ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ

ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ ANTİMİKROBİYEL AKTİVİTEYE SAHİP ENTEROKOK SUŞLARININ MOLEKÜLER DÜZEYDE TANIMLANMASI VE ANTİBİYOTİK DİRENÇLİLİK DÜZEYLERİNİN SAPTANMASI Esra ŞENTÜRK GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ANKARA 2017 Her Hakkı Saklıdır

ÖZET Yüksek Lisans Tezi ANTİMİKROBİYEL AKTİVİTEYE SAHİP ENTEROKOK SUŞLARININ MOLEKÜLER DÜZEYDE TANIMLANMASI VE ANTİBİYOTİK DİRENÇLİLİK DÜZEYLERİNİN SAPTANMASI Esra ŞENTÜRK Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Pınar ŞANLIBABA Bu çalışmada Ankara daki çeşitli market, kasap ve pazarlardan temin edilen 503 adet farklı gıda örneğinden, 459 tanesinde enterokoklar için şüpheli koloni morfolojisi gözlemlenmiştir. Bunlardan 165 i 05-41 mm arasında değişen tür içi antibakteriyel inhibisyon zonu oluşturmuştur. 165 izolatın tamamı ph 9,6 da, % 6,5 NaCL de ve 10-45 o C de gelişim özelliği göstermiştir. Gr (+), katalaz (-) ve eskulin hidrolizi (+) olarak da tanımlanan 165 izolat, muhtemel Enterococcus spp. olarak belirlenmiştir. 140 izolat α-hemolitik, 12 izolat β-hemolitik ve 13 izolat ise γ-hemolitik yapı göstermiştir. İndikatör suşa karşı en yüksek inhibisyon zonu oluşturan 100 enterokok izolatı seçilmiş ve bu suşlara API20 Strep test kitleri uygulanarak tür düzeyinde tanımlama yapılmıştır. 16S rdna dizi analizleri sonucunda 100 enterokok suşunun 61 i E. faecium ve 39 u E. faecalis olarak belirlenmiştir. Tür düzeyinde tanımlamada API20 Strep test kitleri ile elde edilen başarı oranının % 68 olduğu saptanmıştır. Et ve fermente et ürünlerinde baskın tür olarak E. faecium, peynir örneklerinde ise E. faecalis tanımlanmıştır. Enterococcus suşlarının antibiyotik duyarlılık düzeylerinin belirlenmesinde 12 antibiyotik diski kullanılmıştır. Enterococcus suşlarının tamamı streptomisin ve vankomisine karşı duyarlılık gösterirken, nalidiksik aside karşı % 100 dirençlilik göstermiştir. Enterococcus suşlarının antibiyotik dirençlilikleri; kanamisine % 99, rifampine % 81, ampisiline % 60, eritromisine % 37, siprofloksasine % 34, tetrasikline % 9, penisilin G ye % 8, kloramfenikole % 3 ve gentamisine % 2 olarak belirlenmiştir. Çalışmamızda E. faecalis suşlarının E. faecium suşlarına oranla daha fazla dirençlilik fenotipi gösterdiği belirlenmiştir. Nisan 2017, 124 sayfa Anahtar Kelimeler: Enterococcus, Antimikrobiyel Aktivite, Antibiyotik Dirençlilik, Gıda ii

ABSTRACT Master Thesis MOLECULAR IDENTİFİCATİON OF ANTİMİCROBİAL ENTEROCOCCUS SPP. AND DETERMİNATİON OF ANTİBİOTİC RESİSTANCE LEVEL Esra ŞENTÜRK Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Pınar ŞANLIBABA In this study, suspicious colony morphology for Enterococcus was observed in 459 out of 503 different food samples from bazaars, butchers and markets in Ankara. Among them 165 isolates showed in-species antibacterial inhibition zones ranging from 05-41 mm. All the isolates had showed optimal growth at ph 9.6, 6.5% NaCL and 10-45 C. Also identified as Gr(+), catalase(-) and esculin hydrolysis(+) they were determined as possible Enterococcus spp. Out of 165 isolates, 140 isolates were α-hemolytic, 12 isolates β-hemolytic and 13 isolates γ-hemolytic. Among them, 100 enterococcal isolates with the highest inhibition zone against indicator strain were selected and identified using API20 Strep kits. As a result of 16S rdna sequence analysis, 61 of the 100 enterococci strains were identified as E. faecium and 39 as E. faecalis. Identification at the species level, the success rate achieved with API20 Strep test kits was found as 68%. While E. faecium was the dominant species in meat and fermented meat products, E. faecalis strains were dominant in cheese samples. To determine the antibiotic susceptibility level of Enterococcus strains, 12 antibiotic discs were used. While all Enterococcus strains were susceptible to streptomycin and vancomycin, they showed 100% resistance against nalidixic acid. Antibiotic resistance of Enterococcus strains was found as; kanamycin 99%, rifampin 81%, ampicillin 60%, erythromycin 37%, ciprofloxacin 34%, tetracycline 9%, penicillin G 8%, chloramphenicol 3% and gentamicin 2%. In our study, it was determined that E. faecalis strains showed more resistance phenotype than E. faecium strains. April 2017, 124 pages Key Words: Enterococcus, Antimicrobial Activity, Antibiotic Resistance, Food iii

TEŞEKKÜR Bana bu konuda çalışma imkânı sunan ve tez çalışmamın her aşamasında yardım ve desteğinden yararlandığım danışman hocam Sayın Doç. Dr. Pınar ŞANLIBABA ya (Ankara Üniversitesi Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı), Yüksek lisans tez çalışmamın moleküler tanımlama kısmını gerçekleştirmem için laboratuvar olanaklarını kullanmama izin vererek, gösterdiği ilgi ve desteği ile her zaman yanımızda olan Sayın Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK e (Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü); Araştırmalarımda laboratuvar olanaklarını kullanmama izin vererek bilgi ve tecrübesini benimle paylaşan Sayın Prof. Dr. A. Kadir HALKMAN a (Ankara Üniversitesi Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı); Araştırmalarımda kullandığım referans suşları temin etmemde yardımcı olan ve laboratuvar olanaklarını kullanmama izin veren Sayın Yrd. Doç. Dr. Nefise AKÇELİK e (Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü); Çalışmalarım sırasında bilgi, emek ve katkılarını her zaman benimle paylaşan ve tez yazımı sırasında değerli görüşlerine başvurduğum Sayın Yrd. Doç. Dr. Başar UYMAZ TEZEL e (Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi Bayramiç Meslek Yüksekokulu Gıda Teknolojisi Programı); Tez çalışmamın istatiksel kısmının yapılmasında bilgi, emek ve katkılarını esirgemeyen Sayın Doç. Dr. Mehmet Ufuk KASIM a (Kocaeli Üniversitesi Arslanbey Meslek Yüksekokulu); Çalışmalarımın moleküler tanımlama kısmında destek ve katkıları ile beni yönlendiren Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Prokaryot Genetiği Laboratuvarındaki Arş. Gör. Dr. Neslihan TAŞKALE KARATUĞ (Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Anabilim Dalı), Fatma Neslihan YÜKSEL, Sinem UĞUR ve Çiğdem Elif ÇELİK e; iv

Çalışmalarım sırasında bana yardımcı olan laboratuvar arkadaşlarım Gürcü Aybige ÇAKMAK, Raşit KESKİN, Gülmire YUSUFU ve 3. Sınıf lisans öğrencilerinden Bilge Ece ÖZEL e; Hayatım boyunca maddi ve manevi destekleriyle beni yalnız bırakmayan, her zaman yanımda olan sevgili aileme; sonsuz teşekkürlerimi sunuyorum. Bu yüksek lisans tez çalışması Antimikrobiyel Aktiviteye Sahip Enterokok Suşlarının Gıdalardan İzolasyonu, Moleküler Düzeyde Tanımlanması ve Antibiyotik Dirençlilik Düzeylerinin Fenotipik Düzeyde Saptanması başlıklı ve 16L0443001 nolu lisansüstü tez projesi (Yüksek Lisans) kapsamında Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi tarafından desteklenmiştir. Esra ŞENTÜRK Ankara, Nisan 2017 v

İÇİNDEKİLER TEZ ONAY SAYFASI ETİK...i ÖZET...ii ABSTRACT...iii TEŞEKKÜR...iv SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ...ix ŞEKİLLER DİZİNİ...xi ÇİZELGELER DİZİNİ...xii 1. GİRİŞ...1 2. KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ÖZETLERİ...3 2.1 Enterokokların Genel Özellikleri...3 2.2 Enterokokların Fonksiyonel Özellikleri...8 2.2.1 Laktik asit üretimi...9 2.2.2 Proteolitik aktivite...9 2.2.3 Lipolitik aktivite...10 2.2.4 Sitrat metabolizması...10 2.2.5 Probiyotik kültür olarak kullanımı...11 2.2.6 Bakteriyosin üretimi...12 2.3 Enterokokların Virülans Özellikleri...13 2.3.1 Hemolisin/Sitolizin...14 2.3.2 Agregasyon maddesi...14 2.3.3 Hücre dışı yüzey proteini...15 2.3.4 Jelatinaz...15 2.3.5 Antibiyotik dirençlilik...16 2.3.5.1 Doğal (İntrensek) direnç...18 2.3.5.2 Kazanılmış (Ekstrensek) direnç...19 vi

2.3.5.3 Çapraz direnç...20 2.4 Enterokoklarda Antibiyotik Dirençlilik Mekanizmaları...20 2.4.1 β-laktam direnci...22 2.4.2 Glikopeptit direnci...23 2.4.3 Makrolit ve Linkozamit direnci...24 2.4.4 Tetrasiklin direnci...25 2.4.5 Aminoglikozit direnci...25 2.4.6 Rifampisin direnci...26 2.4.7 Oksazolidinon direnci...27 2.4.8 Kinolon direnci...27 3. MATERYAL ve YÖNTEM...28 3.1 Materyal...28 3.1.1 Gıda örnekleri...28 3.1.2 Referans bakteriler...28 3.1.3 Besiyerleri...28 3.1.4 Antibiyotikler...31 3.1.5 Bakterilerin stok kültürlerinin hazırlanması...32 3.2 Yöntem...32 3.2.1 Gıda örneklerinin analize hazırlanması ve enterokokların izolasyonu...32 3.2.2 Antimikrobiyel aktiviteye sahip muhtemel enterokok izolatlarının belirlenmesi...33 3.2.3 Morfolojik ve biyokimyasal testler...33 3.2.3.1 Gram boyama...33 3.2.3.2 Katalaz testi...33 3.2.3.3 Eskulin hidrolizi...34 3.2.3.4 ph 9,6 da gelişme...34 3.2.3.5 Tuz toleransının belirlenmesi...35 3.2.3.6 Sıcaklık toleranslarının belirlenmesi...35 3.2.3.7 Hemoliz testi...36 vii

3.2.3.8 API testi...38 3.2.4 Enterococcus suşlarının 16S rdna dizi analizi ile tür düzeyinde moleküler tanısı...40 3.2.4.1 Toplam genomik DNA izolasyonu...40 3.2.4.2 Toplam genomik DNA örneklerinin elektroforezi...42 3.2.4.3 Enterokok suşlarının 16S rdna bölgesinin polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılması...43 3.2.5 Enterococcus suşlarının antibiyotik duyarlılıklarının saptanması...44 3.2.6 İstatistiksel analiz...45 4. BULGULAR ve TARTIŞMA...46 4.1 Antimikrobiyel Aktiviteye Sahip Enterokokların İzolasyonu...46 4.2 Enterokok İzolatlarının Tanımlanması...58 4.2.1 Morfolojik ve kültürel testler...58 4.2.2 İzolatların biyokimyasal tanımlanması...60 4.2.3 Enterococcus suşlarının 16S rdna dizi analizi ile moleküler tanımlanması..70 4.3 Enterokok Suşlarının Antibiyotik Duyarlılıkları...83 4.3.1 Enterokok türlerinin antibiyotik duyarlılıkları...95 4.3.2 İzole edildiği gıda kaynakları bazında enterokok suşlarının antibiyotik duyarlılıkları...99 5. SONUÇ...103 KAYNAKLAR...106 ÖZGEÇMİŞ...123 viii

SİMGELER DİZİNİ % Yüzde ~ Yaklaşık C Santigrad Derece µg Mikrogram µl Mikrolitre dk Dakika g Gram h Saat kb Kilobaz kob Koloni Oluşturma Birimi L Litre M Molar mg Miligram ml Mililitre mm Milimetre N Normal nm Nanometre sn Saniye V Volt α Alfa β Beta γ Gama Kısaltmalar API Application Programming Interface ATCC Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (American Type Culture Collection) BLAST Basic Local Alingment Search Tool CLSI Clinical Laboratory Standards Institute (Klinik Laboratuvar Standarları Enstitüsü ) DNA Deoksiribonükleik Asit dntp Deoksinukleotidtrifostat karışımı EDTA Etilen Diamin Tetra Asetikasit ETEC Enterotoksijenik Escherichia coli Gr (-) Gram Negatif Gr (+) Gram Pozitif GRAS Generally Regarded as Safe (İnsan ve Hayvan Tüketiminde Güvenli Kabul Edilen) LAB Laktik Asit Bakterisi MİK Minimal İnhibitör Konsantrasyonu NCBI National Center for Biotechnology Information ix

ORF PBP PZR rdna RNA RNaz rrna trna UV VRE Open Reading Frame (Açık Okuma Kalıbı) Penisilin Bağlayıcı Protein Polimeraz Zincir Reaksiyonu Ribozomal Deoksiribonükleik Asit Ribonukleik Asit Ribonukleaz Ribozomal Ribonükleik Asit Taşıyıcı Ribonukleik Asit Ultraviyole Vancomycin Resistant Enterococci (Vankomisin Dirençli Enterokoklar) x

ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Enterokoklarda doğal dirençlilik mekanizması...19 Şekil 3.1 Enterokok izolatlarının Bile Eskulin Azide agar besiyerinde gelişimi...34 Şekil 3.2 Muhtemel enterokok izolatlarının broth ortamda gelişmesi...36 Şekil 3.3 Enterokoklarda β-hemolitik yapı...37 Şekil 3.4 Enterokoklarda α-hemolitik yapı...37 Şekil 3.5 Enterokoklarda γ-hemolitik yapı...38 Şekil 3.6 Enterokok izolatlarının API 20 Strep biyokimyasal test kitleri ile tür düzeyinde tanımlanması...39 Şekil 4.1 Enterokok izolatlarının antimikrobiyel aktiviteleri...48 Şekil 4.2 Enterococcus spp. suşlarının PZR ile çoğaltılan 16S rdna fragmentleri...71 Şekil 4.3 Enterococcus faecalis EP17 suşunun disk difüzyon yöntemi ile tanımlanan antibiyotik duyarlılığı...84 Şekil 4.4 Enterococcus faecium EP24 suşunun disk difüzyon yöntemi ile tanımlanan antibiyotik duyarlılığı...84 Şekil 4.5 Enterococcus faecalis EP35 suşunun disk difüzyon yöntemi ile tanımlanan antibiyotik duyarlılığı...85 Şekil 4.6 Enterococcus faecalis EP23 suşunun disk difüzyon yöntemi ile tanımlanan antibiyotik duyarlılığı...85 xi

ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1 Enterococcus cinsine dâhil olan türler...4 Çizelge 2.2 İnsan ve hayvan tedavisinde ortak kullanılan antibiyotikler...17 Çizelge 2.3 Enterokoklardaki antibiyotik direnç mekanizmaları ve etkilediği antibiyotikler...18 Çizelge 2.4 Antibiyotiklerin genel etki mekanizmaları...21 Çizelge 2.5 Enterokoklarda antibiyotiklerin genetik determinantları...22 Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan besiyerleri ve ürün kodları...29 Çizelge 3.2 Moleküler çalışmalarda kullanılan besiyerleri, çözeltiler ve ürün kodları.. 30 Çizelge 3.3 Çalışmada kullanılan antibiyotikler...31 Çizelge 3.4 Polimeraz zincir reaksiyonunda kullanılan karışım...44 Çizelge 3.5 Enterococcus türleri için antibiyotik duyarlılık sınırları...45 Çizelge 4.1 Gıda örneklerinden izole edilen muhtemel enterokok izolatlarının dağılımları...47 Çizelge 4.2 Gıda örneklerinden izole edilen enterokok izolatları ve antimikrobiyel aktiviteleri...49 Çizelge 4.3 Antimikrobiyel aktivite gösteren enterokok izolatları...57 Çizelge 4.4 Antimikrobiyel akvitite gösteren izolatların hemoliz testi...59 Çizelge 4.5 Enterokok izolatlarının biyokimyasal tanısı...61 Çizelge 4.6 Enterokok izolatlarının API 20 Strep test kiti ile tür düzeyinde tanımlanması...65 Çizelge 4.7 Enterokok izolatlarının API 20 Strep test kitine göre tür düzeyinde dağılımı...69 Çizelge 4.8 API 20 Strep test kiti kullanılarak tür düzeyinde tanımlaması yapılan enterokok suşlarının gıda orjinleri...70 Çizelge 4.9 Enterococcus suşlarının 16S rdna dizi analizi sonuçlarına göre gerçekleştirilen tanısı...72 Çizelge 4.10 16S rdna dizi analizi sonuçlarına göre Enterococcus suşlarının tür düzeyinde dağılımı...75 Çizelge 4.11 Enterokok suşlarının tanımlanması aşamasında API 20 Strep test kiti ile 16s rdna dizi analizi sonuçlarının karşılaştırılması...76 xii

Çizelge 4.12 16S rdna dizi analizleri kullanılarak tür düzeyinde tanımlaması yapılan enterokok suşlarının gıda orjinleri...80 Çizelge 4.13 Enterococcus faecalis suşlarının antibiyotik duyarlılık düzeyleri...86 Çizelge 4.14 Enterococcus faecium suşlarının antibiyotik duyarlılık düzeyleri...88 Çizelge 4.15 Enterococcus suşlarının antibiyotik duyarlılık/dirençlilik yüzdeleri...91 Çizelge 4.16 Enterococcus faecalis suşlarının antibiyotik duyarlılık/dirençlilik yüzdeleri...96 Çizelge 4.17 Enterococcus faecium suşlarının antibiyotik duyarlılık/dirençlilik yüzdeleri...97 Çizelge 4.18 Et ve et ürünlerinden izole edilen Enterococcus suşlarının antibiyotik duyarlılık/dirençlilik yüzdeleri...100 Çizelge 4.19 Peynirlerden izole edilen Enterococcus suşlarının antibiyotik duyarlılık/dirençlilik yüzdeleri...101 xiii

1. GİRİŞ Gıda ve klinik mikrobiyoloji açısından önem taşıyan Enterococcus lar doğada yaygın olarak bulunmakta olup, insan ve hayvanların gastrointestinal sistemindeki floralarının da bir parçasını oluşturmaktadır. Enterococcus lar birçok gıdada doğal olarak bulunan ve çeşitli gıdaların fermantasyonunda rol oynayan önemli mikroorganizmalardır. Enterokokların bazı suşları aynı zamanda endokarditis, üriner sistemde ve diğer dokularda enfeksiyonlara neden olan hastane kaynaklı patojen olarak da tanınmaktadır. Özellikle de Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis suşlarının fırsatçı patojen olduğu bilinmektedir. Bakteri kültürlerinin fermente gıda üretiminde kullanımlarının yaygınlık kazanmasına paralel bir şekilde, probiyotiklere ve insan sağlığı açısından yararlı mikroorganizmalara ilgi artmıştır. Bir suşun etkin bir probiyotik olarak tanımlanabilmesi için gerekli özellikler gerek kullanılacağı gıda sistemindeki davranışı ve gerekse hedef tüketici sağlığı üzerinde yaratacağı olumlu etkiler esas alınarak belirlenmektedir. Diğer yandan antimikrobiyel madde üretim potansiyelleri, gıdaların ve tüketicilerin hem gıda bozulmaları ve hem de patojen mikroorganizmaların olumsuz etkilerinden korunmasında büyük önem taşımaktadır. Bu anlamda en önemli sorun, gıdalara ilave edilecek kültürlerin, canlı olarak ve büyük oranlarda tüketiminin insan sağlığı açısından risk oluşturup oluşturmayacağıdır. Bu tartışmanın odağında ise enterokok türleri yer almaktadır. Gıda kaynaklı Enterococcus ların günümüze kadar herhangi bir klinik enfeksiyona neden olup olmadığı rapor edilmemiştir. Ancak bazı enterokok türlerinin; endokardit, bakteremi, üriner sistem ve merkezi sinir sistemi enfeksiyonlarını da içeren nozokomiyal enfeksiyonlara neden olan türlerinin tanımlanmış olması, enterokok suşlarının starter kültür olarak kullanımları ile ilgili tartışmaları da beraberinde getirmiştir. Kuşkusuz son yıllarda yapılan çalışmaların büyük bir çoğunluğunun odak noktasını klinik izolatlar oluşturmuş; bu izolatların direnç durumları ve mekanizmaları detaylı bir şekilde ortaya konmuştur. Enterokokların Staphylococcus aureus tan sonra hastane 1

enfeksiyonlarında en sık görülen bakteri olması ve birçok antimikrobiyel ajana karşı doğal ve kazanılmış tipte dirençlilik göstermesi, klinik enterokok izolatlarını daima ilgi çekici kılacaktır. Aynı zamanda Enterococcus suşlarının gıdalarda starter ve probiyotik kültür olarak kullanılması gıda güvenliği açısından halen daha üzerinde araştırma yapılan konu başlıkları arasında yer almaktadır. Hastalık yapan Enterococcus türleri ile gıdalarda bulunan Enterococcus türleri birbirleriyle ilişkilendirilmemesine rağmen, bu bakterilerin starter kültür ve/veya probiyotik kültür olarak, gıda zincirine girecek suşlarının seçilmesinde daha dikkatli olmayı gerektirmektedir. Gıdalarda starter ve probiyotik olarak kullanılacak Enterococcus türlerinin glikopeptitlere ve diğer antibiyotiklere direnci ile hemoliz oluşturmalarının yanı sıra diğer virülans özellikleri de taşıyıp taşımadıkları önem taşımaktadır. Günümüze kadar enterokoklar ile ilişkili çok sayıda virülans faktör tanımlanmıştır. Başta vankomisin dirençli enterokoklar olmak üzere, antibiyotik direncine sahip enterokokların sayısı hızla artış göstermektedir. Ancak starter ya da probiyotik olarak kullanılacak enterokok suşlarında virülans faktörlerin bulunmaması ve bu özellikler açısından suşların kesin tanısının yapılması gerekmektedir. Aynı zamanda potansiyel starter kültür belirleme çalışmalarında enterokok izolatlarının antibiyotik dirençliliklerinin belirlenmesi, bu anlamda önem taşımaktadır. Dünyada farklı gıda kaynaklı enterokok izolatlarının antibiyotik duyarlılıklarının saptanması ile ilgili çalışmalara hız verilmiştir. Son yıllarda dünyada ve ülkemizde özellikle hayvansal gıdalarda enterokokların antibiyotik dirençlilik düzeylerini belirleyen literatür verileri, bizi bu çalışmada çeşitli gıdalardan enterokok suşlarının izolasyonu ile bu suşların antibiyotik dirençlilik düzeylerinin belirlenmesine yönlendirmiştir. Çalışmamız kapsamında çeşitli gıdalardan izole edilmiş olan antimikrobiyel aktiviteye sahip enterokok izolatlarının öncelikle biyokimyasal tanımlaması yapılmış ve takiben moleküler tanımlama aşamasına geçilmiştir. 16S rdna analizleri uygulanarak tür düzeyinde tanımlaması yapılmış olan suşların antibiyotik duyarlılık düzeyleri belirlenmiştir. 2

2. KURAMSAL TEMELLER VE KAYNAK ÖZETLERİ 2.1 Enterokokların Genel Özellikleri Enterococcus izolasyonu ilk kez 1899 yılında Fransız mikrobiyolog Thiercelin tarafından yapılmış olup, bağırsak bakterisi olarak tanımlanmıştır. Andrews ve Horder tarafından ise, 1906 yılında Streptococcus faecalis olarak adlandırılmıştır. 1933 yılında Lancefield in yaptığı serolojik tiplendirme sistemine göre ise, D grubu streptokoklara dâhil edilmiştir (Giraffa 2003). 1984 yılına kadar Streptococcus cinsi altında yer alan bu türler, Schleifer ve Kilpper-Balnz tarafından Enterococcus cinsi altında toplanmıştır (Klein 2003, Oryaşın 2008, Karabıyık 2011, Torlak 2013). Moleküler ve biyokimyasal analizler sonucunda Streptococcus cinsinden ayrımı yapılan Enterococcus cinsi DNA-DNA hibridizasyon çalışmaları, 16S rdna dizi analizi ve toplam hücre protein profillerinin belirlenmesi gibi moleküler çalışmalar sonucunda 55 tür ve 2 alt türe ayrılmıştır (Çizelge 2.1), (http://www.bacterio.net/enterococcus.html 2017). Laktik asit bakterileri (LAB) olarak bilinen mikroorganizma grubuna dâhil olan Enterococcus türleri aerobik ya da fakültatif anaerobik, Gr (+), sporsuz, katalaz (-), oksidaz (-), E. casseliflavus ve E. gallinarum gibi bazı türleri dışında hareketsiz, tek, çift veya kısa zincir şeklinde koklardır (Gelsomino vd. 2001, Gaaloul vd. 2014, Yılmaz vd. 2016). Enterokok türlerinin optimum gelişme sıcaklığı 37 C dir. Bununla birlikte çoğu tür 10 45 C sıcaklık aralığında gelişme gösterebilir. Ayrıca % 6,5 NaCl varlığında ve ph 9,6 da gelişebilirler. 60 C de 30 dakika ısı muamelesi sonucunda canlılıklarını sürdürebilirler (Malek vd. 2012). Gaz ve endospor oluşturmazlar. Besin gereksinimleri komplekstir (Holt vd. 1994, Çelik ve Alhan 2008, Karabıyık 2011). Gelişebilmeleri için gerek B vitaminleri ve gerekse bazı temel aminoasitler açısından pek çok Gr (+) bakteriden daha fazla besin maddesine gereksinim duyarlar (Hayaloğlu ve Erginkaya 2001, Abauelnaga vd. 2016). 3

Çizelge 2.1 Enterococcus cinsine dâhil olan türler (http://www.bacterio.net/enterococcus.html 2017) Sıra No Tür Adı Kaynak 1 Enterococcus avium Collins vd. 1984 2 Enterococcus casseliflavus Collins vd. 1984 3 Enterococcus durans Collins vd. 1984 4 Enterococcus malodoratus Collins vd. 1984 5 Enterococcus gallinarum Collins vd. 1984 6 Enterococcus faecalis Schleifer ve Kilpper-Bälz 1984 7 Enterococcus faecium Schleifer ve Kilpper-Bälz 1984 8 Enterococcus hirae Farrow ve Collins 1985 9 Enterococcus mundtii Collins vd. 1986 10 Enterococcus pseudoavium Collins vd.1989 11 Enterococcus raffinosus Collins vd. 1989 12 Enterococcus solitarius Collins vd.1989 13 Enterococcus cecorum Williams vd.1989 14 Enterococcus dispar Collins vd.1991 15 Enterococcus seriolicida Kusuda vd.1991 16 Enterococcus sulfureus Martinez-Murcia ve Collins 1991 17 Enterococcus saccharolyticus Rodrigues ve Collins 1991 18 Enterococcus flavescens Pompei vd.1992 19 Enterococcus columbae Devriese vd. 1993 20 Enterococcus asini De Vaux vd.1998 21 Enterococcus villorum Vancanneyt vd. 2001 22 Enterococcus haemoperoxidus Švec vd. 2001 23 Enterococcus moraviensis Švec vd. 2001 24 Enterococcus ratti Teixeira vd. 2001 25 Enterococcus porcinus Teixeira vd. 2001 26 Enterococcus gilvus Tyrrell vd. 2002 27 Enterococcus pallens Tyrrell vd. 2002 28 Enterococcus canis De Graef vd. 2003 29 Enterococcus phoeniculicola Law-Brown ve Meyers 2003 30 Enterococcus hermanniensis Koort vd. 2004 31 Enterococcus saccharominimus Vancanneyt vd. 2004 32 Enterococcus italicus Fortina vd. 2004 33 Enterococcus aquimarinus Švec vd. 2005 (a) 34 Enterococcus devriesei Švec vd. 2005 (b) 35 Enterococcus canintestini Naser vd. 2005 36 Enterococcus caccae Carvalho vd. 2006 37 Enterococcus silesiacus Švec vd. 2006 38 Enterococcus termitis Švec vd. 2006 4

Çizelge 2.1 Enterococcus cinsine dâhil olan türler (http://www.bacterio.net/enterococcus.html 2017) Sıra Tür Adı No Kaynak 39 Enterococcus camelliae Sukontasing vd. 2007 40 Enterococcus thailandicus Tanasupawat vd. 2008 41 Enterococcus viikkiensis Rahkila vd. 2011 42 Enterococcus lactis Morandi vd. 2012 43 Enterococcus ureasiticus Sistek vd. 2012 44 Enterococcus rivorum Niemi vd. 2012 45 Enterococcus plantarum Švec vd. 2012 46 Enterococcus quebecensis Sistek vd. 2012 47 Enterococcus alcedinis Frolkov vd. 2013 48 Enterococcus ureilyticus Sedláček vd. 2013 49 Enterococcus lemanii Cotta vd. 2013 50 Enterococcus diestrammenae Kim vd. 2013 51 Enterococcus eurekensis Cotta vd. 2013 52 Enterococcus rotai Sedláček vd. 2013 53 Enterococcus olivae Lucena-Padrós vd. 2014 54 Enterococcus xiangfangensis Li vd. 2014 55 Enterococcus bulliens Kadri vd. 2016 Alt Türler 1 Enterococcus saccharolyticus subsp. saccharolyticus Chen vd. 2013 2 Enterococcus saccharolyticus subsp. taiwanensis Chen vd. 2013 Safra varlığında eskulin hidrolizi yapabilirler. % 40 safra tuzu varlığında bile çoğalabilirler. E. faecalis suşları koyun kanından hazırlanmış kanlı agarda hemoliz oluşturmazlarken, tavşan ve at kanından hazırlanmış kanlı agarda ise β-hemolitik koloniler oluşturur. Diğer türler genellikle α-hemolitik ya da γ-hemolitik özellik gösterir. Bazı E. durans türleri ise bütün kanlı agar ortamlarında β-hemoliz oluştururlar (Ogier ve Serror 2008, Fisher ve Phillips 2009, Iseppi vd. 2015). Karbohidratları fermente ederek L (+) laktik asit oluştururlar ve bu özelliklerinden dolayı tipik homofermentatif LAB olarak bilinirler (De Vuyst 2000, Doming vd. 2003, Linaje vd. 2004, Toğay ve Temiz 2011). Laktozu fermente edebilirler, arabinoz pozitif ve pürivat negatiftirler (Willey vd. 1999). Embden-Mayerof-Parnas yolunu kullanarak karbohidratları metabolize ederler (Klibi vd. 2015). 5

Enterokoklar biyokimyasal özelliklerine göre ise beş gruba ayrılırlar. Gruplandırmada mannitol ve sorbitol içeren sıvı besiyerlerinde asit oluşturma ve arjinini hidrolize etme gibi özellikler dikkate alınmıştır (Tok 2006, Oryaşın 2008, Karabıyık 2011, Öztürk 2014). Grup 1: Mannitol ve sorbitol sıvı besiyerinde asit oluştururlar. Arjinini hidrolize edemezler. E. avium, E. malodoratus, E. raffinosus, E. pseudoavium, E. saccharolyticus, E. pallens, E. gilvus bu grubun üyeleri arasındadır. Grup 2: Bu gruptaki üyeler arjinini hidrolize ederler. Mannitollü sıvı besiyerinde asit oluştururlarken, sorbitollü sıvı besiyerinde değişken reaksiyon gösterirler. E. faecalis, E. faecium, E. casseliflavus, E. haemoperoxidus, E. mundtii ve E. gallinorum bu grubun üyeleri arasındadır. Grup 3: Bu gruptaki enterokok türleri arjinini hidrolize ederler. Mannitol ve sorbitol içeren sıvı besiyerlerinin hiçbirisinde asit oluşturamazlar. E. villorum, E. dispar, E. durans, E. hirae, E. ratti ve E. faecalis ile E. faecium un mannitol negatif varyantları bu grubu oluşturur. Grup 4: E. sulfurens, E. asini, E. phoeniculicola ve E. cecorum türlerinin bulunduğu bu grup, mannitol içeren sıvı besiyerlerinde asit oluşturmaz ve arjinini hidrolize etmezler. Sorbitol içeren sıvı besiyerinde ise E. cecorum asit oluştururken, E. sulfureus asit oluşturmaz. Grup 5: E. columbae, E. canis, E. moraviensis türlerinin bulunduğu bu grup ise arjinini hidrolize etmez, mannitollü sıvı besiyerinde asit oluşturur, sorbitollü sıvı besiyerinde değişken reaksiyon gösterirler. Gıda mikrobiyolojisi ve klinik mikrobiyoloji açısından önemli bir grup olan Enterococcus lar, doğada yaygın olarak bulunmakta olup (Brtkova vd. 2010, Tuncer vd. 2013, Toğay vd. 2014), insan ve hayvanların gastrointestinal sistemindeki floralarının da bir parçasıdırlar (Birollo vd. 2001, Bağcıgil vd. 2015). Enterokoklar her zaman, her yerde bulunabilen mikroorganizmalardır ve çevre şartlarına dayanıklı olduklarından her tür ortamda canlılıklarını koruyabilirler (Belgacem vd. 2010, 6

Karabıyık 2011, Iseppi vd. 2015). İnsan ve hayvanların sindirim sisteminin baskın florasını oluşturan enterokoklar toprak, yüzey suları, bitkiler, sebzeler, böcekler ve pek çok gıda ürününde yaygın olarak görülmektedir (Toğay ve Temiz 2011, Avcı 2015). İnsan dışkısından en çok E. faecalis ve E. faecium türleri; tavuk, sığır ve domuz gibi çiftlik hayvanlarından ise en fazla E. faecium türleri izole edilmektedir. Ancak E. cecorum, E. gallinarum, E. durans, E.hirae ve E. avium türlerine de rastlanılmıştır. Hastane ortamlarında ise, E. faecium daha baskındır. E. mundtii ve E. casseliflavus türleri ise bitki kaynaklı olarak kabul edilmektedir (Toğay ve Temiz 2011, Thumu ve Halami 2013). E. faecium ve E. faecalis gıdalardan en sık izole edilen ve gıda proseslerinde yer alan en önemli enterokok türlerdir (De Vuyst vd. 2003, Klein 2003, Toğay vd. 2014, Hammad vd. 2015, Hashem vd. 2015). Bu iki tür, sucukların fermantasyonu sırasındaki baskın mikroflorayı oluştururlar (Papamanoli vd. 2003). Ayrıca süt ürünleri ve peynirlerde de yüksek sayılarda bulunurlar (Gelsomino vd. 2001, Vancanneyt vd. 2002, Malek vd. 2012). Her iki tür de peynir ve fermente süt ürünleri ile sucuk gibi fermente et ürünlerinin üretiminde, organoleptik özellikleri geliştiren, raf ömrünü ve stabilitesini arttıran doğal starter kültürlerdir (De Vuyst 2000, Eaton ve Gasson 2002, Ross vd. 2002, Vancanneyt vd. 2002, Linaje vd. 2004). Ayrıca, E. faecium ve E. faecalis karışık kültür ya da yardımcı kültürler olarak da kullanılırlar (Gelsomino vd. 2001). Bu kültürlerin karışık kültür ya da yardımcı kültürler olarak kullanılma nedeni, peynirin olgunlaştırılmasını hızlandırmak, istenen tadı elde etmek ya da probiyotik özelliklerinden yararlanmaktır (Giraffa 2003). Bu bakteriler GRAS (Generally Recognized As Safe; İnsan ve Hayvan Tüketiminde Güvenli Kabul Edilen) sınıfında değerlendirilen LAB a dâhil olmalarına rağmen, GRAS mikroorganizma olarak kabul edilmediklerinden dolayı gıda ortamındaki güvenilirliği tartışmalara sebep olmaktadır (Frazzon vd. 2010, Toğay 2010, Malek vd. 2012, Iseppi vd. 2015). Gıdalarda E. faecalis in yaygın bulunması her zaman fekal kontaminasyon olarak değerlendirilemez. Enterokoklar gıdalarda sadece yetersiz hijyen göstergesi olarak değil ayrıca gıdanın bir parçası olarak da bulunabilmektedir. 1992 yılında Avrupa Birliği tarafından Escherichia coli ve koliformların hijyen indikatörü olarak gıdalarda 7

maksimum bulunabilme miktarları belirlenirken, enterokoklar için bir limit belirtilmemiştir. Bundan dolayı enterokoklar gıdalarda hijyen indikatörü olarak daha önemsiz kabul edilmektedir (Klein 2003, Foulquie Moreno vd. 2006). Ayrıca fermente gıdalarda enterokoklar kontaminasyon düzeyini ya da kürleme işleminin yetersizliğini de yansıtmaktadır (Hugas vd. 2003, Franz vd. 2003, Toğay ve Temiz 2011). Enterokoklar primer patojenler olarak değerlendirilmezler ancak antimikrobiyel ajanlara karşı yüksek direnç gösterme yeteneklerine bağlı olarak dünya çapında nozokomiyal patojenler olarak ortaya çıkmaktadırlar (Brtkova vd. 2010, Camargo vd. 2014, Toğay vd. 2014, Bağcıgil vd. 2015, Sallem vd. 2016). Enterokoklar insanlarda sıklıkla karşılaşılan çeşitli enfeksiyonlara neden olan türler de içerirler. Bu organizmalar çoğunlukla üriner sistem ve yara enfeksiyonlarının yanı sıra; damar içi, endokardiyum, karın içi, safra sistemi ve yumuşak doku enfeksiyonlarına neden olurlar. Ayrıca enterokokların merkezi sinir sistemi, akciğer, sinüsler, kulak, göz ve periodontal dokuları enfekte edebilme özelliği vardır, ancak bu enfeksiyonlar nadir olarak gözlenmektedir (Başustaoğlu 2004, Sallem vd. 2016). E. faecalis insan enterokokal enfeksiyonlarının % 80-90 ına yol açmaktadır (Camargo vd. 2014, Hammad vd. 2015, Hashem vd. 2015, Abauelnaga vd. 2016). E. faecium ise geriye kalan enfeksiyonlardan sorumludur. E. avium, E. casseliflavus, E. durans, E. gallinarum, E. hirae, E. malodoratus, E. mundtii, E. raffinosus ve E. solitarius un da dâhil olduğu diğer enterokokal türler nadiren insanlarda enfeksiyona sebep olur (Toğay ve Temiz 2011, Bağcıgil vd. 2015). Enterokoklar çevre koşullarına dayanıklı olduklarından birçok ortamda canlılıklarını sürdürebilirler. Bu nedenle enterokoklar gerek cansız maddeler aracılığı ile gerekse sağlık personeli vasıtasıyla hastadan hastaya taşınarak hastane enfeksiyonu olarak anılan salgınlara yol açabilmektedir (Brtkova vd. 2010, Hammad vd. 2015, Sallem vd. 2016). 2.2 Enterokokların Fonksiyonel Özellikleri Enterokokların sahip olduğu fonksiyonel özelliklerden en önemlileri laktik asit üretimi, proteolitik aktivite, lipolitik aktivite, sitrat metabolizması, probiyotik olarak 8

kullanılmaları ve bakteriyosin üretim yetenekleridir (Giraffa 2003, Moreno vd. 2006, Belgacem vd. 2010, Yoğurtçu 2011, Malek vd. 2012, Iseppi vd. 2015). 2.2.1 Laktik asit üretimi Enterokoklar ortamda bulunan heksozları kullanarak başlıca ürün olarak laktik asit üretirler. Glikoz ve laktozu homofermentatif laktik asit fermantasyonu ile pirüvik asite dönüştürerek, piruvattan da laktat dehidrogenaz enzimi ile L-laktik asit oluştururlar. Oluşan laktik asit ph'ı düşürerek gıdalarda bulunan patojenik bakterileri inhibe eder. Bazı enterokok suşları karbohidratları fermente ederek laktik asit üretme yetenekleri ile peynir üretiminde starter kültür olarak kullanılabilmektedir (Abauelnaga vd. 2016). Örneğin cheddar peyniri, yumuşak İtalyan peyniri ve bazı İsviçre peynirlerinin yapımında asit, tat ve aroma oluşumu için kullanılmaktadır. Enterokoklar starter kültür olarak kullanılabilen diğer LAB üyelerine kıyasla süt ürünlerinde daha düşük asitlik oluştururlar (Gürsel vd. 1994). E. faecalis suşları E. faecium suşlarına göre daha güçlü asitlendirme yeteneği göstermektedir (Moreno vd. 2006, Yoğurtçu 2011, Dişçioğlu 2014). 2.2.2 Proteolitik aktivite Gıdalarda bulunan bazı mikroorganizmalar sahip oldukları proteolitik özellikler ile süt, et ve dondurulmuş gıdalarda bulunan proteinleri hidrolize ederek ürünlerin tat ve kokuları üzerinde istenmeyen değişimlere yol açabilmektedir. Bu olumsuz özelliğinin yanı sıra proteolitik aktivite peynir, fermente et gibi gıda ürünlerinin gelişmesi ve olgunlaşmasında olumlu bir etki de gösterebilmektedir. Ayrıca süt, et, kanatlı et ve deniz ürünlerindeki proteolitik bakteri sayımları mikrobiyolojik kalite kriterlerindendir (Moreno vd. 2006, Karabıyık 2011, Şahin 2012). Yapılan çalışmalarda enterokokların düşük düzeyde proteolitik aktivite gösterdiği ancak E. faecalis suşlarının diğer suşlara göre daha yüksek proteolitik aktiviteye sahip olduğu belirlenmiştir (Yoğurtçu 2011, Malek vd. 2012). E. faecium suşu peynir üretiminde proteolitik enzim sayesinde 9

kazeinin ve esterazla da süt yağının parçalanmasını sağlar (Karakaş 2005, Dişçioğlu 2014). 2.2.3 Lipolitik aktivite Enterococcus suşlarında lipolitik aktivite ilk kez 1965 yılında Lund tarafından tanımlanmıştır. Enterokoklar proteolitik aktiviteden daha yüksek oranda lipolitik aktivite göstermektedir. En lipolitik tür ise E. faecalis olarak bilinmektedir (Moreno vd. 2006). Peynir üretiminde süt yağının lipolizi ve peynirlerde muhtemel lezzet bileşikleri olan metil keton ile tiyol esterlerinin oluşumunu sağlayan yağ asitlerinin ileri parçalanması reaksiyonları ile lipolitik aktiveden faydanılmaktadır (Gürsoy ve Kınık 2006, Moreno vd. 2006, Malek vd. 2012). Lipolitik aktivite bazı gıdalarda tat ve aroma oluşumu ile lezzete katkıda bulunurken, ürettikleri katalaz enzimleri ile peroksitleri parçalayarak oluşabilecek renk bozukluklarını da önlerler (Yalanca 2009, Yoğurtçu 2011). Lezzete olumlu etkilerinin yanı sıra peynirlerde önemli bir lezzet kusuru olan oksidatif ransiditeye de neden olarak, ürünlerde kalite kaybına ve bozulmaya yol açmaktadırlar (Karabıyık 2011). 2.2.4 Sitrat metabolizması LAB ın önemli karakteristik ve teknolojik özelliklerinden biri sitrat metabolizmasıdır. Birçok gıdada doğal olarak bulunan veya bazı gıdaların üretiminde katkı maddesi olarak kullanılan sitrat, enterokoklar tarafından fermente edilebilmektedir (Giraffa 2003, Moreno vd. 2006). Enterococcus suşları sitratı asetat, asetaldehit, diasetil ve aseton gibi uçucu lezzet bileşiklerine dönüştürmekte ve peynir aromasını olumlu etkilemektedir (Karakaş 2005, Yoğurtçu 2011, Malek vd. 2012, Dişçioğlu 2014). Enterokokların sitrat metabolizması üzerine, ph ın ve ortamda bulunan karbohidrat kaynaklarının etkisi bulunmaktadır. Organik asitleri kullanma açısından diğer enterokok türlerine göre en aktif tür E. faecalis dir (Dişçioğlu 2014, Iseppi vd. 2015). 10

2.2.5 Probiyotik kültür olarak kullanımı Probiyotikler, canlı olarak vücuda yeterli miktarda alındığında bağırsaklardaki mikrobiyel florayı koruyup geliştirerek dengeleyen, insan ve hayvan sağlığını olumlu şekilde etkileyen yararlı mikroorganizmalar olarak tanımlanmaktadır (Gürsoy ve Kınık 2006a, Toğay 2010). Probiyotikler sahip oldukları antimikrobiyel ve antogonistik aktivite sayesinde gastrointestinal enfeksiyonları kontrol altında tutmakta, antibiyotik kaynaklı ishalleri engellemekte, serum kolesterol düzeyi ile kan basıncının düşmesini sağlamaktadır. Ayrıca antimutajenik ve antikanserojenik aktivite ile probiyotikler bağışıklık sistemini düzenleyici ve anti-alerjik özelliklerinin yanı sıra metal detoksifikasyonu ile kalsiyum, çinko, demir, manganez, bakır ve fosfor gibi mineral ve iz elementlerin biyoyararlanımını arttırmak, proteinlerin sindirimini kolaylaştırmak gibi olumlu etkiler de gösterebilmektedir (Toğay 2010). Günümüzde bazı bilim adamları enterokokların gıda ürünlerinde probiyotik olarak kullanılmasına tepki göstermesine rağmen yine de enterokok türleri insan ve hayvanların bağırsak florasındaki mikrobiyel dengeyi sağlamak amacıyla gıdalarda starter kültür olarak yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Enterococcus cinsi içinde gıda endüstrisinde probiyotik amaçlı kullanılan en önemli iki tür E. faecium ve E. faecalis olarak bilinmektedir (Karabıyık 2011, Akgül 2014, Uludağ 2015). Enterokok türlerinden E. faecium insanlar için probiyotik olarak kullanılırken, hayvanlar için hem E. faecalis hem de E. faecium suşlarının probiyotik özelliğinden yararlanılmaktadır. Özellikle E. faecium türlerinin hayvanların gelişimine ve hastalıklara karşı dirençlilik kazanmasına katkısından dolayı hayvan yemi üretiminde probiyotik olarak kullanımı yaygındır (Moreno vd. 2006). Hatta hayvanların beslenmesinde antibiyotik kullanımı yerine E. faecium suşu kullanımı alternatif yöntem olarak gösterilmektedir. İnsanlarda enterokoklarla ilgili enfeksiyonların büyük çoğunluğundan E. faecalis suşlarının sorumlu olması ve E. faecium suşlarının yüksek oranda bakteriyosin üretmesi nedeniyle gıda üretimlerinde en sık kullanılan tür E. faecium dur (Gürsoy ve Kınık 2006b, Iseppi vd. 2015). İmmun sistemi güçlendirerek, diyarenin önlenmesinde faydası bulunan E. faecium un ticari preparatı olan SF68 suşunun düşük ph ya, safra asitlerine ve dış etkilere karşı dirençli olduğu ve akut enteritis, turist diyaresi gibi bağırsak bozukluklarına karşı etkili olduğu bildirilmiştir (Karakaş 2005, Toğay 2010, Oladipo vd. 2014). Ayrıca insanlarda 11

diyarenin tedavisinde antibiyotik uygulamalarına alternatif olarak E. faecium probiyotiğinin kullanımı düşünülmektedir. Enterokoklar ürettikleri enterosinler sayesinde de, birçok gıda ürününde çeşitli gıda patojenlerinin gelişimini inhibe ettiği için gıda güvenliğinin geliştirilmesi amacıyla kullanılması düşünülen mikrobiyel katkılar arasındadır. Bu suşların çevre koşullarına dayanıklı olmaları ve insan bağırsaklarında doğal olarak bulunmaları sebebiyle probiyotik olarak kullanımları destek görmektedir. Ancak endokartitis, üriner sistem enfeksiyonları ile merkezi sinir sistemi ve solunum yollarında enfeksiyonlara neden olan fırsatçı patojenlerden olan Enterococcus suşlarının ayrıca sahip oldukları antibiyotik dirençlilikleri ve virülans özellikleri nedeniyle probiyotik olarak kullanılması gıda güvenliği açısından tartışmalara neden olmaktadır (Toğay 2010, Uludağ 2015). 2.2.6 Bakteriyosin üretimi Bakteriyosinler, LAB tarafından ribozomal olarak sentezlenen, antimikrobiyel aktiviteye sahip ve yakın akraba cinslere karşı bakteriyostatik veya bakteriyosidal etkiye sahip olan küçük katyonik, amfilik protein yapısındaki bileşiklerdir (Dişçioğlu 2014, Yüksel vd. 2015). Bakteriyosinlerin inhibisyon aktivitesi ile antibiyotiklerin antibakteriyel etkileri genellikle birbirine karıştırılmakla beraber bakteriyosinleri antibiyotiklerden ayıran temel farklılıklar bulunmaktadır (Yüksel 2012, Avcı 2015). Bunlar; 1. Bakteriyosinler ribozomal olarak, antibiyotikler ise enzimatik bir sistemle sentezlenirler. 2. Bakteriyosinler antibiyotiklere göre daha dar bir etki spektrumuna sahiptirler ve sadece yakın akraba türlerine bakteriyosidal ya da bakteriyostatik etki gösterirler. 3. Antibiyotik dirençliliğini yöneten genler antibiyotik genleri ile bağlantılı değil iken, bakteriyosin üreten hücreler bakteriyosinin yapısal genleri ile bağlantılı olup kendi ürettikleri bakteriyosine karşı dirençlilik sağlayan proteinlere sahiptir. 4. Bakteriyosinler primer metabolitler olup, genellikle bakterilerin gelişme fazında üretilirken antibiyotikler ise, gelişimin durağan fazında ikincil metabolitler olarak üretilirler. 12

LAB tarafından üretilen bakteriyosinler, aminoasit dizilimleri, etki mekanizmaları, biyolojik aktiviteleri, ısı toleransları, modifiye aminoasit varlıkları ile salgı mekanizmaları göz önünde bulundurularak; lantibiyotikler, lantibiyotik olmayan ısı stabil bakteriyosinler, yüksek moleküler ağırlığa sahip ısıya duyarlı bakteriyosinler ve lipit veya karbohidrat yan grupları içeren kompleks bakteriyosinler olmak üzere dört ana grupta sınıflandırılmıştır (Yoğurtçu 2011, Avcı 2015). Enterococcus cinsi bakterilerin ürettiği bakteriyosinler; Sınıf II bakteriyosinler grubunun bir üyesi olup enterosin olarak adlandırılmakta ve genellikle güçlü antilisteriyal etkiye sahip lantibiyotik olmayan, küçük ve ısı stabil bakteriyosinler grubunda yer almaktadır. Bakteriyosin üreten enterokoklar süt ürünleri, fermente sucuklar, balık ve sebzelerden sıklıkla izole edilebilmekle beraber doğada yaygın olarak bulunmaktadırlar (Moreno vd. 2006, Yüksel vd. 2015). E. faecalis ve E. faecium suşları tarafından üretilen enterosinlerin en bilinenleri; Enterosin A, Enterosin B, Enterosin P, Enterosin 50, Bakteriosin 31 ve AS-48 sitolisin dir. Enterokoklar tarafından üretilen enterosinler Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens ve Vibrio cholerae gibi patojen türlere karşı antibakteriyel aktivite göstermektedirler (Avcı 2015, Oladipo vd. 2014). Farklı sıcaklık koşullarına dayanabilen enterosinler, yüksek asitlik, geniş ph aralıkları, liyofilizasyon ve kurutma gibi çeşitli prosesler ile lipaz, amilaz ve katalaz enzim uygulamaları karşısında stabilitelerini koruyabilirler. Ancak proteinaz-k, α-kemotripsin, tripsin, pepsin gibi çeşitli proteolitik enzim uygulamaları ile kısmen ya da tamamen inaktive olabilirler (Avcı 2015). 2.3 Enterokokların Virülans Özellikleri Enterokoklardaki virülans faktörler, genomlarında bulunan patojenite adaları denilen özel bölgelerde ve plazmitlerde kodlanan virülans genleri ile düzenlenir. Enterococcus suşlarında patojenite adaları ilk kez 1980 yılında nozokomiyal salgına neden olan E. faecalis te tanımlanmıştır. % G+C oranı % 32,2 ve büyüklüğü 150 kb civarında olan bu patojenite adası virülans genlerinin yanı sıra transpozonlar, transkripsiyonel regülatör genler ve proteinleri kodlayan genlerin yer aldığı 129 ORF (Open Reading Frame: Açık Okuma Kalıbı) bölgesine de sahiptir (Upadhyaya vd. 2009). Bu patojenite adasının 13

tanımlanmasından iki yıl sonra, E. faecium suşlarında da E. faecalis ten farklılık gösteren başka bir patojenite adası daha tanımlanmıştır (Leavis vd. 2004, Iseppi vd. 2015, Yılmaz vd. 2016). Hemolizin / sitolizin, jelatinaz, enterokokkal yüzey proteini, agregasyon faktörü, kapsül ve hücre duvarı polisakkaritleri, lipoteikoik asit, süperoksitler, seks feromonları, hyaluronidaz, Efa A proteini (E. faecalis antijen A proteini), AS-48 ve antibiyotik dirençlilik enterokokların en önemli virülans faktörleridir (Moreno vd. 2006, Sarıgüzel 2012, Hammad vd. 2015, Abauelnaga vd. 2016, Yılmaz vd. 2016). Virülans faktörler arasından hemolisin/sitolizin, agregasyon maddesi, hücre dışı yüzey proteini, jelatinaz ve antibiyotik dirençlilik aşağıda kısaca özetlenmeye çalışılmıştır. 2.3.1 Hemolisin/Sitolizin Enterokok suşlarında görülen virülans özelliklerden biri olan hemolisin/sitolisin, protein yapılı bakteriyel bir toksindir (Morandi vd. 2006, Ogier ve Serror 2008). Toksin insan, at, koyun ve tavşan kanı kullanılarak hazırlanan kanlı agarlarda eritrosinlere karşı hemolitik aktiviteye sahiptir. Sitolizin aynı zamanda lantibiyotik olarak bilinen bir bakteriyosin sınıfı ile yakın ilişkilidir (Akçimen 2010, Ayva 2013). Sitolizin kodlayan gen bölgesi plazmit üzerinde ya da bakteriyel kromozom üzerinde bulunabilmektedir (Karabıyık 2011). Enterokok türlerinden E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum ve E. hirae de sitolizin varlığı belirlenmiştir (Yıldız 2012). 2.3.2 Agregasyon maddesi Enterokoklarda önemli virülans faktörlerden biri olan agregasyon maddesi, bir yüzey proteinidir. Agregasyon maddesi bakteriyel konjugasyon sırasında kümelenmeyi (agregat oluşumunu) sağlayarak enterokok alıcı ve verici hücrelerinin arasında etkin temasın oluşmasına yardımcı olur ve plazmit transferini kolaylaştırırır. Plazmit 14

transferinin kolaylaştırılması sonucunda, antibiyotik direncine yol açan genetik kısımlar türler arasında transfer edilebilmektedir. Agregasyon maddesi sayesinde enterokoklar kalp kapakçıkları ile böbrek epitel hücrelerine tutunabilir ve böylece üriner sistem ile endokardit enfeksiyonlarına sebep olabilir (Yoğurtçu 2011, Yıldız 2012, Sarıgüzel 2012, Şahin 2012, Yüksel 2012, Gültekin 2014, Hammad vd. 2015). 2.3.3 Hücre dışı yüzey proteini Enterokokal yüzey proteini (Esp), ilk olarak gentamisin dirençli bir E. faecalis izolatında tanımlanmıştır (Gültekin 2014). Enterokokal yüzey proteini yüksek moleküler ağırlığına sahip olup, 153 kb büyüklüğündeki bir patojenite adasında yer alan esp geninde kodlanır ve konjugasyonla enterokok izolatları arasında aktarılabilir (Akgül 2014). Hücre dışı yüzey proteinin görevi abiyotik yüzeylere tutunma ve biyofilm üretimi olmakla beraber, Esp konjugasyon sıklığındaki artıştan da sorumludur (Yıldız 2012). 2.3.4 Jelatinaz Enterokokların virülans özelliklerinden biri olarak gösterilen ve enterokok suşları tarafından üretilen jelatinaz jelatin, kollajen, fibrinojen, kazein, hemoglobin, insülin gibi bazı biyoaktif peptitleri hidrolize edebilen, matriks metallo proteinaz (MMP) ailesinin ekstra selüler çinko içeren bir üyesi olup hücre dışı metalloendopeptidazdır (Sarıgüzel 2012). Jelatinaz üreten suşların akut toksik etkilerinin üretmeyen suşlara göre daha yüksek olduğu ve jelatinaz üreten E. faecalis suşlarının endokardit enfeksiyonlarına yol açtığı gösterilmiştir (Akçimen 2010, Şahin 2012, Torlak 2013). Jelatinaz enziminin varlığı enterokoklarda ilk kez 1964 de, E. faecalis suşlarında gösterilmiştir (Upadhyaya vd. 2009). 15

2.3.5 Antibiyotik dirençlilik Canlıların gelişmesini durdurma veya öldürme gücü bulunan mikroorganizmalar tarafından oluşturulan doğal ya da kimyevi maddelere antibiyotik denir (Sipahi 2012). Enterokokların önemli virülans faktörlerinden biri de birçok antibiyotiğe karşı gösterdikleri dirençtir. Enterokokların birçok antibiyotiğe karşı doğal direnç göstermeleri, çoğu diğer antibiyotiklere karşı da kolaylıkla direnç kazanabilmeleri ve ekstrem çevre koşullarına adaptasyon yeteneklerinin iyi olması bu suşların patojenitesini artırmaktadır (Yoğurtçu 2011, Abauelnaga vd. 2016). Enterokoklarda antibiyotik dirençliliğinin gelişmesinde en önemli faktörlerden birisi de, hayvansal gıdalarda katkı maddesi olarak antibiyotik kullanımının yaygınlaşmasıdır (Sallem vd. 2016). Ayrıca, besi hayvanlarında büyümeyi artırıcı ilaçların sık kullanımı da hayvansal gıdalardan izole edilen enterokoklar arasında antibiyotik dirençliliğinin artmasına neden olmuştur. Antibiyotiklerin uygunsuz bir şekilde hayvan beslenmesinde gelişimi arttırıcı ajan olarak kullanılması, dirençli E. faecium türlerinin ortaya çıkmasında selektif ajan rolü taşımaktadır (Cocconcelli vd. 2003, Malek vd. 2012, Sallem vd. 2016). Hayvan besiciliğinde kullanılan bu antimikrobiyeller arasında bilinçsizce insan tedavisinde kullanılan antibiyotikler de yer almaktadır (Çizelge 2.2) (Bozkurt ve Leblebicioğlu 2015). Klinik uygulamalarda kullanılan antibiyotiklere karşı kazanılan direncin bir diğer mekanizması olarak da, bu antibiyotiklerin hayvan beslenmesinde bilinçsiz kullanımı sonucu gelişen çapraz direnç olarak değerlendirilmektedir (Emborg vd. 2003, Bağcıgil vd. 2015, Hashem vd. 2015). 16

Çizelge 2.2 İnsan ve hayvan tedavisinde ortak kullanılan antibiyotikler (Bozkurt ve Leblebicioğlu 2015) Antibiyotik Grubu Penisilinler İnsanlarda Kullanılan Antibiyotikler Penisilin G, Nafsilin, Oksasilin, Dikloksasilin, Ampisilin, Amoksisilin, Karbenisilin, Tikarsilin, Piperasilin Hayvanlarda Kullanılan Antibiyotikler Penisilin, Amoksisilin, Ampisilin Glikopeptitler Teikoplanin, vankomisin Avoparcin, vankomisin Makrolitler Eritromisin, Azitromisin, Klaritromisin, Roksitromisin, Diritromisin, Spiramisin, Telitromisin Eritromisin, Spiramisin, Kitasamisin, Olendomisin, Tilozin, Tiamulin Polipeptitler Basitrasin Basitrasin Aminoglikozitler Gentamisin, Tobramisin, Amikasin, Streptomisin, Neomisin Neomisin Linkozamitler Linkomisin, Klindamisin Linkomisin Tetrasiklinler Doksisiklin, Minosiklin, Demeklosiklin Tetrasiklin, Doksisiklin, Klortetreasiklin, Oksitetrasiklin Amfenikoller Kloramfenikol Kloramfenikol Enterokoklar antibiyotiklere karşı doğal direnç, kazanılmış direnç ve çapraz direnç olmak üzere üç çeşit direnç gösterirler (Tatlı 2009, Sallem vd. 2016). Klinik uygulamalarda kullanılan pek çok antibiyotiğe karşı doğal ve kazanılmış çeşitli direnç mekanizmaları gösteren enterokoklar; yarı sentetik penisilinlere, düşük düzeyde aminglikozitlere, linkozamitlere ve streptograminlere karşı doğal direnç gösterirken, plazmitler, integronlar ve transpozanlar aracılığıyla birçok antibiyotiğe karşı da direnç kazanabilmektedir (Frazzon vd. 2010, Garrido vd. 2014, Abauelnaga vd. 2016, Yılmaz vd. 2016). Enterokoklardaki antibiyotik direnç mekanizmaları ve etkilediği antibiyotikler çizelge 2.3 de gösterilmiştir (Kurtgöz 2013). 17

Çizelge 2.3 Enterokoklardaki antibiyotik direnç mekanizmaları ve etkilediği antibiyotikler (Kurtgöz 2013) Direnç Tipi İntrensek Direnç Kazanılmış Direnç Etkilediği Antibiyotikler Aminoglikozit direnci (düşük düzeyde direnç) β-laktamlar (yüksek düzeyde MİK değerleri) Linkozamitler (düşük düzeyde direnç) Trimetoprim/sulfametoksazol (sadece in vivo direnç) Aminoglikozit direnci (yüksek düzeyde direnç) β-laktamlar (penisilin bağlayıcı proteinlerde değişiklik) Hücre duvarına etkili ajanlar Florokinolonlar Makrolit Penisilin ve ampisilin Rifampisin Tetrasiklin Vankomisin Linezolit 2.3.5.1 Doğal (İntrensek) direnç Bakteriler, bazı antibiyotiklere doğal olarak dirençli olabilir. Doğal (intrensek) direnç, bu mikroorganizmaların tür özelliği olarak ilacın hedefi olan yapıyı taşımamalarının veya ilacın yapısal bir özelliğinden dolayı hedefine ulaşmamasının bir sonucudur (Yalanca 2009). İntrensek direnç enterokokların türe özgü karakteristik özelliklerinden biri olup, enterokok türlerinin tamamında görülen kromozomal direnç tipidir (Blair vd. 2015). Enterokoklar penisilinlere, sefalosporinlere, trimetoprim/sulfametoksazole, nalidiksik asite, linkozamitlere, düşük seviye aminoglikozit ve klindamisinlere karşı intrensek direnç gösterir (Çomoğlu 2008, Dilik 2008, Akçimen 2010, Yılmaz vd. 2016), (Şekil 2.1). 18

Antibiyotik A Antibiyotik B Antibiyotik C Dış Zar Por Peptidoglikan İç Zar Efluks Pompa Şekil 2.1 Enterokoklarda doğal dirençlilik mekanizması (Blair vd. 2015) 2.3.5.2 Kazanılmış (Ekstrensek) direnç Bakteriler genetik özelliklerindeki değişimler sonucu eskiden duyarlı olduğu bir antibakteriyel maddeden etkilenmemeye başladığı durumda, bakteri antibakteriyel maddeye karşı direnç kazanmış olur. Çeşitli fiziksel ya da kimyasal etkilerle bakteri hücresinde oluşan değişimler sonucu, hücrenin antibiyotiklere karşı davranışı değişebilir, hücrenin antibiyotiği geçirgenliği azalabilir ya da hücredeki antibiyotiğin hedefi değişebilir. Kazanılmış (ektrensek) direnç genellikle enterokokların DNA sında oluşan mutasyonlar sonucu veya patojenite adaları, konjugasyon, transformasyon, transpozonlar aracılığı ile plazmit DNA aktarımı sonucu olmaktadır. En sık görülen mekanizma ise konjugasyondur. Bir bakteriden aktarılan direnç genleri, bakterinin bölünmesi ile yavru hücrelere de aktarılır. Bu hücrelerin çoğalması ile de dirençli suşun ve direnç genlerinin yayılımı gerçekleşir. Enterokoklar vankomisine, kloramfenikole, eritromisine, tetrasikline, florokinolona, beta laktamaz üreten penisilinlere, yüksek seviye aminoglikozitlere ve klindamisinlere karşı ise sonradan ektrensek direnç göstermektedirler (Dilik 2008, Yalanca 2009, Garrido vd. 2014). 19

2.3.5.3 Çapraz direnç Bir antibiyotiğe karşı dirençli olan mikroorganizmanın, benzer sistem ile etki eden diğer antibiyotiklere karşı da dirençli olmasıdır. Genellikle eritromisin, neomisin, kanamisin gibi benzer özellikteki antibiyotikler arasında görülür (Yalanca 2009). Hayvanların beslenmesinde bilinçsiz bir şekilde gelişim artırıcı olarak kullanılan antibiyotikler dirençli E. faecium türlerinin ortaya çıkmasına sebep olmakla beraber; çapraz direnç sonucunda hayvanların gelişimi için kullanılan antimikrobiyellere ve insanlardaki hastalıkları tedavi için kullanılan ilaçlara karşı dirençlilik gelişmesine yol açmaktadır (Karakaş 2005). 2.4 Enterokoklarda Antibiyotik Direnç Mekanizmaları Enterokokların diğer Gr (+) mikroorganizmaların duyarlı olduğu pek çok antimikrobiyel ajana karşı kısmen veya tamamen direnç göstermesi, klinik uygulamalarda enterokokkal enfeksiyonların tedavisinde karşılaşılan en önemli sorunlardan birisidir (Yıldız 2012, Garrido vd. 2014, Yılmaz vd. 2016). Çizelge 2.4 te antibiyotiklerin enterokok suşlarındaki genel etki mekanizmaları ve çizelge 2.5 te ise enterokoklarda antibiyotiklerin genetik determinantları gösterilmiştir. 20

Çizelge 2.4 Antibiyotiklerin genel etki mekanizmaları Etki Şekilleri Hücre duvarı sentezini inhibe edenler Sitoplazmik membran geçirgenliğini bozanlar Bakteriyel ribozomlarda protein sentezini inhibe edenler RNA ve DNA sentezini bozanlar Antibiyotikler Penisilin Basitrasin Sefolosporin Vankomisin Sikloresin Karbapenemler Polimiksin Nistatin İmidazol Gramisidin Amfoterisin B Triazol Aminoglikozitler (30S) Klindamisin (50S) Kloramfenikol (50S) Eritromisin (50S) Tetrasiklin (30S) Kinolon Aktinomisin Rifampisin Mitomisin 21

Çizelge 2.5 Enterokoklarda antibiyotiklerin genetik determinantları (Garrido vd. 2014) Antimikrobiyel Ajan β-laktam ve Cephalosporinler Aminoglikozitler Glikopeptitler Makrolit ve Linkozamitler Tetrasiklin Rifampisin Oksazolidinolonlar Daptomisin Quinolonlar Genetik Determinantları Penisilin Bağlayıcı Proteinler (PBPs):PBP4, PBP5 efmm aph(2")-lb aac(6')-li aph(2")-lc aph(3')-llla aph(2")-ld ant(4")-la ant(6')-la aph(2")-la-aac(6 )le ant(3")-la VanA operon (vana, H, X, Y, Z, R, S) VanB operon VanC operon VanD operon VanE operon VanL operon VanM operon VanN operon Isa msrc vgab vgad vat(b) vat(d)(sata) vat(e)(satg) tet(m) tet(q) tet(s) rpobh486y Cfr Cls gdpd GyrA, ParC Qnr vat(g) vat(h) vgb(a) erm(a) erm(b) linb mef tet(k) tet(l) LiaF EmeA EfrAB 2.4.1 β-laktam direnci β-laktam grubu antibiyotiklere direnç, Enterococcus cinsi bakterilerin karakteristik özelliğidir. Enterokoklar β-laktam antibiyotiklere karşı hem intrensek hem de ekstrensek direnç gösterirler (Shepard ve Gilmore 2002, Miller vd. 2014). Enterokoklarda β-laktam üreten genler plazmitlerde ya da kromozomlarda konumlanmış olup, β-laktam grubu antibiyotiklere ana direnç mekanizması penisilin bağlayıcı proteinlerin (PBP-5) üretimi ile olmaktadır. Kromozomal olarak düşük affiniteli PBP-5 22

miktarının artması sonucu, penisilinin hücre içine girişi azalmaktadır. Bu durum sıklıkla E. faecium suşlarında görülmektedir. PBP-5 sentez yeteneğinin kaybı ise, dirençlilik fenotipi gösteren suşların duyarlılık göstermesine neden olmaktadır. β-laktamaz üretimi ise, β-laktam grubu antibiyotiklere karşı direncin bir diğer mekanizmasıdır. β-laktamaz üreticisi Enterococcus suşları ilk kez 1981 yılında Amerika da tanımlanmıştır. β- laktamaz, yüksek düzeyde gentamisin direnç genini taşıyan bir plazmit üzerinde kodlanmıştır. Bu enzimler Gr (+) ve Gr (-) bakteriler tarafından yaygın bir şekilde üretilirler. Son mekanizma ise, efluks sistemiyle antibiyotiğin hedefe ulaşmasının engellenmesidir (Wilke vd. 2005). Enterokoklar β-laktamlara genellikle streptokoklardan yaklaşık olarak 100 kat daha az duyarlıdır (Shepard ve Gilmore 2002). Enterokok türleri genellikle penisilin, ampisilin, piperasilin ve imipenem gibi β-laktam grubu antibiyotiklere karşı bakteriyostatik etki uygulayarak düşük seviyede doğal direnç gösterir. E. faecalis streptokoklara göre penisiline 10 ile 100 kat daha dirençliyken, E. faecium daha az direnç gösterir (Garrido vd. 2014). Ampisilin direnci E. faecium suşlarının % 85 90 nında, E. faecalis suşlarının ise % 2-3 ünde görülmektedir (Akçimen 2010, Garrido vd. 2014). 2.4.2 Glikopeptit direnci Sadece G (+) bakterilere etkili olan glikopeptitler grubunda klinik tedavide sık sık kullanılan vankomisin ve teikoplanin antibiyotikleri yer almaktadır (Cookson vd. 2006). Gr (-) bakterilerin lipit membranından penetre olamadıkları için, bu grup üzerinde etkili değildir. Glikopeptitler, hücre yüzeyindeki peptidoglikan öncülerinin peptidil-d-alanil- D-alanin ucu ile kompleks oluşturarak hücre duvarı sentezini inhibe eder. Plazmit ve transpozonların transferi, kromozomal değişim veya mutasyon gibi sistemlerle enterokoklar, β-laktamlar ve aminoglikozitlerin yanı sıra vankomisin ile teikoplanin gibi glikopeptitlerin yüksek konsantrasyonlarına da direnç kazanırlar. Vankomisin antibiyotiği enterokokkal enfeksiyonların tedavisinde en son durumda başvurulan çok kuvvetli bir antibiyotik olduğu için, vankomisin direnci önem taşımaktadır (Çetinkaya vd. 2013). Günümüze kadar Enterococcus türlerinde glikopeptit direnci ile ilgili olarak vana, vanb, vanc, vand, vane, vang, vanl, vanm and vann olmak üzere toplam 9 gen tanımlanmıştır (Miller vd. 2014). Önceleri fenotipik olarak, MİK (Minimal İnhibitör 23

Konsantrasyonu) değerlerine göre sınıflandırma yapılırken günümüzde ise spesifik ligaz genlerinin varlığına göre sınıflandırılmaktadır (Garrido vd. 2014). VanA, VanB, VanD ve VanM tipi dirençte D-ala-D-ala-Laktat; VanC, VanE, VanG, VanL ve VanN tipi dirençte ise D-ala-D-ala-serin sentezlenmektedir (Miller vd. 2014). Enterokoklardaki en iyi tanımlanmış direnç mekanizması VanA tipidir (Perez-Hernandez vd. 2002). İnsan, hayvan ve yiyeceklerden izole edilen pek çok enterokok izolatında, VanA direncinin Tn1546 üzerinde bulunduğu belirlenmiştir. VanB direncinin transferi Tn1546 ve Tn5382 transpozonlarının konjugal aktarımı sayesinde ortaya çıkar (Zadeh vd. 2015). Vankomisin genleri sıklıkla plazmitler ya da transpozanlar üzerinde bulunurlar. En sık görülen direnç tipleri olan VanA ve VanB dirençlerinin her ikisi de çoğunlukla kromozom üzerinde bulunmasına rağmen plazmit üzerinde de taşınabilir. VanC direnci kromozom üzerinde yer almaktadır. Bu direnç tipi E. gallinarum, E. casseliflavus ve E. flavescens suşları için özeldir (Akçimen 2010, Yüksel 2012, Garrido vd. 2014). Vankomisin dirençli enterokok suşları (Vancomycin Resistant Enterococci-VRE) ilk kez 1986 yılında Avrupa da ve 1987 yılında da Amerika da izole edilmiştir (Seong vd. 2004, Çetinkaya vd. 2013). Glikopeptit grubu antibiyotiklerden olan avoparcin in hayvan yetiştiriciliğinde özellikle de tavukçuluk sektöründe kullanılmaya başlanmasından itibaren, VRE lerin yayılımı hızla artmıştır. Avoparcin kullanımının Avrupa da 1997 yılında yasaklanmasıyla birlikte, VRE prevalansında hızlı bir düşüş gözlemlenmiştir (Barbosa vd. 2009). İlk vankomisin dirençliliği E. faecium suşlarında 1988 yılında Uttley vd. tarafından bildirilmiştir (Iosifidis vd. 2013). Ülkemizde ise 1998 yılında Antalya da ilk tanımlama yapılmıştır (Başustaoğlu ve Özyurt 2000, Başustaoğlu 2004). 2.4.3 Makrolit ve Linkozamit direnci Enterokoklar karakteristik olarak linkozamit ve klindamisine düşük düzeyde intrensek direnç gösterir. Ayrıca enterokoklarda sıklıkla eritromisinlere ya da diğer makrolit antibiyotiklere de dirençlilik görülmüştür. En yaygın tespit edilen makrolit direnç genleri erm genleridir. Enterokoklarda eritromisin direnci ile ilişkili olan ve ribozomal RNA nın metilasyonundan sorumlu tutulan erm(b) geni, çoğunlukla enterokokkal transpozon Tn917 üzerinde bulunur. Ancak plazmit ve kromozomal lokasyonlu olanları 24

da belirlenmiştir. Aynı mekanizma, klindamisine yüksek düzeyde dirençten de sorumludur. İnsanlarda görülen hastalıkların tedavisinde sıklıkla kullanılan makrolit grubu antibiyotiklerden olan eritromisinler, penisiline karşı alerjik etkilerin bulunduğu durumlarda tedavi için penisilinlerin yerine seçilebilecek alternatif antibiyotiklerdendir. Makrolitlere direnç horizontal gen transferi veya hareketli DNA elementleri ile yayılabilir. Makrolitlere direnç; nokta mutasyonlarıyla hedefin modifikasyonu, protein sentezinin engellenmesiyle sonuçlanan makrolitlerin bağlanmasını inhibe eden 23S rrna metilasyonu, makrolitlerde lakton halkasının hidrolizi, antibiyotiğin bakteriden efluks pompalarıyla uzaklaştırılması gibi farklı yollarla gerçekleşebilir (Yüksel 2012, Garrido vd. 2014, Gültekin 2014). 2.4.4 Tetrasiklin direnci Enterokoklarda konjugasyon yolu ile kazanılan direncin en tipik örneği tetrasiklin direncidir (Frazzon vd. 2010). Klinik kaynaklar ve hayvanlardan izole edilen enterokolarda sıklıkla görülen tetrasiklin direnci ribozomun 30S alt ünitesine bağlanarak, aminoaçil-trna yı bloke ederek protein sentezini inhibe eder. Enterokoklar arasında oldukça yaygın olarak görülen tetrasiklin direncinden sorumlu iki ana grup gen bulunmaktadır. İlk grup tet(m), tet(q) ve tet(s) genlerini içerir. İkinci grup ise tet(k) ve tet(l) genlerinden oluşan ve tetrasiklinin hücre dışına atılmasını sağlayan enerji bağımlı efluks sistemidir. Enterokoklarda en yaygın olarak bulunan tetrasiklin direnç geni tet(m) geni olup, genellikle konjugatif transpozon Tn916-1545 üzerinde taşınmaktadır (Bulajic vd. 2015). Diğer bir sorumlu gen olan tet(u) nun mekanizması ise tam olarak bilinmemektedir (Yüksel 2012, Garrido vd. 2014, Miller vd. 2014). 2.4.5 Aminoglikozit direnci Enterokoklar aminoglikozitlere intrensek olarak düşük düzeyde direnç gösterirler. Yüksek seviyede direnç aminoglikozit modifiye edici genlerin kazanımı ile gerçekleşir. Bu direnç tipi en sık gözlenen mekanizma olup plazmit, transpozon veya kromozom üzerindeki genler tarafından kodlanan aminoglikozit modifiye edici enzimler ile 25

gerçekleştirilmektedir. Enterokoklarda aminoglikozit direnci 3 mekanizma ile gerçekleşir. Bütün enterokoklar düşük hücresel geçirgenliği sayesinde orta düzeyde doğal direnç gösterir. Yüksek düzey antibiyotik direnci 30S ribozomal alt birimine ait proteinlerin sentezinin etkilediği mutasyonlar nedeniyle görülür. Üçüncü mekanizma ise 16S rrna modifikasyonu ile oluşan dirençtir. Yüksek düzey direnç antibiyotik moleküllerini inaktive edebilen enzim üretimi ile sağlanır. Genel olarak yüksek düzey aminoglikozit direnci fosfotransferaz (APHs), asetiltransferaz (AACs) ve nükleotidiltransferaz (ANTs) gibi aminoglikozit modifiye enzimler aracılığıyla olur. Enterokoklarda yüksek düzey aminglikozit direncinin çıkışı streptomisin ile ilgilidir (Garrido vd. 2014). Enterokoklar gentamisin ve streptomisine karşı farklı şekillerde direnç gösterdiğinden, antibiyotik direnç testlerinde iki antibiyotiğin de incelenmesi önem taşımaktadır. Streptomisin dışındaki aminoglikozitlere karşı yüksek düzey dirençten genelde bifonksiyonel enzim olan ve gentamisin, tobramisin, netilmisin, amikasin ile kanamisine direnç oluşumunu sağlayan 6'Asetil transferaz- 2"fosfotransferaz -AAC(6')-APH(2")- enzimi sorumludur. Gentamisin direnci, streptomisin hariç diğer aminoglikozitlere olan direncin iyi bir göstergesidir. Ribozomal mutasyonlar veya adenil transferaz sentezlenmesi sonucu oluşan streptomisin dirençli suşlar gentamisine duyarlı davranmaktadır (Akçimen 2010, Yüksel 2012, Garrido vd. 2014, Miller vd. 2014). 2.4.6 Rifampisin direnci Enterokok infeksiyonlarında çok kullanılmamasına rağmen, rifampisin direnci enterokoklarda sık görülür. Rifampisin antibiyotiği, DNA nın beta alt ünitelerini bağlayarak mrna transkripsiyonunu engeller. Rifampisin direncinin diğer bakteriyel infeksiyonların tedavisi sırasında komensal mikrofloranın bu antibiyotiğe maruz kalmasından dolayı ortaya çıktığı düşünülmektedir (Garrido vd. 2014, Miller vd. 2014). 26

2.4.7 Oksazolidinon direnci Bu grubun temsilcisi olan linezolit, Gr (+) bakterilere karşı yüksek antimikrobiyel aktivite gösterir. Linezolit vankomisin, ampisilin, florokinolon, kloromfenikol, rifampin ve makrolitler gibi diğer antibiyotiklerle birlikte çoklu antibiyotik direnci gösterebilmektedir. Çoklu antibiyotik direnci gösteren enterokokların oluşturduğu enfeksiyonlarda, oksazolidinon grubu antibiyotik olan linezolit iyi bir alternatif olarak kullanılmaktadır (Garrido vd. 2014, Miller vd. 2014). 2.4.8 Kinolon direnci Kinolonlar enterokoklara karşı ılımlı düzeyde direnç gösterir. Ancak çeşitli mekanizmalarla yüksek düzeyde direnç kazanabilir. Ribozomlarda antibiyotik bağlayıcı olarak önemli yer tutan linezolit direncinin genel mekanizması 23S rrna da kodlanan genlerdeki mutasyonlardır. gyra (giraz) ve parc (topoizomeraz) genlerindeki mutasyonlara bağlı olarak gelişen kinolon direnci enterokok suşlarının çoğunda orta seviyede görülür (Li 2005, Akçimen 2010, Miller vd. 2014) 27

3.MATERYAL VE YÖNTEM 3.1 Materyal 3.1.1 Gıda örnekleri Ankara daki çeşitli market, kasap ve pazarlarda satışa sunulan ve geleneksel olarak üretilen fermente gıdalar ile fermente olmayan gıdalar izolasyon materyali olarak kullanılmıştır. Tek kullanımlık steril örnekleme kaplarına alınan gıda örnekleri, soğuk zincir korunarak Ankara Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü Gıda Mikrobiyolojisi Laboratuvarına ulaştırılmış ve herhangi bir depolama işlemi uygulanmaksızın aynı gün içinde enterokok suşlarının izolasyon çalışmalarına başlanmıştır. 3.1.2 Referans bakteriler Tez çalışmasında kontrol amaçlı olarak kullanılmış olan Enterococcus faecalis ATCC 29212, Escherichia coli LMG 3083 (ETEC) ve Staphylococcus aureus ATCC 6538 referans suşları Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Prokaryot Genetiği Laboratuvarı kültür koleksiyonundan temin edilmiştir. 3.1.3 Besiyerleri Tez çalışması kapsamında kullanılan besiyerleri ve ürün kodları çizelge 3.1 de yer almaktadır. Çizelge 3.2 de ise moleküler çalışmalar sırasında kullanılan besiyerleri, çözeltiler ve ürün kodları belirtilmiştir. 28

Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan besiyerleri ve ürün kodları BESİYERİ ADI KODU FİRMA Agar 05039-500G SIGMA-ALDRICH API 20 Strep 1004460640 BIOMERIEUX Bile Eskulin Azide Agar 1.00072.0500 MERCK Brain Heart Infusion (BHI)Broth 1.10493.0500 MERCK Etanol 1.00983.2511 MERCK Gliserol 1.04092.2500 MERCK Hidrojen Peroksit (H2O2) ( 30%) 1.08597.2500 MERCK Kanamisin Eskulin Azide Agar (KAA) 1.05222.0500 MERCK Gram-Boyama Seti 1.11885.0001 MERCK Ringer Tableti 1.15525.0001 MERCK Sodyum Klorür (NaCL) 1.06404.1000 MERCK Sodyum Hidroksit (NaOH) 1.06462.1000 MERCK Triptik Soy Agar (TSA) 1.05458.0500 MERCK Triptik Soy Broth (TSB) 1.05459.0500 MERCK 29

Çizelge 3.2 Moleküler çalışmalarda kullanılan besiyerleri, çözeltiler ve ürün kodları BESİYERİ ADI KODU FİRMA 10*Taq Buffer (KCl ve 15 mm MgCl2 ile birlikte) 00328812 THERMO SCIENTIFIC 25mM MgCl2 00335508 THERMO SCIENTIFIC 6*DNA Loading Dye 00353892 THERMO SCIENTIFIC Agaroz A9539-100G SIGMA-ALDRICH Kloroform 1.02445.2500 MERCK dntp (100 mm) 00359866 THERMO SCIENTIFIC Etidyum Bromit E7637-1G SIGMA-ALDRICH Etilendiaamintetraasetik asit (EDTA) E5134-500G SIGMA-ALDRICH Fenol (sıvı) pure grade TK.201120.02500 TEKKİM Gene Ruler 1kb DNA Ladder 00350148 THERMO SCIENTIFIC GeneJET PCR Purifikasyon Kiti 00221296 THERMO SCIENTIFIC Izoamil Alkol 1.00979.2500 MERCK Primer (Forward) (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) Primer (Reverse) (CCGTCAATTCCTTTGAGTTT) 20160609-15 Ongen 20160609-16 Ongen RNaz A 00304866 THERMO SCIENTIFIC Sodyumdodesil Sülfat (SDS) 8.17034.1000 MERCK Sukroz 1.07651.1000 MERCK Taq DNA Polimeraz 00346217 THERMO SCIENTIFIC Tris (hidroksimetil aminometan) 1.08382.0500 MERCK Tris-Hidroklorür T5941-500G SIGMA 30

3.1.4 Antibiyotikler Tez çalışmasında antibiyotik duyarlılık deneylerinde ticari olarak temin edilen antibiyotik diskleri (BIOANALYSE) kullanılmıştır. Enterococcus faecalis ATCC 29212 standart suşu, antibiyotik duyarlılık deneylerinde kontrol suşu olarak kullanılmıştır. Araştırmada kullanılan antibiyotiklerin sembol, grup ve disk konsantrasyonları çizelge 3.3 de belirtilmiştir. Çizelge 3.3 Çalışmada kullanılan antibiyotikler ANTİBİYOTİK SEMBOL GRUBU KATALOG NUMARASI DİSK KONSANTRASYONU (µg) Penisilin G P Βeta laktam ASD07400 10 µg Ampisilin AM Βeta laktam ASD00200 10 µg Vankomisin VA Glikopeptit ASD09400 30 µg Eritromisin E Makrolit ASD03700 15 µg Tetrasiklin TE Tetrasiklin ASD08900 30 µg Kloramfenikol C Fenikol ASD02800 30µg Gentamisin CN Aminoglikozit ASD04310 120 µg Kanamisin K Aminoglikozit ASD04700 30 µg Streptomisin S Aminoglikozit ASD08410 300 µg Nalidiksik asid NA Kinolon ASD06000 30 µg Rifampin RA Ansamisin ASD07800 5 µg Siprofloksasin CIP Florokinolon ASD03000 5µg 31

3.1.5 Bakterilerin stok kültürlerinin hazırlanması Hem referans bakterilerinin hemde tez çalışması kapsamında çeşitli gıdalardan izole edilen enterokok izolatlarının, % 20 gliserol içeren Brain Heart Infusıon (BHI) Broth stok kültürleri hazırlanmıştır. Stok kültür ortamları 20 C de muhafaza edilmiştir. Tez çalışması süresince kültürler BHI broth ortamında ve/veya Triptik Soy Broth (TSB) ortamında 37 C de 18 h geliştirildikten sonra denemeye alınmıştır. 3.2 Yöntem 3.2.1 Gıda örneklerinin analize hazırlanması ve enterokokların izolasyonu Gıda örnekleri, aseptik koşullara dikkat edilerek laboratuvar ortamına getirilmiştir. Örnekler depolanmadan aynı gün içinde enterokok suşlarının izolasyonu amacıyla analize alınmıştır. Steril kaplarda net ağırlıkları 10 g olacak şekilde tartılan gıda örnekleri 90 ml seyreltme sıvısı ile homojenize edilmiştir. Seyreltme sıvısı olarak, peynir örnekleri için 1/4 kuvvetinde ringer çözeltisi, diğer gıda örnekleri için ise steril fizyolojik su (% 0,85 lik NaCL çözeltisi) kullanılmıştır. Seyreltme sıvısı ile homojenize edilen örnekler tam homojenizasyonun sağlanması amacıyla oda sıcaklığında 10 dk inkübe edildikten sonra, 10-5 düzeyine kadar seri dilüsyonları hazırlanmıştır. Her bir dilüsyondan 100 µl alınarak, paralelli olacak şekilde Kanamisin Eskulin Azide Agar (KAA) besiyerine yayma kültürel ekimler yapılmıştır. 37 C de 18-48 h süreyle inkübasyona bırakılan petrilerde, zeytin yeşili/siyah arası renk veren koloniler muhtemel enterokok olarak değerlendirilmiştir. İzolatların saflaştırılması amacıyla, tipik koloni morfolojisine sahip olan koloniler steril kürdan yardımıyla Triptik Soy Agara (TSA) nokta ekim yöntemi ile tekrar aktarılmış ve 37 C de 24 h inkübasyona bırakılmıştır. 32

3.2.2 Antimikrobiyel aktiviteye sahip muhtemel enterokok izolatlarının belirlenmesi TSA üzerinde gelişen koloniler steril kürdan yardımıyla alınıp nokta ekim yöntemi ile BHI Agar ortamına inoküle edilmiş ve 37 C de 24 h inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda gelişen kolonilerin üzerine % 1 tür içi indikatör suş (Enterococcus faecalis ATCC 29212) içeren BHI yumuşak agar (% 0,7 agar oranı) ortamı dökülerek, 37 C de 24 h inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonrası indikatör suşa karşı zon oluşturan koloniler steril öze yardımıyla alınarak, BHI broth ortamına aktarılmıştır (Todorov vd. 1999, Harwood vd. 2004). İnhibisyon zonu oluşturan muhtemel enterokok izolatlarına EP kodu, oluşturmayanlara ise rakamlarla kod verilmiştir. Tez çalışmasının bundan sonraki kısmında ise, antimikrobiyel aktiviteye sahip izolatlara morfolojik ve biyokimyasal testler uygulanmıştır. 3.2.3 Morfolojik ve biyokimyasal testler 3.2.3.1 Gram boyama Gram boyama işlemi Temiz (2000) tarafından önerilen yönteme göre yapılmıştır. Tek ya da kısa zincirler halinde kok ya da kokobasil morfolojisine sahip gram pozitif izolatlar, tez kapsamındaki diğer çalışmalarda kullanılmak üzere % 20 steril gliserol içeren BHI broth ortamlarında mikrosantrifüj tüplerine alınarak -20 C de muhafaza edilmiştir. 3.2.3.2 Katalaz testi TSA besiyerinde 37 C de 24 h inkübe edilerek gelişimi sağlanan kolonilerden, temiz bir lam üzerine tek bir koloni aktarılmıştır. Koloni üzerine % 3 lük hidrojen peroksit (H2O2) çözeltisi damlatılarak gaz çıkışı olup olmadığı kontrol edilmiştir. Kabarcıkların görülmesi halinde test pozitif olarak değerlendirilmiştir (Temiz 2000). Staphylococcus 33

aureus ATCC 6538 kontrol suşu, katalaz testlerinde pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. 3.2.3.3 Eskulin hidrolizi Muhtemel enterokok izolatlarından Bile Eskulin Azide Agar besiyeri üzerine sürme ekimler yapılmıştır. 37 C de 24 h inkübe edilerek, besiyerinde siyah pigment oluşumu (Şekil 3.1) eskulin hidrolizi testinin pozitif olduğunu göstermiştir (Navidghasemizad vd. 2009). Enterococcus faecalis ATCC 29212 kontrol suşu, eskulin hidrolizi testlerinde pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Şekil 3.1 Enterokok izolatlarının Bile Eskulin Azide Agar besiyerinde gelişimi 3.2.3.4 ph 9,6 da gelişme Muhtemel enterokok izolatlarının ph 9,6 da gelişim düzeyini saptamak amacıyla, ph sı 9,6 ya ayarlanmış olan BHI broth besiyeri kullanılmıştır. % 1 oranında inokülasyonu yapılan kültürlerin, 37 C de 24-48 h inkübasyon sonunda gelişimleri incelenmiştir (Manero ve Blanch 1999). Enterococcus faecalis ATCC 29212 kontrol suşu, ph 9,6 da 34

gelişme testlerinde pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Sıvı besiyerinde bulanıklığın gözlenmesi, pozitif sonuç olarak değerlendirilmiştir (Şekil 3.2). 3.2.3.5 Tuz toleransının belirlenmesi Muhtemel enterokok izolatlarının tuz toleransının belirlenmesi amacıyla, % 6,5 NaCL içeren BHI broth besiyeri kullanılmıştır. % 1 oranında inokülasyonu yapılan kültürlerin, 37 C de 24-48 h inkübasyon sonunda gelişimleri incelenmiştir (Facklam vd. 2002). Enterococcus faecalis ATCC 29212 kontrol suşu, tuz toleransının belirlenmesi testlerinde pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Sıvı besiyerinde bulanıklığın gözlenmesi, pozitif sonuç olarak değerlendirilmiştir (Şekil 3.2). 3.2.3.6 Sıcaklık toleranslarının belirlenmesi Muhtemel enterokok izolatlarının sıcaklık toleranslarının belirlenmesi amacıyla, BHI broth ortamına % 1 oranında inoküle edilmiş kültürlerin 10 C ve 45 C de 24-48 h inkübasyon sonunda gelişme özellikleri incelenmiştir (Facklam vd. 2002, Harwood vd. 2004). Enterococcus faecalis ATCC 29212 kontrol suşu, sıcaklık toleranslarının belirlenmesi testlerinde pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Sıvı besiyerinde bulanıklığın gözlenmesi, pozitif sonuç olarak değerlendirilmiştir (Şekil 3.2). 35

Şekil 3.2 Muhtemel enterokok izolatlarının broth ortamda gelişmesi 3.2.3.7 Hemoliz testi Muhtemel enterokok izolatlarının hemolizin aktivitesinin belirlenmesinde Valenzuela vd. (2009) tarafından önerilen yöntem kullanılmıştır. İzolatlardan % 5 (w/v) koyun kanı içeren TSA besiyerine çizgi ekim şeklinde sürme işlemi uygulanmıştır. Kanlı agar ortamları 37 C de 24-48 h tutulmuş ve gelişen koloniler etrafındaki zonlar incelenmiştir. Kolonilerin etrafında kenarları keskin hatlı olmayan, bulanık ve yeşilimsi bir zon oluşumu α-hemolitik, düzgün bir hatla çevrilmiş temiz ve berrak bir zon oluşumu ise β-hemolitik olarak tanımlanmıştır. Kanlı agar üzerinde hemoliz oluşturmayan izolatlar ise γ-hemolitik olarak belirlenmiştir (Şekil 3.3-3.5). Çalışmada kontrol bakterileri olarak Escherichia coli LMG 3083 (ETEC) ve Staphylococcus aureus ATCC 6538 kullanılmıştır. 36

Şekil 3.3 Enterokoklarda β-hemolitik yapı Şekil 3.4 Enterokoklarda α-hemolitik yapı 37

Şekil 3.5 Enterokoklarda γ-hemolitik yapı 3.2.3.8 API testi 3.2.3.1, 3.2.3.2, 3.2.3.3, 3.2.3.4, 3.2.3.5 ve 3.2.3.6 bölümlerinde belirtilen testlerde enterokoklar için tipik reaksiyon veren izolatlar arasından, 100 adet tür içi indikatör suşa karşı en yüksek inhibisyon zonu oluşturan Enterococcus spp. seçilmiş ve tez çalışmasının bundan sonraki kısmı, seçilen bu 100 adet enterokok izolatı üzerinden yürütülmüştür. Enterokok izolatlarının API 20 Strep (Biomerieux) biyokimyasal test kitleri ile tür düzeyinde tanımlanması yapılmıştır (Şekil 3.6). API sistemindeki biyokimyasal testler, inkübasyon süresi sonunda kuyucuklarda gözlemlenen renk değişimlerine göre pozitif (+), negatif (-) veya şüpheli (?) olarak kaydedilmiştir. Sonuçlar Apiweb Identification Software Database (V8.1) kullanılarak izolatların tür düzeyinde tanımlanması yapılmıştır (Biomerieux 2004). 38

Şekil 3.6 Enterokok izolatlarının API 20 Strep biyokimyasal test kitleri ile tür düzeyinde tanımlanması (Biomerieux 2004) 39

3.2.4 Enterococcus suşlarının 16S rdna dizi analizi ile tür düzeyinde moleküler tanısı 3.2.4.1 Toplam genomik DNA izolasyonu TSB besiyerinde 37 C de 18 h süreyle geliştirilen enterokok kültürlerinin ve şahit suşun (Enterococcus faecalis ATCC 29212) genomik DNA izolasyonu, Miteva vd. (1991) ve Cancilla vd. (1992) tarafından önerilen yöntemlerde bazı modifikasyonlar yapılarak uygulanmıştır. 37 C de 18 h inkübe edilerek geliştirilen Enterococcus kültürleri, 10 ml lik steril santrifüj tüplerine aktarılmıştır. 6000 devirde 15 dk santrifüj işlemi uygulandıktan sonra supernetant kısmı dökülmüştür. Hücre çökeltisi 500 µl Tris- EDTA (TE) tampon içerisinde çözülerek, 12000 devirde 1 dk oda sıcaklığında santrifüj edilmiştir. Santrüfüj işleminden sonra, süpernetant dökülmüş ve oluşan hücre çökeltisi üzerine 500 µl Sakkaroz-EDTA-Tris HCl (SET) tampon aktarılmıştır. Hücre çökeltisi tampon içinde tamamen çözündürüldükten sonra üzerine 30 µl lizozim eklenmiş ve 37 C de 45 dk inkübe edilmiştir. 45 dk lık inkübasyon sonrasında, santrifüj tüplerindeki hacmin yarısı steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarılmıştır. Bu içerik üzerine 200 µl TE tampon ve 30 µl % 20 lik taze hazırlanmış sodyum dodesil sülfat (SDS) çözeltisi ilave edilerek, birkaç kez elde çevrilerek ortam içeriğinin karışması sağlanmıştır. 5 M NaCL çözeltisinden 100 µl, bu karışım üzerine aktarılmış ve ortam içeriğinin karışması için yeniden elde çevirme işlemi uygulanmıştır. Daha sonra ortama eşit hacimde (~500 µl) % 3 tuza doyurulmuş fenol çözeltisinden eklenmiş ve emülsiyon oluşuncaya kadar elde çevrilerek karıştırılmıştır. Ortam +4 C de 12000 devirde 15 dk santrifüj edilerek fazların ayrılması sağlanmıştır. Santrifüj işleminden sonra oluşan üst faz mikropipet yardımıyla alınarak steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarılmıştır. Mikrosantrifüj tüplerine aktarılan üst faz miktarı kadar (~500 µl) kloroform-izoamil alkol çözeltisi (24/1) eklendikten sonra elde hafif karıştırma işlemi uygulanmış ve sonrasında oda sıcaklığında 12000 devirde 15 dk santrifüj edilmiştir. Santrifüj işlemi berrak iki faz oluşuncaya kadar tekrar edilmiştir. Santrifüj sonunda berrak üst faz mikropipetlerle alınarak steril yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarılmış ve üzerine aktarılan hacmin 2 katı kadar % 100 lük etil alkol ilave edilmiştir. Bu karışım +4 C de 12000 devirde 15 dk santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonunda üst kısımdaki etil alkol dökülerek DNA pelet 40

halinde elde edilmiştir. Oluşan çökelti 37 C de 30 dk kurutulduktan sonra, 75 µl TE tampon çözeltisinde çözündürülmüştür. Bu karışım üzerine daha sonra 10 mg/ml konsantrasyonundaki RNaz A enziminden 2 µl eklenmiş ve 37 C de tekrar 45 dk inkübasyon uygulanmıştır. 45 dk inkübasyon sonrasında elde edilen DNA saflığı spektrofotometrede A260/A280 oranına bakılmak suretiyle ölçülmüştür. Elde edilen DNA peletleri 20 C de kullanılana kadar muhafaza edilmiştir. Tris(hydroksimetil)aminometan / Etilen Diamin Tetra Asetik Asit (Tris-EDTA) Tris 1,21 g EDTA 0,37 g Destile su 1000 ml ph 7,4 ± 0,02 (Çözelti ph sı, 2 N HCL kullanılarak ayarlanmıştır. 121 C de 15 dk sterilizasyon işlemi uygulanmıştır.) Sakkaroz-EDTA-Tris HCl (SET) Tris-HCL 0,788 g EDTA 1,86 g Sakkaroz 20 g Destile su 100 ml ph 8,0 ± 0,02 (Çözelti ph sı, 2 N HCL kullanılarak ayarlanmıştır. 121 C de 15 dk sterilizasyon işlemi uygulanmıştır.) % 20 lik Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) Çözeltisi SDS 20 g Steril damıtık su 100 ml Kloroform- İzoamil Alkol (24/1) Çözeltisi Kloroform 24 ml İzoamil Alkol 1 ml 41

3.2.4.2 Toplam genomik DNA örneklerinin elektroforezi % 1 agaroz oranı ile hazırlanan jellerde genomik DNA örneklerinin elektroforez işlemi gerçekleştirilmiştir. Elektroforez işlemi için yatay jel sistemleri kullanılmıştır. % 1 lik oranda tartılan agaroz, Tris-Asetat elektroforez tamponu içerisinde çözündürülmüş ve bu işlem için mikrodalga fırın kullanılmıştır. Hazırlanan ortam 45-50 C ye kadar soğutulmuş ve elektroforez plakasına dökülmüştür. Jel tarakları yerleştirilerek, jelin polimerizasyonu için 40-45 dk beklenilmiştir. Bu süre sonunda jelin üzerini tamamen kapatacak şekilde elektroforez tankına Tris-Asetat tampon çözeltisi ilave edilerek, jel tarakları jele zarar vermeden çıkarılmıştır. 15 µl genomik DNA örneği, 2 µl marker boya çözeltisi ile karıştırılmıştır. Mikropipetler yardımıyla örneğin tamamı jel kuyucuğuna aktarılarak, elektroforez işlemi 80 V elektrik akımı altında 1,5-2 h süreyle yapılmıştır. Marker boyanın jel sistemlerini terk etmesinden sonra, elektrik akımı kesilmiştir. Daha sonra ortamdan alınan jel, Tris-Asetat elektroforez tamponunun taze hazırlanmış 0,2 µg/ml etidyum bromit içeren çözeltisinde 1-1,5 h süreyle boyanmıştır (Macrina vd. 1982). Jeller 366 nm dalga boyunda UV ışık altında translüminatör kullanılarak incelenmiştir. Jel fotoğraflarının çekiminde jel görüntüleme sistemi (Kodak Gel Logic 200 Imaging System) kullanılmıştır. Tris-Asetat Tamponu (1X) Tris Sodyum Asetat EDTA Destile Su 4,84 g 4,08 g 0,37 g 1000 ml ph 8,0 ±0,02 Marker Boya Brom Fenol Blue Sakkaroz Destile su 0,25 g 40 g 100 ml 42

3.2.4.3 Enterokok suşlarının 16S rdna bölgesinin polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılması Enterococcus suşlarında 16S rdna bölgesinin polimeraz zincir amplifikasyonu (PZR) için Techne TC-512 Thermal Cycler (England) cihazı kullanılmıştır. PZR denemelerinde çizelge 3.4 de verilen PZR karışımı kullanılmıştır. 200 µl lik PZR tüplerine toplam hacim 50 µl olacak şekilde PZR karışımı eklenmiştir. Tüm bileşenler PZR tüpünde iyice karıştırıldıktan sonra, termal döngü cihazına yerleştirilmiştir. PZR denemelerinde; 95 C de 2 dk başlangıç denatürasyonu (1 döngü), 95 C de 45 sn çift zincirin açılması (35 döngü), 55 C de 45 sn primerlerin bağlanması (35 döngü), 72 C de 2 dk zincir uzaması (35 döngü) ve 72 C de 7 dk son uzama (1 döngü) şeklinde tanımlanan PZR protokolü uygulanmıştır (Blaiotta vd. 2002). Enterococcus suşlarında genomik DNA üzerindeki 16S rdna bölgeleri Beasley ve Saris (2004) tarafından önerilen 16S ileri (5'-CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT -3') ve 16S geri (3'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -5') üniversal primerleri kullanılmıştır. PZR ürünlerinin temizlenmesi için PZR saflaştırma kitinden yararlanılmıştır. Pürifiye edilmiş 16S rdna PZR fragmentlerinden 5 µl alınarak 2 µl 6X yükleme boyası ile karıştırılmış ve % 1 oranında agaroz içeren jelde 100 V elektrik akımı altında koşturulmuştur. Fragmentlerin büyüklüklerinin belirlenmesi amacıyla 1 kb DNA marker den yararlanılmıştır. Elektroforez sonrası jeller 0,2 µg/ml etidyum bromit çözeltisinde 20 dk süreyle boyanmış ve 366 nm dalga boyunda UV ışık altında translüminatör kullanılarak görüntülenmiştir. Jel fotoğraflarının çekiminde jel görüntüleme sistemi (Kodak Gel Logic 200 Imaging System) kullanılmıştır. PZR ürünlerinin çift yönlü DNA dizi analizi için hizmet alımı (Atlas Biyoteknoloji/Ankara) yapılmıştır. Dizi analiz sonuçları Basic Local Alingment Search Tool (BLAST) programı kullanılarak National Center for Biotechnology Information (NCBI) veri tabanında bulunan 16S rdna dizileriyle benzerliğini karşılaştırılmış ve aranan dizi sırasının hangi mikroorganizmaya ait olabileceği benzerlik yüzdesiyle belirlenmiştir. 43

Çizelge 3.4 Polimeraz zincir reaksiyonunda kullanılan karışım Madde Adı Moleküler steril su Miktarı 34,75µL PZR tamponu 5µL dntp (2 mm) 1 µl 16S ileri primer 1µL 16S geri primer 1 µl MgCl2 (25 mm) 4µL Taq DNA polimeraz enzimi (5u/mL) 0,25 µl Genomik DNA 3µL TOPLAM HACİM 50 µl 3.2.5 Enterococcus suşlarının antibiyotik duyarlılıklarının saptanması Enterokok suşlarının antibiyotik dirençlilik / duyarlılıklarının belirlenmesinde Bauer vd. (1966) tarafından önerilen antibiyotik disk difüzyon yöntemi modifiye edilerek kullanılmıştır. Enterococcus suşları BHI agar besiyerine ekilip, 37 C de 18 h inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyondan sonra kültür süspansiyonunun yoğunluğu 0,5 McFarland (1x10 6 kob/ml) standardına uygun bulanıklıkta olacak şekilde ayarlanmıştır. 90 ml lik BHI Agar ortamları dökme sıcaklığına ulaşınca (45 C) oda sıcaklığında soğumaya bırakılmış ve daha sonra bu ortama hücre yoğunluğu ayarlanmış kültür içeren 10 ml lik BHI broth inoküle edilmiştir. Ortamın homojen bir şekilde karışması sağlanmış ve hazırlanan bu ortam eşit miktarlarda 5 ayrı steril cam petri kabına dağıtılmıştır. Agar katılaştıktan sonra her plağa 4 adet antibiyotik diski yerleştirilmiş ve 37 C de 18-24 h süreyle inkübasyona bırakılmıştır. Disk difüzyonu için, 12 farklı antibiyotik kullanılmıştır. Kullanılan ticari antibiyotik diskler ve konsantrasyonları çizelge 3.3 te belirtilmiştir. İnkübasyon süresinin sonunda antibiyotik disklerinin etrafında oluşan inhibisyon zon çapları milimetrik olarak ölçülmüştür. Antibiyotik duyarlılık deneylerinde standart suş Enterococcus faecalis ATCC 29212 kullanılmıştır. 44

Elde edilen zon çapları Klinik Laboratuvar Standarları Enstitüsü nün belirlediği (Clinical Laboratory Standards Institute) (CLSI 2011) zon çaplarıyla karşılaştırılmıştır. Enterococcus suşlarının antibiyotiklere duyarlı, az hassas ve dirençli olarak değerlendirilmesi yapılmıştır (Hombach vd. 2013). Çalışmamızda kullanılan antibiyotik disklerine ait duyarlılık sınırları çizelge 3.5 te gösterilmiştir. Çizelge 3.5 Enterococcus türleri için antibiyotik duyarlılık sınırları (CLSI 2011) ANTİBİYOTİKLER ZON ÇAPI (mm) Duyarlı Az Hassas Dirençli Penisilin G (P) 15-14 Ampisilin (AM) 17-16 Vankomisin (VA) 17 15-16 14 Eritromisin ( E) 23 14-22 13 Tetrasiklin (TE) 19 15-18 14 Kloramfenikol ( C) 18 13-17 12 Gentamisin (CN) 15 13-14 12 Kanamisin (K) 18 14-17 13 Streptomisin (S) 15 12-14 11 Nalidiksik asid (NA) 19 14-18 13 Rifampin (RA) 20 17-19 16 Siprofloksasin (CIP) 21 14-20 15 3.2.6 İstatistiksel analiz İstatiksel analizlerin yapılmasında SPSS 16 paket programı kullanılmıştır. Gruplar arasında fark olup olmadığını ortaya koymak için F Testi (ANOVA, Analysis of Variance) uygulanmıştır. 45

4. BULGULAR ve TARTIŞMA 4.1 Antimikrobiyel Aktiviteye Sahip Enterokokların İzolasyonu Ankara daki çeşitli market, kasap ve pazarlarda satışa sunulan ve geleneksel olarak üretilen fermente gıdalar ile fermente olmayan gıdalar izolasyon materyali olarak kullanılmış olup, toplam 503 gıda örneği araştırma kapsamına dâhil edilmiştir. İzolasyon materyali olarak kullanılan gıda örneklerinin; 7 adedini siyah zeytin, 4 adedini yeşil zeytin, 11 adedini turşu, 215 adedini peynir (93 beyaz peynir, 2 lor peyniri, 24 tulum peyniri, 3 çökelek, 17 keçi peyniri, 51 ezine peyniri, 11 örgü peynir, 14 kırık peynir), 186 adedini sucuk, 72 adedini tavuk ve 8 adedini tarhana oluşturmuştur. Araştırmada 503 farklı gıda örneğinden, 459 tanesinde enterokoklar için şüpheli koloni morfolojisi gözlemlenmiştir (Çizelge 4.1). Çalışmada 8 adet tarhana ve 4 adet yeşil zeytin örneklerinin hiçbirinde tipik zeytin yeşili/siyah arası renk veren şüpheli koloni morfolojisi gözlemlenmemiştir. Çalışma kapsamına dâhil edilen gıda örneklerinden % 91,25 inde enterokoklar için şüpheli koloni morfolojisi tespit edilmiş ve bu örneklerden tek koloniler alınmıştır. 215 adet peynir örneğinden, 213 adedinde (% 99,06) şüpheli enterokok izolatı tanımlanmıştır. Diğer gıdalarda izolasyon oranları ise; tavukta % 91,66, sucukta % 93,54, turşuda % 45,45 ve siyah zeytinde ise % 14,28 bulunmuştur (Çizelge 4.1). 46

Çizelge 4.1 Gıda örneklerinden izole edilen muhtemel enterokok izolatlarının dağılımları Gıda Örnekleri Çalışılan Örnek Sayısı İzolat Sayısı Yüzde % Siyah Zeytin 07 01 14,28 Yeşil Zeytin 04 00 0,00 Peynir Beyaz Peynir Lor Peyniri Tulum Peyniri Çökelek Keçi Peyniri Ezine Peyniri Örgü Peynir Kırık Peynir 93 02 24 03 17 51 11 14 93 02 24 03 17 49 11 14 99,06 Sucuk 186 174 93,54 Tavuk 72 66 91,66 Tarhana 08 00 0,00 Turşu 11 05 45,45 Toplam 503 459 91,25 Antimikrobiyel aktivite çalışmaları, 459 adet enterokok izolatı üzerinde yürütülmüştür. İzolatların tür içi referans suş olarak seçilen Enterococcus faecalis ATCC 29212 karşı zon oluşturup oluşturmadığı tespit edilmiştir (Şekil 4.1). İnhibisyon zonu oluşturan muhtemel enterokok izolatlarına EP kodu, oluşturmayanlara ise rakamlarla kod verilmiştir. 47

EP 17 izolatı 30 nolu izolat Şekil 4.1 Enterokok izolatlarının antimikrobiyel aktiviteleri Çalışmalar sonucunda toplam 459 izolattan 165 i, 05 41 mm arasında değişen inhibisyon zonu oluşturmuştur (Çizelge 4.2). Araştırmanın bu aşamasından sonraki morfolojik ve biyokimyasal tanımlama kısımlarına EP kodu verilen izolatlar ile devam edilmiştir. 48

Çizelge 4.2 Gıda örneklerinden izole edilen enterokok izolatları ve antimikrobiyel aktiviteleri Sıra İzolasyon Kaynağı Bakter i Kodu Zon Çapı (mm) 1 Siyah Zeytin - - 2 Turşu - - 3 Beyaz Peynir EP1 5 4 Siyah Zeytin - - 5 Siyah Zeytin - - 6 Siyah Zeytin - - 7 Beyaz Peynir EP2 20 8 Lor Peyniri EP3 20 9 Yeşil Zeytin - - 10 Tulum Peyniri EP4 7 11 Çökelek Peyniri EP5 15 12 Tulum Peyniri EP6 22 13 Tulum Peyniri 1-14 Beyaz Peynir EP7 5 15 Keçi Peyniri 2-16 Beyaz Peynir 3-17 Beyaz Peynir 4-18 Keçi Peyniri 5-19 Ezine Peyniri EP8 9 20 Ezine Peyniri 6-21 KırıkPeynir EP9 7 22 Keçi Peyniri 7-23 Beyaz Peynir 8-24 Beyaz Peynir 9-25 Lor Peyniri 10-26 Keçi Peyniri EP10 10 27 Beyaz Peynir EP11 15 28 Beyaz Peynir 11-29 Beyaz Peynir 12-30 Ezine Peyniri 13-31 Kırık Peynir 14-32 Keçi Peyniri 15-33 Örgü Peynir EP12 7 Sıra İzolasyon Kaynağı Bakter i Kodu 34 Yeşil Zeytin - Zon Çapı (mm) 35 Ezine Peyniri EP13 5 36 Keçi Peyniri EP14 5 37 Turşu EP15 5 38 Sucuk EP16 5 39 Tavuk 16-40 Ezine Peyniri 17-41 Turşu 18-42 Beyaz Peynir 19-43 Ezine Peyniri 20-44 Turşu 21-45 Turşu 22-46 Turşu 23-47 Beyaz Peynir 24-48 Beyaz Peynir 25-49 Beyaz Peynir 26-50 Beyaz Peynir 27-51 Beyaz Peynir 28-52 Beyaz Peynir 29-53 Keçi Peyniri 30-54 Kırık Peynir EP17 16 55 Tulum Peyniri 31-56 Ezine Peyniri 32-57 Beyaz Peynir 33-58 Beyaz Peynir EP18 8 59 Beyaz Peynir 34-60 Keçi Peyniri 35-61 Ezine Peyniri EP19 10 62 Beyaz Peynir 36-63 Keçi Peyniri 37-64 Beyaz Peynir 38-65 Beyaz Peynir 39-66 Beyaz Peynir 40-49

Çizelge 4.2 Gıda örneklerinden izole edilen enterokok izolatları ve antimikrobiyel aktiviteleri (devam) Sıra İzolasyon Kaynağı Bakteri Kodu Zon Çapı (mm) 67 Keçi Peyniri 41-68 Örgü Peynir 42-69 Örgü Peynir EP20 10 70 Örgü Peynir EP21 10 71 Keçi Peyniri EP22 10 72 Siyah Zeytin 43-73 Beyaz Peynir 44-74 Keçi Peyniri 45-75 Keçi Peyniri 46-76 Keçi Peyniri 47-77 Ezine Peyniri 48-78 Ezine Peyniri 49-79 Beyaz Peynir 50-80 Sucuk 51-81 Sucuk 52-82 Sucuk 53-83 Sucuk EP23 13 84 Sucuk 54-85 Sucuk EP24 12 86 Sucuk EP25 12 87 Sucuk EP26 20 88 Sucuk 55-89 Sucuk 56-90 Sucuk 57-91 Sucuk 58-92 Sucuk 59-93 Sucuk 60-94 Sucuk 61-95 Sucuk 62-96 Sucuk 63-97 Sucuk 64-98 Sucuk 65-99 Sucuk 66 - Sıra İzolasyon Kaynağı Bakteri Kodu Zon Çapı (mm) 100 Sucuk 67-101 Sucuk EP27 10 102 Sucuk 68-103 Sucuk 69-104 Sucuk 70-105 Yeşil Zeytin - - 106 Sucuk 71-107 Sucuk 72-108 Sucuk 73-109 Sucuk 74-110 Sucuk 75-111 Sucuk 76-112 Sucuk 77-113 Sucuk 78-114 Sucuk 79-115 Sucuk 80-116 Örgü Peynir 81-117 Sucuk EP28 6 118 Sucuk - - 119 Ezine Peyniri 82-120 Beyaz Peynir EP29 23 121 Beyaz Peynir 83-122 Beyaz Peynir EP30 20 123 Beyaz Peynir EP31 5 124 Ezine Peyniri EP32 35 125 Beyaz Peynir 84-126 Ezine Peyniri EP33 15 127 Ezine Peyniri 85-128 Kırık Peynir 86-129 Örgü Peynir 87-130 Örgü Peynir 88-131 Beyaz Peynir 89-132 Beyaz Peynir 90-50

Çizelge 4.2 Gıda örneklerinden izole edilen enterokok izolatları ve antimikrobiyel aktiviteleri (devam) Sıra İzolasyon Kaynağı Bakteri Kodu Zon Çapı (mm) 133 Keçi Peyniri EP34 10 134 Keçi Peyniri EP35 10 135 Beyaz Peynir 91-136 Beyaz Peynir 92-137 Keçi Peyniri EP36 5 138 Ezine Peyniri 93-139 Ezine Peyniri EP37 10 140 Ezine Peyniri EP38 10 141 Beyaz Peynir 94-142 Beyaz Peynir 95-143 Ezine Peyniri 96-144 Beyaz Peynir 97-145 Tulum Peyniri 98-146 Tulum Peyniri 99-147 Tulum Peyniri 100-148 Örgü Peynir EP39 16 149 Kırık Peynir 101-150 Kırık Peynir 102-151 Sucuk 103-152 Sucuk 104-153 Sucuk 105-154 Sucuk 106-155 Sucuk 107-156 Beyaz Peynir EP40 5 157 Beyaz Peynir 108-158 Beyaz Peynir 109-159 Beyaz Peynir EP41 20 160 Beyaz Peynir 110-161 Ezine Peyniri 111-162 Beyaz Peynir EP42 4 163 Beyaz Peynir EP43 7 164 Beyaz Peynir EP44 13 165 Tulum Peyniri 112 - Sıra İzolasyon Kaynağı Bakteri Kodu Zon Çapı (mm) 166 Kırık Peynir EP45 5 167 Ezine Peyniri EP46 15 168 Ezine Peyniri 113-169 Sucuk - - 170 Beyaz Peynir 114-171 Turşu - - 172 Beyaz Peynir 115-173 Sucuk 116-174 Sucuk 117-175 Sucuk 118-176 Sucuk 119-177 Sucuk 120-178 Sucuk 121-179 Sucuk 122-180 Sucuk 123-181 Sucuk 124-182 Sucuk 125-183 Sucuk 126-184 Sucuk 127-185 Sucuk 128-186 Sucuk 129-187 Beyaz Peynir 130-188 Sucuk 131-189 Sucuk 132-190 Sucuk 133-191 Yeşil Zeytin - - 192 Sucuk 134-193 Sucuk 135-194 Sucuk 136-195 Siyah Zeytin - - 196 Sucuk 137-197 Sucuk 138-198 Tavuk 139-51

Çizelge 4.2 Gıda örneklerinden izole edilen enterokok izolatları ve antimikrobiyel aktiviteleri (devam) Sıra İzolasyon Kaynağı Bakteri Kodu Zon Çapı (mm) 199 Tavuk 140-200 Tavuk 141-201 Tavuk 142-202 Tarhana - - 203 Tavuk 143-204 Tavuk 144-205 Tavuk 145-206 Tavuk 146-207 Tavuk 147-208 Tavuk 148-209 Tavuk 149-210 Tavuk 150-211 Tavuk 151-212 Tavuk 152-213 Tavuk 153-214 Tavuk EP47 5 215 Tavuk 154-216 Tavuk 155-217 Tarhana - - 218 Tavuk EP48 5 219 Tarhana - - 220 Tavuk 156-221 Tavuk 157-222 Tavuk 158-223 Tavuk 159-224 Tavuk 160-225 Tavuk 161-226 Tavuk 162-227 Tavuk 163-228 Tavuk 164-229 Tavuk 165-230 Tavuk 166-231 Tavuk 167 - Sıra İzolasyon Kaynağı Bakteri Kodu Zon Çapı (mm) 232 Tavuk 168-233 Tavuk EP49 20 234 Tavuk 169-235 Örgü Peynir 170-236 Örgü Peynir 171-237 Beyaz Peynir 172-238 Beyaz Peynir 173-239 Beyaz Peynir 174-240 Beyaz Peynir 175-241 Tulum Peyniri 176-242 Tulum Peyniri 177-243 Ezine Peyniri 178-244 Ezine Peyniri 179-245 Beyaz Peynir 180-246 Beyaz Peynir 181-247 Kırık Peynir 182-248 Kırık Peynir 183-249 Beyaz Peynir 184-250 Ezine Peyniri 185-251 Ezine Peyniri 186-252 Ezine Peyniri EP50 6 253 Ezine Peyniri 187-254 Beyaz Peynir 188-255 Sucuk EP51 14 256 Sucuk EP52 7 257 Sucuk 189-258 Sucuk 190-259 Sucuk 191-260 Beyaz Peynir 192-261 Tulum Peyniri 193-262 Tulum Peyniri EP53 10 263 Örgü Peynir 194-264 Ezine Peyniri EP54 6 52

Çizelge 4.2 Gıda örneklerinden izole edilen enterokok izolatları ve antimikrobiyel aktiviteleri (devam) Sıra İzolasyon Kaynağı Bakteri Kodu Zon Çapı (mm) 265 Ezine Peyniri EP55 10 266 Ezine Peyniri 195-267 Beyaz Peynir EP56 5 268 Beyaz Peynir EP57 16 269 Beyaz Peynir EP58 17 270 Beyaz Peynir EP59 13 271 Beyaz Peynir EP60 22 272 Beyaz Peynir EP61 6 273 Beyaz Peynir EP62 20 274 Tarhana - - 275 Beyaz Peynir EP63 17 276 Tulum Peyniri EP64 14 277 Tulum Peyniri EP65 10 278 Ezine Peyniri EP66 7 279 Ezine Peyniri 196-280 Ezine Peyniri EP67 7 281 Ezine Peyniri EP68 13 282 Beyaz Peynir EP69 9 283 Beyaz Peynir EP70 20 284 Ezine Peyniri 197-285 Ezine Peyniri EP71 7 286 Beyaz Peynir 198-287 Beyaz Peynir EP72 16 288 Tulum Peyniri EP73 10 289 Tulum Peyniri EP74 18 290 Beyaz Peynir EP75 5 291 Sucuk EP76 14 292 Sucuk EP77 23 293 Sucuk EP78 25 294 Sucuk EP79 15 295 Sucuk EP80 18 296 Sucuk EP81 20 297 Sucuk EP82 8 Sıra İzolasyon Kaynağı Bakteri Kodu Zon Çapı (mm) 298 Sucuk EP83 8 299 Sucuk 199-300 Sucuk EP84 21 301 Tavuk 200-302 Tavuk 201-303 Tarhana - - 304 Tarhana - - 305 Tavuk 202-306 Tavuk - - 307 Tavuk - - 308 Tavuk EP85 12 309 Sucuk - - 310 Sucuk EP86 17 311 Sucuk EP87 13 312 Sucuk 203-313 Sucuk 204-314 Sucuk 205-315 Sucuk - - 316 Sucuk 206-317 Sucuk 207-318 Sucuk EP88 15 319 Sucuk 208-320 Turşu - - 321 Sucuk - - 322 Sucuk - - 323 Beyaz Peynir 209-324 Beyaz Peynir 210-325 Beyaz Peynir 211-326 Beyaz Peynir 212-327 Beyaz Peynir 213-328 Beyaz Peynir EP89 10 329 Ezine Peyniri 214-330 Kırık Peynir EP90 20 53

Çizelge 4.2 Gıda örneklerinden izole edilen enterokok izolatları ve antimikrobiyel aktiviteleri (devam) Sıra İzolasyon Kaynağı Bakteri Kodu Zon Çapı (mm) 331 Ezine Peyniri 215-332 Ezine Peyniri EP91 5 333 Ezine Peyniri - - 334 Ezine Peyniri 216-335 Beyaz Peynir EP92 12 336 Beyaz Peynir EP93 12 337 Sucuk - - 338 Sucuk - - 339 Sucuk - - 340 Sucuk 217-341 Sucuk 218-342 Sucuk EP94 5 343 Turşu - - 344 Sucuk - - 345 Sucuk - - 346 Sucuk EP95 5 347 Sucuk EP96 8 348 Sucuk 219-349 Turşu - - 350 Turşu - - 351 Tavuk EP97 5 352 Tavuk 220-353 Tavuk 221-354 Tavuk EP98 6 355 Tavuk EP99 5 356 Tavuk 222-357 Tavuk 223-358 Tavuk - - 359 Tavuk 224-360 Tavuk 225-361 Tavuk 226-362 Tavuk 227-363 Tavuk 228 - Sıra İzolasyon Kaynağı Bakteri Kodu Zon Çapı (mm) 364 Tavuk 229-365 Tavuk - - 366 Tavuk 230-367 Tavuk 231-368 Tavuk 232-369 Tavuk - - 370 Tavuk - - 371 Tavuk EP100 6 372 Tavuk EP101 12 373 Tavuk EP102 12 374 Tavuk EP103 15 375 Tavuk EP104 16 376 Tavuk 233-377 Sucuk EP105 10 378 Sucuk EP106 16 379 Sucuk EP107 17 380 Sucuk EP108 12 381 Sucuk EP109 11 382 Sucuk EP110 16 383 Sucuk EP111 10 384 Sucuk EP112 10 385 Sucuk EP113 10 386 Sucuk EP114 12 387 Sucuk EP115 12 388 Sucuk EP116 14 389 Sucuk EP117 12 390 Sucuk 234-391 Sucuk 235-392 Sucuk 236-393 Sucuk 237-394 Sucuk EP118 15 395 Sucuk EP119 16 396 Sucuk EP120 15 54

Çizelge 4.2 Gıda örneklerinden izole edilen enterokok izolatları ve antimikrobiyel aktiviteleri (devam) Sıra İzolasyon Kaynağı Bakteri Kodu Zon Çapı (mm) 397 Sucuk EP121 10 398 Sucuk EP122 12 399 Sucuk EP123 41 400 Sucuk EP124 13 401 Sucuk EP125 5 402 Sucuk 238-403 Sucuk EP126 20 404 Sucuk 239-405 Sucuk 240-406 Sucuk 241-407 Sucuk 242-408 Sucuk 243-409 Sucuk 244-410 Sucuk 245-411 Sucuk EP127 12 412 Sucuk EP128 25 413 Sucuk EP129 6 414 Sucuk 246-415 Sucuk 247-416 Sucuk EP130 5 417 Sucuk 248-418 Sucuk EP131 5 419 Sucuk EP132 10 420 Sucuk EP133 6 421 Sucuk EP134 14 422 Sucuk 249-423 Sucuk 250-424 Sucuk EP135 17 425 Sucuk EP136 6 426 Sucuk EP137 10 427 Sucuk - - 428 Sucuk EP138 14 Sıra İzolasyon Kaynağı Bakteri Kodu Zon Çapı (mm) 429 Sucuk 251-430 Sucuk 252-431 Sucuk 253-432 Sucuk 254-433 Sucuk 255-434 Sucuk 256-435 Sucuk 257-436 Sucuk 258-437 Sucuk 259-438 Sucuk 260-439 Sucuk 261-440 Sucuk 262-441 Sucuk 263-442 Sucuk 264-443 Sucuk 265-444 Sucuk EP139 19 445 Sucuk 266-446 Sucuk 267-447 Sucuk 268-448 Ezine Peyniri - - 449 Ezine Peyniri EP140 10 450 Ezine Peyniri EP141 5 451 Ezine Peyniri 269-452 Ezine Peyniri 270-453 Ezine Peyniri 271-454 Kırık Peynir 142 20 455 Tavuk 272-456 Tavuk 273-457 Tavuk EP143 12 458 Sucuk 274-459 Beyaz Peynir 275-460 Kırık Peynir 276-55

Çizelge 4.2 Gıda örneklerinden izole edilen enterokok izolatları ve antimikrobiyel aktiviteleri (devam) Sıra İzolasyon Kaynağı Bakteri Kodu Zon Çapı (mm) 461 Tulum Peyniri EP144 25 462 Tulum Peyniri EP145 18 463 Kırık Peynir EP146 20 464 Tulum Peyniri EP147 16 465 Beyaz Peynir 277-466 Kırık Peynir 278-467 Beyaz Peynir EP148 6 468 Beyaz Peynir EP149 12 469 Beyaz Peynir EP150 5 470 Beyaz Peynir 279-471 Beyaz Peynir EP151 18 472 Tulum Peyniri EP152 5 473 Tulum Peyniri EP153 13 474 Tulum Peyniri 280-475 Çökelek EP154 17 476 Çökelek EP155 20 477 Tavuk 281-478 Tavuk EP156 5 479 Sucuk 282-480 Sucuk 283-481 Sucuk EP157 6 482 Sucuk EP158 6 Sıra İzolasyon Kaynağı Bakteri Kodu Zon Çapı (mm) 483 Sucuk 284-484 Sucuk EP159 15 485 Sucuk 285-486 Sucuk EP160 5 487 Beyaz Peynir EP161 20 488 Beyaz Peynir 286-489 Beyaz Peynir EP162 10 490 Beyaz Peynir EP163 20 491 Beyaz Peynir 287-492 Ezine Peyniri EP164 10 493 Ezine Peyniri 288-494 Ezine Peyniri 289-495 Tarhana - - 496 Ezine Peyniri 290-497 Tulum Peyniri 291-498 Tulum Peyniri 292-499 Beyaz Peynir EP165 20 500 Siyah Zeytin - - 501 Beyaz Peynir 293-502 Tarhana - - 503 Sucuk 294 - Araştırmada enterokok izolatlarının Enterococcus faecalis ATCC 29212 suşuna karşı tür içi antimikrobiyel aktivitesi saptanmıştır. Bu kapsamda 79 adet enterokok izolatı 05-10 mm arasında inhibisyon zonu oluştururken, 76 adedi 11-20 mm arasında, 8 adedi 21-30 arasında ve 2 adedi ise 31 mm ve üzeri oluşturmuştur. EP123 suşu 41 mm inhibisyon zon çapı oluşturarak, en yüksek antimikrobiyel aktiviteye sahip suş olarak tanımlanmıştır. Bu izolatı 35 mm zon çapı oluşturan EP32 izolatı takip etmiştir. EP6, EP29, EP32, EP60, EP77, EP78, EP84, EP123, EP128 ve EP144 izolatları 21 mm ve üzeri inhibisyon zon çapı oluşturması bakımından öne çıkan izolatlardır. 165 enterokok izolatının patojenler de dâhil diğer tür içi ve türler arası bakterilere karşı antimikrobiyel 56

aktivite spektrumunun saptanması ve bu kapsamda bu izolatların ürettikleri antimikrobiyel maddenin bakteriyosin doğasının araştırılması önem taşımaktadır. Antimikrobiyel aktivite gösteren enterokok izolatlarının 63 tanesi sucuktan, 36 tanesi beyaz peynirden, 19 tanesi Ezine peynirinden, 14 tanesi tavuktan, 12 tanesi tulum peynirinden, 6 tanesi kırık peynirden, 6 tanesi keçi peynirinden, 4 tanesi örgü peynirden, 1 er tanesi ise lor peyniri ve turşudan izole edilmiştir (Çizelge 4.3). Çizelge 4.3 Antimikrobiyel aktivite gösteren enterokok izolatları Gıda Örneği Antimikrobiyel İzolat Sayısı İzolat No Beyaz Peynir 36 EP1, EP2, EP7, EP11, EP18, EP29, EP30, EP31, EP40, EP41, EP42, EP43, EP44, EP56, EP57, EP58, EP59, EP60, EP61, EP62, EP63, EP69, EP70, EP72, EP75, EP89, EP92, EP93, EP148, EP149, EP150, EP151, EP161, EP162, EP163, EP165 Lor Peyniri 1 EP3 Tulum Peyniri EP4, EP6, EP53, EP64, EP65, EP73, EP74, EP144, EP145, 12 EP147, EP152, EP153 Çökelek Peyniri 3 EP5, EP154, EP155 Ezine Peyniri 19 EP8, EP13, EP19, EP32, EP33, EP37, EP38, EP46, EP50, EP54, EP55, EP66, EP67, EP68, EP71, EP91, EP140, EP141, EP164 Kırık Peynir 6 EP9, EP17, EP45, EP90, EP142, EP146 Keçi Peyniri 6 EP10, EP14, EP22, EP34, EP35, EP36 Örgü Peynir 4 EP12, EP20, EP21, EP39 Turşu 1 EP15 EP16, EP23, EP24, EP25, EP26, EP27, EP28, EP51, EP52, EP76, EP77, EP78, EP79, EP80, EP81, EP82, EP83, EP84, Sucuk 63 EP86, EP87, EP88, EP94, EP95, EP96, EP105, EP106, EP107, EP108, EP109, EP110, EP111, EP112, EP113, EP114, EP115, EP116, EP117, EP118, EP119, EP120, EP121, EP122, EP123, EP124, EP125, EP126, EP127, EP128, EP129, EP130, EP131, EP132, EP133, EP134, EP135, EP136, EP137, EP138, EP139, EP157, EP158, EP159, EP160 Tavuk EP47, EP48, EP49, EP85, EP97, EP98, EP99, EP100, EP101, 14 EP102, EP103, EP104, EP143, EP156 57

4.2 Enterokok İzolatlarının Tanımlanması 4.2.1 Morfolojik ve kültürel testler Antimikrobiyel aktiviteye sahip tamamı Gr (+) morfoloji göstermiştir. Tek ya da kısa zincirler halinde kok ya da kokobasil morfolojisine sahip Gr (+) izolatlar, çalışma kapsamında diğer kültürel testlerde kullanılmak üzere % 20 steril gliserol içeren BHI broth ortamlarında mikrosantrifüj tüplerine alınarak -20 C de muhafaza edilmiştir. Muhtemel enterokok izolatlarına katalaz testi, eskulin hidrolizi, ph 9,6 da gelişme, % 6,5 NaCL de gelişim, 10 C - 45 C de gelişim ve hemoliz doğrulama testleri uygulanmıştır. Enterococcus cinsi; ph 9,6 da, % 6,5 NaCL de, 10 C ve 45 C de gelişim özelliği gösterebilen, katalaz (-) ve eskulin hidrolizi pozitif (+) olan türler içermektedir (Klein 2003, Harwood vd. 2004, Ogier ve Serror 2008, Fischer ve Phillips 2009, Zhang vd. 2013, Oladipo vd. 2014, Abouelnaga vd. 2016). Bu esas doğrultusunda çalışma kapsamındaki 165 izolat, Enterococcus spp. olarak tanımlanmıştır. Hemoliz doğrulama testi sonuçlarına göre ise; 140 izolat α-hemolitik, 12 izolat β-hemolitik ve 13 izolat ise γ-hemolitik yapı göstermiştir (Çizelge 4.4). Enterococcus suşları tarafından salgılanan virülans faktörlerden birisi olan hemolisin/sitolizin, bakteriyel bir toksindir. Plazmit ya da kromozomal DNA kodlu olabilen hemolitik aktivite, insan enfeksiyonlarında önemli bir rol oynamaktadır. Gıdalardan β-hemolitik aktiviteye sahip enterokok suşlarının izole edilmesi ise istenilmeyen bir durumdur. β-hemolitik suşlar daha çok E. faecium ve E. faecalis suşlarında bulunmaktadır (Semedo vd. 2003). Özellikle β-hemolitik aktivite gösteren enterokok suşlarının fermente gıda üretiminde starter kültür olarak kullanılmaları ise önerilmemektedir (De Vuyst vd. 2003, Yoğurtçu 2011). Araştırma kapsamında EP9, EP24, EP40, EP74, EP88, EP134, EP135, EP148, EP151, EP157, EP160 ve EP161 suşlarının β-hemolitik aktivite göstermesi, bu suşların virülans faktör taşıması bakımından önem taşımaktadır. Ancak bu suşlar için diğer virülans faktörlerinin de araştırılması gerekmektedir. İlaveten β-hemolitik aktivite göstermeyen diğer izolatların da virülans özellik taşıyabileceği de gözden kaçırılmaması gereken bir durumdur. 58

Çizelge 4.4 Antimikrobiyel akvitite gösteren izolatların hemoliz testi İZOLAT KODU HEMOLİZ DOĞRULAMA TESTİ İZOLAT KODU HEMOLİZ DOĞRULAMA TESTİ İZOLAT KODU HEMOLİZ DOĞRULAMA TESTİ EP1 α -hemolitik EP36 α-hemolitik EP71 α-hemolitik EP2 α -hemolitik EP37 α-hemolitik EP72 α-hemolitik EP3 α-hemolitik EP38 α-hemolitik EP73 α-hemolitik EP4 γ-hemolitik EP39 α-hemolitik EP74 β-hemolitik EP5 α-hemolitik EP40 β-hemolitik EP75 α-hemolitik EP6 α-hemolitik EP41 α-hemolitik EP76 α-hemolitik EP7 α-hemolitik EP42 α-hemolitik EP77 α-hemolitik EP8 α-hemolitik EP43 α-hemolitik EP78 α-hemolitik EP9 β-hemolitik EP44 α-hemolitik EP79 α-hemolitik EP10 α-hemolitik EP45 α-hemolitik EP80 α-hemolitik EP11 α-hemolitik EP46 α-hemolitik EP81 α-hemolitik EP12 α-hemolitik EP47 α-hemolitik EP82 α-hemolitik EP13 α-hemolitik EP48 α-hemolitik EP83 α-hemolitik EP14 α-hemolitik EP49 α-hemolitik EP84 α-hemolitik EP15 α-hemolitik EP50 α-hemolitik EP85 α-hemolitik EP16 α-hemolitik EP51 γ-hemolitik EP86 α-hemolitik EP17 γ-hemolitik EP52 γ-hemolitik EP87 α-hemolitik EP18 α-hemolitik EP53 α-hemolitik EP88 β-hemolitik EP19 α-hemolitik EP54 α-hemolitik EP89 α-hemolitik EP20 α-hemolitik EP55 γ-hemolitik EP90 α-hemolitik EP21 γ-hemolitik EP56 α-hemolitik EP91 α-hemolitik EP22 γ-hemolitik EP57 α-hemolitik EP92 α-hemolitik EP23 γ-hemolitik EP58 α-hemolitik EP93 α-hemolitik EP24 β-hemolitik EP59 α-hemolitik EP94 α-hemolitik EP25 α-hemolitik EP60 α-hemolitik EP95 α-hemolitik EP26 α-hemolitik EP61 α-hemolitik EP96 α-hemolitik EP27 α-hemolitik EP62 α-hemolitik EP97 γ-hemolitik EP28 γ-hemolitik EP63 α-hemolitik EP98 α-hemolitik EP29 α-hemolitik EP64 α-hemolitik EP99 γ-hemolitik EP30 α-hemolitik EP65 α-hemolitik EP100 α-hemolitik EP31 α-hemolitik EP66 α-hemolitik EP101 α-hemolitik EP32 α-hemolitik EP67 α-hemolitik EP102 α-hemolitik EP33 α-hemolitik EP68 α-hemolitik EP103 α-hemolitik EP34 α-hemolitik EP69 α-hemolitik EP104 α-hemolitik EP35 α-hemolitik EP70 α-hemolitik EP105 α-hemolitik 59

Çizelge 4.4 Antimikrobiyel akvitite gösteren izolatların hemoliz testi (devam) İZOLAT KODU HEMOLİZ DOĞRULAMA TESTİ İZOLAT KODU HEMOLİZ DOĞRULAMA TESTİ İZOLAT KODU HEMOLİZ DOĞRULAMA TESTİ EP106 α-hemolitik EP126 α-hemolitik EP146 α-hemolitik EP107 α-hemolitik EP127 α-hemolitik EP147 α-hemolitik EP108 α-hemolitik EP128 α-hemolitik EP148 β-hemolitik EP109 α-hemolitik EP129 α-hemolitik EP149 α-hemolitik EP110 α-hemolitik EP130 α-hemolitik EP150 α-hemolitik EP111 α-hemolitik EP131 α-hemolitik EP151 β-hemolitik EP112 α-hemolitik EP132 α-hemolitik EP152 α-hemolitik EP113 α-hemolitik EP133 α-hemolitik EP153 α-hemolitik EP114 α-hemolitik EP134 β-hemolitik EP154 α-hemolitik EP115 α-hemolitik EP135 β-hemolitik EP155 α-hemolitik EP116 α-hemolitik EP136 α-hemolitik EP156 α-hemolitik EP117 α-hemolitik EP137 α-hemolitik EP157 β-hemolitik EP118 α-hemolitik EP138 γ-hemolitik EP158 α-hemolitik EP119 α-hemolitik EP139 α-hemolitik EP159 α-hemolitik EP120 α-hemolitik EP140 α-hemolitik EP160 β-hemolitik EP121 α-hemolitik EP141 α-hemolitik EP161 β-hemolitik EP122 α-hemolitik EP142 α-hemolitik EP162 α-hemolitik EP123 α-hemolitik EP143 α-hemolitik EP163 α-hemolitik EP124 α-hemolitik EP144 α-hemolitik EP164 α-hemolitik EP125 γ-hemolitik EP145 α-hemolitik EP165 α-hemolitik 4.2.2 İzolatların biyokimyasal tanımlanması Kültürel testlerde enterokoklar için tipik reaksiyonu veren 165 izolat arasından 100 adet antimikrobiyel aktiviteye sahip Enterococcus spp. seçilmiştir. Tür içi indikatör suşa karşı en yüksek inhibisyon zonu oluşturan izolatlar seçilmeye çalışılmıştır. Tez çalışmasının bundan sonraki kısmı, seçilen bu 100 adet enterokok izolatı üzerinden yürütülmüştür. İzolatların biyokimyasal aktivitelerinin belirlenmesinde API 20 Strep (BioMerieux, France) test kitleri kullanılmıştır (Çizelge 4.5-4.6). 60

Çizelge 4.5 Enterokok izolatlarının biyokimyasal tanısı BAKTERİ KODU VP HIP ESC PYRA αgal βgur βgal PAL LAP ADH RIB ARA MAN SOR LAC TRE INU RAF AMD GLYG βhem EP2 + - + - - - + - + + + + + - + + - - - - - EP3 + - - + - - - - - + + + + - + + - - - - - EP4 + + + + - - - - + + + - + + + + - - - - - EP5 + - + + + - + - + + + + + + + + - + + - - EP6 + - + + + - - - + + + + + + + + - + - - - EP9 + + + + + - + - + + + + + + + + + + - - + EP11 + - + + + - + - + + + + + + + + - + - - - EP12 + - + + + + - + + + + + + + + + - + - - - EP14 + + + + - - - - + + + - + + + + - - - - - EP16 + - + + - - + - + + + + + + + + - - - - - EP17 + - + + - - - - + + + + + + + + - + - - - EP19 + - + + - - - - + + + + + + + + - + - - - EP21 + - + + + - - - + + + + + + + + - + - - - EP22 + - + + + - + - + + + + + + + + - + - - - EP23 + - + + - - - - + + + - + + + + - - - - - EP24 + - + + + - + - + - + + + + + + + + + - + EP26 + - + + + - + - + + + + + + + + + + - - - EP28 + - + + - - + - + + - + + - + + - - - - - EP29 + - + + - - + - + + + + + + + + - - - - - EP30 + - + + - - + - + + + + + + + + - - - - - EP32 + + + + - - + - + + + + + + + + - + - - - EP33 + - + + - - + - + + + + + + + + - + + - - EP35 + - + + - - + - + + + + + + + + - - + - - EP37 + - + + - - - - + + + + + + + + - + + - - EP39 + - + + + - + - + + + + + + + + + + + - - EP40 + + + + + - + - + + + + + + + + - + + - + EP41 + - + + - - - - + + + + + + + + - + - - - EP44 + - + + - - - - + + + + + + + + - - - - - 61

Çizelge 4.5 Enterokok izolatlarının biyokimyasal tanısı (devam) BAKTERİ KODU VP HIP ESC PYRA αgal βgur βgal PAL LAP ADH RIB ARA MAN SOR LAC TRE INU RAF AMD GLYG βhem EP46 + - + + + - + - + + + + + + + + + + + - - EP49 + - + + + - + - + + + + + + + + + + + - - EP51 + - + + - - - - + + + - + + + + - - + - - EP52 + - + + - - - - + + + + + + + + - + + - - EP55 + - + + + - + - + + + + + + + + - + + - - EP58 + + + + + - + - + + + + + + + + - + + - - EP60 + + + + + - + - + + + + + + + + - + - - - EP62 + - + + - - + - + + + + + + + + - - - - - EP63 + - + + - - + - + + + + + + + + - - - - - EP64 + - + + + - + - + + + + + + + + - - + - - EP68 + - + + + - + - + + + + + + + + - + - - - EP70 + - + + + - + - + + + + + + + + - + - - - EP72 + - + + + - + - + + + + + + + + - + + - - EP74 + - + + - - + - - + + + + + + + - - - - + EP76 + - + + - - + - + + + + + + + + + + + - - EP77 + - + + + - + - + + + + + - + + - - - - - EP78 + - + + - - + - + + + + + + + + - - - - - EP80 + - + + + - - - + + + + + + + + - + + - - EP81 + - + + + - - - + + + + + + + + - + + - - EP84 + - + + + - - - + + + + + + + + + + + - - EP85 + - + + + - - - + + + + + + + + + + - - - EP86 + - + + + - - - + + + + + + + + + + - - - EP87 + - + + + - - - + + + + + + + + + + - - - EP88 + + + + + - + - + + + + + + + + + + - - + EP90 + + + + - - - - + + + - + + + - - - - - - EP92 + + + + + - + - + + + + + + + + + + + - - EP98 + - + + + - - - + + + + + + + + + + + - - EP101 + - + + + - - - + + + + + + + + + + - - - 62

Çizelge 4.5 Enterokok izolatlarının biyokimyasal tanısı (devam) BAKTERİ KODU VP HIP ESC PYRA αgal βgur βgal PAL LAP ADH RIB ARA MAN SOR LAC TRE INU RAF AMD GLYG βhem EP102 + - + + + - - - + + + + + + + + + + - - - EP103 + - + + + - - - + + + + + + + + + + + - - EP104 + - + + + - + - + + + + + + + + + + + - - EP106 + - + + + - - - + + + + + + + + + + + - - EP107 + - + + + - - - + + + + + + + + + + + - - EP110 + - + + + - + - + + + + + + + + + + + - - EP111 + - + + + - - - + + + + + + + + + + + - - EP112 + - + + + - + - + + + + + + + + + + - - - EP115 + - + + + - + - + + + + + + + + + + - - - EP116 + - + + + - + - + + + + + + + + + + - - - EP118 + - + + + - + - + + + + + - + + + + - - - EP119 + - + + + - + - + + + + + - + + + + - - - EP120 + - + + + - + - + + + + + + + + + + + - - EP122 + - + + + - + - + + + + + + + + + + + - - EP123 + + + + + - + - + - + + + - + + - + + - - EP124 + - + + + - - - + + + + + + + + + + - - - EP126 + - + + - - + - + + + + + + + + - + - - - EP127 + - + + + - + - + + + + + + + + + + + - - EP128 + - + + - - + - + + + + + + + + - - - - - EP132 + - + + + - + - + + + + + + + + + + - - - EP134 + - + + + - + - + + + + + + + + - + - - + EP135 + - + + - - - - + + + - + + + + - - - - + EP138 + - + + - - + - + + + + + + + + - + - - - EP139 + - + + - - - - + + + + + + + + - + + - - EP140 + - + + - - - - + + + + + + + + - + + - - EP142 + - + + - - - - + + + - + + + + - - - - - EP143 + - + + - - - - + + + - + + + + - - - - - EP144 + + + + - - - - + + + + + + + + - - - - - 63

Çizelge 4.5 Enterokok izolatlarının biyokimyasal tanısı (devam) BAKTERİ KODU VP HIP ESC PYRA αgal βgur βgal PAL LAP ADH RIB ARA MAN SOR LAC TRE INU RAF AMD GLYG βhem EP145 + - + + + - - - + + + + + + + + + + + - - EP146 + - + + - - + - + + + + + + + + - - - - - EP147 + - + + - - - - + + + + + + + + - - + - - EP148 + - + + + - + - + + + + + + + + - + + - + EP149 + - + + - - - - + + + - + + + + - - + - - EP151 + - + + + - - - + + + + + + + + + + - - + EP153 + + + + + - - - + + + + + + + + + + + - - EP154 + - + + - - - - + + + - + + + + - - + - - EP155 + - + + + - - - + + + + + + + + - + + - - EP157 + - + + - - - - + + + + + + + + - + + - + EP159 + - + + - - - - + + + - + + + + - - + - - EP160 + + + + + - - - + + + + + + + + + + + - + EP161 + - + + - - - - + + + - + + + + - - - - + EP162 + - + + + - + - + + + + + + + + - + + - - EP163 + - + + - - - - + + + - + + + + - - - - - EP165 + - + + - - - - + + + - + + + + - - + - - VP Asetoin üretimi (Voges Proskauer) RIB D-ribose HIP Hidrolizis (HIPpurik asit) ARA L-arabinoz ESC β-glukosidaz hidrolizi (ESCulin) MAN D-mannitol PYRA PYRrolidonyl Arylamidaz SOR D-sorbitol αgal α-galaktosidaz LAC D-laktoz βgur β-giukuronidaz TRE D-trehaloz βgal β-galaktosidaz INU İnulin PAL Alkaline Phosphataz RAF D-raffinose LAP Lösin AminoPeptidaz AMD Nişasta ADH Arjinin DiHidrolaz GLYG Glikojen 64

Çizelge 4.6 Enterokok izolatlarının API 20 Strep test kiti ile tür düzeyinde tanımlanması İzolat Kodu API 20 Strep Test Kiti ile Tanımlanan Tür % ID Tanımlama Yüzdesi T Yakınlık EP2 Enterococcus faecium 98,1 0,97 EP3 Enterococcus faecium 67,4 0,31 EP4 Enterococcus faecalis 99,1 0,99 EP5 Enterococcus faecium 99,9 0,71 EP6 Enterococcus faecium 91,0 0,53 EP9 Enterococcus faecium 95,0 0,43 EP11 Enterococcus faecium 99,5 0,68 EP12 Enterococcus faecium 99,5 0,68 EP14 Enterococcus faecalis 86,8 0,77 EP16 Enterococcus faecium 98,8 0,86 EP17 Enterococcus faecium 70,5 0,56 EP19 Enterococcus faecium 70,5 0,56 EP21 Enterococcus faecium 91,0 0,53 EP22 Enterococcus faecium 99,5 0,68 EP23 Enterococcus faecalis 97,0 0,79 EP24 Enterococcus faecium 96,8 0,71 EP26 Enterococcus faecium 99,9 0,56 EP28 Enterococcus faecium 99,4 0,85 EP29 Enterococcus faecium 98,8 0,86 EP30 Enterococcus faecium 98,8 0,86 EP32 Enterococcus faecium 99,4 0,79 EP33 Enterococcus faecium 98,6 0,73 EP35 Enterococcus faecium 89,9 0,89 EP37 Enterococcus faecium 73,1 0,59 EP39 Enterococcus faecium 99,9 0,59 EP40 Enterococcus faecium 99,8 0,36 EP41 Enterococcus faecium 70,5 0,56 EP44 Enterococcus faecium 76,5 0,72 65

Çizelge 4.6 Enterokok izolatlarının API 20 strep test kiti ile tür düzeyinde tanımlanması (devam) İzolat Kodu API 20 Strep Test Kiti ile Tanımlanan Tür % ID Tanımlama Yüzdesi T Yakınlık EP46 Enterococcus faecium 99,9 0,59 EP49 Enterococcus faecium 99,9 0,59 EP51 Enterococcus faecalis 99,7 1,00 EP52 Enterococcus faecium 73,1 0,59 EP55 Enterococcus faecium 99,9 0,71 EP58 Enterococcus faecium 99,8 0,69 EP60 Enterococcus faecium 99,1 0,66 EP62 Enterococcus faecium 98,8 0,86 EP63 Enterococcus faecium 98,8 0,86 EP64 Enterococcus faecium 99,8 0,87 EP68 Enterococcus faecium 99,5 0,68 EP70 Enterococcus faecium 99,5 0,68 EP72 Enterococcus faecium 99,9 0,71 EP74 Enterococcus faecium 98,7 0,31 EP76 Enterococcus faecium 99,9 0,61 EP77 Enterococcus faecium 99,4 0,95 EP78 Enterococcus faecium 98,8 0,86 EP80 Enterococcus faecium 98,2 0,56 EP81 Enterococcus faecium 98,2 0,56 EP84 Enterococcus faecium 99,6 0,44 EP85 Enterococcus faecium 99,2 0,41 EP86 Enterococcus faecium 99,2 0,41 EP87 Enterococcus faecium 99,2 0,41 EP88 Enterococcus faecium 99,5 0,68 EP90 Enterococcus faecalis 86,8 0,77 EP92 Enterococcus faecium 99,9 0,57 EP98 Enterococcus faecium 99,6 0,44 EP101 Enterococcus faecium 99,2 0,41 66

Çizelge 4.6 Enterokok izolatlarının API 20 Strep test kiti ile tür düzeyinde tanımlanması (devam) İzolat Kodu API 20 Strep Test Kiti ile Tanımlanan Tür % ID Tanımlama Yüzdesi T Yakınlık EP102 Enterococcus faecium 99,2 0,41 EP103 Enterococcus faecium 99,6 0,44 EP104 Enterococcus faecium 99,9 0,59 EP106 Enterococcus faecium 99,6 0,44 EP107 Enterococcus faecium 99,6 0,44 EP110 Enterococcus faecium 99,9 0,59 EP111 Enterococcus faecium 99,6 0,44 EP112 Enterococcus faecium 99,9 0,56 EP115 Enterococcus faecium 99,9 0,56 EP116 Enterococcus faecium 99,9 0,56 EP118 Enterococcus faecium 99,9 0,67 EP119 Enterococcus faecium 99,9 0,67 EP120 Enterococcus faecium 99,9 0,59 EP122 Enterococcus faecium 99,9 0,59 EP123 Enterococcus faecium 85,2 0,62 EP124 Enterococcus faecium 99,2 0,41 EP126 Enterococcus faecium 98,2 0,70 EP127 Enterococcus faecium 99,9 0,59 EP128 Enterococcus faecium 98,8 0,86 EP132 Enterococcus faecium 99,9 0,56 EP134 Enterococcus faecium 99,5 0,36 EP135 Enterococcus faecalis 96,2 0,46 EP138 Enterococcus faecium 98,2 0,70 EP139 Enterococcus faecium 73,1 0,59 EP140 Enterococcus faecium 73,1 0,59 EP142 Enterococcus faecalis 97,0 0,79 EP143 Enterococcus faecalis 97,0 0,79 EP144 Enterococcus faecium 71,3 0,70 67

Çizelge 4.6 Enterokok izolatlarının API 20 Strep test kiti ile tür düzeyinde tanımlanması (devam) İzolat Kodu API 20 Strep Test Kiti ile Tanımlanan Tür % ID Tanımlama Yüzdesi T Yakınlık EP145 Enterococcus faecium 99,6 0,44 EP146 Enterococcus faecium 98,8 0,86 EP147 Enterococcus faecalis 74,3 0,67 EP148 Enterococcus faecium 99,9 0,38 EP149 Enterococcus faecalis 99,7 1,00 EP151 Enterococcus faecium 99,8 1,00 EP153 Enterococcus faecium 98,5 0,42 EP154 Enterococcus faecalis 99,7 1,00 EP155 Enterococcus faecium 98,2 0,56 EP157 Enterococcus faecium 73,1 0,26 EP159 Enterococcus faecalis 99,7 1,00 EP160 Enterococcus faecium 98,5 0.42 EP161 Enterococcus faecalis 97,0 1,00 EP162 Enterococcus faecium 99,9 0,71 EP163 Enterococcus faecalis 97,0 0,79 EP165 Enterococcus faecalis 99,7 1,00 Mükemmel Tanımlama : % ID 99,9 T 0,75 Çok İyi Tanımlama : % ID 99,0 T 0,50 İyi Tanımlama : % ID 90,0 T 0,25 Kabul Edilebilir Tanımlama :% ID 80,0 T 0 68

Enterokok izolatlarının tür düzeyinde tanımlama testleri sonucunda, bu izolatlardan 15 tanesi (% 15) E. faecalis ve 85 tanesi (% 85) ise E. faecium olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.6-4.7). Çizelge 4.7 Enterokok izolatlarının API 20 Strep test kitine göre tür düzeyinde dağılımı İzolat Sayısı Enterococcus Türleri İzolat Kod No n % Enterococcus faecalis Enterococcus faecium EP4, EP14, EP23, EP51, EP90, EP135, EP142, EP143, EP147, EP149, EP154, EP159, EP161, EP163, EP165 EP2,EP3, EP5,EP6, EP9,EP11, EP12, EP16,EP17, EP19, EP21, EP22, EP24, EP26, EP28, EP29, EP30, EP32, EP33, EP35, EP37, EP39, EP40, EP41, EP44, EP46, EP49, EP52, EP55, EP58, EP60, EP62, EP63, EP64, EP68, EP70, EP72, EP74, EP76, EP77, EP78, EP80, EP81, EP84, EP85, EP86, EP87, EP88, EP92, EP98, EP101, EP102, EP103, EP104, EP106, EP107, EP110, EP111, EP112, EP115, EP116, EP118, EP119, EP120, EP122, EP123, EP124, EP126, EP127, EP128, EP132, EP134, EP138, EP139, EP140, EP144,EP145, EP146, EP148, EP151, EP153, EP155, EP157, EP160, EP162 15 15 85 85 Toplam 100 100 Çalışmada API 20 Strep test kiti kullanılarak yapılan tür düzeyinde tanımlama testi için seçilen 100 izolatın; 52 tanesi peynir (21 beyaz peynir, 1 lor peyniri, 8 tulum peyniri, 3 çökelek peyniri, 3 keçi peyniri, 8 Ezine, 3 örgü peynir, 5 kırık peynir), 40 tanesi sucuk ve 8 tanesi ise tavuk orjinlidir (Çizelge 4.8). 69

Çizelge 4.8 API 20 Strep test kiti kullanılarak tür düzeyinde tanımlaması yapılan enterokok suşlarının gıda orjinleri Gıda Örnekleri Adet Enterococcus faecalis (Adet) Enterococcus faecium (Adet) Sucuk 40 4 36 Tavuk 8 1 7 Peynir Örnekleri 52 10 42 Toplam 100 15 85 4.2.3 Enterococcus suşlarının 16S rdna dizi analizi ile moleküler tanımlanması Enterococcus suşlarının moleküler tanımlanmasında 16S rdna dizi analizi yöntemi kullanılmıştır. 16S rdna bölgesinin PZR ile çoğaltılmasında; 16S ileri (5'-CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT -3') ve 16S geri (3'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -5') üniversal primerleri kullanılarak, jel fotoğragflarının çekiminde jel görüntüleme sisteminden (Kodak Gel Logic 200 Imaging System) yararlanılmıştır (Şekil 4. 2). 70

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 N Şekil 4.2 Enterococcus spp. suşlarının PZR ile çoğaltılan 16S rdna fragmentleri M O Gene Ruler DNA marker (bç) 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250 1 21 EP9, EP11, EP12, EP14, EP16, EP17, EP19, EP21, EP22, EP23, EP24, EP26, EP28, EP29, EP30, EP32, EP33, EP35, EP37, EP39 N Negatif Kontrol PZR ile çoğaltılan 16S rdna gen bölgesinin çift yönlü DNA dizi analizi sonuçları BLAST programı kullanılarak NCBI veri tabanında bulunan 16S rdna dizileriyle benzerliği karşılaştırılmıştır (Çizelge 4.9). 71

Çizelge 4.9 Enterococcus suşlarının 16S rdna dizi analizi sonuçlarına göre gerçekleştirilen tanısı BAKTERİ KOD NO İleri (F) Benzerlik Oranı % Geri (R) Benzerlik Oranı % 16S rdna Dizisine Göre Yapılan Tanı EP2 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP3 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 93,0 Enterococcus faecium EP4 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP5 Enterococcus faecalis 94,0 Enterococcus faecalis 94,0 Enterococcus faecalis EP6 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis 96,0 Enterococcus faecalis EP9 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium EP11 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis EP12 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium EP14 Enterococcus faecium 95,0 Enterococcus faecium 95,0 Enterococcus faecium EP16 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis 99,0 Enterococcus faecalis EP17 Enterococcus faecalis 96,0 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis EP19 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium EP21 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis EP22 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis EP23 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 96,0 Enterococcus faecalis EP24 Enterococcus faecium 89,0 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium EP26 Enterococcus faecium 92,0 Enterococcus faecium 85,0 Enterococcus faecium EP28 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium EP29 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium EP30 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP32 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium EP33 Enterococcus faecium 95,0 Enterococcus faecium 91,0 Enterococcus faecium EP35 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 99,0 Enterococcus faecalis EP37 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis EP39 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium EP40 Enterococcus faecium 95,0 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium EP41 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis EP44 Enterococcus faecalis 96,0 Enterococcus faecalis 94,0 Enterococcus faecalis EP46 Enterococcus faecalis 92,0 Enterococcus faecalis 95,0 Enterococcus faecalis EP49 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium 87,0 Enterococcus faecium EP51 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 95,0 Enterococcus faecalis EP52 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium 93,0 Enterococcus faecium EP55 Enterococcus faecalis 93,0 Enterococcus faecalis 94,0 Enterococcus faecalis EP58 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP60 Enterococcus faecalis 93,0 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis EP62 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis EP63 Enterococcus faecalis 94,0 Enterococcus faecalis 81,0 Enterococcus faecalis 72

Çizelge 4.9 Enterococcus suşlarının 16S rdna dzi analizi sonuçlarına göre gerçekleştirilen tanısı (devam) BAKTERİ KOD NO İleri (F) Benzerlik Oranı % Geri (R) Benzerlik Oranı % 16S rdna Dizisine Göre Yapılan Tanı EP64 Enterococcus faecium 93,0 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium EP68 Enterococcus faecalis 93,0 Enterococcus faecalis 91,0 Enterococcus faecalis EP70 Enterococcus faecium 88,0 Enterococcus faecium 88,0 Enterococcus faecium EP72 Enterococcus faecium 78,0 Enterococcus faecium 95,0 Enterococcus faecium EP74 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP76 Enterococcus faecium 95,0 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium EP77 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis EP78 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium EP80 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium EP81 Enterococcus faecium 89,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP84 Enterococcus faecium 95,0 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium EP85 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium EP86 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium EP87 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium EP88 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP90 Enterococcus faecium 91,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP92 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium 95,0 Enterococcus faecium EP98 Enterococcus faecalis 96,0 Enterococcus faecalis 99,0 Enterococcus faecalis EP101 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP102 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium EP103 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium 95,0 Enterococcus faecium EP104 Enterococcus faecium 94,0 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium EP106 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium EP107 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium EP110 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP111 Enterococcus faecium 93,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP112 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis 99,0 Enterococcus faecalis EP115 Enterococcus faecium 95,0 Enterococcus faecium 94,0 Enterococcus faecium EP116 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium EP118 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP119 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium EP120 Enterococcus faecium 88,0 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium EP122 Enterococcus faecium 94,0 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium EP123 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium EP124 Enterococcus faecium 87,0 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium EP126 Enterococcus faecium 95,0 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium EP127 Enterococcus faecium 95,0 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium 73

Çizelge 4.9 Enterococcus suşlarının 16S rdna dizi analizi sonuçlarına göre gerçekleştirilen tanısı (devam) BAKTERİ KOD NO İleri (F) Benzerlik Oranı % Geri (R) Benzerlik Oranı % 16S rdna Dizisine Göre Yapılan Tanı EP128 Enterococcus faecium 92,0 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium EP132 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium EP134 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis EP135 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis EP138 Enterococcus faecalis 94,0 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis EP139 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP140 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium EP142 Enterococcus faecalis 94,0 Enterococcus faecalis 92,0 Enterococcus faecalis EP143 Enterococcus faecalis 96,0 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis EP144 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis EP145 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis 88,0 Enterococcus faecalis EP146 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium EP147 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium EP148 Enterococcus faecium 95,0 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium EP149 Enterococcus faecalis 90,0 Enterococcus faecalis 89,0 Enterococcus faecalis EP151 Enterococcus faecalis 94,0 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis EP153 Enterococcus faecalis 99,0 Enterococcus faecalis 94,0 Enterococcus faecalis EP154 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 93,0 Enterococcus faecalis EP155 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis EP157 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP159 Enterococcus faecalis 99,0 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis EP160 Enterococcus faecalis 96,0 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis EP161 Enterococcus faecalis 94,0 Enterococcus faecalis 95,0 Enterococcus faecalis EP162 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP163 Enterococcus faecalis 95,0 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis EP165 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 16 S rdna dizi analizlerinden elde edilen veriler dikkate alındığında, 100 Enterococcus suşunun 61 i (% 61) E. faecium ve 39 u (% 39) ise E. faecalis olarak tanımlanmıştır (Çizelge 4.9-4.10). 74

Çizelge 4.10 16S rdna dizi analizleri sonucuna göre Enterococcus suşlarının tür düzeyinde dağılımı Enterococcus Türleri Enterococcus faecalis Enterococcus faecium İzolat Sayısı İzolat Kod No Sayı % EP5, EP6, EP11, EP16, EP17, EP21, EP22, EP23, EP35, EP37, EP41, EP44, EP46, EP51, EP55, EP60, EP62, EP63, EP68, EP77, EP98, EP112, EP134, EP135, EP138, EP142, EP143, EP144, EP145, EP149, EP151, EP153, EP154, EP155, EP159, EP160, EP161,EP163, EP165 EP2,EP3, EP4,EP9, EP12, EP14, EP19, EP24, EP26, EP28, EP29, EP30, EP32, EP33, EP39, EP40, EP49, EP52, EP58, EP64, EP70, EP72, EP74, EP76, EP78, EP80, EP81, EP84, EP85, EP86, EP87, EP88, EP90, EP92, EP101, EP102, EP103, EP104, EP106, EP107, EP110, EP111, EP115, EP116, EP118, EP119, EP120, EP122, EP123, EP124, EP126, EP127, EP128, EP132, EP139, EP140, EP146, EP147, EP148, EP157, EP162 39 39 61 61 Toplam 100 100 Çizelge 4.6 ile Çizelge 4.9 karşılaştırıldığı zaman API 20 Strep test kitleri ile tanımlanan 15 E. faecalis suşunun 16S rdna dizi analizleri sonucunda 4 tanesi (EP4, EP14, EP90, EP147) E. faecium olarak tanımlanmıştır. Aynı şekilde 85 E. faecium suşunun 28 tanesi (EP5, EP6, EP11, EP16, EP17, EP21, EP22, EP35, EP37, EP41, EP44, EP46, EP55, EP60, EP62, EP63, EP68, EP77, EP98, EP112, EP134, EP138, EP144, EP154, EP151, EP153, EP155, EP160) E. faecalis olarak tanımlanmıştır. Toplamda 32 enterokok suşunun tür düzeyinde adlandırması değişmiştir. 68 suşun ise 16S rdna dizi analizleri sonucunda tür düzeyinde tanımlanmasında herhangi bir değişiklik gözlemlenmemiştir (Çizelge 4.11). Sonuç olarak; çalışmamızda API 20 Strep test kitleri enterokok izolatlarını tür düzeyinde tanımlama aşamasında başarı oranı % 68 olarak saptanmıştır. 75

Çizelge 4.11 Enterokok suşlarının tanımlanması aşamasında API 20 Strep test kiti ile 16S rdna dizi analizi sonuçlarının karşılaştırılması İzolat Kodu API 20 Strep Test Kiti ile Tanımlanan Tür 16S rdna Dizi Analizleri Sonucu Tanımlanan Tür EP2 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP3 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP4 Enterococcus faecalis Enterococcus faecium EP5 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP6 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP9 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP11 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP12 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP14 Enterococcus faecalis Enterococcus faecium EP16 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP17 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP19 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP21 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP22 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP23 Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis EP24 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP26 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP28 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP29 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP30 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP32 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP33 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP35 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP37 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP39 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP40 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP41 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP44 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis 76

Çizelge 4.11 Enterokok suşlarının tanımlanması aşamasında API 20 Strep test kiti ile 16S rdna dizi analizi sonuçlarının karşılaştırılması (devam) İzolat Kodu API 20 Strep Test Kiti ile Tanımlanan Tür 16S rdna Dizi Analizleri Sonucu Tanımlanan Tür EP46 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP49 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP51 Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis EP52 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP55 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP58 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP60 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP62 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP63 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP64 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP68 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP70 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP72 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP74 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP76 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP77 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP78 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP80 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP81 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP84 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP85 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP86 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP87 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP88 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP90 Enterococcus faecalis Enterococcus faecium EP92 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP98 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP101 Enterococcus faecium Enterococcus faecium 77

Çizelge 4.11 Enterokok suşlarının tanımlanması aşamasında API 20 Strep test kiti ile 16S rdna dizi analizi sonuçlarının karşılaştırılması (devam) İzolat Kodu API 20 Strep Test Kiti ile Tanımlanan Tür 16S rdna Dizi Analizleri Sonucu Tanımlanan Tür EP102 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP103 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP104 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP106 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP107 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP110 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP111 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP112 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP115 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP116 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP118 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP119 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP120 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP122 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP123 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP124 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP126 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP127 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP128 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP132 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP134 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP135 Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis EP138 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP139 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP140 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP142 Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis EP143 Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis EP144 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis 78

Çizelge 4.11 Enterokok suşlarının tanımlanması aşamasında API 20 Strep test kiti ile 16S rdna dizi analizi sonuçlarının karşılaştırılması (devam) İzolat Kodu API 20 Strep Test Kiti ile Tanımlanan Tür 16S rdna Dizi Analizleri Sonucu Tanımlanan Tür EP145 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP146 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP147 Enterococcus faecalis Enterococcus faecium EP148 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP149 Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis EP151 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP153 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP154 Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis EP155 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP157 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP159 Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis EP160 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP161 Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis EP162 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP163 Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis EP165 Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis 16S rdna dizi analizleri sonucu tanımlanan enterokok suşlarının gıda orjinleri Çizelge 4.12 de yer almaktadır. Sucuk örneklerinde izole edilen enterokok suşlarının % 25 ini (10 adet) E. faecalis ve % 75 ini (30 adet) ise E. faecium oluşturmuştur. 8 adet tavuk örneğinin ise % 25 ini (2 adet) E. faecalis ve % 75 ini (6 adet) E. faecium ve aynı şekilde 52 adet peynir örneklerinin % 51,92 sini (27 adet) E. faecalis ve % 48,08 ini (25 adet) E. faecium olduğu tespit edilmiştir. 79

Çizelge 4.12 16S rdna dizi analizleri kullanılarak tür düzeyinde tanımlaması yapılan enterokok suşlarının gıda orjinleri Gıda Örnekleri Adet Sucuk 40 Enterococcus faecalis Enterococcus faecium İzolat No Sayı % İzolat No Sayı % EP16,EP23,EP51,EP77,EP1 12, EP134, EP135, EP138, EP159, EP160 10 25,00 Tavuk 8 EP98, EP143 2 25,00 Peynir Örnekleri 52 EP5, EP6, EP11, EP17, EP21, EP22, EP35, EP37, EP41, EP44, EP46, EP55, EP60, EP62, EP63, EP68, EP142, EP144, EP145, EP149, EP151, EP153, EP154, EP155, EP161, EP163, EP165 27 51,92 EP24, EP26, EP28, EP52, EP76, EP78, EP80, EP81, EP84, EP86, EP87, EP88, EP106, EP107, EP110, EP111, EP115, EP116, EP118, EP119, EP120, EP122, EP123, EP124, EP126, EP127, EP128, EP132, EP139, EP157 EP49, EP85, EP101, EP102, EP103, EP104 EP2, EP3, EP4, EP9, EP12, EP14, EP19, EP29, EP30, EP32, EP33, EP39, EP40, EP58, EP64, EP70, EP72, EP74, EP90, EP92, EP140, EP146, EP147, EP148, EP162 100 39 39 61 61 30 6 25 75,0 0 75,0 0 48,0 8 Yapılan birçok araştırmada (Klein 2003, Alves vd. 2004, Fischer ve Phillips 2009, Toğay ve Temiz 2011, Silva vd. 2012, Valenzuela vd. 2012, Dada vd. 2013, Carasi vd. 2014, Klibi vd. 2015), E. faecium ve E. faecalis türlerinin gıdalardan sıklıkla izole edilen enterokok türleri olduğu ifade edilmektedir. Araştırmamızda fermente ve fermente olmayan gıda ürünlerinden izole ettiğimiz enterokok izolatlarının moleküler düzeyde E. faecium ve E. faecalis olarak tanımlanması, literatür verileri ile paralellik göstermektedir. Tez çalışması kapsamında et ve fermente et ürünlerinden izole edilen suşların büyük bir kısmını E. faecium suşları oluşturmaktadır. Araştırmamızda et ürünlerinden izole edilen enterokok suşları E. faecalis ve E. faecium olarak tanımlanmıştır (Çizelge 4.12). 80

Peters vd. (2003) tarafından, fermente et ürünlerinden izole edilen 416 Enterococcus suşunun 299 u E. faecalis, 54 ü E. faecium, 24 ü E. durans, 24 ü E. hirae, 22 si E. casseliflavus, 9 u E. avium ve 8 i ise E. gallinarum olarak tanımlanmıştır. Barbosa vd. (2009), fermente et ürünlerinden izole ettikleri 182 Enterococcus suşunun 76 sını E. faecalis, 44 ünü E. faecium, 1 ini E. casseliflavus ve 61 ini Enterococccus spp. olarak tanımlamıştır. Şahin (2012), 160 tavuk örneğinden izole ettiği 130 Enterococcus suşunun 46 sını (% 35,4) E. faecalis, 32 sini E. faecium (% 24,6), 17 sini (% 13,1) E. gallinarum, 12 sini (% 9,2) E. mundtii, 9 unu (% 6,9) E. durans, 7 sini (% 5,4) E. rafinosus ve 7 sini (% 5,4) Enterococcus spp. olarak tanımlamıştır. Jahan ve Holley (2013), fermente olmayan et ürünlerinden izole ettikleri 29 Enterococcus suşunun % 51,7 sini E. faecalis, % 44,8 ini E. faecium ve % 3,4 ünü E. gallinarum olarak moleküler düzeyde tespit etmişlerdir. Klibi vd. (2013), tavuk ve hindiden izole ettikleri 119 Enterococcus suşunun 49 unu E. faecalis, 30 unu E. faecium, 12 sini E. gallinarum, 12 tanesini E. hirae, 16 sını ise Enterococcus spp. olduğunu belirtmişlerdir. Hammad vd. (2014), balıktan izole ettikleri 48 Enterococcus suşunun 31 ini E. faecalis, 7 sini E. faecium, 7 sini E. casseflavus ve 3 ünü ise E. gallinarum olarak belirlemişlerdir. Araştırmada elde ettiğimiz sonuçlar, et ve fermente et ürünlerinde yüksek E. faecalis oranına işaret eden literatür verileriyle uyumlu bulunmamıştır. Hayes vd. (2003), fermente olmayan et ürünlerinden izole ettikleri 1357 Enterococcus suşunun % 61 ini E. faecium, % 29 unu E. faecalis ve % 5,7 sini ise E. hirae, % 2,1 ini E. casseliflavus, % 2,1 ini E. durans, % 0,7 sini E. gallinarum, % 0,1 ini E. avium olarak saptamışlardır. Kasımoğlu-Doğru vd. (2010), 106 tavuk örneğinden izole ettikleri 83 Enterococcus suşunun % 48 ini E. faecium, % 23 ünü E. durans ve % 19 unu E. faecalis olarak tanımlamışlardır. Karabıyık (2011) Ankara nın çeşitli marketlerinden temin ettiği fermente et örneklerinden izole ettikleri 134 Enterococcus suşunun 79 unu (% 59) E. faecium, 35 ini (% 26,1) E. faecalis, 13 ünü (% 9,7) E. gallinarum, 5 ini (% 3,7) E. durans, 1 ini (% 0,7) E. avium ve 1 ini ise (% 0,7) E. hirae olarak tespit etmiştir. Bu çalışmalar et ve fermente et ürünlerinde tanımlanan suşların büyük bir kısmını E. faecium suşları oluşturması bakımından, bizim tez çalışmamızda elde ettiğimiz verileri desteklemektedir. 81

Tez çalışması kapsamında peynir örneklerinden izole edilen suşların büyük bir kısmını E. faecalis suşları oluşturmaktadır. Araştırmamızda peynirlerden izole edilen enterokok suşları E. faecalis ve E. faecium olarak tanımlanmıştır (Çizelge 4.12). Cosentino vd. (2004) geleneksel olarak üretilen peynir örneklerinden izole ettikleri 118 Enteroccocus suşunun 84 ünü E. faecium, 24 ünü E. durans ve 10 unu ise E. faecalis olarak sınıflandırmışlardır. Jurkovic vd. (2006) peynirden izole ettikleri 308 Enterococcus suşunu moleküler düzeyde tanımlamışlar ve bunlardan 177 sini E. faecium, 59 unu E. durans, 41 ini E. faecalis, 13 ünü E. mundtii ve 11 ini E. casseflavus olarak tespit etmişlerdir. Yoğurtçu (2011) tulum peynirinden izole ettiği 47 adet Enterococcus suşunu 16S rdna sekans analizi ile tür düzeyinde tanımlamış ve 21suşu E. faecium, 14 suşu E. durans ve 12 suşu ise E. faecalis olarak saptamıştır. Oladipo vd. (2013) fermente süt ürünlerinden izole ettikleri 108 Enteroccocus suşunun % 75 ini E. gallinarum, % 14,5 ini E. faecium, % 7,6 sını E. faecalis ve % 2,8 ini E. casselliflavus olarak tanımlamışlardır. Vallejo vd. (2013), peynirden izole etikleri 27 Enterococcus suşunun 22 sini E. faecium ve 5 ini ise E. faecalis olarak belirlemişlerdir. Bulajić vd. (2015) fermente süt ürünlerinden 226 Enterococcus izolatı izole etmişler ve izolatların 119 unun (% 52,65) E. faecium, 40 ının (% 17,7) E. durans, 37 sinin (% 16,37) E. hirae, 29 unun (% 12,83) E. faecalis ve 1 inin (% 0,44) E. gallinarum olduğunu tespit etmişlerdir. Hammad vd. (2015) peynirden izole ettikleri 50 enterokokkal suşun 37 sini E. faecium ve 13 ünü E. faecalis olarak saptamışlardır. Araştırmada elde ettiğimiz sonuçlar, fermente süt ürünlerinde yüksek E. faecium oranına işaret eden literatür verileriyle uyumlu bulunmamıştır. Morandi vd. (2006), fermente süt ürünlerinden izole ettikleri 68 enterokok suşunun 35 ini E. faecalis, 27 sini E. faecium ve 6 sını E. durans olarak tanımlamışlardır. Fermente süt ürünlerinde tanımlanan suşların büyük bir kısmını E. faecalis suşları oluşturması bakımından, bu çalışma bizim tez çalışmamızda elde ettiğimiz verileri desteklemektedir. 82

4.3 Enterokok Suşlarının Antibiyotik Duyarlılıkları Bauer vd. (1966) tarafından önerilen antibiyotik disk difüzyon yöntemi modifiye edilerek, enterokok suşlarının antibiyotik dirençlilik/duyarlılıklarının belirlenmiştir (Şekil 4.3-4.6). Disk difüzyonu için, 12 farklı antibiyotik kullanılmıştır. Elde edilen zon çapları Klinik Laboratuvar Standartları Enstitüsü nün belirlediği (Clinical Laboratory Standards Institute) (Anonymous 2011) zon çaplarıyla karşılaştırılmıştır. Enterococcus suşlarının antibiyotiklere duyarlı, az hassas ve dirençli olarak değerlendirilmesi yapılmıştır. Antibiyotik duyarlılık deneylerinde standart suş Enterococcus faecalis ATCC 29212 kullanılmıştır. 100 adet enterokok suşunun antibiyotiklere karşı oluşturduğu inhibisyon zon çapları (mm) ve duyarlılık düzeyleri (%) çizelge 4.13 ve 4.14 te verilmiştir. Antibiyotiklere karşı duyarlı, az hassas ve dirençlilik fenotipi gösteren suşlar ise çizelgede farklı renklerle işaretlenmiştir. 83

Şekil 4.3 Enterococcus faecalis EP17 suşunun disk difüzyon yöntemi ile tanımlanan antibiyotik duyarlılığı Şekil 4.4 Enterococcus faecium EP24 suşunun disk difüzyon yöntemi ile tanımlanan antibiyotik duyarlılığı 84

Şekil 4.5 Enterococcus faecalis EP35 suşunun disk difüzyon yöntemi ile tanımlanan antibiyotik duyarlılığı Şekil 4.6 Enterococcus faecalis EP23 suşunun disk difüzyon yöntemi ile tanımlanan antibiyotik duyarlılığı 85