Ampliquality HPV-HL Kod 03-31A Kod 03-31R

Transkript

1 KULLANICI KILAVUZU Ampliquality HPV-HL Kod 03-31A Kod 03-31R Yüksek ve düşük onkojenik risk-ilişkili genotiplerin tanımlanması için Human Papillomavirus tiplendirme kiti

2

3 1. ÜRÜN BİLGİSİ KİT İÇERİĞİ REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER GÜVENLİK KURALLARI Genel güvenlik kuralları Kit hakkında güvenlik kuralları KİT İÇERİĞİNDE OLMAYAN GEREKLİ MATERYALLER Reaktifler Cihazlar Materyaller REAKTİF HAZIRLAMA GİRİŞ TEST PRENSİBİ ÜRÜN TANIMI ÖRNEK TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN-MUAMELESİ Sitolojik örnekler Histolojik örnekler PROTOKOL DNA ekstraksiyonu DNA amplifikasyonu TST gen amplifikasyonu yüksek ve düşük risk HPV amplifikasyonu Page 1

4 12.3. Amplifikasyon ürünlerinin görüntülenmesi Agaroz jel elektroforezi Örnek yükleme Sonuçların yorumlanması: TST ve HPV DNA amplifikasyonu SORUN GİDERME TEST LİMİTLERİ TEST PERFORMANSI Özgünlük Duyarlılık REFERANSLAR İLGİLİ ÜRÜNLER Page 2

5 1. ÜRÜN BİLGİSİ Bu kullanıcı kılavuzu aşağıdaki ürünleri içerir: HPV-HL (kod 03-31A) Yüksek ve düşük risk onkojenik risk ile ilişkili Human Papillomavirus genotiplerinin belirlenmesi için kit. Amplifikasyon ve agaroz jelde görüntüleme için tüm reaktifleri içerir. Kod Ürün Pkg 03-31A-25 HPV-HL 25 test 03-31A-50 HPV-HL 50 test HPV-HL - amplifikasyon reaktifleri (Kod 03-31R) Yüksek ve düşük risk onkojenik risk ile ilişkili Human Papillomavirus genotiplerinin belirlenmesi için reaktifler. Amplifikasyon için reaktifleri içerir. Kod Ürün Pkg 03-31R-25 HPV-HL amplifikasyon reaktifleri 25 test 03-31R-50 HPV-HL amplifikasyon reaktifleri 50 test Page 3

6 2. KİT İÇERİĞİ DİKKAT! Farklı içerikler farklı kitler ile ilişkilidir. (kısaltma: = kit içeriğinde bulunan komponent; 0= kit içeriğinde bulunmayan komponent) KUTU P 20 C DE SAKLANIR kod 03-31A kod 03-31R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) RENGİ YA DA KAPAK 25 test 50 test 8 test Tek-doz premiks tüpleri Yüksek risk 1 Kırmızı (T) Tek-doz premiks tüpleri Yüksek risk 2 Sarı (T) Tek-doz premiks tüpleri Düşük risk Yeşil (T) Tek-doz premiks tüpleri TST (thiosulfate sulfurtranferase -rhodanese) Mavi (T) Thermostabil Taq DNA polimerase AB Taq 5 U/μL Kırmızı 100 μl 150 μl 30 μl KÜÇÜK ÇANTA 20 C DE SAKLANIR kod 03-31A kod 03-31R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) RENGİ YA DA KAPAK 25 test 50 test 8 test HPV 16 genom parçası İçeren plazmid DNA Pozitif kontrol YÜKSEK RİSK 1 HPV 16 Mavi 1 60μL 1 100μL 1 20μL HPV 18 genom parçası İçeren plazmid DNA Pozitif kontrol YÜKSEK RİSK 2 HPV 18 Mavi 1 60μL 1 100μL 1 20μL HPV 6 genom parçası İçeren plazmid DNA Pozitif kontrol DÜŞÜK RİSK HPV 6 Mavi 1 60μL 1 100μL 1 20μL Page 4

7 KUTU F +2 / +8 C DE SAKLANIR kod 03-31A kod 03-31R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) RENGİ YA DA KAPAK 25 test 50 test 8 test Elektroforez için yükleme buffer Ethidium Bromide solusyonu (2,5 mg/ml) DNA Moleküler Ağırlık Markır 6 Blue Mavi μl μl μl Ethidium Bromide toksik R23, 68 S 36/37 45 Kırmızı μl μl μl MW Markır Sarı μl μl 1 90 μl KUTU A +15 / +25 C DE SAKLANIR kod 03-31A kod 03-31R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) RENGİ YA DA KAPAK 25 test 50 test 8 test 0 Moleküler biyoloji için agaroz AGAROZ 1 27g 1 54 g 1 10 g 0 Elektroforez buffer TRIS-Acetate-EDTA ph: 8,00 50 TAE 1 90 ml ml 1 30 ml 3. REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI Kitin herbir komponenti, tekli kutuların etiketlerinde belirtilen talimatlara gore saklanmalıdır. Özellikle: KUTU P Küçük çanta KUTU F KUTU A -20 C de saklanır -20 C de saklanır +2 / +8 C DE SAKLANIR +15 / +25 C DE SAKLANIR Önerilen sıcaklıkta saklandığında, tüm test reaktifleri son kullanım tarihine kadar stabil kalır. Page 5

8 4. KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER Kit; moleküler biyoloji tekniklerini diagnostikte uygulama eğitimi almış ve tecrübesi olan araştırmacı tarafından kullanılmalıdır; Kit prosedürüne başlamadan önce kullanım kılavuzunu dikkatlice ve tamamen okuyun; Ürünleri ısı kaynağından uzakta tutun; Son kullanım tarihi geçmiş kitparçalarını kullanmayın; Saklama koşulları, kutu bütünlüğü ya da metod uygulaması ile ilgili herhangi bir şüpheniz olduğunda, AB ANALITICA teknik destek ile bağlantı kurun: Nükleik asitlerin amlifikasyonunda, araştırmacı aşağıdaki özel önlemleri almalıdır: Filtreli uç kullanın; Biyolojik örnekler, ekstrakte edilmiş DNA, kit içeriğindeki referans DNA ve tüm amplifikasyon ürünleri, amplifikasyon reaktiflerinden farklı bir yerde saklanmalıdır. PCR öncesi ve sonrası için farklı alanlar hazırlayın ve iki alan arasında materyal (pipetler, uçlar, tüpler, vs.) paylaşımı yapmayın. Sık sık eldiven değiştirin. Benç yüzeyini %5 sodyum hipoklorit ile temizleyin. Kullanmadan once PCR premiksi oda ısısında eritin; Taq DNA polymerase ekleyin ve oda ısısında ya da buz kabında oldukça hızlı DNA purifiye edin. Page 6

9 5. GÜVENLİK KURALLARI 5.1. Genel Güvenlik Kuralları Reaktifler ve klinik örnekler ile çalışırken tek kullanımlık eldiven kullanın ve çalışma bitiminde ellerinizi yıkayın. Ağızla pipetleme yapmayın. Bilinen hiçbir diagnostik metod enfektif ajalnların yok olduğunu garanti etmez. Tüm klinik örnekleri potansiyel enfeksiyonu ajanı olarak kabul edip o şekilde kullanmak gerekir; Klinik örnekler ile direk temasta olan cihazların kontaminasyonlu olduğu ve bu şekilde kullanılması gerektiği göz önüne alınmalıdır. Örneklerin kazara etrafa dökülmesi durumunda, %10 Sodyum Hipoklorit ile temizleyin. Temizlenmiş materyaller, kontamine ürünler için olan özel konteynerlere atılmalıdır. Klinik örnekler, materyaller ve kontamine ürünler aşağıdaki dekontaminasyondan sonra atılmalıdır: 30 dakika %5 Sodyum Hipoklorit (1 volüm %5 Sodyum Hipoklorit solusyonu herbir 10 volüm kontaminasyonlu sıvı için) solusyonuna batırılmalı YA DA en az 2 saat 121 C de otoklavlanmalı (NOT: Sodyum Hipoklorit içeren solusyonları otoklavlamayın!!) Page 7

10 5.2. Kit Hakkında Güvenlik Kuralları Bu kit kullanımı için riskler tekli komponentler ile ilişkilidir: Tehlikeli Komponentler: ETHIDIUM BROMIDE (03-31A kit içinde bulunur) 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridiumbromide <2% Risk tanımı: T (Toksik) RİSK İBARESİ VE S İBARESİ R 23 ve R 68 S 36/37 45 İnhalasyon için toksik. Geri dönülmez etkiler riski. Laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven kullanın. Kaza veya rahatsızlık durumlarında, doktora başvurun ve paket etiketini gösterin. R ve S ibareleri kit ile sağlanan konsantre ürünlere işaret etmektedir. Özellikle Ethidium Bromide için, agaroz jelde dilusyona kadar. Konsantre Ethidium Bromide uygulamasında kimyasal dağıtıcı buharlı kabin kullanın. Seyreltilmiş Ethidium solusyonu ile çalışırken daima laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven giyin. Bu ürünler genel çöplere atılamaz. Kurutucu sistem kullanılmamalıdır. Atılım için yasal kuralları takip edin. Ethidium Bromide kaza ile dökülmesi durumunda Sodyum Hipoklorit ve su ile temizleyin. İstenildiğinde ürünlerin Materyal Güvenlik Data Sheetleri gönderilebilir. Page 8

11 6. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER 6.1. Reaktifler DNA ekstraksiyonu için reaktifler; Steril DNase ve RNase free su; Distile su; Agaroz jelde elektroforez ile DNA görüntülemesi için reaktifler (03-26R kiti gerektirir) Cihazlar Laminar flow kabini (kontaminasyondan korunmak için amplifikasyon premikse TAQ polymerase eklenirken kullanılması önerilir; ekstrakte DNA eklenirken başka bir laminar flow kabini kullanılması önerilebilir); Mikropipetler (aralık: 0,2-2 µl; 0,5-10 µl; 2-20 µl); Thermalcycler; Tartı; Mikrosantrifüj (max rpm); Vorteks; Manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga; Kimyasal kabin (Ethidium Bromide uygulamasında kullanılması önerilir); Agaroz minijel için yatay elektroforez haznesi; Güç kaynağı ( V); UV Transilluminator; Foto kamera ya da imaj analizör Materyaller Tek kullanımlık eldivenler; Tek kullanımlık filtreli uçlar (aralık: 0,2-2 µl; 0,5-10 µl; 2-20 µl); TAE dilusyonu için dereceli silindirler (1L); Agaroz jel hazırlamak için pyrex şişe ya da Becker; Parafilm. Page 9

12 7. REAKTİF HAZIRLAMA 1 L TAE Buffer (1) hazırlamak için: 20 ml 50 TAE (03-31A kitinde bulunur) ile 980 ml distile su karıştırın. Page 10

13 8. GİRİŞ Human Papillomavirus (HPV) özellikle bölge-spesifiktir: Host hücrelerinin farklılaşmasının derecesi ile ilişkili aktiviteye sahip geçirgen hücreler içinde viral partiküllerin sentezi ve üretimine neden olan çok katmanlı skuamoz epitelyumi enfekte eder. HPV partikülleri sirküler, çift-iplikli DNA ve farklı HPV tiplerinde farklı olabilen yapısal proteinler içerir: En çok görülen protein L1 (kapsid yapısal protein) dir. Ayrıca, virus replikasyon siklusunun ilk fazında eksprese olan E (erken ve prekosiyöz) isimli proteinler vardır. E1 ve E2 proteinleri viral replikasyonun başlangıcında çalışır ve viral genomun transkripsiyonunu düzenlerken, E5, E6 ve E7 gibi diğer proteinler enfekte hücrelerin proliferasyon ve neoplastik transformasyonuna neden olarak HPV onkojenik gücünden sorumludurlar (Stoler M.H., 1997). Şimdiye kadar 100 farklı HPV tipi tanımlanmıştır; bunların arasından 35 den fazlası ano-genital bölgeyi (kondilomlar) enfekte eder ve yaklışık 20 si genital karsinoma ile ilişkilidir. HPV dizisi varlığı skuamoz hücreli invaziv servikal karsinomaların %90 dan fazlasında, kondilomlarda ve sıklıkla intraepitelyum servikal karsinomalarda tanımlanmıştır (Broker TR ve ark., 1986). Patoloji temelinde (selim ya da malignan) en sık ilişkili olduğu HPV tipleri düşük, orta ve yüksek malignan riskte ayırt edilebilir. HPV 6, 11, 34, 40, 42, 43, 44, 53, 54, 70 ve 74 onkojenik düşük risk, genotip 16, 18, 31, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 ve 68 onkojenik yüksek risk olarak tanımlanır (Zur Hausen H., 1996). Avrupada servikal kanser HPV tip 16 ile %50 den fazla, HPV tip 18 ile %10-15, HPV tip 31 ile %7-8 ile ilişkili iken, kalan %20 si daha az genel tipler ile ilişkilidir. Servikal kanserin erken tanısı için temel metod, daima HPV tiplendirmesine de izin veren sito-histolojik tanının duyarlılık ve özgünlüğünü artırmaya yardımcı moleküler biyolojik testler ile ilişkili olan Pap Testtir. Dahası, devamlı ASCUSlu (Atipik Skuamoz Hücre Belirsiz Anlam) ya da düşük derece lezyonlu hastalarda direk moleküler biyoloji testleri ile viral DNA varlığının belirlenmesi gereklidir. Bu bayanlarda yüksek onkojenik risk ile bir viral alttipin varlığı ya da yokluğunun tanımlanma olasılığı ya olası hastalık ya da spontane duraksamanın belirtisi olabilir. HPV in vitro kültür için iyi bir teknik olmadığından (Beutner KR, 1997) HPV enfeksiyonu için tanı DNA amplifikasyonu ile viral dizilerin araştırılmasına dayanır. Page 11

14 9. TEST PRENSİBİ PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) literatürlerde ilk DNA amplifikasyonu metodudur. (Saiki RK ve arkadaşları, 1985). Thermostable DNA polymerase ile DNA nın spesifik bir parçasının (hedef dizi) in vitro amplifikasyon reaksiyonu olarak tanımlanabilir. Reaksiyonda nükleik asitin üç segmenti yer alır: Amplifiye olması için çift iplikli DNA kalıbı (hedef DNA) ve iki tek iplikli oligonükleotid primerler kalıp DNA ya spesifik olarak dizayn edilmiştir. DNA polymerase primerler tarafından işaretlenen bölgeden sentez işlemine başlar ve solusyonda serbest olarak bulunan tamamlayıcı nükleotidlerin (dntpler) eklenmesi ve bağlanması ile orjinal çift iplikli hedef DNA bölgesi ile aynı olan yeni çift iplikli DNA molekülünü sentezler. Çeşitli sikluslardan sonra, hedef diziye uygun olan milyonlarca DNA molekülü oluşturabilir. Bu testin duyarlılığı, laboratuar tanısında uygulamaya olanak sağlar. Amplifikasyon reaksiyonunun geniş biyolojik örneklerde uygulanabilmesinin yanında, PCRın oldukça küçük DNA segmentlerini de amplifiye edebilmesinden başlangıç DNAsı kısmi olarak yıkılabilir. Page 12

15 10. ÜRÜN TANIMI HPV genotipleri ile ilişkili farklı onkojenik özellikler, yüksek duyarlı virus varlığı ile HPV tiplerini belirleyebilen ve yüksek ve düşük risk HPV tanımlayabilen diagnostik test gerektirir. Bu kitte kullanılan metod viral genomun E6 ve E7 bölgelerinin amplifikasyonu için üç eş zamanlı PCR reaksiyonunu içerir. 10 HPV yüksek-risk genotipi (HPV 16, 18, 31, 33, 39, 45, 51, 52, 56, 58) ve iki HPV düşük risk tipini (HPV 6 ve 11) tanımlar. Bu metod, sitolojik örneklerden (servikal swablar, ağızdan hücreler) ve doku örneklerinden (taze, donmuş ya da formalin-fikse ve parafine-gömülü biyopsiler) ekstrakte DNA kullanabilir. Metod, bölge 22q13.1 de (amplifikasyon kontrol) TST (thiosulfate sulfurtransferase rhodanese) geni amplifikasyonu ile ekstrakte DNA nın uygunluğunu değerlendirebilir. TST gen amplifikasyonunda negatif bir sonuç ya ekstrakte DNAda amplifikasyon reaksiyonunun inhibitörlerinin görüldüğünü ya da DNAnın oldukça yıkıldığını işaret eder. Bu metod olası yanlış negatif sonuçların tanımlanmasını sağlar ve ekstra zaman gerektirmez çünkü TST gen amplifikasyonu HPV ilk amplifikasyonu ile aynı dönemde uygulanır. Kit, amplifikasyon ve HPV DNA 18, 16 ve 6 tiplendirmesi için pozitif kontroller içerir. Bu kontroller kullanıcı için tehlikeli değildir çünkü viral genomun bir parçasını içeren plazmidik DNA dır. Pozitif kontrolün başarılı amplifikasyonu reaksiyonun doğru çalıştığını garanti eder. Bu kit premiks formatındadır: Amplifikasyon için tüm reaktifler pre-mikstir ve Taq polymerase ve ekstrakte DNA eklenebilecek şekilde tekdoz test tüplerinde alikuatlanmıştır. Bu premiks formatı, kullanıcı için zaman kazancı ile amplifikasyon öncesi manipulasyon aşamalarını azaltır; reaktiflerin tekrar tekrar dondurup çözülmesini engeller ve hepsinden öte, bu format kontaminasyon riskini minimize eder, risk yanlış pozitif sonuçlara neden olur. Bu nedenle, daima uygun amplifikasyon kontrollerini kullanmayı önerir. Page 13

16 11. ÖRNEK TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN- MUAMELESİ Sitolojik örnekler Sitolojik örnekler servikal vajinal sıvı, oral hücreler vs. dir. Örnekler kazıcı ya da steril sito-fırça kullanılarak elde edilir. Toplanan hücreler uygun transport medyumlarında seyreltilir (1PBS, fizyolojik solusyon ya da diğer medyumlar). Örnek +2 / +8 C de maksimum 48 saat için saklanabilir; sonra nukleik asit ekstraksiyonu ile kullanmak için daha iyidir. Kısa bir zaman içinde örneklerin ekstraksiyonunun yapılması mümkün değilse, örnekler -20 C de saklanmalıdır. AB ANALITICA, sitolojik örnek toplama için HPV-SCK kit (kod ) önerir Histolojik örnekler Histolojik örnekler taze, donmuş, formalin fikse ve parafine gömülü deri biyopsileridir. Taze biyopsiler toplamadan birkaç dakika içinde çalışılmalı veya likit nitrojen ile hızlıca dondurulmalıdır ve sonra enzimatik sindirimi takiben steril kesici kullanarak mekanik kesilmeye kadar -80 C de saklanmalıdır, Proteinaz K ile sindirim ile takip etmelidir. Fikse ve parafine gömülü biyopsilerde Lilie formülü olarak %10 sodyum ve potasyum tuzları ile ph 7 de formalin buffer kullanmanızı öneririz. Buffer olmayan Bouin, Holland ve diğer asidik fiksatifler (osmik asit gibi) olan formalinde fikse edilmiş dokular sonraki nukleik asit ekstraksiyonu için uygun değildir, çünkü bu maddeler dokuda sindirilemeyen çapraz-bağlar meydana getirirler. Page 14

17 12. PROTOKOL DNA ekstraksiyonu DNA ekstraksiyonu tam ve saf DNA elde edebilen herhangi bir metod ile yapılabilir. TST ve yüksek-düşük risk HPVamplifikasyonu (20 μl) için paragraph 12.2 de belirtilen ekstrakte DNA miktarı AB ANALITICA metodu ile elde edilen ekstrakte miktar için referanstır. Alternatif ekstraksiyon metodları kullanıldığında, eğer amplifikasyon için DNA solusyon miktarı 20 μl den düşükse su ekleyerek amplifikasyon miks miktarı ayarlanmalıdır DNA AMPLİFİKASYONU TST gen amplifikasyonu Her bir örnek için, aşağıdaki gibi premiks tüplerine AB Taq ve DNA ekleyin: Komponent Mavi tüp AB Taq DNA Miktar 29.5μL 0,5 μl 20 μl Yüksek ve düşük risk HPV amplifikasyonu Her bir örnek için, aşağıdaki gibi 3 farklı premiks tüpüne AB Taq ve DNA ekleyin: YÜKSEK RİSK 1 Komponent Kırmızı tüp AB Taq DNA Miktar 29,75 μl 0,25 μl 20 μl Page 15

18 YÜKSEK RİSK 2 DÜŞÜK RİSK Komponent Sarı tüp AB Taq DNA Komponent Yeşil tüp AB Taq DNA Miktar 29,75 μl 0,25 μl 20 μl Miktar 29,75 μl 0,25 μl 20 μl Analiz etmek için örneklerin yanında daima bir negatif kontrol (mikse DNA yerine su ekleyin) ve bir pozitif kontrol (20 µl herbir pozitif control kit içinde bulunur) amplifiye edilmelidir. Kısa bir süre santrifüj edin ve test tüplerini (TST ve HPV) aşağıdaki programda thermalcyclera koyun: 1 cycle 95 C 5 min 35 cycles 94 C 55 C 72 C 1 min 1 min 1 min 1 cycle 72 C 5 min Amplifikasyon fragman uzunluğu: TST: HPV YÜKSEK RİSK 1: HPV YÜKSEK RİSK 2: HPV DÜŞÜK RİSK: 202 bp bp bp bp Page 16

19 12.3. Amplifikasyon ürünlerinin görüntülenmesi: Agaroz jel elektroforezi %3 agaroz jel hazırlayın: 1,5 g Agaroz tartın ve 50 ml 1 TAE içine dökün. Solusyonu berrak oluncaya kadar manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga içine bırakın. Jelin soğumasına izin verin (3-5 dakika), sonra 10 μl 2.5 mg/ml Ethidium Bromide solusyonu ekleyin. NOT: Ethidium Bromide güçlü bir mutajenik ajandır: Daima eldiven kullanın ve bu reaktifle ya da içeren jel ile çalışırken tercihen kimyasal güvenlik kabini altında çalışın. Jeli tarakları ile birlikte uygun bir dökme tankına koyun ve oda ısısında soğuyana kadar bekleyin ya da jel katı hale gelene kadar buzdolabına koyun. Jel katılaştığında tarakları dikkatlice alın (jel kuyucuklarına zarar vermemeye dikkat edin) ve trayi elektroforez tankına geçirin. Jeli tamamen kaplayacak şekilde (jel yüzeyinin 1-2mm üzerinde) uygun miktarda 1 TAE buffer dökün Örnek yükleme Test tüpünde ya da direk parafilmde aşağıdakileri karıştırın: 2 µl 6 Blue* 10 µl PCR ürünü ya da DNA Moleküler Ağırlık Markır (MW Markır)* Miksi jel kuyucuklarına yükleyin; güç kaynağını açın ve voltajı V a ayarlayın. Çalışma sonunda, jeli UVtransilluminatore koyun ve amplifikasyon ürünlerinin boyutunu referans DNA Moleküler Ağırlık Markır ile karşılaştırarak sonuçları analiz edin. * = 6 Blue ve DNA Moleküler Ağırlık Markır 03-31A kit içinde bulunur; Başka bir yükleme buffer ya da DNA Moleküler Ağırlık Markır kullanıldığında sağlayıcı bilgilerini takip edin. *DNA Moleküler Ağırlık Markır (MW): , 404, 331, 242, 190, 147, 111, 110, 67, 34x2, 26 bp. %3 agaroz jelde bp bantlar genellikle tam olarak çözülmez ve tek bir bant olarak görülür; 26 ve 34 bp bantları %3 agaroz jelde bazen görünmek için çok küçük olur (düşük moleküler ağırlıklarından dolayı). Page 17

20 NOT: UV ışınları deri ve en önemlisi gözler için tehlikelidir: daima eldiven ve koruyucu gözlük kullanın ya da UV transilluminatorün koruyucu ekranını kullanın Sonuçların yorumlanması: TST ve HPV DNA amplifikasyonu Agaroz jel elektroforezinden sonra, kontroller aşağıdaki sonuçları göstermelidir: KONTROL SONUÇ YORUM Pozitif kontrol pozitif Amplifikasyon doğru çalışmıştır Negatif kontrol negatif Kontaminasyon yokluğu Sonra, band paterninin yorumlanması için aşağıdaki tabloyu izleyin: DNA bandı SONUÇ YORUM TST band yok Örnek amplifikasyon için uygun değildir (DNA ekstraksiyonunu tekrar edin) TST band HPV yüksek risk 1 band ve/veya HPV yüksek risk 2 band TST band HPV düşük risk band var var var var Amplifiye olabilir örnek ve aşağıdaki HPV genotiplerinden biri için pozitif: 16, 18, 31, 33, 39, 45, 51, 52, 56 ya da 58. Amplifiye olabilir örnek ve HPV genotip 6 ya da 11 İçin pozitif TST band Üç amplifikasyonunda band HPV HPV var yok Amplifiye olabilir örnek ve HPV genotip testi için negatif örnek. Page 18

21 Fig. 2: Dört amplifikasyon reaksiyonunun pozitif kontrollerin %3 agaroz jel elektroforezi İle görüntülenmesi. 1. DNA Moleküler Ağırlık Markır 2. Amplifikasyon kontrol TST 3. YÜKSEK RİSK 1 amplifikasyon için pozitif kontrol: HPV YÜKSEK RİSK 2 amplifikasyon için pozitif kontrol: HPV DÜŞÜK RİSK amplifikasyon için pozitif kontrol: HPV 6 Page 19

22 13. SORUN GİDERME Amplifikasyon ürünü ya da pozitif kontrol DNA bandı yoksa TAQ polymerase premikse doğru eklenememiştir - -Uygun volümde pipet ve uçlar kullanın (pipet aralığı 0,2-2 μl); - -Görsel olarak TAQ polymerasın premikse difüze olduğunu gözleyin: Bu basittir, çünkü enzim, yüksek bir densiteye sahip olan gliserolde çözülür; - Alternative olarak, tüp duvarına konulmuş olan TAQ polymerasın görsel olarak teyit edin, sonra kısa bir süre santrifüj edin. Thermalcycler doğru olarak programlanmamıştır - Thermalcycler programının uygunluğunu ve kullanıcı kılavuzundaki sıcaklık profilini kontrol edin. Kit uygun şekilde çalışmaz - Premiks, enzimler ve referans DNAyı -20 C de saklayın; - -Premiks ve reaktifleri tekrar tekrar dondurup/çözdürmekten sakının. Test edilen örneklerde ya TST ya da HPV için amplifikasyon bandı yoktur, fakat Pozitif kontrol için iyi bir band vardır Ekstraksiyon aşaması sırasında olası problemler: - Ekstraksiyon metodunun uygun olduğundan ve tüm bilgileri doğru şekilde takip ettiğinizden emin olun; - Ekstraksiyon kitinin sorun giderme bölümüne başvurun; - Yeni bir örnek ile doğru şekilde tekrar DNA ekstraksiyonu yapın. Amplifikasyon inhibe olmuştur - Başlangıç örneğini distile su ve TE ile seyreltin; - Küçük miktarda klinik örnekten DNA ekstraksiyonunu tekrar edin; - Ekstraksiyon protokolünün doğru yapıldığından emin olun (yukarıdaki durumları referans alın) ve yeni bir örnek ile ekstraksiyonu tekrar edin; Page 20

23 Amplifiye ürünlerin agaroz jelde görüntülenmesinden sonra aspesifik ürün ya da ekstraband görülmesi Thermalcycler sıcaklık değişimlerini çok yavaş yapın - Thermalcycler değişikliklerini uygulayın. Amplifikasyon reaksiyonunun hazırlanması oda ısısında çok uzun zaman alır. - Oda ısısında çalışma zamanınızı hızlandırın; - Buz üzerinde çalışın. Ekstrakte ürünler saflaşmamıştır - Örnekleri iyi saflaştıran bir ekstraksiyon sistemi kullanın. Başlangıç örnekleri yıkılmış DNA içerir - Ekstraksiyon aşamasını başka bir başlangıç klinik örneği kullanarak tekrarlayın; - Örneğin uygun yolla toplanıp saklandığından emin olun. Daha fazla detaylı bilgi için AB ANALITICA teknik destek ile irtibata geçin. laboratorio@abanalitica.it, faks (+39) , ya da tel. (+39) Page 21

24 14. TEST LİMİTLERİ Kit performansı aşağıdaki durumlarda azalır: Klinik örnekler bu analize uygun değildir (doğru saklanmamış histolojik örnekler için nötral formalin fiksatifinden farklı bir fiksatif kullanın). Amplifikasyon reaksiyonunun inhibitörlerinin görülmesi ya da uygun olmayan ekstraksiyon sistemi kullanılması nedeniyle DNA amplifiye olmaz. 15. TEST PERFORMANSI Özgünlük Yüksek ve düşük onkojenik risk HPV amplifikasyonu için bu kitte kullanılan primerler, belli HPV genotiplerinin tanımlanması için klinikörneklerde valide edilmiş spesifik konsensus primerlerdir. Diğer patojenik mikroorganizmaların genomik DNA ya da nukleik asitleri ile çapraz reaksiyon görülmemiştir Duyarlılık Kitin analitik duyarlılığı, HPV negatif hastalardan alınan insan servikal swablardan ekstrakte genomik DNA da seyreltilmiş HPV 16 genomunun bir kısmını içeren plazmid DNA nın farklı konsantrasyonlarını kullanarak değerlendirilmiştir. Test, 10 hücrede viral DNA nın 1 kopyasını tanımlamayı sağlayan metodu içerir. Page 22

25 16. REFERANSLAR Beutner KR, Amer J Med, 102,9-15, 1997 Broker TR, Botcham M, DNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp.17-36, 1985 Karlsen F, Kalantari M, Jenkins A, et al., J Clin Microb, 34, , 1996 Saiki RK, S Scharf, F Faloona, KB Mullis, GT Horn, HA Erlich and N Arnheim, Science 230, , 1985 Stoler M H, Pathology Case Reviews 2:1, 8-16, 1997 Zur Hausen H, Biochim Biophys Acta, 1288: F55-F78, 1996 Consensus Guidelines, Bethesda 2001 Congresso Nazionale Associazione Microbiologi Italiani, Bari giugno 2001, ABSTRACT G066 Page 23

26 17. İLGİLİ ÜRÜNLER HPV-HS Bio: L1 proteini için gen bölgesinin DNA amplifikasyonu ile Human Papillomavirus yüksek-duyarlı taraması ve tiplendirmesi için kit. Metod yaklaşık 30 HPV genotipinin (viral genomun 10 kopyasına kadar) varlığını belirleyebilir. Biotinli nested PCR ürünleri striplerde reverse hibridizasyon ile tiplendirme için kullanılır (HPV-STRIP, kod 03-24R-20). Kod Ürün Pkg 03-23A HPV-HS BIO 25 / 50 test R HPV-HS Bio amplifikasyon 25 / 50 test. reaktifleri HPV-STRIP: Striplerde alel spesifik reverse hibridizasyon ile Human Papillomavirus için tiplendirme sistemi. İt, HPV-HS-Bio kiti (kod 03-23) ile elde edilen PCR ürünleri ile kullanılır. Kod Ürün Pkg 03-24R-20 HPV-STRIP 20 test HPV-SCK: Human Papillomavirus belirlemek için örnek toplama kiti. Kod Ürün Pkg 03-33R-10 HPV-SCK 100 test Page 24

27

28 AB ANALITICA srl Via Svizzera PADOVA, (ITALY) Tel Fax info@abanalitica.it