ANKAFERD BLOOD STOPER ĐN NÖROTOKSĐK ETKĐSĐ

T.C. SAĞLIK BAKANLIĞI ŞĐŞLĐ ETFAL EĞĐTĐM VE ARAŞTIRMA HASTANESĐ II. KBB & BAŞ BOYUN CERRAHĐSĐ KLĐNĐĞĐ KLĐNĐK ŞEFĐ: PROF. DR. BURHAN DADAŞ ANKAFERD BLOOD STOPER ĐN NÖROTOKSĐK ETKĐSĐ (Deneysel Çalışma) Dr.BURAK GÜLER UZMANLIK TEZĐ Đstanbul 2009

TEŞEKKÜRLER... Hayat 'hayal imiş. Sorduklarında Doktor olacağım dediğim ilkokul sıralarında geçen yıllarım, çocukluktan delikanlılığa geçiş dönemi olan orta ve lise yıllarım, doktor olma yolunda ilk adımı attığım üniversite yıllarım ve nihayet, nasıl geçer dediğim şu son 5 yıllık asistanlığım hayal olup geçip gitti. Yoğun bir şekilde geçen asistanlık eğitimini bitirip uzmanlık dönemine geldim. Hayal gibi Beş sene boyunca asistanı olduğum klinik şefimiz Prof.Dr. Burhan Dadaş hocamıza teşekkür ediyorum. Yine, klinik şef yardımcımız Doç.Dr. Hüseyin Seven e, başasistan kadrosunda bulunan Doç.Dr.Berna Uslu Coşkun ve Doç.Dr.Seyhan Alkan a, uzmanımız ve asistanlıkta da beraber çalıştığımız tez danışmanlığımı da yapan Op.Dr. Esra Sözen e, kısa bir süre de olsa birlikte çalışma fırsatı bulduğumuz Op.Dr Serdar Baylançiçek ve Op.Dr. Turgay Ercan Tunç a asistanlığımda beraber çalıştığım kıdemlilerim Op.Dr.Belit Merve Şener, Op.Dr.Hayati Şavk, Op.Dr.Seher Uğur, Op.Dr.Mehmet Çifci, Op.Dr.Deniz Çelik, Op.Dr.Alper Tolga Koşar a ve bir üstümdeki asistan olduğundan benim için ilk danışılacak kişi Op.Dr.Erdal Sakallı ya, birer ikişer gelip, nöbet sayımı azaltan çekirgelerim Dr.Đlknur Topkar, Dr.Sultan Bişkin Erol, Dr.Selçuk Cem Erdurak, Dr.Savaş Sarı, Dr.Hasan Deniz Tansuker, Dr. Yusuf Orhan Uçal, Dr.Vepa Silapov, Dr.Ömürsen Yıldırım ve Dr. Eymen Oruç a teşekkür ederim. Sevgili kızım Ümran Damla ya, eşime, abime, ablama ve beni dünyaya getiren ve büyüten, herşeyin ilkini, temelini öğreten, anneme ve babama sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

ĐÇĐNDEKĐLER 1. GĐRĐŞ...6 2. TEMEL BĐLGĐLER...7 SIÇAN SĐYATĐK SĐNĐR ANATOMĐSĐ SĐNĐR HASARI ELEKTROMYOGRAFĐ VE SĐNĐR ĐLETĐ ĐNCELEMELERĐ PIHTLAŞMA MEKANĐZMALARI ANKAFERD BLOOD STOPPER 3. MATERYAL METOD...32 4. SONUÇLAR...36 5. TARTIŞMA...43 6. SONUÇ...50 7. ÖZET...51 8. ĐNGĐLĐZCE ÖZET (ABSTRACT)...52 9. KAYNAKLAR...53 I. RESĐM LĐSTESĐ...4 II.TABLO LĐSTESĐ...5 III.ŞEKĐL LĐSTESĐ...5 IV.KISALTMALAR...5

I. RESĐM LĐSTESĐ Resim 2.1. Sıçan siyatik sinir anatomisinin şematik çizimi Resim 2.2. Motor sinir ileti incelemesi Resim 2.3. Motor sinir ileti incelemesi Resim 2.4. Konsantrik iğne elektrot Resim 2.5. Motor ünite potansiyelleri Resim 2.6. Normal Motor Ünite Potansiyelleri Resim 2.7. Đnterferans Paternleri Resim 2.8. Polifazik motor ünite potansiyelleri Resim 2.9.Demiyelinizan nöropatide elektrofizyolojik bulgular Resim 2.10 Primer trombosit tıkacı Resim 2.11 Ankaferd Bloodstopper'in ticari formları Resim 2.11 Normal plazmaya ABS eklenmeden önce ABS ekledikten sonra Resim 2.13. Normal kana ABS eklenmeden önce ABS ekledikten sonra teryali Resim 2.14. Plazma örneği Resim 3.1 N.Đschiadicus Resim 3.2. Deneklerde kayıt ve uyarı elektrotlarının yerleştirilmesi Resim 3.3. Siyatik sinire ait EMG ve sinir ileti incelemesi Resim 3.4. Siyatik sinire ait EMG ve sinir ileti incelemesi Resim 4.1.H-E Boyası ile Normal sinir dokusu görünümü Resim 4.2. PAS histokimyasal boyası ile Normal sinir dokusu görünümü Resim 4.3. Massontrikrom Boyası ile Normal sinir dokusu görünümü II. TABLO LĐSTESĐ Tablo 2.1. Ampul ve tampon formunda Ankaferd BloodStopper içerikleri Tablo 2.2. Sprey formunda Ankaferd BloodStopper içerikleri Tablo 4.1. EMG sonuçları 4

III. ŞEKĐL LĐSTESĐ Şekil 2.1. Ekstrinsek yol Şekil 2.2. Đntrensek yol Şekil 4.1: Distal latans ölçümlerinin dağılım grafiği Şekil 4.2: Amplitüd ölçümlerinin dağılım grafiği Şekil 4.3: Alan ölçümlerinin dağılım grafiği Şekil 4.4: Süre ölçümlerinin dağılım grafiği IV. KISALTMALAR ABS; Ankaferd BloodStopper mv; Milivolt BKAP; Birleşik kas aksiyon potansiyeli MÜP; Motor ünite potansiyeli msn; Milisaniye mm; Milimetre L; Litre ml; Mililitre EMG; Elektromyografi vwf; von Willebrand faktörü PAF; Platelet aktive edici faktör ADP; Adenozindifosfat TF; Tissue factor (doku faktörü) LPS; Lipopolisakkaridle NO; Nitrik oksit LTB; Lökotrien B LTC; Lökotrien C LTD; Lökotrien D p; Đstatistiksel anlamlılık değeri ORS; Okside rejenere selüloz 5

1.GĐRĐŞ Ankaferd BloodStopper (ABS) folklorik olarak geleneksel Türk hekimliğinde hemostatik ajan olarak kullanılmış bir bitkisel ekstrakttır (1,2). ABS, Thymus vulgaris, Glycyrrhiza glabra, Vitis vinifera, Alpinia officinarum ve Urtica dioica bitkilerinin standardize karışımından oluşmaktadır (1,2). Bu bitkilerin hepsi tek başına endotel, kan hücreleri, damar oluşumu (angiogenesis), hücresel üreme, vasküler dinamikler ve mediyatörler üzerinde etkilidir (1). Kanamanın durdurulması maksadıyla kullanılmakta olan ABS ampul, tampon ve sprey formlarında bulunmaktadır. Đçeriğindeki bitkilerle ilgili literatür bilgilerinin desteklediği üzere hayvanlarda hemostatik etkileri gözlenen ABS nin etki mekanizması in vitro çalışmalarla aydınlatılmaya çalışılmaktadır. Hayvanlarda kullanımının etkinliği gösterilmiştir (2,3,4). Đnsanlarda hem topikal, hem de oral kullanımının güvenliliğini ortaya koyma maksadıyla Türkiye de ABS nin sağlıklı gönüllülerde topikal kullanımının güvenliliğinin araştırıldığı, plasebo ile karşılaştırmalı olarak ve randomize, çift-kör, çapraz-geçişli bir faz I klinik çalışma yapılmış ve Kasım 2008 de sonuçlandırılmıştır. ABS diş operasyonları, vücut dışı yaralanmalar, travmatik kesiler, spontan ya da cerrahi girişimler sonrası oluşan minör ve majör kanamaların kontrolünde kullanılmaktadır. Nörotoksisite (toksik nöropati), santral ve periferik sinir sisteminin doğal ya da insan yapımı yabancı bir madde nedeniyle zarar görmesi sonucu gelişen, ilgili kas grubunda kuvvet kaybı ve duyu bozukluğu ve/veya refleks değişiklikler ile seyreden sinir lezyonlarının genel tanımıdır. Ankaferd Blood Stopper ile yapılmış çalışmalarda herhangi bir yan etki, istenmeyen doku reaksiyonları, sitotoksisite bildirilmemişse de bu konuda literatürde yayınlanmış yeterli çalışma bulunmamaktadır (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8). Özellikle boyun diseksiyonu, tiroidektomi, parotidektomi gibi ameliyatlarda önemli fonksiyonlara sahip sinir yapılarına yakın çalışılmaktadır. Sinir hasarına ve fonksiyon kaybına neden olmamak için fazladan özen gösterilmektedir. Sinire yakın bölgelerde koter kullanımının kısıtlı olması nedeniyle buralarda meydana gelen kanamalar cerraha zaman zaman sıkıntı yaşatmaktadır. Bu gibi durumlarda Ankaferd Blood Stopperin kullanılabilmesi için ABS nin ayrıca sinirler üzerine olan etkilerinin bilinmesi gerekmektedir. Literatürde ABS nin nörotoksik etkisi olup olmadığına dair yapılmış 6

bir çalışma henüz bulunmamaktadır. Biz bu çalışmada Ankaferd Blood Stoper in olası nörotoksik etkilerini objektif olarak incelemeği planladık. Bu amaçla sıçan periferik siniri (siyatik sinir) deneysel olarak Ankafed Blood Stopper in etkisine maruz bırakılması, sonuçlarının elektromyografik ve histopatolojik olarak incelenmesi planlandı. 2. TEMEL BĐLGĐLER 2.1. Sıçan Siyatik Sinir Anatomisi Sıçanlarda siyatik sinir (n. ischiadicus) 5. ve 6. lumbar, 1. sakral spinal sinir liflerinin birleşmesiyle oluşur. Siyatik sinir minör pelviste ischium ve sakrum kemiklerinin dorsal yüzleri arasındaki derin oluktan ilerler. Siyatik çentikten geçtikten sonra m. priformis in ventral yüzünde ilerler. M. priformis in 1-2 mm kaudalinde m. quadratus femoris üzerinden oblik olarak bacak bölgesine girer. Prifom kas seviyesinde küçük bir dal vererek m. biceps femoris, m. semitendinosus ve m. semimembranosu inerve eder. Sonra, diz ekleminin yaklaşık 5 mm kranyalinde 2 ana dala ayrılır: n. fibularis ve n. tibialis posterior. (9, 10) Resim 2.1. Sıçan siyatik sinir anatomisinin şematik çizimi. f: femur başı, s: siyatik sinir, t: n. Tibialis, p: n. Fibularis. (Cagri A Uysal et al., Sciatic nerve anatomy in rat re-visited isimli çalışmadan 7

alınmıştır.) 2.2 Sinir Hasarı Sunderland bir periferik sinir fibrilinin maruz kalabileceği 5 tip hasar derecesi tarif etmiştir. Birinci derece hasar: Nöropraksi veya iletim bloğu olarak da adlandırılan bu durumda sinir anatomik olarak intakttır, ancak intranöral basıncın artmasına bağlı olarak gelişen fizyolojik blok vardır. Özellikle dışardan olan basılar nöropraksi durumuna yol açarlar. Sinir, bası yerinde impuls iletimini gerçekleştiremez buna karşılık lezyonun distaline uygulanacak elektrik uyarana cevap verir. Bası ortadan kalkacak olursa sinirin innerve ettiği kas hareketleri hemen veya en geç 3 hafta içinde normale döner ve rejenerasyon hatası olmaz. Nöropraksinin mekanizması hasar görmüş intranöral kapillerlerden sıvı sızmasına sekonder olarak gelişen endonöriumdaki elektrik direnci artmasıyla açıklanmaktadır (11). Đkinci derece hasar: Bu tip hasara aksonotemezis ya da Sunderland'ın 2. derece hasarı denir. Bu hasar nöropraksiye yol açmış basının devam etmesi sonucunda gelişir ve bu, nörotemezisten ayrı bir olay olarak kendini gösterir (11). Đntranöral basıncın artmasına bağlı olarak venöz drenajda obstrüksiyon, buna bağlı olarak aksoplazma hasarı ile birlikte sinirin distal ve proksimalinde şişlik ve sonuçta basıya uğramış arterioller boyunca sinirin beslenmesinde bozukluk söz konusudur. Sonuçta akson kaybı ortaya çıkar. Ancak endonöral tüpler sağlam kalır. Hasar geriye dönecek olursa iyileşme tam olmakla beraber dejenere olmuş aksonların rejenerasyonu için zamana ihtiyaç olduğundan 1.derece hasara göre daha uzun bir süre gereklidir. Dolayısıyla iyileşme genellikle 3 hafta ile 2 ay içinde olur ve sonuçta rejenerasyon hatası gözlenmez (12). Üçüncü derece hasar: Nörotemezis olarak da bilinir. Đntranöral bası artmaya devam etmektedir ve endonöral tüp kaybı ortaya çıkmıştır. Klinik olarak en sık travma sonrasında gelişir. Bu hasarda elektrik uyarılarına olan cevaplarda belirgin derecede azalma olur ve spontan iyileşme 2 4 aya kadar kendini göstermez. Rejenere olan aksonlar uygun bir distal endonöral tüp bulmada düzensiz ve birbirinden bağımsızdırlar, bu yüzden iyileşme inkomplet ve sinkinezi ile birlikte olur. Bozuk rejenerasyonun derecesi direk olarak hasarlı endonöral tüp sayısına bağlıdır (12). 8

Dördüncü ve beşinci derece hasarlar: Sinirin parsiyel veya tam kesisi sonucunda ortaya çıkarlar. Bu tip hasarlarda spontan iyileşme beklenmez. Hasardan sonra en kısa zamanda yapılacak bir cerrahi müdahale iyileşme üzerine büyük katkıda bulunur. Endonöral tüplerin büyük çoğunluğunun veya tamamının kaybına ilaveten dördüncü derecedeki perinörium kaybı ve beşinci derecedeki epinörium kaybından dolayı en ideal şartlarda dahi iyileşme ilk üç derecedeki gibi olmaz. Bunların yanında bazen birden fazla hasar tipinin birlikte olabildiği durumlar ortaya çıkabilmektedir (12). 2.2.1. Periferik nöropati ve nörotoksisite Periferal nöropati terimi bir veya daha çok periferal siniri etkileyen süreçlere işaret eder. Periferal nöropatiler etiyolojik olarak; otoimmün, metabolik, nütrisyonel, iskemik, toksik, paraneoplastik, kalıtsal nöropatiler olarak sınıflandırılır (13). Çalışmamızda kullandığımız Ankaferd BloodStopper in sinir üzerindeki olası etkisi, bu gruplardan lokal toksik nöropati içinde ele alınabilir. 2.2.2. Periferik toksik nöropati Nörotoksisite, nöropatilerin içinde toksik nöropatiler grubunda kabul edilen, sinirin vücutta bulunan doğal ya da vücuda dışarıdan giren yabancı herhangi bir kimyasal madde ile hasar görmesi ve/veya fonksiyon kaybına uğraması ile sonuçlanan bozuklukların genel adıdır (14,15). Sinirde sinsice ilerleyen veya subakut başlayan fonksiyon bozukluğu, tıbbi tedaviye veya bazı özel toksinlere maruziyet nedeniyle oluşan yan etkileri akla getirilmelidir. Toksik nöropatiler, genellikle iş yerinde toksik maddelere ve/veya gıdalara maruz kalan işçilerde veya sistemik tedavi alanlarda görülür. Ayrıca bizim çalışmamızda da belirttiğimiz gibi lokal uygulanan ilaç ve toksinler, kimyasal maddeler ve ilaçlar ya da enfeksiyonlar sonucu da görülebilir. Periferik sinirlere her tür travma (ateşli silah yaralanması, kesici aletle yaralanma, elektrik çarpması, 9

yanıklar, ezilmeler, toksik maddeler gibi), en hafifinden en ağrına değişik derecelerde sinir hasarlanmasına yol açar. Periferik sinir içindeki bütün sinir lifleri aynı derecede hasara uğrayabileceği gibi, hasarlanmanın şiddetine ya da tipine göre, aynı sinir içindeki farklı lifler farklı türde hasara da uğrayabilir Toksik etkenlerin sinirler üzerindeki etki mekanizması tam olarak bilinmemektedir. Ancak çeşitli mekanizmalar bu etkiyi açıklamak için tariflenmiştir. Bunların bazıları toksik etkisini, Na-K-ATPaz (sodyum-potasyum adenozin trifosfataz) enzimini inhibe ederek, hücrede polarizasyon bozukluğu yaparak gösterir (16). Bir kısmı Na-K- ATPaz ve SH içeren enzimlere ilgi göstererek hücre membran sağlamlığını bozar, sonuçta oluşan aksonal dejenerasyonun birincil patolojik değişiklik olduğu gösterilmiştir (17). Yine bazıları pridoksin metabolizmasını bozarak etki eder (18, 19). Mitokondrial enerji üretimini bozarak sinir hasarına yol açan maddeler de mevcuttur (20, 21). Radyasyon hasarında olduğu gibi damar endotelinde çoğalma ve fibrinoid nekrozis gelişimi de sinir beslenmesini bozarak nörotoksisiteye yol açan bir mekanizmadır. Periferal sinirlerin yapısının ana bileşeni sinir lifidir (Schwann hücresi ve myelin kılıfı ile bir akson). Her sinir, konnektif doku kılıfları ile fasiküllere ayrılmış bir seri liften oluşur. Fasikül içerisinde miyelinli ve miyelinsiz lifler birlikte seyreder. Aksonlarda miyelinli kısımlar Ranvier düğümleri (internode) ile sınırlıdır. Periferal sinir lifleri yaralanmaya kısıtlı sayıda reaksiyon gösterir. Bunlar aksonal dejenerasyon ve schwann hücrelerinde miyelin kaybı sonucu segmental demiyelinizasyondur (22). Primer olarak schwann hücresini etkileyen hastalıklar myelin kaybına yol açarlar ve segmental demiyelinizasyon olarak adlandırılırlar. Segmental demiyelinizasyon schwann hücresi disfonksiyonunda ya da miyelin kılıfı hasara uğradığında görülür. Aksonu etkileyen birincil patoloji yoktur. Çıplak miyelinsiz akson remiyelinizasyon için bir uyarı kaynağıdır. Yeni oluşan miyelinli segmentleri normalden kısadır. Endonöryumdaki hücreler prolifere olarak aksonu sarar yeni gelişen bu doku demiyelinize alanları konsantrik sararak soğan zarı görünümü meydana getirir. Nöronun ve aksonun primer tutulumu aksonal dejenerasyona yol açar. Aksonal hasar bütün hücreyi etkileyebilen daha yaygın bir sürecin sonucu (nöronopati) olabileceği gibi aksonla ilişkili bir anormallikte de olabilir (aksonopati) 10

(23). Zedelenen kısmın distalinde Wallerian dejenerasyon gelişir. Kas liflerinde denervasyon atrofisi gelişir. Bazı durumlarda akson dejenerasyonunu, akson rejenerasyonu ve kasın yeniden inervasyonu izler. 2.3. Elektromiyografi ve Sinir Đleti Đncelemeleri EMG, uygulandığı sinirlerin ve kasların elektriksel yöntemlerle incelendiği bir laboratuar tanı yöntemidir. Đstemli aktivasyonla nöromuskuler kavşakta başlatılan ya da kas membranı boyunca kendiliğinden oluşabilen postsinaptik membran potansiyellerini yansıtmaktadır, sinir ileti incelemelerini de içerir. Sinir ileti incelemelerinde ana prensip sinir yolunun bir noktasından yüzeyel veya iğne elektrotlar ile doğru elektrik akımı verilerek elektrik uyarının sonlandığı noktadaki kastan veya sinirin diğer bir noktasından uyarının iletim özelliklerinin kayıt elektrotları ile kaydedilerek değerlendirilmesidir. Bunun için, parmaklara ve sinirlerin üzerindeki cilt bölgelerine düşük şiddette elektrik akımı uygulanır ve sinirin veya cildin başka bir yerinden bu akım, kayıt elektrodu ile kayıt cihazında toplanarak ilgili parametreler ölçülüp yorumlanır. Böylece sinirin sağlıklı fonksiyon yapıp yapmadığı anlaşılır. 2.3.1. Motor sinir ileti incelemeleri Amaç, incelenecek motor veya mikst(duysal-motor) sinirin en hızlı ileten motor liflerinin ileti hızını ölçmek ve hedef kasa giden motor liflerin ne kadarının fonksiyon gördüğünü yaklaşık olarak belirlemektir. Bu amaçla, kas üzerine kayıt elektrodu yerleştirilip kası innerve eden motor sinir yeterli şiddette elektrikle uyarıldığında (Resim 2.3) kastan bir aksiyon potansiyeli kaydedilir (Resim 2.4). Bu potansiyele birleşik kas aksiyon potansiyeli (BKAP) adı verilir. 11

Resim 2.2. Motor sinir ileti incelemesi(bilek ve dirsekteki noktalar uyarım yerlerini göstermektedir) (Resim, Đstanbul Tıp Fakültesi Nöroloji Kliniğinden Dr. Mustafa Ertaş ın Elektromyografi isimli seminerinden alınmıştır.) Resim 2.3. Motor sinir ileti incelemesi. BKAP (Birleşik kas aksiyon potansiyeli) paterni ve distal latans, amplitüd, süre parametreleri (Resimler; Đstanbul Tıp Fakültesi Nöroloji Kliniğinden Dr. Mustafa Ertaş ın Elektromyografi isimli seminerinden alınmıştır.) BKAP'ın çeşitli elektrofizyolojik özellikleri ölçülür. Elektrik uyarım verildiği andan potansiyelin başlangıcına kadar geçen süre distal latans (milisaniye olarak) adını alır. Distal latans, söz konusu sinir içindeki en hızlı ileten sinir liflerinin 12

iletisini gösterir ve bu latans içinde sinirin iletim süresi, nöromüsküler ileti zamanı ve kas membranında elektrik ileti zamanı yer alır. BKAP' ın diğer parametreleri süre ve amplitüddür. Motor sinir ileti hızı ölçümü için, kayıt koşullarını değiştirmeksizin aynı sinirin daha proksimal bir noktasından sinir tekrar elektrikle uyartılıp yine kastan bir BKAP elde edilir. Proksimal uyarımla kayıtlanan BKAP latansından distal latans çıkartıldığında proksimal ve distal uyarım noktaları arasındaki mesafede ilgili motor sinirin iletim süresi hesaplanmış olur. Bu mesafenin milimetre cinsinden değeri distal ile proksimal latans farkına bölündüğünde ilgili sinirin en hızlı ileten motor liflerinin ileti hızı metre/saniye cinsinden bulunmuş olur. Örneğin medyan siniri bilekte (distal) uyarımla 3 milisaniyelik distal latans elde edilmiş olsun. Aynı sinirin dirsekte (proksimal) uyarımıyla 7 milisaniyelik proksimal latans bulunsun. Proksimal ile distal latansların farkı 7msn - 3msn = 4msn' dir. Dirsek ile bilekte uyarım noktaları arasındaki mesafe 240mm olsun. Medyan sinirin (en hızlı ileten liflerinin) motor ileti hızı 240 / 4 = 60 milimetre/milisaniye veya başka bir deyişle 60 metre/saniye olarak hesaplanır. Ayrıca, distal uyarımla elde edilen BKAP' ın dalga şekli ve amplitüdü (milivolt, mv cinsinden), proksimal uyarımla elde edilen BKAP' ninki ile karşılaştırılır. Normalde her iki BKAP dalga şeklinin çok benzemesi ve amplitüdünün değişmemesi beklenir. Motor sinirin veya aksonunun herhangi bir yerde (ön boynuz hücresi, ön kök, pleksus, periferik sinir) dejenerasyonuna yol açan bir patoloji BKAP amplitüdünde düşmeye yol açarken motor sinir ileti hızı normal veya normale yakın kalır. Normal BKAP amplitüdüne karşılık yavaşlamış motor ileti hızı ise periferik motor sinirin demiyelinizan süreçleri (Kronik inflamatuvar demiyelinizan polinöropati, Tip 1 Herediter sensorimotor nöropati -HSMN- gibi) için tipiktir. Proksimal uyarımla elde edilen BKAP amplitüdü fazla düşme göstermese bile süresi sıklıkla uzundur (dispersiyon). Bununla birlikte, demiyelinizasyon motor sinirin belirli bir bölgesinde ise ve motor sinir iletimine olanak vermeyecek boyuttaysa, demiyelinizan bölgenin distalinden sinirin uyarımıyla normal ileti hızlı ve amplitüdlü BKAP elde edilirken, demiyelinizan bölgenin proksimalinden uyarımla BKAP, patolojinin ağırlığına göre küçük amplitüdlü olabileceği gibi hiç de elde edilemeyebilir. Bu duruma elektrofizyolojik olarak ileti bloğu adı verilir. 13

2.3.2. Đğne elektromiyografisi Đğne elektromiyografisi, kaslardan iğne elektrod yoluyla kayıtlamaya dayanan bir inceleme yöntemidir. Konsantrik (Resim 2.4) veya monopolar iğne elektrodlar kullanılır. Bu elektrodlar yardımıyla denerve kaslarda istirahatte bile ortaya çıkan anormal potansiyeller ve aktivasyon sırasında ortaya çıkan Motor Ünite Potansiyelleri incelenir (24, 25). Bir alfa motor nöron ve ona bağlı kas liflerinin tamamına MOTOR ÜNĐTE adı verilir (Resim 2.5). Bir alfa motor nöronun aktivasyonu sonucu ona bağlı kas liflerinin hepsinin oluşturduğu toplam potansiyele ise MOTOR ÜNĐTE POTANSĐYELĐ (MÜP) adı verilir (Resim 2.5, Resim2.6). Nöropatilerde ve miyopatilerde bu durumlara özgü MÜP değişiklikleri olur. Đğne EMG sinde bu MÜP değişiklikleri saptanarak patolojik durum tanınmaya çalışılır. Bir kasın maksimum güçte kasısı sırasında ortaya çıkan MÜP dizilerinin görünümüne ĐNTERFERANS PATERNĐ adı verilir (Resim 2.7). Nöropati ve miyopatilerde interferans paterninde bu durumlara özgü değişiklikler olur. Resim 2.4 Konsantrik iğne elektrot Resim 2.5 Motor ünite potansiyelleri. Üsttekiler motor üniteleri, alttakiler motor ünite potansiyellerini göstermektedir. (Resimler Đstanbul Tıp Fakültesi Nöroloji Kliniğinden Dr. Mustafa Ertaş ın Elektromyografi isimli seminerinden alınmıştır.) 14

Resim 2.6 Normal Motor Ünite Potansiyelleri Resim 2.7 Đnterferans Paterleri A) Erken interferans; B) Normal interferans; C) Seyrelme (Resimler Đstanbul Tıp Fakültesi Nöroloji Kliniğinden Dr. Mustafa Ertaş ın Elektromyografi isimli seminerinden alınmıştır.) 2.3.3. Aksonal tutulumla giden nöropatide EMG Motor ve duyu sinir ileti hızları normal veya normale yakındır. Amplitüdler ise normalin altındadır. Đğne elektromiyografisinde spontan denervasyon potansiyelleri ve nörojenik MÜP değişiklikleri (büyük boylu, geniş süreli polifazik MÜP ler) izlenir (Resim 2.8). Maksimal kasılma sırasında ateşlenen akson sayısının azlığına bağlı olarak interferans paterninde seyrelme paterni alınır (Resim 2.7). Resim 2.8. Polifazik motor ünite potansiyelleri (Resim; Đstanbul Tıp Fakültesi Nöroloji Kliniğinden Dr. Mustafa Ertaş ın Elektromyografi isimli seminerinden alınmıştır.) 2.3.4. Demiyelinizan nöropatide EMG Sinir ileti hızları yavaşlamıştır, distal latanslar uzundur. Sinir ileti incelemelerinde amplitüdler normal veya ufaktır (Resim 2.9). Đğne EMG 15

incelemesinde normal MÜP ler elde edilir. Maksimal kası sırasında seyrelme paterni gözlenir (Resim 2.7). Resim 2.9. Demiyelinizan nöropatide elektrofizyolojik bulgular (Resim; Đstanbul Tıp Fakültesi Nöroloji Kliniğinden Dr. Mustafa Ertaş ın Elektromyografi isimli seminerinden alınmıştır.) 2.4 Pıhtılaşma Mekanizmaları Hemostaz, kanın dolaşımda sıvı halde kalmasını sağlayan fizyolojik mekanizmadır. Fizyolojik mekanizmanın kanın sıvı halde kalmasını sağladığı gibi, kan damarlarında herhangi bir travma sonucu oluşan kanamayı durdurduğu ve daha sonra aynı damarın fonksiyonunu devam ettirmesi için damarın pıhtıdan temizlenerek açıldığı ve bu fonksiyonu da hemostaz aracılığı ile gerçekleştirdiği bilinmektedir. Hemostaz ile koagülasyon zaman zaman aynı anlamda kullanılmakta ise de koagülasyonun hemostazın sadece bir fazı olduğu unutulmamalıdır. Hemostaz mekanizmasının üç önemli komponenti vasküler yapılar, koagülasyon sistemi ve trombositler, fibrinolitik sistemdir. (26, 27, 28, 29) Herhangi bir anda damarın zedelenmesiyle oluşan kanamada hemostaz sırasıyla; vasküler sistem, trombositler, koagülasyon sistemi, fibrinolitik sistemin (tamir proçesi) devreye girmesi ile sağlanacaktır. Damar hasarının olduğu bölgede trombositlerin tıkaç oluşturmasına primer, bunu takiben koagülasyon sisteminin aktif hale gelerek fibrin pıhtısını oluşturmasına sekonder hemostaz adı verilir. 16

2.4.1 Primer hemostaz Primer hemostaz trombosit, damar duvarı ve von Willebrand faktörünün rol oynadığı bir işlem olup primer trombosit tıkacı oluşumunu amaçlar. Genel bir kural olarak primer tıkaçla ilgili bozukluk durumlarında mukozal kanamalar (epistaksis, melena, hematüri vb), peteşi ve ekimozlar ile kan almayı veya yaralanmayı takiben kanamanın uzaması görülür. Primer defekt tipinde bir kanamalı hastada sorun trombosit sayı ve işlevi ile damar duvarı ve von Willebrand faktörü eksikliğini düşündürmelidir. Normal koşullarda endotel fizik bir bariyer oluşturarak ve trombositleri inhibe eden prostoglandin I 2 ve nitrik oksit sentezleyerek hemostazın dengede olmasını sağlar. Bir zedelenmeyi takiben ilk oluşan mekanizma vasküler daralmadır. Bu şekilde kaybedilen kan azaltılmaya çalışılır. Bu durum geçicidir ve lokal bir olaydır. Vazokonstruksiyon sadece kan kaybını azaltmakla kalmaz aynı zamanda lokal kan akımını zayıflatarak trombositlerin endotel altı yapılara yapışmasını kolaylaştırıcı ve koagülasyonu kolaylaştırıcı staz etkisi sağlar. Primer trombosit tıkacının oluşumu için önce trombositler endotel altındaki kollagen yapısına yapışmalıdır. Daha sonra trombositler birbirlerine yapışarak(agregasyon) damarı geçici olarak tıkayacak mekanik bir bariyer oluşturur. 17

Resim 2.10 Primer trombosit tıkacı (www.gata.edu.tr adlı intenet sitesinden alınmıştır.) Trombosit yapışması (adezyon): Hemostazın ilk aşamasında öncelikle trombositler endotel altında açığa çıkan kollajene yapışırlar. Bu işlem için aracılığı von Willebrand faktörü, trombosit membranında glikoprotein Ib-IX bağlayarak yapar. Trombosit aktivasyonu: Trombositler damar duvarına yapışma ile birlikte aktive olarak şekil değişikliğine uğrarlar, yüzeylerindeki kollajen reseptörleri (glikoprotein IIb/IIIa adında bir integrin reseptör) uyarılır ve alfa ve dense granüllerden salınım fazına geçerler. Ek olarak tromboksan A 2, platelet aktive edici faktör (PAF) adı verilen vazokonstrüktif ve trombosit agregasyonu yapan maddelerin salınımı olur. Platelet agregasyonu: Tromboksan A 2, PAF, ADP ve serotonin (ADP ve serotonin dens granüllerden salınır) trombosit agonistleri olarak trombositleri aktive ederler ve onlara bağlanarak daha fazla trombositin olay bölgesine gelmesine neden olurlar. Bu aktivasyon koagülasyon kaskadında oluşan trombin aracılığı ile arttırılır. Trombosit agregasyonu özellikle trombosit yüzeyindeki glikoprotein IIb/IIIa yi bağlayan 18

fibrinojen aracılığı ile gerçekleşir (vwf minimal rol oynar). Bu agregasyon primer trombosit tıkacının oluşmasına yol açar ve aşağıdaki bölümde anlatılacak olan fibrin oluşumunu izleyerek oluşan tıkaç sağlamlaştırılır. Trombositler aynı zamanda bir fosfolipid yüzeyi (PF3) ve koagülasyon faktörlerinin bağlanacağı reseptörler oluşturarak sekonder hemostaza katkıda bulunurlar. 2.4.2 Sekonder hemostaz Sekonder hemostaz koagülasyon kaskadı yoluyla fibrin oluşumu anlamına gelir. Kaskat içinde enzim olarak rol alan dolaşan koagülasyon faktörleri ve kofaktörleri, kalsiyum ve trombositler bulunur. Koagülasyon kaskadındaki eksiklikler primer hemostaza göre daha ciddi kanamalara neden olurlar, kanamalar genellikle vücut boşlukları içine olur. Bu tip kanamalarda peteşi görülmez. Geleneksel olarak koagülasyon kaskadı üç bölümde incelenir: intrensek, ekstrensek ve ortak yol. Ekstrensek yol X faktörü aktive eden doku faktörü ve faktör VII kompleksini kapsar. Đntrensek yol yüksek mol ağırlıklı kininojen, prekallikrein ve XII, XI, IX VIII inci faktörleri kapsar. Faktör VIII kalsiyum ve platelet fosfolipid ile birlikte faktör IX aracılıklı olarak X faktörün aktivasyonu için kofaktör olarak rol alır. Her iki yol X faktörü ortak olarak aktive edebilir. Ortak yol faktör X aracılıklı olarak protrombinden trombin oluşumunu sağlar. Bu olay faktör V, kalsiyum ve trombosit fosfolipidi tarafından kolaylaştırılır. Ortak yolun son ürünü fibrinojenden fibrin oluşumuna yol açar. Eskiden her iki yolun da koagülasyonu başlatabileceği ileri sürülürdü. Bu günkü anlayışa göre esas başlatıcı olan yol ekstrensek yoldur. Đntrensek yol ise amplifiye edici olarak rol almaktadır. Faktör XII daha çok bradikinin oluşumunda rol almakta ve fibrinolizisin uyarılmasında etkili olmaktadır. Gerçekte faktör XII eksikliği olan koşullarda kanama bozukluğu olmamaktadır. 19

2.4.3 Koagülasyon mekanizmasının aktivasyonu Bugün için koagülasyon mekanizmasının transmembran bir protein olup hücre bütünlüğü bozulunca kanla temas eden doku faktörünün FVII yi aktive ederek başladığı (ekstrinsik yol) görüşü hâkimdir. Başlangıç fazı olarak adlandırılan bu fazda; Tromboplastin olarak bilinen TF (Tissue factor), FVII/VIIa ile çok güçlü bir bağ oluşturur. FVII plazmada inaktif enzim (zymogen) olarak sirküle ederken sadece %1 veya daha az bir kısmının aktif formda ( FVIIa) dolaştığı bilinmektedir. TF e bağlandığı an FVII sınırlı bir proteoliz ile FVIIa ya dönüşür. FVIIa, TF ile bağlandığında enzimatik aktivitesi çok belirgin artar. TF membran proteini olduğundan TF:FVIIa kompleksi membrane yüzeyine yapışır. Bu şekilde koagülasyon mekanizması sadece lokal olarak gerektiği yerde aktive olur ve bunun sonucunda sınırlı proteoliz ile FIX u, aktive ederken (FIXa) diğer bir yoldan doğrudan doğruya FX u FXa ya dönüştürür. Đster FIXa, FVIIIa-PS (trombosit yüzeyindeki fosfatidil serin) aracılığı ile ister FVIIa+TF yoluyla oluşmuş olsun neticede aktive olan FX (FXa); FVa, FII (Trombin), PS hep birlikte Protrombinase adı verilen kompleksi oluşturur ve protrombin in trombin e (FIIa) dönüşümü sağlanır. Bu şekilde oluşan trombin ve onun etkisiyle fibrinojenden oluşan fibrin in çok düşük düzeyde olduğu ve totalin %4 ünü oluşturduğu hatırlanmalıdır. Trombin Fibrinojen (faktör I) molekülünden önce fibrinopeptid A ve B fragmanlarını kopararak fibrin monomerleri daha sonra monomerlerin bir araya gelmesi ile fibrin polimerlerini oluşturur. Trombin aynı zamanda FXIII ü (fibrin stabilize eden faktör) aktive ederek fibrin polimerlerinin çapraz bağlarının oluşması ve güçlü fibrin pıhtısının meydana gelmesini sağlar. Koagülasyon sisteminde ekstrinsik yol (TF) aracılığıyla başlayan ve az miktarda fibrin oluşumu ile sonlanan ilk koagülasyon aktivasyonu endotelden salınan TFPI (doku faktör yolu inhibitörü, tissue factor pathway inhibitor) aracılığı ile bloke edilir. Bu nedenle devreye intrensek yol girer. Đntrensek yolun Trombin aracılığıyla FXI in aktive edilmesiyle devreye girdiği, aktive FXI (FXIa) in FIX u aktive ettiği (FIX a) ve neticede FIX, kofaktör olarak bulunan FVIII, FX ve trombosit PS in TENASE kompleksini oluşturarak FX u FXa ya dönüştürdüğü görülür. Bundan sonraki aşamada yine yukarıda ifade edilen protrombinaz kompleksi aracılığı ile protrombinin trombine dönüşümü ve fibrinojenden çok daha fazla fibrin oluşumu ile 20

arzulanan düzeyde koagulumun meydana geldiği görülür. Đntrensek yolun aktivasyonuyla birlikte yeterli fibrin oluşumunun sağlandığı bu faza propogasyon (gelişme) fazı adı verilir. Şekil 2.1 Ekstrensek yol Şekil 2.2 Đntrensek yol 21

Koagülasyon kaskadı, aktivatör ve inhibitörlerle çok sıkı denetlenen bir sistemdir. Bu reaksiyonlar devam ederken, pıhtılaşmayı sadece gerekli bölgeye sınırlamak için doğal koagülasyon inhibitörleri devreye girer. Antitrombin, protein C ve protein S değişik koagülasyon faktörlerinin fizyolojik inhibitörleridir. Diğer yandan fibrinolitik sistem global hemostaz sürecinde en az pıhtılaşma sistemi kadar önemli diğer bir sistemdir. Plazmin, fibrinojen ve fibrin pıhtısını eriterek pıhtının sınırlanmasını sağlar. Sonuçta hemostatik sistem, şu beş önemli sistemde bağlantılı olarak stimüle edici ya da inhibe edici yolların mozaikliğinden oluşan bir bütündür: Kan damarları, trombositler, pıhtılaşma faktörleri, pıhtılaşma inhibitörleri ve fibrinoliz. 2.5 Akaferd Blood Stopper Ankaferd Bloodstopper folklorik olarak Türk hekimliği geleneğinde hemostatik ajan olarak kullanılmış bir nebati ekstrakttır. ABS, Thymus vulgaris, Glycyrrhiza glabra, Vitis vinifera, Alpinia officinarum ve Urtica dioica bitkilerinin standardize karışımından oluşmaktadır. Bu bitkilerin hepsi tek başına, endotel hücreleri, kan hücreleri, damar oluşumu (angiogenesis), vasküler dinamikler ve mediatörler üzerinde, hemostatik etkiye katkıda bulunabilecek etkileri vardır: Thymus vulgaris yapraklarının, bilinen antioksidanlar olan alfa-tokoferol ve bütile hidroksitoluen ile kıyaslanabilir düzeyde antioksidan etki gösterdiği bildirilmiştir (30). Glycyrrhiza glabra köklerinden elde edilen ekstraktın in vitro hücre dizilerinde antianjiyojenik aktivite gösterdiği bildirilmiştir (31). Bu bitki kökünün antiinflamatuar, antitrombotik, antioksidan ve antiaterosklerotik etkileri çeşitli araştırmalarla gösterilmiştir (32, 33, 34, 35, 36, 37, 38). Öte yandan meyan kökünün, mineralokortikoid etki nedeniyle kan basıncını yükselttiği bildirilmiştir (39). Alpinia officinarum, lipopolisakkaridle (LPS) aktive edilmiş fare peritoneal makrofajında nitrik oksit (NO) üretimini inhibe eder (40). 22

Urtica dioica nın sıçanda endotel kaynaklı hipotansif yanıt oluşturduğu, bunun endotelden NO salıverilmesi ve potasyum kanallarının açılması sonucu oluşan vasodilatasyona ve negatif inotropik etkiye bağlı olabileceği bildirilmiştir (41). ABS nin diğer etkileri: ABS nin antimikrobiyal etkinliğine dair araştırmalar vardır (42). Urtica dioica kökünün antifungal ve antiviral etkilerinden söz edilmektedir (43, 44). Benzer şekilde Glycyrrhiza glabra köklerinin de antibakteriyel, antifungal ve antiviral etkileri araştırılmıştır (45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53). Ayrıca ABS nin doku iyileşmesi, mezenkimal kök hücre gelişimi ve kanser hücreleri üzerine etkileri araştırılmaktadır (54). Bu bitkilerin yukarıda anılanlar dışında da çeşitli etkileri vardır ve tek başlarına çeşitli endikasyonlarda kullanımları söz konusudur. Thymus vulgaris, Glycyrrhiza glabra, Vitis vinifera, Alpinia officinarum ve Urtica dioica bitkilerinin standardize karışımı olan ABS ise hemostatik etkisi nedeniyle klinik kullanıma sunulmuş olup, bileşenlerinin etkilerine, en azından bazılarına sahip olması beklenir. Bu potansiyel etkiler ABS nin yeni endikasyonlar için değerlendirilebileceğini, ancak aynı zamanda, ABS nin olası sistemik istenmeyen etkileri açısından dikkatli olunması gerektiğini düşündürmektedir. 2.5.1 Isırgan (Stinging Nettle) / Urtica dioica Isırgan otunun tıbbi kısmı Urtica dioica, Urtica urens ve/veya bu türlerin melezlerinin çiçek açma zamanı boyunca toplanan taze ve kurutulmuş toprak üstü kısımlarından oluşmaktadır. (55) Taze bitkinin batıcı tüylerinde histamin, serotonin, asetilkolin, formik asit, lökotrienler (LTB4, LTC4, LTD4) bulunur. Isırganın yine çiçekli bitki kısmında flavanoidler, silisik asit, uçucu yağlar, potasyum iyonları ve nitratlar bulunmaktadır. Kök kısmında ise çeşitli steroidler, lektinler, polisakkaridler (Glukanlar, glukogalakturonanlar, asidik arabinogalaktanlar), hidroksikumarinler, seramidler bulunmaktadır. Isırgan otunun etkileri şöyle sıralanabilir; 23

Çiçekli bitki kısmında taze yapraklar asetilkolin, serotonin ve histamin içerir. Sıkılmış suyu (önemli aktif maddeler; skopoletin, beta-sitosterol ve kafeoil malik asit) yeterli sıvı alımı ile birlikte diüretik özellik gösterir. Taze yapraklarda batıcı tüyler bulunur, fakat bunlar antiinflamatuvar ve analjezik etkilidir (56). Kafeoil asit, in vitro ortamda 5-lipoksijenaza bağımlı lökotrien sentezini inhibe eder. Hayvan deneylerinde yapılan çalışmalarda lokal anestezik ve analjezik etkisi olduğu bulunmuştur. Taze ısırgan yapraklarının topikal kullanımı tahriş önleyici olarak bildirilmiş, fakat sistematik olarak araştırılmamıştır. Yapılan çeşitli çalışmalarda, antiromatizmal ve antiartrit etkisi saptanmıştır. (57, 58) Isırganın kök kısmı tek başına ya da diğer bitkilerle birlikte uygulanmasının benign prostat hiperplazisinin semptomlarını etkili olarak azalttığı görülmüştür (59, 60, 61, 62, 63). Lektin ısırgan aglutinini kitini bağlama yeteneğine ek olarak antifungal aktivite göstermiştir (43). Isırgan otundan elde edilen (N-asetilglukozamin)(n)-spesifik lektininin CMV, HIV-1, HIV-2, RSV ve influenza A virusunu in vitro koşullarda değişen konsantrasyonlardaki EC-50 değerinde (%50 oranında inhibitör özellik gösteren konsantrasyon) inhibe ettiği bulunmuştur (64). 2.5.2 Koruk (Grape) / Vitis vinifera Bitkinin tıbbi olarak kullanılan kısmı yapraklar, meyve ve meyvenin suyudur. (65) Đçeriğinde flavonoidler, tanenler, nonflavonoidler (stilbenler), meyve asitleri (Tartarik asit, malik asit, suksinik asit, sitrik asit ve oksalik asit), fenilakrilik asit türevleri bulunmaktadır. Üzüm çekirdeği ekstresi, periferal venöz yetmezliğe karşı, antioksidan olarak, variköz venlerde, kapiller incelme, diyabetik retinopatinin de dâhil olduğu retina hastalıkları, ödem, oküler stres ve premenstruel sendromda pozitif etkiler göstermektedir (66, 67). In vitro ve hayvan deneylerinde antioksidan, vasküler, sitotoksik, kemopreventif ve sitoprotektif etkileri gösterilmiştir (68,69,70,71,72,73, 74,75). Ayrıca üzüm çekirdeği ekstresinin çok iyi olan antioksidan etkileri 24

aterosklerozis ve kanser gibi diğer kronik dejeneratif hastalıklara karşı koruyucu olarak önerilebilir (76, 77). Üzümden diyet ile alınan polifenoller, ilk olarak Fransız Paradoksu olarak tanımlanan doymuş yağlı diyete karşın koroner kalp hastalığı gelişiminin daha az olması gibi çoklu kardio-protektif özelliklere sahiptir. Son araştırma, bu etkilerin sadece LDL oksidasyonunda polifenollerin olası inhibitor etkilerinden dolayı değil, üzüm polifenollerinin hepatik kolesterol absorpsiyonuna etkisi, trigliserid toplanması ve sekresyonuna etkisi ve plazma lipoproteinlerin işlenmesindeki değişiklikler gibi diğer etkilerini de göstermektedir (78). Üzüm çekirdeği ekstresi kollajen stabilizasyonunu da destekleyebilir. Đn vitro çalışmanın sonuçları prosiyanidinlerin (Vitis vinifera çekirdeklerinden olan) hidrofilik ve lipofilik radikallerin giderilmesinde oldukça etkili olduğunu göstermiştir. Prosiyanidinler dikkate değer anlamda doz bağımlı, anti-lipoperoksidan aktivite göstermiştir. Bu bağlamda, lipozomal membranları şelasyon mekanizması aracılığı ile radikal temizleyici etkileri sonucunda lipit peroksidasyonundan koruyabilirler (79). 2.5.3 Meyan (Licorice) / Glycyrrhiza glabra Meyan kökü, Glycyrrhiza glabra nın soyulmuş ve soyulmamış kurutulmuş kök ve filizlerini içerir. Meyan suyu Glycyrrhiza glabra ekstresidir (80). Meyan ekstresi ve kökü triterpen saponinler, flavonoidler, izoflavonoidler, kümestan türevleri, hidroksikumarinler, steroidler içermektedir. Meyan antiinflamatuvar (81,82,83,84), anti-ülser (85,86,87,88,89) ve ekspektoran etkilidir. Ayrıca antitrombotik, antifungal ve antibakteriyel etkileri de söz konusudur (32,47,52). Meyan kalsiyum iyonlarını inhibe eder (34). Meyanın antiülser olarak kullanımı eskilerden günümüze kadar uzanmaktadır. Meyan pek çok enfeksiyöz hastalık üzerinde etkilidir. Soğuk algınlığı ve grip için kullanılan preparatların terkibinde sıklıkla yer alır ve bronşitin tedavisinde kullanılır. Kortikal hormonların endojen üretimini ve prolongasyonunu stimule eden meyanın menapoz ve premenstruel şikâyetler gibi durumlarda da kullanımı söz konusudur. Bir çalışmada meyanın SARS hastalığına karşı etkili olduğu bildirilmiştir (90). 25

Kronik hepatit C olan hastalarda intravenoz glisirizin solusyonu tedavisinin hepatoselüler karsinoma gelişimini önlediği gözlenmiştir (91, 92). In vitro ve in vivo kanser çalışmalarında meyanın kanserin tedavisi için umut vaat edici bir bileşik olabileceği öne sürülmüştür (36, 93). Bir küçük çalışmanın sonuçları glisirizinin herpes zoster tedavisinde kullanabileceğini desteklemiştir, ancak bu bulgular daha fazla çalışma ile desteklenmelidir (94). Meyanın peptik ülserasyonlardaki yararlı etkileri bilinmekle beraber efektif bir tedavi yöntemi olarak tanımlanabilmesi için daha fazla araştırma yapılması gerekmektedir. Meyanın viral enfeksiyonlardaki etkileri dikkat çekicidir. Glisirizin insan anoploid Ep2 hücrelerinde HSV-1 büyümesini inhibe eder (95). Hepatit B olan hastalarda Hepatit B yüzey antijeni (HbsAg) sekresyonunu baskılar. Glisirizin HIV virüsü üzerindeki antiviral etkinliği virüs hücre bağlanmasını interfere ederek replikasyonu inhibe etmek ve dev hücre formasyonunu baskılamak suretiyle gösterir (49). Ancak bu sonuçlar daha geniş çapta klinik çalışmalarla desteklenmelidir. 2.5.4 Havlıcan (Lesser Galangal) / Alpinia officinarum Havlıcan koyu, kızıl kahverengi yaklaşık 1 2 cm eninde ve 3 6 cm boyunda silindirik rizomlara sahiptir. Bitkinin tıbbi olarak kullanılan kısmı rizomudur (96). Đçeriğinde diarilheptanoidler, gingerol, nişas-ta, tanen ve flavonoidler bulunmaktadır. Bitkinin antispazmotik, antiflojistik ve anti-bakteriyel özellikleri olduğu söylenmektedir. Hazımsızlık, iştahsızlık ve ağrılı üst abdominal sendromlarında kullanılmaktadır (97,98,99). 26

2.5.5 Kekik (Thyme) / Thymus vulgaris) Tıbbi kısmı taze, çiçek açmış bitki, kurutulmuş yapraklar ve dilimlenmiş kuru yapraklardan ekstre edilen yağıdır (100). Uçucu yağlar, kafeik asit deriveleri, flavonoidler, triterpenler içeriğini oluşturan maddelerdir. Kekik, bronşiyal antispazmodik ve ekspektoran etkilidir. Antibakteriyel, antifungal, antiviral, antiprotozoan ve antioksidan özelliklere sahiptir. Hayvan deneylerinde flavon fraksiyonunun spazmolitik bir etkiye, terpenlerin ise silyer aktivite uzerinde ekspektoran bir etkiye sahip olduğu gözlenmiştir. (101, 102, 103, 104, 105, 106) 2.5.6 Ürünün üretim şekli Öncelikle bitkiler toplanır, ardından kümeler halinde depolanan bitkilerin uygunluk bakımından kalite kontrol işlemi eşzamanlı olarak gerçekleştirilir. Kalite kontrol sürecinin ardından bitkiler aşağıda listelendiği şekilde parçalara ayrılırlar: 1.Urtica dioica (kurutulmuş kök) 2.Vitis vinifera (kurutulmuş yaprak) 3.Glycyrrhiza glabra (kurutulmuş yaprak) 4.Alpinia officinarum (kurutulmuş yaprak) 5.Thymus vulgaris (kurutulmuş ot) Parçalara ayırma işleminin tamamlanmasını takiben ekstraksiyon ve damıtma (distilasyon) işlemlerine geçilir. Fiziksel ve kimyasal özellikler açısından yapılan kalite kontrolünün ardından dolum ve ambalajlama işlemleri başlar ve ardından son ürün, kontrol ve analiz için tekrar laboratuvara gönderilir. Kontrol ve analiz işlemlerinden geçerek depolanan ürün aşağıda belirtilen ticari takdim şekillerinde hazırlanır. 27

2.5.7 Ürünün farmasötik formları Ankaferd BloodStopper ampul, tampon ve sprey olmak üzere 3 farklı farmasötik formda hazırlanmıştır: 1.Ankaferd BloodStopper ampul 2 ml 2.Ankaferd BloodStopper tampon 2.5 cm x 7 cm 3 ml 5 cm x 7.5 cm - 10 ml 20 cm x 20 cm 100 ml 3.Ankaferd BloodStopper sprey 5 ml 10 ml 25 ml 50 ml 200 ml Birim farmasötik formda bulunan etkin madde miktarları Tablo 2.1 ve Tablo 2.2 de özetlenmiştir. Etkin madde miktarı (mg) Etkin madde adı Ampul Tampon 2 ml 2.5 X 7 cm 3 ml 5 X 7.5 cm 10 ml 20 X 20 cm 100 ml Urtica dioica 0.12 0.18 0.6 6 Vitis vinifera 0.16 0.24 0.8 8 Glycrrhiza glabra 0.18 0.27 0.9 9 Alpinia fficinarum 0.14 0.21 0.7 7 Thymus vulgaris 0.10 0.15 0.5 5 Tablo 2.1. Ampul ve tampon formunda Ankaferd BloodStopper içerikleri 28

Etkin madde adı Etkin madde miktarı (mg/ml) Urtica dioica 0.06 Vitis vinifera 0.08 Glycrrhiza glabra 0.09 Alpinia fficinarum 0.14 Thymus vulgaris 0.10 Tablo 2.2. Sprey formunda Ankaferd BloodStopper içerikleri Resim 2.11 Ankaferd Bloodstopper 'in ticari formları (resim www.ankaferd.com adlı internet sitesinden alınmıştır.) 2.5.8 ABS nin Temel Hemostatik Parametreler Üzerine Etki ve Kanama Durdurucu Etki Mekanizması Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Đç Hastalıkları Anabilim Dalı Hematoloji Ünitesi nce yapılan çalışmada uluslararası kabul edilen EN ISO 10993-1 Tıbbî (Medikal) Aletlerin Biyolojik Değerlendirilmesi ve ISO 10993-4 Tıbbî Medikal) Aletlerin Biyolojik Değerlendirilmesi - Kan ile etkileşimler için testlerin seçimi rehberlerinde bulunan prosedürler izlenerek, Ankaferd BloodStopper ın (ABS) in vitro hemostatik etkisi araştırılmıştır (1). Bu çalışmada ABS nin temel hemostatik laboratuvar testlerindeki etkileri ABS nin bu amaçla deney tüpünde işletilmesinden sonra birincil ve ikincil hemostatik sistem elementlerinin (koagülasyon proteinleri, plateletler, kan hücreleri) durumunu belirlemek için incelenmiştir. 29

Sonuç olarak; ABS, plazma ve serumda çok hızlı bir (1 saniyeden daha kısa) protein ağı oluşumunu indüklediği görülmüş (Resim 3.12 ve Resim 3.13). ABS nin etkilerine bağlı olarak oluşan her iki ağın da koagülasyon ve hemostaz adına muhtemel reaksiyonlarını durdurma yetisine sahip olduğu gözlenmiştir. Plazmada pıhtılaşma faktörlerinin (koagülasyon faktör II, V, VII, VIII, IX, X, XI ve XIII) düzeylerini etkilememiş olduğu, Trombin zamanı (TT) uzamasına paralel olarak, plazma fibrinojen aktivitesi düştüğü ayrıca ABS ile etkileşim sonucu serumda total protein, albümin ve globülin düzeylerinin anlamlı derecede azaldığı gösterilmiştir. Kan hücreleri (eritrositler ve trombositler), özellikle eritrositler, ABS varlığında hızla (<1 saniye) kümeleşmiş ve ağ oluşumuna katılmışlardır. Resim 2.12 Normal plazmaya ABS eklenmeden önce ABS eklendikten sonra. Resim 2.13 Kana ABS eklenmeden önce ABS ABS eklendikten sonra. (Resimler H. Göker ve ark. (1) çalışmasından alınmıştır.) Genel hemostatik ve biyokimyasal testler, ABS tarafından oluşturulan ağın, temel olarak, başlıca fibrinojen olmak üzere kan proteinleri ile etkileşmesine bağlı olduğunu göstermektedir. Pıhtılaşma faktörlerinin düzeyi etkilenmediği için ve plazma ve serumdaki ağ oluşumunun işaret ettiğine göre, ABS nin bir ağ (network) oluşturmak için fibrinojen ve diğer protein moleküllerinin aglütinasyonunu sağladığı düşünülmüştür. Bu gözlemlere dayanarak ABS nin yol açtığı ağın, herhangi bir pıhtılaştırıcı faktörü spesifik olarak etkilemeksizin, bütün fizyolojik hemostaz sürecini etkilediği ileri sürülebilir. Bundan dolayı ABS hem normal hemostaz parametrelerine sahip bireylerde hem de, dissemine intravasküler koagülasyon da dâhil olmak üzere primer ve/veya sekonder hemostaz yetersizliği olan hastalarda etkili olabilir. ABS nin plazmada neden olduğu ağ oluşumunun ışık mikroskopik ve 30

elektron mikroskopik görünümü resim 3.14 de gösterilmiştir. Resim 2.14 Plazma örneği. (a) Işık mikroskopisi ABS uygulamasından önce, (b) Işık mikroskopisi ABS uygulamasından sonra, (c) elektron mikroskopisi ABS uygulamasından önce ve (d) elektron mikroskopisi ABS uygulamasından sonra (Resimler H. Göker ve ark. (1) çalışmasından alınmıştır.) Olası in vitro etki mekanizması şu şekilde özetlenebilir: ABS mekanizmasının temel etki mekanizması eritrosit yığınları için odak noktaları olan kapsülleşmiş bir protein ağının oluşumu gibi görünmektedir. Belli bölgede ABS ye maruz kalınması doku oksijenasyonuyla birlikte herhangi bir bireysel pıhtılaştırıcı faktörünü devreye sokmadan fizyolojik hemostatik süreci sağlamaktadır. Bu mekanizma ABS ye diğer hemostatik etkili aktif bitki özlerine göre avantaj sağlamaktadır. ABS eritrositlerin agregasyonu damar direncini ve mikrovasküler akış dinamiklerini etkiler. Lokal olarak kapiller damarda oluşan yoğun eritrosit agregasyonu hızla lümendeki normal kan akımını ve kan akımının reolojik özelliğini bozar. Eritrositler aynı zamanda trombosit agregasyonunu da etkiler. Eritrosit agregasyonu fibrinojen varlığında artar. Bu çalışmada elde edilen bulgular, ABS nin fibrinojen eritrosit aglütinasyon ilişkisini etkileyerek, eritrosit agregasyonunu uyaracak kapsüllü bir protein ağı oluşumuna neden olduğunu göstermektedir. 31

3. MATERYAL METOD Mayıs 2009 ve Haziran 2009 tarihleri arasında, Şişli Etfal Eğitim ve Araştırma Hastanesi Hayvan Laboratuarında 8 adet Sprague Dawley cinsi sıçan çalışmaya alındı. Doku büyüme faktörlerinin etkisinin en aza indirilmesi amaçlanarak erişkin ve yaklaşık 250 400 g ağırlığındaki sıçanlar çalışmaya dâhil edildi. Hayvanlar operasyon öncesi 1 hafta bekletilerek laboratuar şartlarına alışmaları sağlandı. Hayvanlar her kafeste en fazla 4 adet olacak şekilde 20 25 C 0 oda sıcaklığında, % 65 70 oranında nemli, 12 saat aydınlık 12 saat karanlık dönemleri sağlanan laboratuar ortamında tutuldular. Su ve yem kısıtlaması yapılmadı. Sıçanların sağ arka bacakları çalışma grubu, sol bacakları da kontrol grubu olarak belirlendi. Đstanbul Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu ndan onay alındı. Çalışmamızda Ankaferd BloodStopper ampul 2 ml kullanıldı. Çalışma esnasında 5199 numaralı Hayvanları Koruma Kanunu ve Tarım ve Köy işleri Bakanlığı nın deneysel ve diğer bilimsel amaçlar için kullanılan deney hayvanlarının korunması, deney hayvanlarının üretim yerleri ile deney yapacak olan laboratuvarların kuruluş, çalışma, denetleme, usul ve esaslarına dair yönetmeliğine uyuldu. 3.1 Cerrahi Prosedür Hayvanların beslenmeleri cerrahi prosedürden 5 saat önce kesildi. Bütün hayvanlara anestezik madde olarak Acepromazine maleat (0.5 mg/kg) ve ketamin hydrochloride (25-30 mg/kg) ve lokal anestezi sağlanması için %1 lidokain hidroklorid + 1/200000 epinefrin (jetokain) 2 ml kullanıldı. Cerrahi prosedür aseptik şartlarda gerçekleştirildi. Operasyon sahası traş edilip, povidin iyot (betadin ) ile temizlendi. Hayvanlar yüzükoyun yatırılarak ön ve arka ayakları flaster bandlarla sabitlendi. Posterolateral düzlemde trochanter major den condylus lateralis femorise uzanan longitudinal insizyon yapıldı. Gluteus maximus ve quadriceps femoris kasları arasından künt diseksiyonla n. ischiadicus ortaya konuldu. Kontrol grubu olan, sıçanların sol bacaklarına başka herhangi bir işlem yapıldan insizyon kapatılırken, çalışma grubu olan sağ bacaklarda n. ischiadicus üzerine 0,2 ml Ankaferd BloodStopper damlatıdı. Beş dakika bekledikten sonra cerrahi saha kapatıldı ve hayvanlar iyileşmeye bırakıldı. Denekler 8 hafta boyunca her kafeste en fazla 4 adet 32

olacak şekilde laboratuarda herhangi bir yem ve su kısıtlaması olmadan bakıldı. Resim 3.1 N.Đschiadicus 3.2 Elektrofizyolojik Kayıtlama Postoperatif 8. haftada denekler genel anestezi verilerek uyutulup elektrofizyolojik incelemeye geçildi. Elektrofizyolojik kayıtlamalar esnasında deneklerin cilt sıcaklığının 30-32 ºC arasında olmasına özen gösterildi. Siyatik sinir uyarımı ve motor cevapların kayıtlaması 4 kanallı elektromiyografi cihazında gerçekleştirildi (Keypoint, Dantec, Skovlunde, Denmark). Pron pozisyonda yatan sıçanlarda; siyatik sinir yüzeyel bipolar tel elektrodlar ile uyluk arka lojunda, en proksimalden uyartıldı. Kayıtlama, gümüş gümüş klorür ihtiva eden yüzeyel elektrodlar ile aktif elektrod baldır arka yüz kasları üzerine (gastroknemius / soleus) ve referans elektrod da topuğa yerleştirildi. Toprak elektrod karın cildi derisi altına sabitlendi. Siyatik sinir, kare dalga şekilli doğru akım ile supramaksimal olarak uyarıldı. En yüksek genlikli motor cevap kaydedilene kadar uyarı şiddeti arttırıldı ve uyarıcı kaydedici elektrodların pozisyonu değiştirildi. Aynı şekil ve genlikte tekrarlayan; en yüksek amplitüdlü cevaplar ard arda en az 3 kez kaydedildi. Kayıtlama deney hayvanların sağ ve sol arka ekstremitelerinde iki yanlı olarak gerçekleştirildi. Sinirde oluşabilecek patolojileri (aksonal dejenerasyon, demyelinizasyon) değerlendirmek için kaydedilen motor cevapların distal gecikme, amplitüd ve alan değerleri hesaplandı. ABS uygulanan bacak ile uygulanmayan bacakların motor cevapları 33

istatistik analize alındı. Tanımlayıcı istatistikleri takiben ortalama değerler üzerinden grup kıyaslamaları yapıldı. Resim 3.2 Deneklerde kayıt ve uyarı elektrotlarının yerleştirilmesi. Resim 3.3 N. Đschiadicus a ait EMG incelemesi. Kontrol grup (Ankaferd BloodStopper uygulanmamış) 34

Resim 3.4 N. Đschiadicus a ait EMG incelemesi. Çalışma grubu (Ankaferd BloodStopper uygulanmış) 3.3 Histopatolojik Örneklerin Hazırlanması Çalışma ve kontrol grubundaki bütün sıçanlar postoperatif 8. haftada yapılan EMG incelemeleri sonrasında yüksek doz ketalar sonrası intrakardiyak potasyum klorür (%7,5 KCl) verilerek sakrifiye edildi ve uygulama yapılan bölgelerden yeteri miktarda N.ischiadicus örnekleri alındı. Her doku örneği histopatolojik inceleme için formaldehit solüsyonu (%10) içerisinde 24 saat bekletilerek fikse edilen örnekler paraffin bloklar içinde saklandı. Patoloji laboratuarında mikrotom yardımıyla 4 6 mikron kalınlığında kesitler alındı. Kesitler Hemotoksilen Eozin, PAS ve Massontrikrom özel boyaları ile boyandı. Işık mikroskopta aynı patolog tarafından değerlendirildi. Örnekler x40, x100, büyütme alanlarında fotoğraflandı (Resim 5.1, 5.2, 5.3). Histopatolojik incelemelerde her parametre kendi arasında sınıflandırıldı (44,46). Histopatolojik olarak; Yabancı cisim reaksiyonu Đnflamasyon Granülasyon dokusu Perinöral kılıf ve Myelin yapının düzeni Aksonal Dejenerasyon değerlendirildi. 35

4. SONUÇLAR 4.1 Elektrofizyolik Đnceleme Sonuçları Elektrofizyolojik incelemelerde her grupta ortalama distal latans, amplitüd, alan, süre değerleri hesaplandı(tablo 4.1). Tablo 4.1 EMG sonuçları Distal latans (msn) Amplitüd (mv) Alan Süre (msn) Sağ Sol Sağ Sol Sağ Sol Sağ Sol Rat 1 1,67 1 1,2 37,4 0,2 25,7 1,8 1,8 Rat 2 1 0,83 42,1 83,3 29,5 69,6 2,2 2,3 Rat 3 1,33 0,83 6,1 56,1 7,5 52,4 2,8 3,1 Rat 4 1,33 0,5 7,4 58,2 4,6 47,7 2,8 2,9 Rat 5 1,17 0,83 8 83,7 8,1 65,7 2,5 2,5 Rat 6 1,33 0,67 7,1 63 6,8 64,8 2,7 2,9 Rat 7 1,25 0.75 8,2 72.3 4,3 47.6 2 2.7 Rat 8 1,58 0,75 6,6 52,5 5,3 46,5 2,1 2,4 Kontrol grubunda ortalama distal latans değeri 0,77±0,14 msn, ortalama amplitüd değerleri 63,31±15,86 mv, ortalama alan değeri 52,52±14,23, süre değerleri 2,57±0,42 msn olarak sonuçlandı (tablo 4.2). Çalışma grubunda ortalama distal latans değeri 1,33±0,21 msn, ortalama amplitüd değerleri 10,83±12,82 mv, ortalama alan değeri 8,29±8,91, süre değerleri 2,36±0,38 msn olarak sonuçlandı (tablo 4.2). 36

Tablo 4.2: EMG değerleri açısından gruplara göre Distal latans, amplitüd, alan ve süre değerleri karşılaştırılması Çalışma grubu Kontrol Grubu Medyan Medyan Ort±SD (%25-75 Ort±SD (%25-75 perc) perc) Distal Latans (msn) 1,33±0,21 1,33(1,19-1,52) 0,77±0,14 0,79(0,69-0,83) 0,001** Amplitüd (mv) 10,83±12,82 7,25(6,22-8,15) 63,31±15,86 60,6(53,4-80,6) 0,001** Alan 8,29±8,91 6,05(4,39-7,95) 52,52±14,23 50,05(46,8-65,5) 0,001** Süre (msn) 2,36±0,38 2,35(2,02-2,77) 2,57±0,42 2,60(2,32-2,90) 0,268 + Mann Whitney U test **p<0,01 + p Distal latans ölçümleri gruplara göre istatistikî olarak anlamlı farklılık göstermektedir (p<0,01). Çalışma grubu olgularda distal latans anlamlı düzeyde yüksek olarak saptanmıştır (Şekil 4.1). Şekil 4.1: Distal latans ölçümlerinin dağılım grafiği 37

Amplitüd ölçümleri de gruplara göre istatistikî olarak anlamlı farklılık göstermektedir (p<0,01). Çalışma grubu olgularda amplitüd ölçümü kontrol grubundan anlamlı düzeyde düşük olarak saptanmıştır (Şekil 4.2). Şekil 4.2: Amplitüd ölçümlerinin dağılım grafiği 38

Alan ölçümleri yine gruplara göre istatistikî olarak anlamlı farklılık göstermektedir (p<0,01). Çalışma grubu olgularda alan ölçümü kontrol grubundan anlamlı düzeyde düşük olarak saptanmıştır (Şekil 4.3). Şekil 4.3: Alan ölçümlerinin dağılım grafiği 39

Süre ölçümleri ise gruplara göre istatistikî olarak anlamlı farklılık göstermemektedir (p>0,05) (Şekil 4.4). Şekil 4.4: Süre ölçümlerinin dağılım grafiği Đstatistikî Đncelemeler Çalışmada elde edilen bulgular değerlendirilirken, istatistik analizleri için NCSS 2007&PASS 2008 Statistical Software (Utah, USA) programı kullanıldı. Çalışma verileri değerlendirilirken tanımlayıcı istatistik metodların (Ortalama, Standart sapma) yanı sıra verilerin karşılaştırılmasında Mann Whitney U test kullanıldı. Sonuçlar % 95 lik güven aralığında, anlamlılık p<0.05 düzeyinde değerlendirildi. 40