre santrifüj etmenizi öneririz. Tüpleri aşağıdaki thermalcycler programına koyun: 1 cycle 96 C 4 min Denatürasyon 10 cycles 96 C 65 C 72 C 25 cycles 96 C 62 C 72 C 30 sec 40 sec 90 sec 30 sec 40 sec 90 sec Denatürasyon Bağlanma Uzama Denatürasyon Bağlanma Uzama 1 cycle 72 C 3 min Final Uzama 02-10R-50_ _TR.doc 19

22 Tablo 1: Multipleks amplifikasyon ürünlerinin uzunluğu MULTIPLEX N 1 bp TST 508 DQA1*0501 DQA1*0505 DQB1*0302 DQB1*0201 DQB1*0202 MULTIPLEX N bp TST 508 DRB1* DQA1*02 96 MULTIPLEX N 3 bp TST 508 DQB1*0201 DQB1* NOT: Bu tabloda rapor edilen renkler Fig. 2 deki ile aynıdır, fakat bunlar multipleks I, II ve III tüplerine referans değildir! R-50_ _TR.doc

23 12.3. AMPLİFİKASYON ÜRÜNLERİNİN GÖRÜNTÜLENMESİ Agaroz jel elektroforezi %3 agaroz jel hazırlanması: 1,5 g Agaroz tartın ve 50 ml 1X TAE içine dökün. Solusyonu berrak oluncaya kadar manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga içine bırakın. Jeli el ile dokunabilecek kadar soğumaya bırakın ve 10 µl Ethidium Bromide (2.5 mg/ml) ekleyin. NOT: Ethidium Bromide güçlü bir mutajenik ajandır; daima eldiven giyin ve bu reaktifle uygulama yaparken kimyasal güvenlik kabininin içinde çalışın. Jeli tarakları ile birlikte uygun bir dökme tankına koyun ve oda ısısında soğuyana kadar bekleyin ya da jel katı hale gelene kadar buzdolabına koyun. Jel katılaştığında, dikkatlice tarakları çıkarın (jel kuyucuklarına zarar vermemeye dikkat edin), tankı elektroforez haznesine alın ve jelin üzerini tamamen kaplayana kadar uygun miktarda TAE buffer ekleyin (yaklaşık jel yüzeyinin 1-2mm üzerinde) Örnek yükleme NOT: Herbir reaksiyon multipleks içindeki Cresol Red görünür olması için Bromophenol Blue ya da diğer yükleme bufferlarından birinin eklenmesi gerekir. Jel kuyucuklarına 10 μl herbir reaksiyon multipleksten ve 10 μl boyut markırı* ekleyin; güç kaynağını açın ve voltajı V arasına ayarlayın. Jeli yürütün ve sonra UV transilluminatore koyun; amplifikasyon ürünlerinin boyutunu referans boyut markırı ile karşılaştırarak analiz edin. NOT: UV ışınları deri ve en önemlisi gözler için tehlikelidir: daima eldiven ve koruyucu gözlük kullanın ya da UV transilluminatorün koruyucu ekranını kullanın. Size markır 02-10A ve 02-10C kitlerinde bulunur R-50_ _TR.doc 21

24 13. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Doğru bir sonuç yorumlama için aşağıdaki tabloya bakın: Multiplex I Multiplex II Multiplex III DQA1*0501, * pb TST 508 pb 508 pb 508 pb DRB1* pb DQB1* pb 180 pb DQB1*020101, *020102, *0202 w128 pb 121 pb DQA1*02 96 pb w = zayıf amplifikasyon ürünlerinin olasılığı. * = DRB1*04 alel ile DQB1*0302 alelin görülmesinin doğrulaması için linkage çalışmalarından çıkarım Literatürlerde linkage çalışmalarına dayanarak; primerlerin DQB1*0302 alelini, DQB1*020101, *020102, *0202 alellerini ve DRB1*04 alelini amplifiye etmesi DQB1*0302 görülmesini garantiler (Bouguerra ve arkadaşları, 1997; Fernandez-Arquero ve arkadaşları, 1995; Karell ve arkadaşları, 2003). DQB1*020101, *020102, *0202 lu hastalarda, multipleks III te 121 bp de ve multipleks II de 180 bp de amplifikasyon ürünlerinin her ikisi görülür. Iki homolog kromozom görülmesine göre DQ8 heterodimeri için kodlanan aleller, DQ2 heterodimeri için kodlanan alellerden biri veya her ikisi ile bir arada var olabilir. Bu olgularda, multipleks I de 128 bp de ve multipleks II de 180 bp de amplifikasyon ürünleri (DQB1*0302 ve DRB1*04), multipleks I de 728 bp de ve/veya multipleks III de 121 bp de amplifikasyon ürünleri (DQA1*05 ve/veya DQB1*02 Karell ve arkadaşları, 2003) ile birlikte görülür. Multipleks II de 96 bp bandının görülmesinin yok edilmesi trans ta kodlanan HLA-DQ2 heterodimerini işaret eder (par. 7 ye bakın). Bir ya da daha fazla reaksiyonda HLA bantlarının olması fakat TST bantlarının olmaması olasıdır: Bu olabilir; çünkü belli reaksiyon koşulları HLA alellerinin amplifikasyonunu pozitif kontrolden daha çok tercih edebilir. Bu durumlarda, HLA bant(lar)i görüldüğünden TST bant olmaması birproblem değildir. TST kontrolü, üç multipleksin bir ya da daha fazlasında HLA aleli olmayan hastaların rekasiyonu için önemlidir. Eğer hem amplifikasyon ürünleri hem de internal pozitif control (TST) görülmezse, test tekrar çalışılmalıdır R-50_ _TR.doc

25 Bazen coeliac hastaları atipik haplotip gösterirler (Karell ve arkadaşları, 2003): Aşağıdaki tabloda gösterilen bantların bazılarına sahiptirler; özellikle DQ2 heterodimeri için kodlanan iki alelden sadece birine sahiptir. I II III I II III I II III A B C Fig. 4: %3 Agaroz jel elektroforezi A: Multipleks I: 728 bp amplifikasyon ürünü (DQA1*0501 ve/veya DQA1*0505) bp amplifikasyon ürünü (DQB1* ve/veya DQB1*0202: DQB1*0302 değildir, çünkü DRB1*04 Multipleks II de kayıptır ve DQB1*020101, *020102, *0202 spesifik amplifikasyon ürünü Multipleks III de görülür); Multipleks II: TST hariç amplifikasyon ürünü olmaz; Multipleks III: 121 bp amplifikasyon ürünü (DQB1* ve/veya DQB1* ve/veya DQB1*0202). Yorumlama: Cis de kodlanmış HLA-DQ2 heterodimerli hasta B: Multipleks I: 728 bp amplifikasyon ürünü (DQA1*0501 ve/veya DQA1*0505) bp amplifikasyon ürünü (DQB1* ve/veya DQB1* ve/veya DQB1*0202: DQB1*0302 değildir, çünkü DRB1*04 Multipleks II de kayıptır ve DQB1*020101, *020102, *0202 spesifik amplifikasyon ürünü Multipleks III de görülür); Multipleks II: 96 bp amplifikasyon ürünü (DQA1*02); Multipleks III: 121 bp amplifikasyon ürünü (DQB1* ve/veya DQB1* ve/veya DQB1*0202). Yorumlama: Trans ta kodlanmış HLA-DQ2 heterodimerli hasta C: Multipleks I: 128 bp amplifikasyon ürünü (DQB1*0302: DQB1*02 değildir, çünkü DRB1*04 Multipleks II de görülür ve DQB1*020101, *020102, *0202 spesifik amplifikasyon ürünü Multipleks III de görülmez); Multipleks II: 180 bp amplifikasyon ürünü (DRB1*04); Multipleks III: TST hariç amplifikasyon ürünü görülmez. Yorumlama: HLA-DQ8 haplotipli hasta 02-10R-50_ _TR.doc 23

26 14. SORUN GİDERME 1. Hem amplifikasyon ürünü hem de pozitif kontrol DNA bandı yoksa TAQ polymerase premikse doğru eklenememiştir -Uygun volümde pipet ve uçlar kullanın (pipet aralığı 0,2-2 μl); -Görsel olarak TAQ polymerasın premikse difüze olduğunu gözleyin: Bu basittir, çünkü enzim, yüksek bir densiteye sahip olan gliserolde çözülür; Thermalcycler doğru programda değildir ve/veya thermalcycler doğru çalışmıyordur ve/veya amplifikasyon programı bitmemiştir -Thermalcycler program uygunluğunu ve kullanım kılavuzundaki sıcaklık profili uygunluğunu kontrol edin (par ye bakın); sonra doğru program ile amplifikasyonu tekrar edin. Kit uygun şekilde çalışmaz -Premiks, TAQ polymerase ve pozitif kontrolü -20 C de saklayın; -Premiks ve reaktifleri tekrar tekrar dondurup/çözdürmekten sakının. 2. Sadece referans DNAnın amplifikasyon ürünleri görülür Kullanılan su DNase ile kontamine olmuştur. -Analizi yeni alikuatlanmış steril, DNase ve RNase free su ile tekrar edin. Heparinli tam kandan DNA ekstrakte edilmiştir. Testi, antikoagülant olarak Sodyum sitrat ya da EDTA kullanılmış yeni bir kan örneği kullanarak tekrar edin R-50_ _TR.doc

27 3. Üç reaksiyondan sadece birinde pozitif kontrol bantı dahil hiçbir bant yoktur. Miks iyi bir şekilde karışmamıştır ve/veya üç reaksiyon tüpünde 10 µl miktarından az eklenmiştir - Reaksiyon premiks, DNA ve TAQ polymerase içeren miksi iyice karıştırın; miksin homojen olduğundan emin olun. Reaksiyon premiksine yetersiz miktarda TAQ polymerase eklenmiştir - -Uygun volümde pipet ve uçlar kullanın (pipet aralığı 0,2-2 μl); - Pipetlerin uygun düzende ya da yeterlilikte olduğunu kontrol edin. Bazı thermoblock kuyucukları doğru çalışmaz - Önceki amplifikasyonların sonuçlarına bakın ve thermalcyclerı kontrol edin. 4. Referans DNA için iyi bir sinyal fakat bazı zayıf bantların görülmesi Ekstraksiyon protokolü sırasında, elusyonda küçük miktarda DNa görülmesi veya görülmemesi. Eğer 02-10C kiti kullanıldıysa, aşağıdaki noktaları ve önerildiği gibi ilerleyip ilerlemediğini doğrulayın R-50_ _TR.doc 25

28 Olası nedenler Örnek ile Solusyon 1 in yetersiz karışmasına gore yetersiz hücresel lizis. Düşük protease aktivitesine bağlı yetersiz hücresel lizis. Filtre kolonlara transfer edilmeden önce lizata Ethanol (%96-100) eklenmemiştir(nokta 6, par. 12.1) ya da düşük oranlı bir ethanol ile solusyon kullanılmıştır. Lökopenik hasta. Filtre kolon oda ısısında (+15 C/+25 C) 1 dakika inkübe edilmemelidir (nokta 12, par. 12.1). DNA etkili olarak elute edilememiştir. Solusyon 1 ve 2 doğru kullanılmamıştır. Yorumlar ve öneriler Yeni bir örnek ile ektraksiyonu tekrar edin; örneğin Solusyon 1 ile vorteksle iyice karıştığından emin olun. (Nokta 11, par. 12.1) Yeni aliquatlanmış bir Protease kullanarak yeni bir örnek ile ekstraksiyonu tekrar edin; solusyonun tekrar tekrar dondurulup/çözülmesinden kaçının. Yeni bir örnek ile doğru şekilde tekrar ekstraksiyon yapın. Tam kan kullanmayın, örneğin lökositer fraksiyonunu zenginleştirin (buffy coat, Ficoll-Hypaque). Filtre kolon, Elusyon solusyonu eklendikten sonra oda ısısında en az 1 dakika inkübe edilmelidir. DNA elusyonunun etkisiniartırmak için filtre kolonu oda ısısında 5 dakika inkübe edin. Her iki solusyonunda doğru sırada kullanıldığından emin olun. Yeni bir örnek ile doğru şekilde tekrar ekstraksiyon yapın. Yeni bir örnek ile doğru şekilde tekrar ekstraksiyon yapın. Fazla miktarda Elusyon Solusyonu ile Elusyon yapılmıştır. Elut içinde az miktarda DNA görülür. Amplifikasyon reaksiyonunun iyisonuçları için gerekli DNA miktarı 120 ng. Eğer elute edilmiş DNA konsantrasyonu çok düşük ise (fotometrik ölçüm ile belirlenmiş), ekstraksiyonu 200 μl den düşük miktarda elusyon ile tekrar etmenizi öneririz. Eğer elusion miktarı <200 μl ise, DNA konsantrasyonu elut içinde artar, fakat final ekstraktte görülen ürün azalır R-50_ _TR.doc

29 Eğer 02-10A ya da 02-10R kiti kullanıldıysa, aşağıdaki noktaları ve önerildiği gibi ilerleyip ilerlemediğini doğrulayın. - Kullanılan ektraksiyon kitinin kullanıcı manuelinde belirtilen cihazların doğru şekilde kullanıldığından emin olun. - Kullanılan ekstraksiyon kitinin kullanıcı manuelindeki Sorun Giderme kısmına bakın. - Yeni bir örnek ile doğru şekilde tekrar ekstraksiyon yapın. Bazı inhibitörler ve amplifikasyon reaksiyonu ile etkileşen diğer faktörler görülmüştür. - Elde edilen DNA solusyonu saf değildir (A260/A280 oranı çok düşüktür). Ekstraksiyon protokolünü doğru şekilde yaptığınızı kontrol edin ve yeni bir örnek ile doğru şekilde tekrar ekstraksiyon yapın. - Elde edilen DNA solusyonunda rezidüel RNA bulunur (A260/A 280 oranı çok yüksektir), RNase ile sindirme aşamasında elimine edilebilir. Eğer 02-10C kiti kullanıldıysa, aşağıdaki noktaları ve önerildiği gibi ilerleyip ilerlemediğini doğrulayın. - Eğer filtrenin alt parçası Solusyon 3 ün filtratı ile ıslanmış ise (nokta 14, par.12.1), filtre kolonları yeni bir 2mL tüpe aktarın ve rpm de 1 dakika santrifüj edin. - Solusyon 2 ve 3 ün protokoldeki doğru sıra ile kullanıldığını kontrol edin. 5. Tüm amplifikasyon ürünleri çok zayıf ve/veya jel zemini çok güçlü ve/veya amplifikasyon ürünleri iyi tanımlanamamış ve karışık görünüyor. Jele çok fazla miktarda EtBr eklenmiştir. - Jele EtBr eklerken uygun volümüolan pipet ve uçlar kullanın (pipet aralığı 2-20 μl) Elektroforetik buffer yanlıştır ya da elektroforetik çalışma sırasında çok ısınmıştır. - 1X TAE Buffer kullanın (par.7 ye bakın) ve voltajı azaltın R-50_ _TR.doc 27

30 Daha fazla detaylı bilgi için AB ANALITICA teknik destek ile irtibata geçin( R-50_ _TR.doc

31 15. TEST LİMİTLERİ Kitperformansı aşağıdaki durumlarda azalır: Klinik örnekler bu analiz için uygun değildir (heparin antikoagülant olarak kullanılan kan örnekleri uygun değildir); Filtre kolon, kan örneğindeki fazla lökosit konsantrasyonundan dolayı tıkanmıştır (5 X 10 6 /200 μl den fazla) R-50_ _TR.doc 29

32 16. TEST PERFORMANSI Özgünlük Bu kitte kullanılan primerler 6p21.3 HLA bölgesine mensup olan insan genlerinin tanımı için spesifik olarak dizayn edilmiştir; en önemli databanktaki primer dizisi spesifik olmayan dizilerin yokluğunda görülür. Özellikle, tüm HLA bölgesindeki genomic DNA ile çapraz reaksiyonlar tanımlanmamıştır Doğruluk, Duyarlılık ve Diagnostik Özgünlük AB CELIACHIA kiti amplifikasyon protokolü, çeşitli laboratuarlarda analiz edilmiş coeliac hastalarının DNA örnekleri üzerinde test edilmiştir ve sonuçlar aşağıda gösterilmiştir: Doğruluk 98%; Duyarlılık 98%; Özgünlük 99% R-50_ _TR.doc

33 17. BİBLİYOGRAFİK REFERANSLAR Bouguerra F, Babron MC, Eliaou JF, Debbabi A, Clot J, Khaldi F, Greco L, Clerget-Darpoux F., Genet Epidemiol, 14: , 1997 Fernandez-Arquero M, Figueredo MA, Maluenda C, de la Concha EG., Human Immunol., 42, , 1995 Karell K, Louka AS, Moodie SJ, Ascher H, Clot F, Greco L, Ciclitira PJ, Solid LM, Partanen J and the members of the EGC on Celiac Disease, Human Immunol., 64, , 2003 Kaukinen K, Partanen J, Maki M, Collin P., Am J Gastroenterol. Mar; 97(3):695-9, 2002 Louka AS, Sollid LM., Tissue Antigens, Feb; 61(2): , 2003 Lundin KE, Scott H, Hansen T, Paulsen G, Halstensen TS, Fausa O, Thorsby E, Sollid LM., J Exp Med., Jul 1; 178(1): , 1993 Ploski R, Ek J, Thorsby E, Sollid LM., Tissue Antigens, Apr; 41(4): 173-7, 1993 Saiki RK, S Scharf, F Faloona, KB Mullis, GT Horn, HA Erlich and N Arnheim, Science 230, , 1985 Sollid LM, Throsby E., Gastroenterology, Apr; 106 (4): , 1993 Sollid LM., Nat Rev Immunol., Sep; 2(9): , 2002 Tonutti E, Visentini D, Bizzaro N, Villalta D, Tozzoli R, Bagnasco M, Bozzoli R, Bassetti D, Musso M, Liguori M, Antico A, Platzgummer S, Manoni F, Camogliano L, Pradella M, Villanacci V, Ceppa P, Fiocca R. RIMeL / IJLaM 2005; Yararlı web siteleri R-50_ _TR.doc 31

34 R-50_ _TR.doc

35

36 AB ANALITICA srl - Via Svizzera PADOVA, (ITALY) Tel Fax info@abanalitica.it