HÜCRE DONDURMA VE ÇÖZME Uzm. Mol. Bio. Gamze ÇAĞATAY
Neden Dondurma? Hücreleri saklamak Düşük pasajlarda araştırma yapmak Hücrenin orijinal yapısını korumak Genetik stabiliteyi korumak Mikrobiyal ve çapraz kontaminasyon riskini azaltmak Dondurma (Cryopreservation)
Dondurma Süreci için Gerekli Malzemeler Cryovial tüp Cryoprotektan [(DMSO, Gliserol, Polivinilprolidon, Hidroksietil starch (HES), Plasma proteinleri] FBS, pipetör, medyum -20, -80, sıvı nitrojen (aıcı -196, buhar 156), azot tankları Cryo solution: Soğutulmuş FBS, Medyum karışımının üzerine damla damla DMSO (Gliserol) eklenerek hazırlanır.
Dondurma Süreci için Gerekli Malzemeler DMSO, HES vs cryoprotektan Neden cryoprotektan: Dehitrasyon ve buz kristallerinin oluşumun engellemek %10 kons ta kullanılır Cryo sol: 1ml DMSO+4ml medyum+5 ml FBS (Eğer hücreniz çok değerli ve nazlı nazlı çoğalan bir ürün ise 9 ml FBS+ 1 ml DMSO)
Dondurma Hücreler tripsine edilir (Cryopreservation) Santrifüj ve sayım Cryo solüsyonu içeren medyum eklenir D O N D U R M A +4 C 20 dakika -20 C 1 saat -80 C 1 gece +4 C 20 dakika -80 C 1 gece S Ü R E C İ
Dondurma Sürecine İlişkin Önemli Spot Bilgiler Dondurma işlemi yavaş olmalı (hız<5 C/dak; -50 C ye kadar) Dondurma sürecinde kritik işlem: Hücreleri -80 ye kadar soğutmak Hücreyi -80 C ye getirince hücreler büyük oranda korunmuştur. DMSO toksiktir. Cryovial sol yaparken sabit bir hızla veya damla damla eklenmeli ve eklendikten sonra soğuma sürecine geçilmelidir. DMSO ve kullanılacak kadar medyum, FBS, ve cryovial tüp önceden soğutulmalıdır. Cryovial üzerine hücre ismi, pasaj sayısı, hücre sayısı, tarih, cryo solüsyonun içeriğini kısaca yazılmalıdır.
Dondurma Sürecine İlişkin Önemli Spot Bilgiler Hücreler DMSO ile +4 C te 24 saat, 37 C de 1 saatten fazla kalmamalı. Farklı cryoprotektanların birbiriyle karışımı kullanılabilir. %5 DMSO, %4 HES, FBS ve albumin Plazma proteinleri kullanımı söz konusudur. Çıplak elle cryoprotektan ve sıvı nitrojeni tutmayın. Sıvı nitrojen (-196 C) ellerinizi yakar Eldiven kullanılmalı Nitrojen buharı solumayın
Dondurma Sürecine İlişkin Önemli Spot Bilgiler Soğutma Hızı hücrelerin ölümünü veya yaşamını belirler. Hızlı soğutulursa (>10 C/dak) Buz kristalleri oluşur ve mekanik hasardan ölür Yavaş soğutulursa (<10 C/dak) hücre dehidrasyondan ölecektir.
Dondurma Sürecine İlişkin Önemli Spot Bilgiler Hücreler tripsine edilir Santrifüj ve sayım Cryo solüsyonu içeren medyum eklenir M E K A N İ K D O N D U R M A Mekanik Dondurma Avantajı: Süreç kısalır Ek solüsyonara gerek kalmaz Maliyet azalır Dezavantajı: Hücre kaybı çok olur Uzun süre (yıllarca) saklanıp saklanamayacağı bilinmiyor
Hücre Çözme
Hücre Çözme Dondurulmuş olan hücrelerin tekrar sıvı hale getirme sürecidir. Hızlı olunması gerek (Dondurma yavaş Çözme hızlı) Çözerken hücre içinde oluşan serbest su hücre lizisine neden olabilir. DMSO burada da koruyucudur. Hücre kaybı mutlaka olur. (%10-25)
Hücre Çözme Süreci Medyum 37 C ye getrilir. Crovial tüpler hızlıca azot tankından alınır Elimizin içinde veya 37 C de hızlıca eritilir. Crovial solüsyon içerisinde 5 ml besiyeri olan 15 ml lik falkon tüpüne aktarılır. Santrifüj sonrası supernatant atılır ve yeni medyum eklenir Santrifüj (1200 rpm, 5 dak) Uygun konsantrasyonda yeni flasklara hücreler dağıtılır
Hücre Çözme Sürecine İlişkin Önemli Notlar Medyumu önceden ısıtın Azot tankında hangi kutudan örnek alınacağını önceden tespit edin Cryovial tüpleri hızlıca eritin, eritme sonrası beklemeyin hızlı davranın Flasklara dağıttıktan sonra yeni açılan hücrelerin adaptasyonu pasaj yapılanlara göre biraz geç olabilir Bir gün sonra kontrol edin ve ölü hücreleri atın Çözülmüş hücrelerin medyum değişimini diğerlerine göre biraz daha erken yapabilirsiniz. Cryoprotektan artığı kaldı şüphesi var ise
HÜCRE KÜLTÜRÜ KONTAMİNASYON RİSKİ ve LABORATUVAR TEMİZLİĞİ Kontaminasyon Kimyasal Su Medyum Serum Makine Teçhizat Biyolojik Bakteri, Maya Virüs Mikoplazma Çapraz Kontaminasyon
Kimyasal Kontaminasyon Su: Steril Distile Su, Revers Osmosis Medyum: Serum : Makine-Teçhizat: ph değişimi kontrol edilmeli L- Glutamin eklenme zamanı Hayvansal kökenli toksinler olabilir İnkubatör Laminar flow Santrifüj içi
Biyolojik Kontaminasyon Bakteri Parıldayan bölgeler, çubuk, spiral ve küresel şekiller ph düşer, medyum rengi sarıya döner
Biyolojik Kontaminasyon Mikoplazma Granüler, yıkıntı görüntü, kümeleşme (hücre proliferasyonu düşer, süpansiyon ve monolayerda)
Biyolojik Kontaminasyon Maya Tomurcuk-oval şekiler, genellikle Ph artar, medyum mora doğru döner
Çapraz Kontaminasyon: ne zaman şüphelenmeliyim?
Biyolojik Kontaminasyon Ne zaman şüphe duyulur? Hücrelerde morfolojik değişim varsa (proliferasyon bağımsız) Şüphe: Viral, Bakteri Medyum rengi (proliferasyon bağımsız) Şüphe:Bakteri, maya Doubling time zamanı değişince (mitotik index önemli) Şüphe: Mikoplazma Hücrelerde davranış bozukluğu Şüphe: Virüs, Mikoplazma ph değişiklikleri Şüphe: Bakteri, maya
Kimyasal ve Biyolojik Kontaminasyon Ne Yapmalı? Makine-Teçhizat temizliği, parçalar steril edilir Lab yerlerinin temizliği Medyumlar atılır Yeni besiyerleri ve serumlar kullanılır Yeni hücreler açılır (Stoktan şüphe varsa yeni hücre temin edilir) Lab kıyafetleri değiştirilir. Eldiven, bone, maske yenilenir.
Teşekkür ederim