SONUÇ RAPORU DOMUZ GRĐBĐ VĐRÜSÜ (H1N1) KULLANILARAK YAPILAN VĐRÜSĐDAL ETKĐLĐLĐK TESTĐ

Transkript

1 MICROBIOTEST THE MICROBIOLOGY AND VIROLOGY LABORATORY Sayı SONUÇ RAPORU DOMUZ GRĐBĐ VĐRÜSÜ (H1N1) KULLANILARAK YAPILAN VĐRÜSĐDAL ETKĐLĐLĐK TESTĐ Test Amili: Medentech üretimi 2,5gram aktif maddeli NaDCC Tabletleri Test Organizması: Domuz Gribi Virüsü (H1N1) A/Swine/1976/31, ATCC VR-99 Veri Gereksinimi: EPA Kılavuzları (g) Müellif: Zheng Chen MS. Çalışma Bitiş tarihi 15 / 09 / 2009 Test Yapan Laboratuar MICROBIOTEST 105 Carpenter Drive, Sterling, Virginia Laboratuar Proje Tanımlama Numarası Protokol Tanımlama Numarası Sponsor Medentech Ltd Whitemill Industrial Estate Clonard Road Wexford, Ireland Sayfa: 1

2 GĐZLĐLĐK GEREKTĐREN VERĐ DURUMU YOKTUR. Başlık: Domuz Gribi Virüsü (H1N1) Kullanılarak Test Mercii: MICROBIOTEST 105 Carpenter Drive Sterling, Virginia Bu çalışmada FIFRA 10(d)(1)(A),(B) veya (C) kapsamı dâhilindeki düşüş temelinde gizlilik şikâyeti olacak herhangi bir bilgi yoktur. Firma Mümessili Başlık Đmza Tarih Sayfa: 2

3 UYUM BEYANI Bu çalışma aşağıdaki istisnalar hariç 40CFR 160 gereksinimlerine uymaktadır. Tanımlama, kuvvet, saflık, stabilite, uyumluluk test amilinin doz solüsyon analizi bilgileri çalışma sponsorunun mükellefiyetindedir. Aşağıdaki teknik personel bu çalışmada yer almıştır. Çalışma Müdürü: MICROBIOTEST Đmza Tarih Zheng Cheng, MS. 15/09/2009 Onaylayan Đsim Unvan Đmza Tarih Sponsor Medentech Ltd LIZ DELAHUNTY Đsim Kamu Kurumlarıyla Đlişkiler Müdürü Unvan Đmza 17/09/2009 Tarih Sayfa: 3

4 KALĐTE TEMĐNĐ ÜNĐTE DURUMU Başlık: Domuz Gribi Virüsü (H1N1) kullanılarak yapılan Virüsidal Etkililik Testi MICROBIOTEST in Kalite Temini Ünitesinin Proje numarasıyla Đyi Laboratuar Uygulamaları kurallarına (40 CFR 160) uygunluğu denetlenmiştir. Denetleme tarihleri ve hüküm tarihleri yönetime ve çalışma müdürüne aşağıda listelendiği gibi bildirilmiştir. DENETĐM FAZI DENETĐM TARĐHĐ ÇALIŞMA MÜDÜRÜNE YÖNETĐME RAPOR RAPOR TARĐHĐ TARĐHĐ Protokol 31/08/ /09/ /09/2009 Đşlem 31/08/ /09/ /09/2009 Final raporu 08/09/ /09/ /09/2009 Đmza 15/09/09 Nathan S. Jones, RQAEP GLP Tarih Müdür, Kalite Temini Ünitesi Sayfa: 4

5 ĐÇĐNDEKĐLER SONUÇ RAPORU KAPAK SAYFASI 1 GĐZLĐLĐK VERĐSĐ BULUNMAMA DURUMU 2 UYUMLULUK DURUMU 3 KALĐTE TEMĐNĐ ÜNĐTESĐ DURUMU 4 ĐÇĐNDEKĐLER 5 TEST ÖZETĐ 6 TEST KOŞULLARI 7 8 ÇALIŞMA TARĐHLERĐ VE TESĐSLER 8 ELDE EDĐLEN KAYITLAR 8 TĐTRASYON HESAPLAMASI 9 SONUÇLAR 9 11 DEĞERLENDĐRME 12 EKLER Sayfa: 5

6 TEST ÖZETĐ BAŞLIK: Domuz Gribi Virüsü (H1N1) kullanılarak yapılan Virüsidal Etkililik Testi ÇALIŞMA DĐZAYNI: Bu çalışma, Çalışma Müdürü (Bkz. Ek) tarafından verilen imzalı protokol ve proje sayfalarına göre yapılmıştır. ÇALIŞMA SPONSORU TARAFINDAN TEMĐN EDĐLEN TEST AMĐLLERĐ 1. Medentech 2,5gram NaDCC tabletleri üretmiştir. Lot No 09HA149, MICROBIOTEST e gelme tarihi ve Tahsis numarası 2. Medentech 2,5gram NaDCC tabletleri üretmiştir. Lot No 07F7482, MICROBIOTEST e gelme tarihi ve Tahsis numarası SPONSOR: Medentech Ltd Whitemill Industrial Estate Clonard Road Wexford, Đrlanda Sayfa: 6

7 TEST KOŞULLARI Mevcut Virüs: Domuz Gribi Virüsü (H1N1), A/Domuz/1976/31, ATCC VR-99 Konakçı Hücre Soyu MDCK hücreleri, ATCC CC-34 Aktif maddeler Sodyum dikloroizosayanurat (troklozen sodyum) Nötralizer Minimum Zorunlu Ortam (MEM) mol/l Na 2 S 2 O 3 + %1 Fetal Bovine Serum Test amili preparasyonu Bir tablet 10 litrelik steril de-iyonize suda eritilir Çözücü Steril de-iyonize su Temas süresi 10 dakika Temas ısısı Ortam oda sıcaklığı 19 21C (20C gerçek) Organik direnç >%5 serum Taşıyıcı aşılama ve kurutma süresi 2 x 2 inç ebadında bir cam taşıyıcı 0,4ml virüs ile aşılanmış ve 30 dakika süreyle kurutulmuştur. Test amili uygulaması 2ml test amili aşılanmış taşıyıcıya ilave edilmiştir. Ortam ve reaktifler Minimum Zorunlu Ortam (MEM) + 1,0µf/ml Tripsin Minimum Zorunlu Ortam (MEM) mol/l serum Sefakril Kolonu Fosfat Tamponlu Tuz 8PBS Steril De-iyonize su DPD Toplam Klor Toz Yastığı Na 2 S 2 O 3 + % 1 Fetal Bovine Sayfa: 7

8 ÇALIŞMA TARĐHLERĐ VE TESĐSLER Bu testin laboratuar fazı 105 Carpenter Drive Sterling, Virginia adresindeki MICROBIOTEST te yapılmıştır. Test yapılan laboratuar işe da başlamıştır ve tarihinde tamamlamıştır. Çalışma müdürü protokolü tarihinde imzalamıştır. Çalışma tamamlama tarihi müdürün final raporunu imzaladığı tarihtir. Protokolün bütün değişiklikleri ve revizyonları doküman haline getirilmiş, çalışma müdürü tarafından imzalanmış, tarih atılmış ve protokole uydurulmuştur. KORUNAN KAYITLAR Bütün test verileri, protokol, protokol düzeltmeleri, test malzemesi kayıtları, final rapor ve MICROBIOTEST ve sponsor arasındaki yazışmalar 105 Carpenter Drive Sterling, Virginia adresindeki MICROBIOTEST arşivlerinde veya kurumun kontrollü bir tesisinde saklanmaktadır. Sayfa: 8

9 TĐTRASYON HESAPLAMASI % 50 doku kültürünün her ml deki enfeksiyonlu dozu Spearman Karber metodu ile aşağıdaki formül kullanılarak tanımlanmıştır. d M = x k + [ ] d p i 2 Burada m= test hacmi ile bağıntılı titrasyon logaritması X k = bütün kültürlerin enfekte olmasına sebep olan en küçük dozajın logaritması d= sulandırma faktörü logaritması p i = sulandırma i de pozitif sonuçların oranı Sonuçlar Tablo 1 5 te gösterilmiştir. SONUÇLAR Log 10 Đndirgeme Faktörü aşağıdaki şekilde hesaplanmıştır. Log 10 Đndirgeme = Log 10 TCID 50 (plaka Alma Kontrolü) - Log 10 TCID 50 (Test) Viral Dirençleme (Log 10 TCID 50 ) her taşıyıcı için aşağıdaki şekilde tanımlanmıştır. Direnç (Log 10 TCID 50 ) = titrasyon (Log 10 TCID 50 /ml) + Log 10 [her taşıcı hacmi (ml)] Anahtar (bütün tablolar için): x/y = y plakası dışındaki x plakası gösterilen pozitif viral sitopatik etki aşılanmıştır. 0/y= y plakası dışındaki 0 gösterilen pozitif viral sitopatik etki aşılanmıştır. Herhangi bir sitotoksisite veya bakteriyel kontaminasyon aşılanmış olan herhangi bir plakada gözlemlenmemiştir. Sayfa: 9

10 SONUÇLAR Tablo 1 Test Amili Sonuçları Sulandırma* Medentech üretimi 2,5gm NaDCC Tabletleri Lot No. 09HA149 Lot No. 07F /4 0/ /4 0/ /4 0/ /4 0/ /4 0/ /4 0/4 Titrasyon (Log 10 TCID 50 /ml) <1,50 <1,50 Direnç her taşıyıcıda (0,4ml) Log 10 TCID 50 <1,10 <1,10 Log 10 Đndirgeme >5,00 >5,00 Sulandırma virüs inokülümünden sulandırma katına atıfta bulunur. Tablo 2 Nötralizer Etkililiği ve Kontrollerle Đlgili Sitotoksisite Sulandırma* Medentech üretimi 2,5gm NaDCC Tabletleri Lot No. 09HA149 Lot No. 07F /4 0/ /4 0/ /4 0/4 Sulandırma taklit inokülümünden sulandırma katına atıfta bulunur. Sayfa: 10

11 SONUÇLAR (devam) Tablo 3 Yaşama Kabiliyeti Kontrolü Hücre Yaşama Kabiliyeti Kontrolü 0/4 Hücreler yaşayabilir; ortam sterildir Tablo 4 Virüs Telafi Kontrolü Sulandırma* Plaka Telafi Kontrolü Kolon Titrasyon Kontrolü Virüs stok Titrasyon Kontrolü /4 4/4 Tanımlanmadı /4 4/4 Tanımlanmadı /4 4/4 4/ /4 4/4 4/ ¾ ¾ 4/ ¼ ¼ 4/ Tanımlanmadı Tanımlanmadı 2/ Tanımlanmadı Tanımlanmadı 0/4 Titrasyon (Log 10 TCID 50 /ml) 6,50 6,50 8,00 Direnç her taşıyıcıda (0,4ml) Log 10 TCID 50 6,10 6,10 NA Sulandırma virüs inokülümünden sulandırma katına atıfta bulunur. NA = uygulanmaz Tablo 5 Toplam Klor Analiz Sonuçları Medentech üretimi 2,5gm NaDCC Tabletleri Lot No ppm 09HA F Sayfa: 11

12 DEĞERLENDĐRME Düzenleme kurumlarına göre, test amili bütün sulandırmalardaki virüs çeşitlerinin inaktivasyonu tamamlandıysa Virüsidal Etkililik testinden geçmiştir. Sitotoksisite belirgin olduğunda, titrasyonda en azından üç log indirgeme sitotoksik seviye ötesinde açıklanmaktadır. Test tanımlandığı gibi yapıldığında, Medentech tarafından üretilen 2,5gm NaDCC Tabletleri, 20C de 10 dakika süreyle % 5 organik kirlilik içeren test amiline maruz bırakılmış olup Domuz Gribi Virüsü (H1N1) Virüsidal Etkililik testinden geçmiştir. Kontrollerin tamamı geçerli test kriterine uyumludur. Bu sonuçlar gözlem verilerine dayanmaktadır. Sayfa: 12

13 EKLER Sayfa: 13

14 MICROBIOTEST PROTOKOLÜ Domuz Gribi Virüsü (H1N1) VĐRÜSĐDAL ETKĐLĐLĐK TESTĐ Test Kurumu MICROBIOTEST 105 Carpenter Drive, Sterling, Virginia Test isteği yapan firma Medentech Ltd Whitemill Industrial Estate Clonard Road Wexford, Ireland 19 Ağustos 2009 MICROBIOTEST 9 MICROBIOTEST Proje: Sayfa: 14

15 AMAÇ: Bu test virüsit olarak etiketlenmiş ürünün virüsidal etkililik iddiasını kanıtlamak için yapılmıştır. Domuz Gribi Virüsü (H1N1) ile kirletilmiş sert yüzeylerdeki test amilinin potansiyelini belirlemektedir. Test tüketici kullanımına benzer bir şekilde dizayn edilmiştir ve Kasım 1981 tarihli DIS/TSS-7 EPA Kılavuzlarına uymaktadır ve Test Malzemeleri için Amerikan Derneğinde (American Society for Test Materials) belirtilen E de gösterilen test metodunu takip etmektedir. TEST KOŞULLARI Virüs oda sıcaklığındaki uygun steril bir sert yüzeyde kurutulmuştur. Bir tablet sıvı test amili elde etmek için 10 litre suda eritilmiştir. Test amilinin 2 farklı lotu kurutulmuş virüsü işlemden geçirmek üzere kullanılmıştır. Sponsor tarafından belirtilen maruz kalma periyodu tanımlandıktan sonra test amili virüs karışımı yüzeyden kazınarak alınmış, biriktirilmiş, nötralize edilmiş ve enfeksiyonlu viral partiküllerin bulunup bulunmadığı test edilmiştir. Test amilinin bir konsantrasyonu bir maruz kalma süresinde değerlendirilmiştir. her bir test koşulu için bir tekrar yapılmıştır. MALZEMELER A. Test, kontrol ve referans maddeleri çalışma sponsoru tarafından tedarik edilmiştir (bakınız son sayfa) Test amili aksi bir durum belirtilmediği müddetçe sponsorun tanımladığı gibi test edilmiştir. Sulandırma ve özel depolama koşulları gibi test amilinde yapılan bütün testler teste başlamadan önce sponsor tarafından belirtilmiştir. Sponsor, MICROBIOTEST test yapma kurumu yönetimini test amili uygun bir şekilde test edilmiştir tanılama, kuvvet, saflık, stabilite ve üniformite uygulanabilirliği açısından temin etmektedir. MICROBIOTEST test tamamlandıktan sonra kullanılmayan test amillerini en azından üç ay süreyle alıkoyacak ve daha sonra emniyet memurunun onay uygunluğu ile atacaktır. Sayfa: 15

16 B. MICROBIOTEST tarafından temin edilen, fakat sınırlandırılmayan malzemeler 1. Çalışma sponsoru tarafından istenilen virüs çeşidi: Domuz Gribi Virüsü (H1N1), A- Domuz/1976/31 (ATCC VR-99) 2. Konakçı Virüs Soyu: MDCK hücreleri 3. Laboratuar ekipmanı ve malzemeleri 4. Ortam ve reaktifler Ortam ve reaktifler konakçı virüs soyu ile ilişkilidir ve testi yapılan test amili ilk proje sayfasında ve veri paketinde belgelenmiştir. TEST SĐSTEMĐ TANIMLAMASI Bütün petri kutuları, sulandırma tüp rakları ve konakçı içeren aparatlar aşağıdaki bilgilerle uygun bir şekilde etiketlenmiştir. Virüs, konakçı ve test amili ve / veya proje numarası. DENEYSEL DĐZAYN Bu çalışma performansına dâhil olan bütün prosedürler MICROBIOTEST tarafından korunan bir SOP serisinde detaylı olarak tanımlanmıştır. SOP ve loglar ham veriye dayanmakta ve GLP (Good Laboratory Procedure Đyi Laboratuar Uygulamaları) kurallarının bir parçası olarak gerekmektedir. Çalışma akış diyagramı aşağıdaki bölümde detaylı bir şekilde tanımlandığı gibi Figür 1 de gösterilmiştir. Sayfa: 16

17 TABLO Ürün Lot 1 Ürün Lot 2 Plaka Kontrol NE/VI Kontrol Petri kutusu Petri kutusu Petri kutusu Petri kutusu Kurutulmuş 0,4ml virüs Ürün uygulama Temas süresinde tutma Nötralize ekleme Karışımı kazıma Bir seri sulandırmadan sonra, hücreleri aşılama Kurutulmuş 0,4ml virüs Ürün uygulama Temas süresinde tutma Nötralize ekleme Karışımı kazıma Bir seri sulandırmadan sonra, hücreleri aşılama Kurutulmuş 0,4ml virüs Eşit hacimli CCM uygulama Temas süresinde tutma Nötralize ekleme Karışımı kazıma Bir seri sulandırmadan sonra, hücreleri aşılama Sitotoksite Kontrol Kurutulmuş 0,4ml virüs Ürün uygulama (Lot 1) Temas süresinde tutma Nötralize ekleme Karışımı kazıma Đki bölüme ayırma NE/VI CC Bir seri sulandırmadan sonra, virüs ile karıştırma Hücreleri aşılama Bir seri sulandırmadan sonra, virüs eklememe Hücreleri aşılama Hücre Yaşayabilirlik Kontrol Hücre Kültür Ortamı Hücreleri aşılama Đnkübasyon Enfeksiyonlu virüs için tahlil CCM: Hücre Kültür Ortamı (Cell Culture Medium) NE/VI: Nötralizer Etkililiği / Viral Karışım Kontrolü (Neutralizer Effectiveness / Viral Interference Control) CC: Sitotoksisite Kontrolü (Cytotoxicity Control) Not 1: 1 tablet 10 litre su içerisinde eritilerek sıvı test amili hazırlanmıştır. Not 2: Her bir taşıyıcıya uygulanan virüs hacmi virüs titrasyonuna bağlı olarak değiştirilebilir. Bu hacim yapılan bütün testler ve kontrol çalışmaları süresince sürekli olarak kalmaktadır. Sayfa: 17

18 A. Aşılama Preparasyonu: Viral stoklar bilimsel olarak kabul edilmiş metotlar vasıtasıyla tanımlanmış itibarlı kaynaklardan satın alınmıştır ve MICROBIOTEST te üretilmiştir. Virüs kaynağını belirten kayıtlar korunmuştur. Virüs stokları ultra düşük ısılarda depolanmaktadır. Donuk viral stokları test gününde çözülmektedir (taze stok kültürleri Çalışma Müdürünün tutumuna göre kullanılmaktadır). Serum, sponsor tarafından belirtilmediği müddetçe %5.lik (eğer %5 veya üzeri değilse) bir organik ürün elde etmek için viral stoklara eklenmektedir. B. Taşıyıcı preparasyonu: Test amilinin her bir lotu stok virüsün 0,4ml.lik kısmı ile önceden steril edilmiş ve alt kısmı yaklaşık 4 inç kare şeklinde işaretlenmiş bir petri kutusuna yayılmıştır. Not: Her bir taşıyıcıya uygulanan test virüsü hacmi Çalışma Müdürünün tutumuna göre değiştirilebilir. Bu hacim bütün test ve kontrol çalışmaları süresince tutarlı bir şekilde kalmaktadır. Daha sonra virüs oda sıcaklığında kurumaya bırakılmaktadır. Kurutma süresi ve ısı kayıt edilmektedir. Bir taşıyıcı, her bir lottan alınan test amilinin her kopyalanmasıyla ile hazırlanmaktadır. Buna ilaveten, nötralize etkililiği / viral karışım kontrolü için bir taşıyıcı virüsteki hücre kültür ortamı kullanılarak hazırlanmaktadır. C. Test amili hazırlama Test amili sponsorun kesin talimatlarına göre hazırlanmaktadır. Bir tablet sıvı test amili elde edilmesi için 10 litre su içerisinde eritilmektedir. Tabet eridikten sonra, test yapılmadan önce numunedeki serbest klor analiz edilmektedir. Serbest klorun kabul edilebilir genişliği (eğer uygulanabilirse) protokolün son sayfasında sponsor tarafından madde madde belirtilmiştir. Sayfa: 18

19 D. Test Test amilinin iki lotu bir temas süresinde test edilmiştir. Bir tekrar test amilinin her bir lotu için test edilmiştir. Her tekrar çalışması için, aşılama kuruduktan sonra, kurutulmuş virüs filminin tamamen kaplandığından emin olunarak 2,0ml test amili ilave edilmiştir. Plakalar sponsorun belirlediği ısı ve sürede bırakılmıştır. Temas periyodundan sonra test amili 2,0ml.lik uyun bir nötralize edici ile nötralize edilmiş ve petri yüzeyinden alınan karışım ile karıştırılmıştır. Bunun ortalama 10-1 seyrelti olduğu göz önünde tutulmaktadır. Sprey tipli amiller için, amil sponsorun tarifine göre kullanılmakta, dağıtılan hacim ölçülmekte ve buna eşit miktarda nötralize edici kullanılmaktadır. Temas süresini takiben, numune işlenmesi için prosedür daha önce tanımlandığı gibidir. Eğer kolonlar kullanılacaksa, her bir numune farklı pre-spun Sephacryl kolonlarına dirençlenmiştir. Kolonlardaki pasajları takiben, eşitlikler aseptik olarak biriktirilmiştir ve seri olarak CCM de on kere sulandırılmıştır. Eğer kolonlar kullanılmazsa, bir seri on kere sulandırma aşılama / test amili karışımı CCM de hazırlanmıştır. E. Enfektifite Tahlili: Her iki test ve kontrollerdeki bakiye enfekte virüs, viral çekimli sitopatik etki vasıtasıyla tespit edilmektedir. Nötralize aşılama / dezenfektan karışımının seçilmiş seyreltileri kültürlenmiş konakçı hücrelere eklenmiştir (en azından her seyrelti için 4 plaka, her reaksiyon karışımı için) ve 4 6 günlük bir periyotta % 5 +1 CO 2 ile 36C +2 inkübe edilmiştir. Hücre plakaları, aşılamadan önce fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile iki kere yıkanmıştır. Konakçı hücre kültürleri gözlemlenmiş ve inkübasyon periyodu süresince gerekli referans olarak refere edilmiştir. Bu aktiviteler, eğer uygulanabilirse, kayıt edilmiştir. Konakçı hücreler inkübasyon tamamlandıktan sonra enfekte virüslerin bulunması konusunda mikroskobik olarak kontrol edilmiştir. Virüs spesifik CPE ve test amili - spesifik sitotoksik etkiler sonucu hem testlerin ve hem de kontrollerin kontrolü ile ortaya çıkartılmıştır. Bu gözlemler kayıt edilmiştir. F. Kontroller 1. Plaka Geri Alma Kontrolü: Virüs aşısı steril cam petri kabı yüzeyine yayılır ve ortam sıcaklığında kuruması için bırakılır. Test amili hacmine eşit olan CCM hacmi kurutulmuş virüse eklenir. Temas süresinden sonra virüs test amili olarak benzer nötralizasyon prosedürüne tabi tutulur. Bu kontrol kurutma ve nötralizasyondan sonuçlanan rölatif virüs enfektifite kaybını belirleyecektir. Sayfa: 19

20 Bu kontrolden elde edilen sonuçlar, kurutma ve nötralizasyonu takip eden bu kontroldeki enfekte virüs miktarının en azından 4.0-log indirgendiğini konfirme eden test sonuçları ile mukayese etmektedir. Titrasyon test sonuçlarının titrasyonu ile elde uygulanabilir test kriterine ulaşmak mukayesede kullanılmaktadır. (bkz. Alt metin) 2. Nötralizer etkililiği / viral karışım kontrolü: Bu kontrol nötralizasyondan sonra bakiye aktif maddenin bulunup bulunmadığını ve nötralize test amilinin virüs enfeksiyon sistemine karışıp karışmadığını tespit etmektedir. Test amilinin bir lotu test prosedürü olarak tam anlamıyla işlemden geçirilmeden önce virüs aşılama yerinde kurutulmuş CCM test amiline maruz bırakılacak (2.0ml) ve daha önce tanımlandığı gibi test edilecektir. Son kontrol ve nötralizasyon, nötralize CCM/ test amili karışımı iki parçaya bölünmüş olup, bir tanesi sitotoksi kontrolü ve diğeri nötralizer etkililiği / viral karışım kontrolü ve test olarak işlemden geçecek şekilde ayrılmıştır. Eğer kolonlar kullanılırsa, her bir parça bireysel kolonlar içerisinden geçirilmiş ve CCM de seri olarak on kere seyreltilmiştir. Eğer kolonlar kullanılmayacaksa, nötralizer etkililik numunesi (0,5ml) CCM de seri on kere seyreltme kullanılarak seyreltilmiştir. CM deki her bir reaksiyon karışımının seri seyreltisi takip edilerek, virüs (100ml virüs aşılamanın düşük titrasyonu) her bir seyreltiye ilave edilmiş ve temas süresine eşit veya daha uzun süreli periyotta tutulmuştur. Daha sonra seçilmiş seyreltiler test prosedürü için tanımlandığı şekilde konakçı hücreleri aşılamak için kullanılacaktır. 3. Sitotoksisite Kontrolü Nötralize etkililiği / viral karışım kontrolünden elde edilen sitotoksisite numunesi seyreltilmiş olup ilave edilen virüs yoktur. Seçilen seyreltiler aşılanmış ve test ve kontrol numunelerinin geri kalanı olarak aynı amaçla inkübe edilmiştir. Bu etkiler plakadan alınan kontrol kültürlerinde apaçık belli olan virüs teşvikli sitopatik etkilerden farklıdır. 4. Kolon titrasyon kontrolü (sadece Sephacryl kolon kullanılması durumunda yapılacaktır) Bu kontrol enfekte virüs titrasyonu bulunan kolonlardaki herhangi bir değişimi tespit etmek için yapılmaktadır. Bu kontrol için numune kolonlardan geçmeden önceki PRC parçasından elde edilmekte ve CCM de seri olarak seyreltilmekte ve daha sonra test olarak aynı amaçla işlemden geçirilmektedir. 5. Hücre yaşayabilirlik kontrolü: Bu kontrol tahlil periyodu esnasında canlı kalan hücreleri göstermektedir. Buna ilaveten, tahlil periyodu süresinde kullanılan CCM nin sterilitesini konfirme etmektedir. En azından 4 plaka hücre sadece CCM için alınmıştır ve inkübe edilmiş Sayfa: 20

21 ve her iki test ve diğer kontroller için işlemden geçirilmiştir. Bu negatif kontrol olarak saklanmıştır. 6. Virüs Stok Titrasyon Kontrolü Bu çalışmada kullanılan virüs tam böleni seri olarak seyreltilmiş ve stok virüs titrasyonunun konfirme etmek için konakçı hücrelere aşılanmıştır. Bu kontrol stok virüs kullanılmaya uygun olup olmadığını ve viral enfektifite tahlilinin uygun bir şekilde yapılıp yapılmadığını göstermektedir. G. Hesaplama: Her ml.lik dozu enfekte olan % 50 doku kültürü (TCID 50 /ml) Spearman-Karber veya baka bir uygun metot kullanılarak tanımlanmıştır. Test sonuçları Log 10 olarak belirtilen test amili ile işlemden geçirilmesinden dolayı virüs titrasyon indirgemesi olarak rapor edilmektedir. PERSONEL VE TEST YAPMA TESĐSLERĐ Bir çalışma müdürü test başlatmadan önce atanmıştır. Özetler saklanmış ve istek halinde ortaya çıkartılmıştır. Bu çalışma 105 Carpenter Drive, Sterling, Virginia adresindeki MICROBIOTEST te yapılmıştır. TEST KABUL KRĐTERĐ Bu test, aşağıda listelenen kriterler tatmin edici bulunduğu zaman test sonuçlarının değerlendirilmesi kabul edilebilir olacaktır. Çalışma müdürü testin güvenilirliğini ve kabul edilebilirliğinin etkileyen diğer sebepleri göz önünde tutacaktır. PRC kontrolden alınan Enfekte virüs mutlaka > 4.0- Log 10 olacaktır. Viral indüklü CPE sitotoksisite etki indüklü test amilinden ayırt edilebilmelidir (eğer varsa). Virüs mutlaka nötralizer etkililiği / viral karışım kontrolünden (sitotoksisite bulunmayan) alınmalıdır. Hücre Yaşayabilirlik Kontrolü (tahlil negatif kontrol) virüs göstermemelidir. ÜRÜN DEĞERLENDĐRME KRĐTERĐ Denetim acentelerine göre test amili bütün seyreltilerde komple bir virüs inaktivasyon varsa geçer. Sitotoksisite ortadayken, titrasyonda en azından üç-log indirgeme sitotoksisite seviyesi boyunca gösterilmelidir. RAPOR FORMATI MICROBIOTEST her bir test dizaynı için bir standart rapor formatı verir. Her sonuç raporu aşağıdaki bilgileri kapsamaktadır. Sponsor tanımlaması Test amili tanımlaması Tahlil tipi ve proje numarası Çalışma başlangıç ve bitirme tarihi Sayfa: 21

22 Sonuçların ve kararların yorumlanması Cetvel halinde gösterilen test sonuçları Metotlar ve değerlendirme kriteri, eğer varsa Çalışma başlangıç ve bitirme tarihi (sadece GLP çalışmaları) Đmzalı Kalite Temini ve Uyumluluk Beyanı (sadece GLP çalışmaları) SAKLANAN KAYITLAR Bütün ham veriler, protokol, protokol düzeltmeleri, test amili kayıtları, sonuç raporu ve MICROBIOTEST ile sponsor arasında yapılan yazışmalar 105 Carpenter Drive, Sterling, Virginia adresindeki MICROBIOTEST e ait kapalı kontrollü tesislerde saklanacaktır. Bu onaylı protokoldeki bütün değişiklikler ve revizyonlar belgelendirilecek, çalışma müdürü tarafından imzalanacak ve tarih atılacak ve bu protokolle saklanacaktır. Sponsor çalışma ile ilgili herhangi bir değişiklik, önerge ve karar hakkında derhal bilgilendirilecektir. Niyet edilen deneysel başlangıç ve sonuçlandırma tarihi; test amili ile ilgili ilave bilgiler, kullanılan mevcut virüs ve konakçı hücre soyu tek tabakası ve testte kullanılan nötralizer tipi her bir çalışma için bir proje sayfası şeklinde ayrı ayrı yöneltilecektir. Çalışma müdürünün proje sayfa numarasını imzaladığı tarih, başlangıç tarihi olacaktır. Bütün proje sayfaları uygun bir şekilde çalışma sponsoruna gönderilecektir. Sayfa: 22

23 MUHTELĐF BĐLGĐ Aşağıdaki bilgiler çalışma başlamadan önce sponsor tarafından tamamlanacaktır. A. Đsim ve Adres: Medentech Ltd Whitemill Industrial Estate, Clonard Road Wexford, Đrlanda B. Test amili: Sodyum Dikloroizosayanurat (Troklozen Sodyum) Aktif Madde MEDENTECH ÜRETĐMĐ 2,5GR NADCC TABLETLERĐ Lot1: 09HA149 Lot 2: 07F7482 Maruziyet (temas) süresi 10 dakika Maruziyet ısısı Ortam 19 21C ( ) veya + 2C Test edilen çözelti 10 litre suda eritilen 1 tablet ( ) Not: tablet eridikten sonra, test yapmadan önce numunedeki serbest klor miktarı analiz edilmiştir. Kabul edilebilir serbest klor sınırı: 140 ila 180pm ( ) Seyreltici Steril de-iyonize su ( ) ppm % +2,9 AOAC sert su ( ) Diğer ( ) Sprey / pompa tipi ürünler için uygulama talimatları Sprey süresi: Uygulanmaz ( ) Islanana kadar sprey ( ) Diğer ( ) Sprey mesafesi Uygulanmaz ( ) Diğer ( ) C. Çalışma en azından % 5 organik direnç karşısında yürütülmüştür. ( ) D. Uyarılar / depolama koşulları- MSDS veya analiz sertifikası Sağlanmış ( ) Sağlanmamış ( ) E. Đlave bilgi: Yok KULLANILAN RAPORLAR EPA ( ) FDA ( ) Kanada Sağlık ( ) CAL DPR ( ) ARTG ( ) non GLP ( ) diğer PROTOKOL ONAYI: Sponsor imzası Liz Delahunty Basılı isim LIZ DELAHUNTY Sayfa: 23

24 Dağıtım tarihi: 26/08/2009 Proje Sayfa No: 1 Sayfa No: 1 Laboratuar Proje Tanımlama No: ÇALIŞMA BAŞLIĞI: Virüsidal Etkililik Testi Domuz Gribi Virüsü (H1N1) ÇALIŞMA MÜDÜRÜ: Zheng Chen, MS. Đmza 26/08/2009 TEST MALZEMELERĐ LOT NO ALINMA TARĐHĐ DS NO Medentech üretimi 2,5gr NaDCC tabletleri Medentech üretimi 2,5gr NaDCC tabletleri 09HA149 07F /08/ /08/ DEPOLAMA KOŞULLARI: yer: D2 ĐŞLEM YAPAN DEPARTMAN Karanlık ( ) Ortam Oda Sıcaklığı ( ) VĐROLOJĐ DEPARTMANI Desikatör ( ) Dondurucu ( ) Buzdolabı ( ) Diğer ( ) KORUYUCU ÖNLEMLER GEREKSĐNĐMĐ: MSDS Evet ( ) Hayır ( ) FĐZĐKSEL TANIMLAMA: Katı ( ) Sıvı ( ) Aerosol ( ) Diğer: Tablet ( ) AMAÇ: Bkz. Ekli protokol YETKĐLENDĐRME: bkz. Müşteri imzası TAHMĐN EDĐLEN DENEYSEL BAŞLANGIÇ TARĐHĐ: 27/08/2009 BĐTĐRME TARĐHĐ: 04/09/2009 ÇALIŞMA ĐDARESĐ: FDA ( ) EPA ( ) R&D ( ) GLP ( ) GCP ( ) Diğer ( ) SPONSOR: Medentech Ltd Whitemill Industrial Estate Clonard Road Wexford - Đrlanda TEST KOŞULLARI Mevcut organizma Konakçı Hücre Soyu MDCK hücreleri, ATCC CCL-34 YETKĐLĐ KĐŞĐ: Liz Delahunty Telefon Faks Domuz Gribi Virüsü (H1N1), A/Domuz/1976/31, ATCC VR-99 Temas süresi 10 dakika Sulandırma Ortamı MEM +1,0µg/ml Tripsin Organik Direnç >% 5 serum Aktif madde Nötralizer Sodyum dikloroizosayanurat (troklozen sodyum) Minimum zaruri ortam mol/l Na 2 S 2 O 3 + %1 Fetal Bovine Serum Temas ısısı Ortam sıcaklığı Seyreltici Steril de-iyonize su Test edilen seyrelti 10 litre steril de-iyonize su içerisinde eritilmiş 1 tablet Đnkübasyon süresi 4 6 gün Đnkübasyon ısısı C % 1 CO 2 ile Not: Tablet eridikten sonra, numune test yapılmadan önce serbest klor için analiz edilecektir. Kabul edilebilir serbest klor seviyesi 140pm ile 180ppm.dir Sayfa: 24

25 Dağıtım tarihi: 14/09/2009 Proje Sayfa No: 2 Sayfa No: 1 Laboratuar Proje Tanımlama No: ÇALIŞMA BAŞLIĞI: Virüsidal Etkililik Testi Domuz Gribi Virüsü (H1N1) ÇALIŞMA MÜDÜRÜ: Zheng Chen, MS. Đmza 26/08/2009 TEST MALZEMELERĐ LOT NO ALINMA TARĐHĐ DS NO Medentech üretimi 2,5gr NaDCC tabletleri Medentech üretimi 2,5gr NaDCC tabletleri 09HA149 07F /08/ /08/ DEPOLAMA KOŞULLARI yer: D2 ĐŞLEM YAPAN DEPARTMAN Karanlık ( ) Ortam Oda Sıcaklığı ( ) VĐROLOJĐ DEPARTMANI Desikatör ( ) Dondurucu ( ) Buzdolabı ( ) Diğer ( ) ÇALIŞMA ĐDARESĐ: FDA ( ) EPA ( ) R&D ( ) GLP ( ) GCP ( ) Diğer ( ) SPONSOR: Medentech Ltd Whitemill Industrial Estate Clonard Road Wexford - Đrlanda TANIMLAMA Bu proje sayfası aşağıdakileri belgelendirmek için verilmiştir. YETKĐLĐ KĐŞĐ: Liz Delahunty Telefon Faks Protokol Sapma (ları) 1. Protokol, sayfa 5 ve 11 serbest klorun test yapılmadan önce ölçülmesini gerektirmektedir. Bunun yerine, bu testte HACH reaktifi kullanılarak toplam klor ölçülmüştür. Bu durum protokoldeki planlı bir sapmadır ve çalıma verisinin kalite veya bütünlüğünde önemli bir etkisi bulunmamıştır. Toplam klor serbest klorun en kötü durumu olduğu düşünülmüştür ve beklenen sınırlar içerisinde iyi olduğu görülmüştür (142 ve 143ppm). Bu sistemde serbest ve toplam klorun bir miktar bağlı klor bulunmasıyla tamamen eşit olduğu görülmüştür. Sayfa: 25