Spinal musküler atrofide MNS proteinin ilaçlarla yüksek üretiminin iki yanl ELISA ile belirlenmesi

Transkript

1 Spinal musküler atrofide MNS proteinin ilaçlarla yüksek üretiminin iki yanl ELISA ile belirlenmesi Nguyen thi Man, PhD E. Humphrey, PhD L.T. Lam, PhD H.R. Fuller, PhD T.A. Lynch, MPhil C.A. Sewry, PhD P.R. Goodwin, BSc A.E. MacKenzie, PhD G.E. Morris, DPhil Yaz flma adresi ve reprint istekleri için Prof. G.E. Morris, Wolfson Centre for Inherited Neuromuscular Disease, RJAH Orthopaedic Hospital, Oswestry, SY10 7AG, BK ÖZET Amaç: Spinal musküler atrofi (SMA) otozomal resesif bir hastal k olup alt motor nöronlar n erken ya da postnatal geliflim döneminde kayb ile karakterizedir. fiiddeti de iflkenlik göstermekle birlikte motor nöron proteinlerinin sa kal m n (MNS) düzeyi ile ters orant l d r. Bu çal flman n amac hem fliddetli SMA hastalar n n hücre kültürlerinde düflük, temel MNS proteinin düzeyini ve hem de hücrelerde ilaçlarla yap lan tedaviden sonra küçük art fllar iki yanl bir ELISA testi ile saptayabilmektir. Yöntemler: MNS yi mikrotitreli levhalarla yakalamak için, rekombinant MNS ye karfl gelifltirilmifl MANS- MA1 isimli bir monoklonal antikor seçilmifltir. Rekombinant, tekrar katlanm fl MNS ye karfl seçilmifl bir tavflan antiserumu MNS yi saptayabilmek için kullan lm flt r. Bulgular: Kontrol fibroblastlarda MNS seviyesi oran SMA fibroblastlara göre 3.0 dan büyük bulunmufltur, bu bulgu da Western blot verileri ile do rulanm flt r. Saptayabilme limiti 0.13 ng/ml dir ve MNS 96 iyi kültür taba nda üretilmifl insan NT-2 nöral öncü hücrelerde ölçülmüfltür ( hücre/tabak). ELI- SA ile 24 saatin sonunda valproat ya da fenilbütirat ile tedavi edilmifl 10 5 SMA fibroblastlar nda MNS düzeylerindeki art fl gösterilmifltir. Sonuç: H zl ve iki yanl, özgül, 96 kapl ELISA testi, kit formunda mevcut olup, hücre kültürlerinde motor nöronlar n sa kal m nda ilaçlar n etkilerini say sal olarak ölçebilmektedir. Neurology 2008;71: SÖZLÜK HDAS = histon deasetilaz; SMA = spinal musküler atrofi; MNS = motor nöron sa kal m. Spinal musküler atrofi (SMA) otozomal resesif bir hastal k olup, MNS1 genindeki delesyon ya da mutasyona ba l olarak motor nöron sa kal m (MNS) proteinin düzeylerinin düflmesi ile karakterizedir. 1 Farede MNS geninin kayb ölümcüldür, 2 ancak insanda MNS1 geninin kayb böyle de ildir. Bunun nedeni ise insan genomunda özdefl bir MNS proteini kodlayan MNS2 geninin bulunmas d r. Ancak nükleotid sekanslar ndaki ufak farkl l klar nedeniyle MNS2 gen transkriptlerinin ço unlu u tam uzunlukta bir protein yerine farkl olarak kesilerek budanm fl bir MNS oluflturur. 3,4 Hem SMA hastalar nda 5,6 hem de transjenik fare modellerinde 7 MNS2 geninden MNS üretilmesi ile hastal n fliddeti aras nda güçlü bir ters orant bulunmaktad r. Bu da MNS seviyelerinde makul bir art fl sa layan ilaçlar ile fliddetli tip I SMA bebeklerin daha hafif fliddette olan SMA tip II çocuklar na dönüflebilmesi ya da tip II çocuklar n ayakta durabilen ve yürüyebilen daha da hafif tip III eriflkinler olarak yaflamaya devam edebilmesi için ümit vermektedir. 8 Ancak en fliddetli SMA formlar nda alt motor nöronlar n fonksiyonlar n n do umdan k sa bir süre sonra 9 olufltu u ve bu nedenle yüksek MNS düzeylerinin engel- 16 Temmuz 2008 den itibaren elektronik bask s mevcuttur, Wolfson Centre for Inherited Neuromuscular Disease (N.t.M., E.H., L.T.L., H.R.F., T.A.L., C.A.S., G.E.M.), Oswestry, BK; Hallmark Analytical Ventures (P.R.G.), Saltney, Flintshire, BK; Children s Hospital of Eastern Ontario Research Institute (A.E.M.), Ottawa, Kanada ve Institute for Science and Technology in Medicine (G.E.M.), Keele University, BK. SMA Projesi nden (NAtional Instute for Neurological Disease and Stroke, ABD), bir araflt rma fonu olan Andrew Buddies (FightSMA) JL SMA numaral bursu ile desteklenmifltir, ABD. Beyan: P.R. Goodwin ELISA kiti ticari olarak üretebilecek bir firmada direktör ve yönetici bilim adam d r. Di er yazarlar herhangi bir flirket ya da sat fllardan sa lanabilecek herhangi bir maddi ç kar ilgisi bildirmemifltir. RJAH Orthopaedic Hospital flirketten telif hakk ödemesi al yor olabilir. Copyright 2008 by AAN Enterprises Inc. Neurology 71 November 25,

2 leyebilse bile bu kayb geri döndüremedi i ak lda tutulmal d r. MNS düzeylerini artt rmas olas ilaçlar n gelifltirilmesi büyük bir h zla devam etmektedir ve insanlar n kullan m için flu anda lisans alm fl olanlar daha da çok ilgi çekmektedir. Bunlar aras nda butirat, 10 fenilbutirat, 11 valproat 12,13 ve trikostatin A, 14,15 gibi histon deasetilaz inhibitörleri (HDAS) ve aklarubisin, 16 indoprofen 17 ve hidroksiüre 18 gibi di er mekanizmalar üzerinden görev yapan ilaçlar say labilir. Aminoglikozidler 19 ve antisense oligonükleotidlerin 20 de MNS düzeyini artt rd gösterilmifltir. Ancak çok küçük yafltaki çocuklarda bile düflük dozlarda güvenle kullan labilecek ilaçlar n gelifltirilmesi için yürütülen çal flmalar hala önem tafl maktad r. Ayn zamanda ilaç tedavisi sonras MNS düzeylerindeki küçük art fllar ölçebilen ve genifl örnek topluluklar nda da kolayl kla kullan labilecek testlerin gelifltirilmesi gereklidir. Yüksek sonuç verme gücü olan tarama testleri tam uzunluktaki MNS mrna üretimini artt ran ilaçlar için mevcuttur. Ya MNS2 gen transkriptinin ek yerini de ifltirip tam uzunluktaki MNS den daha yüksek oranda üretilmesini sa layarak 21 ya da MNS2 gen promoter aktivitesini artt rarak görev yaparlar. 22 HDAS inhibitörleri, hem ek yerini de ifltirerek hem de MNS2 transkripsiyonunu artt rarak çal fl rlar. 13 MNS yi artt rmak için baflka mekanizmalar da vard r. Bunlar aras nda mrna ya da proteinlerin sa laml n artt rmak say labilir ve bu nedenle bir ilac n MNS protein seviyelerine son etkisini ölçebilen bir yöntem oldukça önemlidir. Western blot tekni i protein düzeylerini ölçmek için standart bir yöntem de olsa büyük miktardaki örnekleri taramak için çok uygun de ildir. Periferik kan hücrelerinde MNS yi ölçmek için 96 kapl format hücre immünoassay kullan lm flt r. 23,24 Biz burada, tip I SMA hastalar n n deri fibroblastlar gibi model sistemlerde ilaçlara ba l MNS art fl n ölçebilen iki yanl bir ELISA testini anlatmak ve HDAS inhibitörleri ile tedaviden sonra bu testin MNS art fl n do ru bir flekilde ölçtü ünü göstermek istedik. YÖNTEMLER Materyal. Daha önce tarif edildi i gibi tioredoksin ile pet32 den bakterilerde bir füzyon proteini olarak tam uzunluktaki rekombinant insan MNS si eksprese edildi ºC de saklanm fl, 4 M üre içeren PBS li (fosfatla tamponlanm fl izotonik tuzlu solusyon) inklüzyon cisimciklerinden üretilmifltir. Katlanma için 20 hacimde (2 M, 1 M, 0.5 M ve 0.25 M) 2 saat süre ile ve bir gece sonra sadece PBS ye karfl diyalize edilmifltir. MNS ye karfl poliklonal antiserumlar farelerde Eurogentec Ltd. (Seraing, Belçika) ve ya katlanm fl MNS ya da 6 M deki MNS immünojen olarak kullan larak elde edilmifltir. Eurogentec in MANSMA1 fare hibridoma hücre serisinde asit s v s haz rlanm flt r. Antiserum ve asit s v s ndan saflaflt r larak elde edilen immünoglobülinler PBS ile 5 10 kat suland r ld ve %50 lik konsantrasyon elde edilene kadar amonyum sülfat eklendi. Pelletler tekrar çözdürülerek PBS ye karfl diyalize edildi. Keçi anti-(fare Ig) immünglobülinleri ve peroksidaz ile konjuge edilmifl domuz anti-(tavflan Ig) immünglobülinleri DAKO parçalar ndan (Glostrup, Danimarka) elde edildi, ELISA tabaklar NUNC Maxisorp F8 96 kap idi (Roskilde, Danimarka). ELISA. ELISA kiti Hallmark Analitik Servislerinden (Saltney, Flintshire, BK) elde edildi ve burada bahsedilen yöntemler temelinde kullanma k lavuzu içermekteydi. Kullan - lan ELISA n n reagentlerin konsantrasyonlar ile birlikte özellikleri sonuçlar k sm nda verilmifltir. Birime konulmadan önce y kanmas ya da bloke edilmesi hariç reagentlerin hacmi kap bafl na 0.1 ml idi. Her basamakta tabaklar su ya da PBS ile 3 ila 5 kez k sa süre y kand. Hücre kültürü. nsan Ntera-2 nörojen hücre serisi, Prof. P.W. Andrews (Sheffield Üniversitesi, BK) taraf ndan sa land. Tip I SMA l bir hastan n (Cat No GM 03813), ayn aileden bir SMA tafl y c s n n (Cat No GM03814) ve akrabal bulunmayan bir kontrolün (cat No GM08333) deri fibroblast hücre serisi, Corriel Hücre Bankas ndan (Camden, NJ) düflük geçiflli numara ile elde edildi. Hücreler DMEM-Glutamax 1 de, %10 luk s ile inaktivasyonlu fetal buza serumunu %80 konflüans ile 1:5 oran nda subkültür yap larak sakland. Doku kültürü fliflelerinde üretilen hücreler (NUNC) tripsinizasyonla topland ve 0.3 ml RIPA ekstraksiyon tamponu 10 6 hücre bafl na ekstraksiyon yap lmadan önce santrifüj ile ekildi (%0.5 deoksikolat, %2 NP-40, 2 mm EDTA, 300 mm NaCl, 100 mm Tris-HCL, ph 7.4, %0.1 bovin serum albümin). Bu ekstreler ELISA öncesi 1:1, 1:3 oran nda suland r labilir. 24 well, 96 kap doku kültür tabaklar nda büyüyen hücreler (NUNC) y kand, süzüldü ve 4ºC de 30 dakika boyunca 0.2 ml RIPA ekstraksiyon tamponu ile salland 0.1 ml civar nda madde al nd ve ELISA ya direkt olarak verildi (santrifüj edilmeden). HeLa hücreleri DMEM-HEPES + %10 at serumu hücre/ml yo unlu a kadar süspansiyonda büyütüldü. Öncesinde 10 6 hücre bafl na 0.3 ml tampon olarak flekilde santrifüj ve ekstraksiyon yap ld. BULGULAR Format. ki yanl ELISA n n çal flma prensibi flekil 1A da verilmifltir. Ölçülmesi planlanan antijenin bir epitopundan daha fazlas yla bir proteinin çapraz tepkimeye girmesi pek beklenmedi i için iki yanl testlerin tek antikor kullan lan testlere göre özgünlü- ünün daha yüksek olmas beklenir. Mikrotitre 28 Neurology 71 November 25, 2008

3 Şekil 1 A B OD (U) İki yanlı ELISA testinin ve ELISA standart eğrisinin prensipi y = x x R 2 = MNS (ng/ml) (A) Aşama 1: tabağa bağlanan fare monoklonal antikoru diğer protein karışımlarının arasından motor nöron sağkalım proteinini (MNS) saptar (siyah elips). Aşama 2: Farklı MNS epitoplarına karşı tavşan antikoru ilk antikor ile tabağa bağlanan MNS yi saptar. İlk antikor ile tanınan, ortak bir epitopu olan başka herhangi bir proteinin (gri daire) her iki antikor ile tanınmadan ELISA da yer almayacağına dikkat ediniz. Bu neden iki yanlı ELISA testinin yüksek özgünlüğü olduğunu açıklamaktadır. Aşama 3: Piyasada mevcut olan konjuge anti- (tavşan Ig) ikinci antikora bağlanır. Aşama 4: kromojenik substratın eklenmesi ile renk reaksiyonu oluşur. (B) Bu tipik standart eğri benzerlerin üretilebilirliğini (değerler ilave edilmiştir) ve çizgisellikten hafif negatife saparak nasıl kuadratik bir eğriye tam uyduğunu göstermektedir. tabaklar bir gece boyunca saflaflt r lm fl asit s v - s ndan elde edilen (0.5 µg/ml PBS de) MNS monoklonal antikoru, MANSMA1 25 ile kaplan r. Sinyal/arka plan oran n en yükse e ç karmak için nonspesifik protein ba lama bölgeleri bir protein kayna ile engellenir. Daha sonra kurutmadan önce laktilol içeren bir üst kaplama ile sabitlenir. Bu ELISA tipinde baz engelleyiciler, (BSA, soya papton ve Byco A ya da C) belirgin olarak di erlerinden (ya al nm fl süt, jelatin, Byco M ya da polivinilpirolidon) daha iyidir. Standartlar ya da bir baflka deyiflle hedef proteini (MNS) içeren ekstreler kaplanm fl ELISA ya uygulan r (aflama 1) ve katlanm fl tam uzunlukta MNS ye karfl gelifltirilmifl k smen saflaflt r lm fl tavflan anti-mns ile antijenler saptan r (aflama 2). Ba l tavflan Ig, piyasada mevcut olan peroksidaz ile konjuge edilmifl domuz anti-tavflan Ig (aflama 3) ve sonra kalorimetrik madde olarak tetrametil benzidin ile (aflama 4) tespit edilir. Standart. Uygun bir MNS standart haz rlayabilmek için daha önce de bahsedildi i gibi bakteride, tioredoksin ile füzyon proteini olarak tam uzunluktaki MNS eksprese edildi. 25 Çözülmeyen inklüzyon cisimcikleri oluflturuldu ve 6 M ya da 8 M ürede rekombinant MNS çözdürüldü. Ancak üreden ar nd rmak için diyaliz yolu ile yap - lan dikkatli katlanma PBS de 4 ºC s da bir y ldan daha uzun süre stabil kalabilen 0.5 mg/ml stoklar sa lad. Jel filtrasyon analizi bu katlanm fl MNS nin küçük bir k sm n n monomerik oldu unu ve tanelerin hariç tutulma özelliklerine ba l olarak (Neurology de flekil 1-e, Web sitesi: ço unun oktamerik (>400 kd) ya da daha büyük (800 kd) oldu unu göstermifltir. Endojen MNS nin de multimerik komplekslerde yer ald düflünülmektedir. 26 fiekil 1-B de ELISA kiti kullan larak oluflturulan standart e ri gösterilmifltir. Kitte verilen seyreltilmifl edilmifl MNS standartlar 8 haftaya kadar oda s nlar nda bile RIPA ekstraksiyon tamponunda ve %0.1 lik BSA da stabildir (flekil e-2a). Dondurman n ELISA aktivitesi üzerine dokuz siklusa kadar belirgin bir etkisi olmad için seyreltilmifl standartlar n 20ºC de ya da daha düflük s larda uzun süreler saklanmas için uyguland (flekil e-2b). MNS standard 6 M üre içeren 0.5 mg/ml lik PBS de saha stabil olmas na ra men bu seriden elde edilen seyreltilmifl standartlar düzgün katlanm fl MNS den elde edilen seyreltilmifl standartlara göre ELI- SA da daha kötü performans göstermifllerdir. Antikorlar. Bir ELISA format nda sinyal:arka plan oran için MNS ye 25 karfl 22 farkl mabs nin ilk incelemesinde MANSMA1 in en az di erleri kadar iyi performans gösterdi i (veriler gösterilmemifltir) saptanm flt r. fiekil 1A da gösterildi i gibi amonyum sülfat presipitasyonu ile asit s v s ndan saflaflt r lm fl ve tabaklar kaplamada direkt uygulanm flt r. Yakalanan MNS ilk olarak ba fl kl k kazand r lm fl tavflanlardan 6 M üre ile h zl ca seyreltilmifl edilmifl rekombinant MNS ile elde edilen antiserum ile saptanm flt r. Katlanm fl MNS nin, 6 M üre ile seyreltilmifl edilmifl MNS ye göre testte daha iyi aktivitesinin olmas nedeniyle ELISA n n katlanm fl MNS ye karfl tavflan antiserumunun kullan m ile gelifltirilebilir oldu u düflünülmüfltür. Tablo 1-A da normal/sma oran verilmifl olup bu, test özgünlü ü için bir indeks olarak kullan ld (afla ya bak n z) ve bu flekilde gelifltirilmifl iki yeni tavflan antiserumundan birinin kullan m ile gelifltirildi. Bir di er iyilefltirme antikor konsantrasyonlar n n (tablo 1B) saptanmas - n n ideal hale getirilmesi ile yap ld. Testin özgünlü ünün artmas düflük antikor konsantrasyonlar nda nonspesifik antikor ba lanma miktar n n düflürülmesi ile gerçekleflmifltir. Antiserumun 1/2000 de 1/200 HRP-konjugat ile kombine edilmesi hem sinyal yüksekli i hem de yüksek kontrol/sma oran verdi i için tercih edildi. Neurology 71 November 25,

4 Tablo Tablo1 1 ELISA ELISA performansının iyileştirilmesi Arka Arka plan plan (çıkarılmıştır) Kontrol Kontrol A 450 A SMA 450 SMAA 450 A 450 Oran Oran Katlanmış MNS ye MNS ye karşı karşı iyileştirilmiş bir bir tavşan tavşan antiserumunun (Tavşan (Tavşan A/S A/S No.2) No.2) kullanılması Tavşan Tavşan A/S A/S a:0.298 a: Vs Vs 6M 6M üre üre MNS MNS b:0.557 b: Tavşan Tavşan A/S A/S No.1 No.1 a:0.161 a: Vs. Vs. katlanmış MNS MNS b:0.280 b: Tavşan Tavşan A/S A/S No.2 No.2 a:0.233 a: vsvsrefolded SMN SMN b:0.501 b: Antikor Antikor konsantrasyonlarının daha daha iyi iyi tanınması için için ileri ileri optimizasyon Tavşan Tavşan A/S A/S No. No. 2 21/400 a:0.333 a: HRP HRP anti-rb anti-rb 1/1000 1/ b:0.541 b: Tavşan Tavşan A/S A/S No. No. 2 21/200 a:0.401 a: HEP HEP anti-rb anti-rb 1/2,000 1/2, b:0.570 b: Tavşan Tavşan A/S A/S No. No. 2 21/200 a:0.249 a: HRP HRP anti-rb anti-rb 1/4000 1/ b:0.337 b: Bir Bir SMA SMA hastasının deri deri fibroblast kültürü kültürü ve ve normal normal kontrolün (Coriell (Coriell 8333) 8333) ekstreleri ELISA dan önce önce ya ya (a) (a) 1:3 1:3 ya ya da da (b) (b) 1:1 1:1 oranında sulandırılmıştır. Sulandırılmamış ekstreler hücre 6 hücre başına başına ml ml ekstrasiyon tamponu kullanılarak üretilmiştir. Arka Arka plan plan için için hücre hücre ekstreleri sadece sadece tampon tampon ekstresi ile ile yer yer değiştirilmiştir. A 450 A okumaları 450 arka arka plan plan için için düzeltilmiştir. SMA SMA = = spinal spinal musküler atrofi; atrofi; MNS MNS = = motor motor nöron nöron sağkalımı. Şekil Şekil 22 DAB DAB ECL ECL Spinal Spinal musküler atrofi atrofi (SMA) (SMA) fibroblastlarına kıyasla kıyasla kontrol kontrol deri deri fibroblastlarındaki motor motor nöron nöron sağkalım (MNS) (MNS) düzeylerinin oranı oranı Kontrol Kontrol (8333) (8333) SMA SMA (3813) (3813) Oran Oran Hücreler tripsinizasyonla toplandı ve ve ml ml RIPA RIPA ekstraksiyon tamponu hücre hücre başına başına ekstraksiyon yapılmadan önce önce santrifüj ile ile ekildi. ekildi. Bir Bir alikuot alikuot 1:1 1:1 oranında 2 2 SDS SDS yon ekstraksiyon tamponu ile ile seyreltildi (%4 (%4 SDS, SDS, %10 % merkaptoetanol, %20 %20 gliserol, mm mm Tri-HCL, ph:6.8) ph:6.8) ve ve iki iki dakika dakika kaynatıldı. Total Total protein protein ile ile aynı aynı miktardaki örnekler %10 %10 poliakrilamid jellere jellere ayrıştırıldı ve ve nitrosellüloz memranlara elektroblot edildi. edildi. MANSMA1 anti-sma mab mab ile ile Western blot blot (1:100) (1:100) geliştirildi ve ve peroksidaz ile ile loz işaretli işaretli tavşan tavşan anti-fare Ig Ig (DAKO; (DAKO; 1:1000) ve ve ürünleri kimyalüminesans için için ya ya diaminobenzidin (DAB) (DAB) ya ya da da Süpersinyal ECL ECL reagent (Pierce) (Pierce) ile ile elde elde edildi. edildi. Bantların elde elde edilen edilen imajları imajları Bio-Rad Quantity One One Yazılımı kullanılarak ölçüldü. rak Ekstraksiyon tamponu. Sitoplazmik MNS basit düflük tuz ya da izotonik tamponlar kullan larak oldukça kolay bir flekilde suland r labilmesine ra men nükleer MNS sadece yüksek tuz konsantrasyonlar nda çözünme özelli ine sahiptir ve böyle ekstreler iki yanl ELISA ile saptanamaz. %0.5 deoksikolat ve %2 lik NP-40 içeren modifiye edilmifl bir RIPA tamponu güvenilir ELISA sonuçlar elde etmek için gereklidir. Bu tampon az miktarda çözünmeyen kal nt b rakmakta ve hücre ekstreleri direkt olarak ELISA kaplar na santrifüj edilemeden uygulanabilmektedir. Bu tampon ile MANSMA1 ile saptanan ek MNS epitoplar sa layabilmekteydi. Test. Normal deri fibroblastlar n n MNS düzeylerinin SMA daki deri fibroblastlar na oran özgünlük için bir indeks olarak al nd. fiekil 2 de verilen örnekte oldu u gibi bu çal flmadaki hücre serilerinde Western blot normal/sma oran n olarak göstermifltir. Bu nedenle özgün ELISA en az 2.6 oran na ulaflmal d r ve bu da test için uyarlanm fl antikor kombinasyonlar ile elde edilmifltir (tablo 1). Tablo 2 de MNS düzeylerinin SMA tafl y c lar ndaki deri fibroblastlar nda (heterozigot 3814) kontrol (8333) ve homozigot SMA hastalar n nkilerin (3813) düzeylerinin aras nda oldu u gösterilmektedir. Bu deneyde normalin SMA ya oran 3.84 dür. Ancak kontrol fibroblastlar nda (SMA olmayan) MNS düzeylerinin anlaml derecede de iflkenlik gösterdi ini ve genellikle bu çal flmada kullan lan Coriell 8333 hücrelerinden daha düflük oldu unu fark ettik. Bu nedenle bir baflka deneyde kontrollerin (8333) SMA 3813 lere oran 3.3 olarak saptanm flt r (lokal olarak elde edilmifl di er üç kontrol deri fibroblastlara göre 3.2, 2.1 ve 2.0) (geçifl numaras ile iliflki yoktur). SMA fibroblastlar için, 2 3 arka planda bir ELISA okumas için gereken hücre say s 105 ve normal fibroblastlar ya da NT-2 nöronal öncü hücreler için dür. Tek kapta, 96 kapl mikrotitre taba nda yetifltirilmifl NT-2 hücreler ve 4 arka plan için testler yap labildi (tablo e-1), ancak SMA fibroblastlar için 24- kapl tabaklardan oluflan daha büyük kaplara ihtiyaç duyulmaktayd. ELISA n n özgünlü ünü artt rmak için iki yöntem araflt r ld. Peroksidaz ile konjüge streptavidin ve biyotinile edilmifl saptama antikorlar bilinmeyen nedenlerle nonspesifik arka planlar n yüksek olmas na neden olmufltur. Kimyaluminesan saptamas piyasada mevcut olan bir ajan (West Femto: Pierce) saptama limitini yükseltmifl, ama daha pahal reagentlere ve ekipmana ihtiyaç duyulmas na neden olmufltur ve ELISA kaplar aras ndaki farkl l klar daha büyük olarak saptanm flt r (veriler gösterilmemifltir). 30 Neurology 71 November 25, 2008

5 Tablo 2 Bir SMA taşıyıcısında MNS seviyeleri hasta ve kontrollerin arasındadır Tablo 2 Bir SMA taşıyıcısında Ortalama AMNS 450 seviyeleri MNS ng/ml hasta ve kontrollerin Test edilen arasındadır hücre no. MNS ng/10 6 hücre Yüzde Normal kontrol (8333) [6] Ortalama A 450 MNS ng/ml Test edilen hücre no. MNS ng/10 6 hücre Yüzde SMA taşıyıcısı (3814) [6] Normal kontrol (8333) [6] SMA hastası (3813) [6] SMA taşıyıcısı (3814) [6] Her SMA hücre hastası serisi, (3813) 25 cm 2 lik doku kültürü şişelerinde tek 15 tabaka [6] olarak yetiştirildi. Daha sonra tripsinize edildi ve hemositometer 26 ile ölçülerek santrifüj işlemi yapıldı ve ELISA için ekstrate edildi. MNS Her hücre = motor serisi, nöron 25 cm sağkalımı; 2 lik doku sma kültürü = spinal şişelerinde musküler tek atrofi. tabaka olarak yetiştirildi. Daha sonra tripsinize edildi ve hemositometer ile ölçülerek santrifüj işlemi yapıldı ve ELISA için ekstrate edildi. MNS = motor nöron sağkalımı; sma = spinal musküler atrofi. MNS (ng/ml) MNS (ng/ml) MNS (ng/ml) MNS (ng/ml) Şekil 3 Şekil 3 A A B 0.8 B Spinal musküler atrofi (SMA) fibroblastlarında motor nöron sağkalım Spinal musküler (MNS) proteinlerine atrofi (SMA) ilaçların etkisinin fibroblastlarında ELISA ile motor ölçülmesi nöron sağkalım (MNS) proteinlerine ilaçların etkisinin ELISA ile ölçülmesi Valproik asit dozu (µm) Valproik asit dozu (µm) Fenilbutirat dozu (µm) Deri fibroblastları, ilaçlı Fenilbutirat ya da ilaçsız dozu 24 kaplı (µm) kültür tabaklarına 1 ml kültür mayisinde 1000 hücre olacak şekilde yerleştirildi Deri fibroblastları, ve 37ºC de ilaçlı ya 24 da saat ilaçsız büyütüldü. 24 kaplı Valproik kültür tabaklarına ve 1 fenilbutiratın ml kültür mayisinde (B) sodyum 1000 tuzları hücre Sigma-Aldrich den olacak şekilde asidin (A) sağlandı yerleştirildi ve suda ve 37ºC de 100 mm 24 kültür saat mayisinde büyütüldü. seyreltildi. Valproik Kültür asidin kapları (A) ve fenilbutiratın yöntemde anlatıldığı (B) sodyum gibi ekstrakte tuzları Sigma-Aldrich den edildi ve direkt olarak sağlandı ELISA ve suda kaplarına 100 mm yerleştirildi. kültür mayisinde Her seyreltildi. tedavi için Kültür dört kopya kapları kültür yöntemde kutusuna anlatıldığı dair standart gibi ekstrakte sapma edildi oranları ve direkt hata barında olarak ELISA gösterilmiştir. kaplarına yerleştirildi. Her tedavi için dört kopya kültür kutusuna dair standart sapma oranları hata barında gösterilmiştir. SMA fibroblastlar ndaki MNS seviyelerine ilaçlar n etkisi. laçlar hücre büyümesini ve sa kal m n etkileyebilir ve MNS seviyelerini de ifltirebilir. Bu nedenle hücre say s na göre belirleme ve düzeltme yapabilen bir yöntem arzu edilir. Kopya kültürlerin tripsinizasyonunu, hemositometer say m ya da otomatik yöntemler (FACScan hücre ay r c s ) ve MTS ile kaplar direkt testler ile belirlemeyi denedik. Ancak bu ölçümlerdeki farkl l klar ELI- SA ölçümlerinden çok daha yüksekti ve ayn zamanda oldukça zaman al c yd lar. Bir baflka yaklafl m yüksek yo unluklu, k sa dönem hücre kültürleri ile (24 saat) kontakt inhibe hücrelerin hücre kültüründeki büyümesini primer deri fibroblastlar gibi en aza indirmek ve ilaç tedavisinin hücre say s üzerine etkisini azaltmakt r. Takip eden deneyler ile ilaçlar n tetikledi i upregülasyonun artm fl hücre say s na ba l olup olmad n belirlenmesi amaçland. fiekil 3 de valproat ve fenibütirat gibi MNS yi artt rd bilinen ilaçlar n MNS seviyelerine doza ba ml etkisi gösterilmifltir. fiekil 3 deki her de er dört ayr hücre kültürü kab n n ortalamas d r. Her kültür kab bir ELISA kab na transfer edilmifl ve bu nedenle hata fleritleri hem hücre kültüründe hem de ELISA daki varyasyonlar içermifltir. Test kitinin do rulanmas. ELISA, üç ayr kit kullanan endüstriyel olarak standart Biyoanalitik Yöntem Do rulama Program na tabiidir. ( Sonuçlar afla da verilmifltir. 1. Donmufl ekstreler için test içi varyasyon %4.6 rsd idi (SD/ortalama 100) (hedef <%10). 2. Yirmi dört kapl tabaklardaki kaplar için test içi varyasyon %19 idi (hedef <%20). 3. Donmufl ekstreler için test içi varyasyon %16.7 idi (hedef <%15). 4. Rekombinant MNS standartlar için çizgisel varyasyon %20 idi (hedef <%30). 5. Saptama limiti 0.13 ng/ml idi. 6. Spike kurtarma oran %82.5 idi. 7. Yüksek doz kanca etkisi yoktu: yüksek MNS konsantrasyonlar testte renk oluflumu engellememekteydi. Antikorlarla inkübasyon süreleri ± %25 oran nda de iflmifltir ve önemli bir etkisi olmam flt r. TARTIfiMA Hücre ekstrelerindeki proteinlerin ölçülmesinde Western blot tekni i standart yöntemdir. Özgünlü ü, hedef proteini (MNS) SDS- PAGE kullanarak di er olas çapraz tepkimeye girebilecek proteinlerden ay rmas ile sa lan r. Hücre say s için düzeltme, house keeping bir proteine karfl (ayn ya da kopyas bir jelde, aktin, lamin gibi proteinler) antikorlar kullan larak mümkün olur. Kalorimetrik ya da luminesan Neurology 71 November 25,

6 yöntemler ile yap lan Western Blot tekni i, dar bir konsantrasyon aral d fl nda çizgisellikten uzaklaflma e ilimindedir. ki yanl ELISA testinin bir avantaj ng/ml konsantrasyon aral - n n üstünde de neredeyse çizgisel bir yan t vermesidir. Western blot daki teknik sorunlar n üstesinden gelinebilse bile zaman sorunu ve küçük say daki örnekler d fl ndaki neredeyse tüm miktarlar için manipülasyonun gerekmesidir. Buna karfl n otomatik ekipman bulunmaks z n rutin olarak kap ELISA ile bir günde çal - fl labilmektedir. ELISA yeteri kadar do ru ve kopya kültürler ile büyük rakamlara ihtiyaç duyulmaks z n MNS deki küçük art fllar bile ölçebilmektedir (+%20 30). En önemlisi ilaç verilen hücrelerin manipülasyona ya da tekrar ifllenmesine gerek duyulmamas d r; ekstraksiyon için sadece bir tampon eklenir ve daha sonra direkt olarak ELISA ya transfer edilir. Western blot un özgünlü ü MNS nin moleküler boyuta göre önceden ayr flt r lmas ELISA da iki ayr anti-mns antikorunun kullan lmas ile sa lanmaktad r. Çünkü bu ELISA format nda tek bir çapraz tepkime veren proteinin iki ba lanma bölgesini birden içermesi pek olas de ildir. ELISA n n özgünlü ünü ortaya koymak kolay de ildir, çünkü negatif kontrol olarak kullan lmak üzere MNS si olmayan insan ya da fare hücresi bulunmamaktad r. Bu nedenle normal ve SMA hücre ekstrelerindeki MNS düzeylerinin oran n maksimize etmeyi tercih ettik, böylelikle en az Western blot dan elde edilen oran yakalamay amaçlad k. ki MNS2 geninden kaynaklanan fonksiyonel transkriptlere göre tip I SMA hücrelerinde beklenen MNS düzeyleri, iki MNS1 ve iki MNS2 geni olan normal hücrelere göre %10 dan daha azd r. Di erleri taraf ndan da gözlemlendi i gibi SMA hücre serilerinde MNS düzeyleri burada ve di er çal flmalarda oldu u gibi (Coriell 3813) Western blot ile belirlenmekte ve bilinmeyen nedenlerle genellikle beklenenden daha yüksek bulunmaktad r (kontrollerin yaklafl k %35 i [Coriell 8333]) MNS düzeyinde ilaçlara ba l geliflen yükselmeyi saptaman n bir di er yolu ilaç verilen hücrelerin çekirde inde mücevherleri ya da Cajal cisimciklerini saymakt r. Daha az hücre ve küçük ilaç dozlar na ihtiyaç duyulmas, hücre say s na ba l olarak düzeltme yap lmas gerekmemesi ve metodun kendisinin otomatik karmafl k mikroskobi ve görüntü analizi içermesi avantajlar say lmaktad r. Ancak mücevher say s n n hem toplam MNS düzeyini yans tmamas hem de ilaç tedavisi ile fonksiyonel MNS düzeyinin ve küçük art fllar n gözden kaçabilmesi dezavantajlar n oluflturmaktad r. Ek olarak tedavi edilmemifl SMA hücrelerinde mücevher say s oldukça az olup arka plandaki mikroskopik nonspesifik noktalar n daha da düflük düzeyde tutulmas n gerektirmektedir. ELISA verileri MNS de erini göreceli, ancak kesin olmayan flekilde verir. Bunun nedeni ölçülmek istenen antikorlar n konfirmasyona ba l olmas ve rekombinant standart MNS ye karfl farkl çekim düzeyleri olmas d r. Ek olarak do al komplekslerde MNS, MANSMA1 mab 27 ile etkin bir biçimde saptanabilmesine ve ekstraksiyon tamponundaki deterjanlar ile k smi ulafl labilir k l nmas na ra men her iki antikor taraf nda ulafl labilir olmamaktad r. Bu nedenlerle ELISA ile mg/ml cinsinden saptanan MNS seviyeleri kesin de erlerden daha düflüktür. Ekstraksiyonun etkinli i sa lanabilir, ancak flekil 3 ve tablo e-1 deki deneylerde anlat ld gibi ayr hücre ekstreleri aras ndaki SD sadece %5 dir. Kesin MNS düzeyleri asl nda çok gerekli olmamakta ve ilaca ba l upregülasyonun incelendi i durumlarda ilgisiz olmaktad r. Ancak rekombinant standartlar ve bir ya da daha fazla bilinmeyen Western blot ile çal fl ld ktan ve sonuçlar ELISA ile elde edildikten sonra bir düzeltme faktörü oluflturulabilir. Bu iki yanl ELISA ve hücre immünotesti 23,24 aras nda direkt bir k yaslama yapmak mümkün de ildir. Çünkü ikincisi periferik kan hücrelerinde kullan lm fl, ilaç çal flmalar nda fibroblastlarda uygulanmam flt r. Her iki test de ancak Western blot ile uyumlu sonuç verir ve her ikisinin de sonuçlar kesin olmaktan çok görecelidir. Bu kit henüz insan kan hücrelerindeki MNS için do rulanmam flt r, ancak eldeki lökositler eritrositlerden ve plazmadan ar t lm flt r, küçük bir kan örne inde yeterli MNS bulunmal d r ( lökosit/ml). 25 Ekim 2008 de al nd. Son haliyle 13 fiubat 2008 de yay - na kabul edildi. KAYNAKLAR 1. Lefebvre S, Burglen L, Reboullet S, et al. Identification and characterization of a spinal muscular atrophydetermining gene. Cell 1995;80: Schrank B, Gotz R, Gunnersen JM, et al. Inactivation of the survival motor neuron gene, a candidate gene for human spinal muscular atrophy, leads to massive cell death in early mouse embryos. Proc Natl Acad Sci USA 1997;94: Lorson CL, Hahnen E, Androphy EJ, Wirth B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96: Monani UR, Lorson CL, Parsons DW, et al. A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2. Hum Mol Genet 1999;8: Lefebvre S, Burlet P, Liu Q, et al. Correlation between severity and SMN protein level in spinal muscular atrophy. Nat Genet 1997;16: Coovert DD, Le TT, McAndrew PE, et al. The survival motor neuron protein in spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet 32 Neurology 71 November 25, 2008

7 1997;6: Monani UR, Sendtner M, Coovert DD, et al. The human centromeric survival motor neuron gene (SMN2) rescues embryonic lethality in Smn( / ) mice and results in a mouse with spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet 2000;9: Pearn J. Classification of spinal muscular atrophies. Lancet 1980;1: Crawford TO, Pardo CA. The neurobiology of childhood spinal muscular atrophy. Neurobiol Dis 1996;3: Chang JG, Hsieh-Li HM, Jong YJ, et al. Treatment of spinal muscular atrophy by sodium butyrate. Proc Natl Acad Sci USA 2001;98: Andreassi C, Angelozzi C, Tiziano FD, et al. Phenylbutyrate increases SMN expression in vitro: relevance for treatment of spinal muscular atrophy. Eur J Hum Genet 2004;12: Sumner CJ, Huynh TN, Markowitz JA, et al. Valproic acid increases SMN levels in spinal muscular atrophy patient cells. Ann Neurol 2003;54: Brichta L, Hofmann Y, Hahnen E, et al. Valproic acid increases the SMN2 protein level: a well-known drug as a potential therapy for spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet 2003;12: Avila AM, Burnett BG, Taye AA, et al. Trichostatin A increases SMN expression and survival in a mouse model of spinal muscular atrophy. J Clin Invest 2007;117: Ting CH, Lin CW, Wen SL, Hsieh-Li HM, Li H. Stat5 constitutive activation rescues defects in spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet 2007;16: Andreassi C, Jarecki J, Zhou J, et al. Aclarubicin treatment restores SMN levels to cells derived from type I spinal muscular atrophy patients. Hum Mol Genet 2001;10: Lunn MR, Root DE, Martino AM, et al. Indoprofen upregulates the survival motor neuron protein through a cyclooxygenase-independent mechanism. Chem Biol 2004;11: Grzeschik SM, Ganta M, Prior TW, Heavlin WD, Wang CH. Hydroxyurea enhances SMN2 gene expression in spinal muscular atrophy cells. Ann Neurol 2005;58: Wolstencroft EC, Mattis V, Bajer AA, Young PJ, Lorson CL. A non-sequence-specific requirement for SMN protein activity: the role of aminoglycosides in inducing elevated SMN protein levels. Hum Mol Genet 2005;14: Skordis LA, Dunckley MG, Yue B, Eperon IC, Muntoni F. Bifunctional antisense oligonucleotides provide a transacting splicing enhancer that stimulates SMN2 gene expression in patient fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA 2003;100: Feldkotter M, Schwarzer V, Wirth R, Wienker TF, Wirth B. Quantitative analyses of SMN1 and SMN2 based on real-time lightcycler PCR: fast and highly reliable carrier testing and prediction of severity of spinal muscular atrophy. Am J Hum Genet 2002;70: Jarecki J, Chen X, Bernardino A, et al. Diverse smallmolecule modulators of SMN expression found by highthroughput compound screening: early leads towards a therapeutic for spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet 2005;14: Kolb SJ, Gubitz AK, Olszewski RF Jr, et al. A novel cell immunoassay to measure survival of motor neurons protein in blood cells. BMC Neurol 2006;6: Sumner CJ, Kolb SJ, Harmison GG, et al. SMN mrna and protein levels in peripheral blood: biomarkers for SMA clinical trials. Neurology 2006;66: Young PJ, Le TT, Nguyen thi Man, Burghes AH, Morris GE. The relationship between SMN, the spinal muscular atrophy protein, and nuclear coiled bodies in differentiated tissues and cultured cells. Exp Cell Res 2000;256: Lorson CL, Strasswimmer J, Yao JM, et al. SMN oligomerization defect correlates with spinal muscular atrophy severity. Nat Genet 1998;19: Hao LT, Fuller HR, Lam LT, Le TT, Burghes AH, Morris GE. Absence of gemin5 from SMN complexes in nuclear Cajal bodies. BMC Cell Biol 2007;8:28. Neurology 71 November 25,