ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Ayşegül KARAKAŞ BEYAZ PEYNİR VE FERMENTE SUCUKLARDAN Enterococcus faecium un İZOLASYONU VE TANIMLANMASI GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ADANA, 2005

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BEYAZ PEYNİR VE FERMENTE SUCUKLARDAN Enterococcus faecium un İZOLASYONU VE TANIMLANMASI Ayşegül KARAKAŞ YÜKSEK LİSANS TEZİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Bu tez 30/12/2005 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza... İmza... İmza... Doç. Zerrin ERGİNKAYA Doç. Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ Yrd. Doç. Dr. Işıl VAR DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu tez Enstitümüz Gıda Mühendisliği Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No : Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü Bu Çalışma Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: ZF.2003.YL.41 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ BEYAZ PEYNİR VE FERMENTE SUCUKLARDAN Enterococcus faecium un İZOLASYONU VE TANIMLANMASI Ayşegül KARAKAŞ ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Danışman : Doç. Dr. Zerrin ERGİNKAYA Yıl : 2005, Sayfa: 69 Jüri : Doç. Dr. Zerrin ERGİNKAYA Doç. Dr. Hatice KORMAZ GÜVENMEZ Yrd. Doç. Dr. Işıl VAR Bu çalışmada Adana daki çeşitli marketlerden 20 adet sucuk ve 30 adet peynir örneği toplanarak, Enterococcus faecium izole edilmeye çalışılmıştır. İzole edilen suşlarda, selektif besiyerinde gelişim, gram boyama, katalaz testi, 10 ºC ve 45 ºC sıcaklıkta gelişim ile glikozdan gaz üretimi gibi özellikleri belirlenerek, biyokimyasal özellikleri API 20STREP test kiti ile tespit edilip tanımlanaları yapılmıştır. Analizler sonunda 20 adet sucuk örneğinden elde edilen izolatlardan 3 tanesinin Enterococcus spp. ye ait olduğu tespit edilmiştir. Bu izolatlardan 1 tanesi Enterococcus faecium türü olarak tanımlanırken, sucuk örneğindeki sayımların 9.4 x 10 5 kob/g olduğu tespit edilmiştir. Diğer sucuk izolatlarının bir tanesi Enterococcus durans; diğeri ise Enterococcus avium olarak tanımlanmış ve sayımları sırasıyla 2 x 10 1 kob/g ve 3 x 10 3 kob/g olarak tespit edilmiştir. Peynir örneklerinden elde edilen kültürlerin 3 tanesi Enterococcus faecium olarak tanımlanmıştır. Enterococcus faecium olarak tanımlanan izolatların sayımları ise 2.3x10 6 ; 2x10 1 ve 3x10 3 kob/g olarak bulunmuştur. Ayrıca peynir örneklerinden 1 tane Enterococcus durans ve 1 tane de Enterococcus avium izole edilmiştir. Çalışmada ayrıca izole edilen Enterococcus spp. nin hemoliz varlığı ve vancomycin e direnç özellikleri araştırılmıştır. Peynir ve sucuk örneklerinden elde edilen Enterococcus durans suşlarında hemoliz varlığı saptanırken diğer suşlarda hemoliz varlığı bulunamamıştır. İzole edilen Enterococcus spp. nin vancomycin e dirençleri araştırılmış ve bu suşların vancomycin e karşı direnç göstermedikleri tespit edilmiştir. Anahtar Kelimeler : Enterococcus faecium, izolasyon, tanımlama, peynir, sucuk I

4 ABSTRACT MSc THESIS ISOLATION AND IDENTIFICATION OF Enterococcus faecium FROM CHEESES AND FERMENTED SAUSAGES Ayşegül KARAKAŞ DEPARTMENT OF FOOD ENGINEERING INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor : Assoc. Prof. Zerrin ERGİNKAYA Year : 2005, Pages: 69 Jury : Assoc. Prof. Zerrin ERGİNKAYA Assoc. Prof. Hatice KORMAZ GÜVENMEZ Assist. Prof. Işıl VAR In this study, 20 sausages and 30 cheeses samples were collected from markets in Adana and Enterococcus faecium strains were tried to be isolated from these samples. In isolated strains, growth on selective media, gram dye, catalase test, growth at 10 ºC ve 45 ºC and production gas from glucose were tested. Biochemichal characteristics were determined and they were identified using API 20STREP test kit. In the study, 3 of islolates that were obtained from 20 sausage samples belonged to Enterococcus spp. One of these isolate was identified as Enterococcus faecium with count of 9.4 x 10 5 cfu/g. Other sausages isolates were identified as Enterococcus durans with count of 2 x 10 1 cfu/g; as Enterococcus avium with count of 3 x 10 3 cfu/g. 3 of isolates obtained from cheese samples were identified as Enterococcus faecium. These Enterococcus faecium isolates were counted 2.3x10 6 ; 2x10 1 ve 3x10 3 cfu/g. Also 1 Enterococcus durans strain and Enterococcus avium strain were isolated from cheese samples. In the study, isolated Enterococcus spp. were searched for precence of haemolysin and vancomycin resistant. These isolates were tested for precence of haemolisis and vancomycin resistant. Enterococcus durans strains which isolated from cheese and sausage samples showed β haemolysin; haemolysin couldn t find in other strains. Enterococcus spp. isolated in this study tested for vancomycin resistance and it s found that these strains did not show vancomycin resistant. Vancomycin resistant was found only for Enterococcus faecium that was used as referance strain. KeyWords : Enterococcus faecium, isolation, identification, cheese, sausage II

5 TEŞEKKÜR Eğitimim sırasında hep yanımda olduğunu hisstttiren, her konuda bana yol gösteren, yardımcı olan, yakın ilgisi ile beni her zaman teşvik ve motive eden sevgili hocam Doç. Dr. ZERRİN ERGİNKAYA ya sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Çalışmam sırasında ilgi ve yardımlarını esirgemeyen değerli hocam Yrd. Doç. Dr. Işıl VAR, Arş. Gör. Bülent ZORLUGENÇ, Bülent KABAK, Emine AKSAN a, Tüm çalışmalarım süresince her türlü yardımını ve manevi desteğini gördüğüm sevgili arkadaşım Orhan GÖZEN e, Tezim sırasında destek vermekten kaçınmayan ve her zaman yardımcı olan sevgili arkadaşlarım Naci Erhan YURDAKUL, Cihan ÇELİK e, sevgili kardeşim Esra KARAKAŞ a, Manevi desteği için Ali ÖNDER e, Beni yetiştiren ve yaşamım boyunca bana maddi ve manevi destek veren sevgili annem Teslime KARAKAŞ ve babam Bekir KARAKAŞ a teşekkürü borç bilirim. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ...I ABSTRACT...II TEŞEKKÜR... III İÇİNDEKİLER...IV SİMGELER VE KISALTMALAR...VII ÇİZELGELER DİZİNİ...IX ŞEKİLLER DİZİNİ... X RESİMLER DİZİNİ...XI 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Enterococcus spp. nin Genel Özellikleri Enterococcus faecium Enterococcus faecium un Starter Kültür Olarak Kullanılması Enterococcus faecium un Probiyotik Özellikleri Enterococcus faecium un İndikatör Olarak Kullanılması Enterococcus faecium un Antimikrobiyel Özellikleri Enterococcus faecium un Patojenitesi Enterococcus faecium un Hemolitik Özellikleri Enterococcus faecium un Antibiyotik Direnci Enterococcus faecium un İzolasyonu İle İlgili Yapılan Çalışmalar Enterococcus faecium un Süt Ürünlerinden İzolasyonu İle İlgili Yapılan Çalışmalar Enterococcus faecium un Et Ürünlerinden İzolasyonu İle İlgili Yapılan Çalışmalar Enterococcus faecium un İzolasyonu ile İlgili Yapılan Diğer Çalışmalar Enterococcus faecium un Starter ve Yardımcı Kültür Olarak Kullanılması ile İlgili Yapılan Çalışmalar IV

7 Enterococcus faecium un Biyokoruyucu Kültür Olarak Kullanılması ile İlgili Yapılan Çalışmalar Enterococcus faecium un Probiyotik Kültür Olarak Kullanılması ile İlgili Yapılan Çalışmalar Enterococcus faecium un Antibiyotik Direnci ve Patojeniteleri İle İlgili Yapılan Çalışmalar Enterococcus faecium un Vancomycin Direnci İle İlgili Yapılan Çalışmalar MATERYAL VE METOT Materyal Referans Suşlar Besiyerleri Kimyasal Maddeler Metot Örneklerin Analize Hazırlanması Enterococcus faecium un İzolasyonu ve Sayımı Enterococcus faecium un Tanımlanması Tuz Toleransının Belirlenmesi Sıcaklık Toleranslarının Belirlenmesi Glikozdan Gaz Üretimi API Testi Vancomycin Direnç Testi Hemoliz Testi ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Enterococcus faecium un İzolasyonu ve Tanımlanması Enterococcus faecium un İzolasyonu API Testi BEA ve KAA Agar Besiyerlerinin Kıyaslanması Enterococcus spp. nin Hemoliz Varlığının Belirlenmesi V

8 4.5. Enterococcus spp. nin Vancomycin Dirençleri SONUÇ KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ VI

9 SİMGELER VE KISALTMALAR ADH : Arginin Dihydrolase AMD : Amidon Acidification API : Analytical Profile Index ARA : Arabinose Acidification ARE : Antibiotic Resistant Enterococci BEA : Bile Esculin Azide Agar ESC : Esculin GRAS : Generally Recognised As Safe GRE : Glicopeptide Resistant Enterococci GLYG : Glycogen Acidification HIP : Hipuric Acid Hydrolisis INU : Inulin Acidification ICMSF : International Commission on Microbiological Specifications For Foods KAA : Kanamycin Aesculin Azide Agar kob (cfu) : Koloni Oluşturma Birimi (Colony Forming Unit) LAB : Laktik Asit Bakterileri LAC : Lactose Acidification LAP : Leucine Amino Peptidase MAN : Mannitol Acidification MRS : ManRogoSharpe Agar PAL : Alkaline Phosphatase PYRA : Pyrarolidonyl Arylamidase RAF : Raffinose Acidification RIB : Ribose Acidification SOR : Sorbitol Acidification TRE : Trehalose Acidification TSA (CASO) : Trypticase Soy Agar VII

10 VRE VREF VP α GAL β GAL β GUR β HEM : Vancomycin Resistant Enterococcus : Vancomycin Resistant Enterococcus faecium : Voger Proskauer : α Galoctosidase : β Galactosidase : β Giucuronidase : β Haemolysis VIII

11 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 3.1. Araştırmada Kullanılan Besiyerleri ve Kullanım Amaçları Çizelge 3.2. Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis in Bazı Karakteristikleri Çizelge 4.1. Peynir ve Sucuk Örneklerinden Elde Edilen Analiz Sonuçları Çizelge 4.2. Tanımlanan Suşlar Çizelge 4.3. API 20 STREP Test Kiti ile Elde Edilen Biyokimyasal Test Sonuçları 45 Çizelge 4.4. Örneklerden İzole Edilen Enterococcus Türlerinin Sayım Sonuçları Çizelge 4.5. β Hemoliz Testi Sonuçları Çizelge 4.6. Vancomycin Direnç Testi Sonuçları IX

12 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 3.1. Enterococcus faecium un Tanımlanması Şekil 3.2. Enterococcus faecium un İzolasyonu ve Tanımlanması Şekil 3.3. API 20 Strep Test Sistemi X

13 RESİMLER DİZİNİ Resim 4.1. Enterococcus faecium (İzolat No: 28) Suşunun API 20STREP ile Tanımlanması Resim 4.2. Enterococcus faecium (İzolat No: 68) Suşunun API 20STREP ile Tanımlanması Resim 4.3. Enterococcus faecium (İzolat No: 69) Suşunun API 20STREP ile Tanımlanması Resim 4.4. Enterococcus faecium (İzolat No: 104) Suşunun API 20STREP ile Tanımlanması Resim 4.5. Enterococcus faecium Suşunun KAA Besiyerinde Görünüşü.. 49 Resim 4.6. Enterococcus faecium Suşunun BEA Besiyerinde Görünüşü.. 50 XI

14 1. GİRİŞ Ayşegül KARAKAŞ 1. GİRİŞ Enterococcus lar gıda mikrobiyolojisi ve klinik mikrobiyoloji açısından önemli laktik asit bakterileri arasında yer almaktadır (Franz ve ark., 2003; Klein, 2003). Enterococcus cinsi bakteriler doğada yaygın olarak bulunmakta olup, insan ve hayvanların gastrointestinal sistemindeki floralarının bir parçasıdırlar. Bu nedenle, bu bakterilerin primer kaynağı olarak, insan ve sıcak kanlı hayvanların intestinal yolları gösterilmektedir (Klein ve ark., 1998; Ringo ve Gatesoupe, 1998; Ke ve ark., 1999, Birollo ve ark., 2001). Ayrıca memeliler, kuşlar, böcekler, sürüngenler ile hava, su, lağım, toprak, bitki materyalleri ve çiğ materyaller gibi fekal kontamine olmuş ortamlarda bulunurlar (Lu ve ark., 2002; Doming ve ark., 2003). Bu kaynakların dışında, deniz ürünleri ve süt ürünleri gibi hayvansal kaynaklı gıdalar, sebzeler ile fermente gıdalarda da bu mikroorganizmalara rastlanmaktadır (Hayes ve ark., 2003; Kühn ve ark., 2003). Enterococcus cinsine ait bakteriler, genelde fekal çevrelerde yoğun olarak bulunmalarına karşın, gıdalarda üretim aşamalarında hijyenik olmayan koşullar sonucunda ortaya çıkarlar (Giraffa, 2003; Lukaskova ve Sustackova, 2003). Ayrıca intestinal ve çevresel kontaminasyonla da süt ve et gibi çiğ gıdalarda kolonize olabilirler. ph, sıcaklık ve tuza karşı olan dirençleri sayesinde, gıda üretimi sırasında canlı kalarak son ürünü de kontamine edebilirler. Bu sebeple gıdalarda bulunmaları kontaminasyonun bir göstergesi olarak kabul edilirken, fermente gıdalarda kötü üretim koşulları ve kontaminasyon seviyesinin bir göstergesi olarak bilinir (Hugas ve ark., 2003). Bu özelliklerinden dolayı Enterococcus ların sularda ve bazı gıda ürünlerinde hijyen indikatörü olarak kullanılmaktadır (Arizcun ve ark.,1997; Frahm ve Obst, 2003; Klein, 2003). Enterococcus cinsi bakteriler, gıdaların normal floralarının da bir parçası oldukları için, sadece kötü hijyen koşullarının göstergesi değildirler (Giraffa, 2002; Klein, 2003). Bu bakteriler birçok gıdada doğal olarak bulunan ve çeşitli gıdaların fermantasyonunda rol oynayan önemli mikroorganizmalardır (Cocconcelli ve ark., 2003; Guessas ve Kihal, 2004). Özellikle bazı fermente et ürünlerinin ve bazı peynir çeşitlerinin mikrofloralarının önemli bir kısmını oluştururlar (Giraffa, 2003). 1

15 1. GİRİŞ Ayşegül KARAKAŞ Diğer yandan, Enterococcus cinsi bakterilerin bazıları, et ürünlerinde, şarap ve meyve sularında bozulma yaparlar (Semedo ve ark., 2003). Bu organizmalar, sıcaklığa karşı dirençleri sayesinde ile pastörizasyonda canlılıklarını koruyabildikleri için pişmiş, dilimlenmiş ya da paketlenmiş etlerde çapraz kontaminasyon sonucunda gelişerek, diğer birçok laktik asit bakterileri gibi bozulma yapan mikroorganizmalar olarak tanımlanırlar (Hugas ve ark., 2003). Fermente sucuklarda da yüksek sayılarda bulundukları zaman bozulmaya neden olurlar (Giraffa, 2002). Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis gıdalardan ve bağırsaklardan en sık izole edilen, gıda proseslerinde yer alan en önemli türlerdir (De Vuyst ve ark., 2003; Klein, 2003). Bu iki tür, sucukların fermantasyonu sırasındaki baskın mikroflorayı oluştururlar (Papamanoli ve ark., 2003). Ayrıca süt ürünleri ve peynirlerde de yüksek sayılarda bulunurlar (Giraffa ve Sisto, 1997; Gelsomino ve ark., 2001; Vancanneyt ve ark., 2002). Her iki tür de peynir ve fermente süt ürünleri ile sucuk, salam gibi fermente gıdaların üretiminde, organoleptik özellikleri geliştiren, raf ömrünü ve stabilitesini arttıran doğal starter kültürlerdir (De Vuyst, 2000; Eaton ve Gasson, 2002; Ross ve ark., 2002; Vancanneyt ve ark., 2002; Linaje ve ark., 2004). Ayrıca, E. faecium ve E. faecalis karışık kültür ya da yardımcı kültürler olarak da kullanılırlar (Gelsomino ve ark., 2001). Bu bakteriler proteolitik ve lipolitik aktiviteleri sayesinde bazı peynirlerin olgunlaştırılmalarında önemli rol oynarlar (Sarantinopoulos ve ark., 2001). Enterococcus faecium, Akdeniz ülkelerinde üretilen Feta, Mozerella, La Serena ve Comte gibi peynirlerde doğal floralarının bir parçasıdırlar (Gelsomino ve ark., 2001; Sarantinopoulos ve ark., 2002). Enterococcus faecium; Listeria, Clostridium, Bacillus, Staphylococcus cinsine ait bazı patojen türleri inhibe edebilen ya da öldürebilen enterocin adı verilen bakteriyosinleri üretmektedir (Tarelli ve ark., 1994; Yıldırım ve Yıldırım, 2000). Bakteriyosinlerin gıdalarda istenmeyen mikroorganizmaların kontrol altına alınmasında önemli rol oynadığı düşünülmektedir (O Keeffe ve ark., 1999). Enterococcus cinsine ait bazı bakterilerin insanlar ve hayvanlar için probiyotik özellik taşıdığı ve gıdalarda probiyotik olarak kullanım alanı buldukları bildirilmektedir (Çakır ve ark., 2002; Eaton ve Gasson, 2002; Karahan ve Çakmakçı, 2

16 1. GİRİŞ Ayşegül KARAKAŞ 2002; Kühn ve ark., 2003; Papamanoli ve ark., 2003; Yaman ve Esendal, 2004). Günümüzde Enterococcus cinsi bakteriler hayvan beslenmesinin yanı sıra insanlar tarafından kullanılan probiyotik özellikli bazı farmasetik ürünlere ilave edilmektedir (Klein ve ark., 1998). Enterococcus faecium, bakteriyosin üretimi ve probiyotik özellikleri nedeniyle biyoteknolojik uygulamalar bulmasına rağmen, diğer taraftan bu bakterilerin birçok enfeksiyona neden olan fırsatçı patojenler oldukları da bildirilmektedir (Giraffa ve Sisto, 1997; Birollo ve ark., 2001; Ahmad ve ark., 2002; Eaton ve Gasson, 2002; Cocconcelli ve ark., 2003; Lund, 2003). Bu organizmalar endocartitis, üriner yol enfeksiyonları ile merkezi sinir sistemi ve solunum yollarında enfeksiyonlara neden olurlar (Vancanneyt ve ark., 2002; Gelsomino ve ark., 2003). Ayrıca, karın, safra yolu ve yanık ve kesiklerde enfeksiyon yapabilirler (Doming ve ark., 2003; Peters ve ark., 2003). Enterococcus lar düşük virulans faktör göstermelerine ve yüksek patojenik organizmalar olarak adlandırılmamalarına rağmen, önemli patojenler arasında gösterilmektedir (Lu ve ark., 2002) Enterococcus ların antimikrobiyel ajanlara olan dirençleri bu bakterileri fırsatçı patojenlere dönüştürmektedir (Hammes ve Hertel, 2001). Düşük virulans özelliklerine sahip olsalar bile, virulans özellikleri ve antibiyotiklere karşı dirençleri birleştiğinde tedavileri zor olmaktadır (Lund ve ark., 2002). Glikopeptide dirençli Enterococcus ların sayısının artmasıyla birlikte bu türler dünya çapında önemli bir problem olarak ortaya çıkmaktadır (Ke ve ark., 1999). Glikopeptidler immun sistemi zayıf ya da bastırılmış bireylerde birkaç enfeksiyona karşı en son çare olarak kullanılan antibiyotiklerdir. Günümüzde Enterococcus cinsi bakteriler Amerika da ikinci en sık hastane enfeksiyonu yapan bakteri olarak bildirilmektedir (Klein, 2003). Enfeksiyona neden olan Enterococcus cinsi bakteriler arasında en sık izole edilen türler Enterecoccus faecalis ve Enterecoccus faecium dur (Salminen ve ark., 1998; Lund ve ark., 2002). Enterococcus enfeksiyonlarda klinik izolatların % 85 ini Enterococcus faecalis, % 10 unu ise Enterococcus faecium oluşturmaktadır (Lu ve ark., 2002; Hammes ve Hertel, 2001). Meydana gelen enfeksiyonlarda, Enterococcus faecium, 3

17 1. GİRİŞ Ayşegül KARAKAŞ antibiyotiklere karşı Enterococcus faecalis ten daha dirençli olmasıyla dikkat çekmekte ve patojenik Enterococcus faecium un çok çabuk antibiyotik direnç mekanizması geliştirebilmesinin ve bu özelliğini transfer edebilme kabiliyetinin sağlık açısından önemli bir risk olduğu düşünülmektedir (Lund ve ark., 2002; Rinkinen ve ark., 2003). Bunun dışında Enterococcus spp. nin biyojen amin üretimi ile gıda intoksikasyonlarına neden olabilecekleri düşünülmektedir (Durlu-Özkaya ve Tunail, 2000; Giraffa, 2002; Yerlikaya ve Gökoğlu, 2002). Enterococcus lar yılardır probiyotik ve starter kültür olarak güvenli bir şekilde kullanılmıştır (Eaton ve Gasson, 2001). Gıda kaynaklı Enterococcus lar günümüze kadar herhangi bir klinik enfeksiyona neden olmamıştır. Ayrıca şimdiye kadar herhangi bir probiyotik Enterococcus enfeksiyonu rapor edilmemiştir (Rinkinen ve ark., 2003). Ancak bazı gıda hijyenistleri Enterococcus cinsi bakterilerin gıdalarda bulunmasından endişe etmektedir. Çünkü bu mkroorganizmalar henüz GRAS (generally recognised as safe) yani güvenilir olarak kabul edilmemişlerdir (Giraffa ve ark., 2000; Gelsomino ve ark., 2001). Enterococcus cinsi bakterilerin klinik olaylara neden olması sebebiyle, bu bakterilerin gıda fermantasyonlarında ve probiyotik olarak kullanılmaları günümüzde sorgulanmaktadır (Vancanneyt ve ark., 2002). Enterococcus faecium genellikle gıdalarda bulunan zararsız mikroorganizmalar iken, hastane enfeksiyonları yapan bakteriler olarak karşımıza çıkmaktadır. Bu nedenle bu organizmaların gıda mikrobiyolojisinde ve gıda proseslerinde kontrolü önem taşımaktadır. Bu araştırmada, farklı firmalar tarafından üretilen sucuk ve beyaz peynir örneklerinde Enterococcus faecium un varlığını belirlemek amacı ile izolasyon ve tanımlama yapılmıştır. Ayrıca gıdalardan izole edilen Enterococcus spp. nin vancomycin dirençleri ve hemoliz özellkleri araştırılarak, klinik kökenli Enterococcus spp. ile karşılaştırılmıştır. Bu çalışmanın sucuk ve peynir gibi gıdalardan izole edilen Enterococcus türlerinin virulans özellikleri araştırılarak insan sağlığı için bir tehtid oluşturup oluşturmadığının değerlendirilmesi ve bu türlerin 4

18 1. GİRİŞ Ayşegül KARAKAŞ probiyotik ya da starter kültür olarak gıdalarda kullanım alanı bulup bulamayacağına dair yapılacak araştırmalar için kaynak olabileceği düşünülmektedir. 5

19 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.1. Enterococcus spp. nin Genel Özellikleri Enterococcus spp., taksonomide 1984 yılından önce Streptococcus cinsi altında yer almaktaydı dan sonra Thiercelin tarafından bu cinsin ilk tanımlaması yapılmış ve 1993 yılında Thiercelin ve Jouhaud tarafından Enterococcus olarak tanımlanmıştır. Daha önce Streptococcus faecalis ve Streptococcus faecium olarak bilinen bakteriler, yeni sınıflandırmada Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium olarak adlandırılmıştır (Doming ve ark., 2003; Klein, 2003). Enterococcus cinsine ait bakteriler, aerobik ya da fakültatif anaerobik, katalaz (-), kok şeklindedirler (Gelsomino ve ark., 2001). Sıvı besiyerlerinde 0,6-2,0 x 0,6-2,5 mm çiftli ya da zincir şeklinde olup, endospor oluşturmazlar. Besin gereksinimleri komplekstir (Holt ve ark., 1994). Gelişebilmeleri için gerek B vitaminleri ve gerekse bazı temel amino asitler açısından pek çok gram (+) bakteriden daha fazla besin maddesine gereksinim duyarlar (Hayaloğlu ve Erginkaya, 2001). Bu bakteriler Lancefield D grubu içinde yer almaktadırlar (Giraffa, 2003). Laktozu fermente edebilirler, arabinoz pozitif ve pürivat negatiftirler (Willey ve ark., 1999). Karbonhidratları fermente ederek L (+) laktik asit oluştururlar ve bu özelliklerinden dolayı tipik homofermentatif laktik asit bakterileri olarak bilinirler, ancak gaz oluşturmazlar (Klein ve ark., 1998; De Vuyst, 2000; Doming ve ark., 2003; Linaje ve ark., 2004). Karbonhidrat metabolizmaları için Embden- Mayerof-Parnas yolunu kullanırlar (Morgen ve Hill, 2002) Enterococcus faecium Enterococcus faecium un belirgin bir kaynağı olmayıp, değişik kaynaklarda bulunurlar. Bu bakteriler lağım, hayvansal atıklar, toprak, yüzey suları, bitki ve sebzelerde bulunmaktadır (Marekova ve ark., 2003). Bu bakteriler birçok gıdada, özellikle de hayvansal orijinli gıdalarda bulunmaktadır. Enterococcus faecium fermente gıdalardan sıklıkla izole edilmektedir (Bodil, 2003; Klein, 2003). 6

20 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ Enterococcus faecium enzim aktiviteleri ile primer ve sekonder metabolitler oluşturarak, peynirlerin aromasına katkıda bulunmaktadır (Giraffa, 2003). Enterococcus faecium, asidifikasyon, proteoliz, sitrattan yararlanma, uçucu aromatik bileşikler üretme gibi fonksiyonel özelliklere sahip olması nedeniyle, bir çok geleneksel fermente gıdanın tat, koku ve aromasında önemli rol oynamaktadırlar. Bu nedenle de bazı gıdaların fermantasyonunda duyusal özellikleri arttırmak amacıyla da kullanılmaktadır (De Vuyst, 2000; Cocconcelli ve ark., 2003). Ayrıca Enterococcus faecium insanlarda ve hayvanlarda intestinal mikrofloranın dengesini korumak amacıyla probiyotik olarak kullanılmaktadır (Eaton ve Gasson, 2001; Strompfova, 2004). Tüm yararlarına rağmen pastörize süt ve seçilen laktik starter kültürlerle yapılan taze yumuşak endüstriyel peynirlerin yüksek derecede Enterococcus faecium ile kontaminasyonu, peynir üretimindeki olumsuz hijyenik koşullar nedeniyle, ürünlerin duyusal özelliklerinin bozulmasına neden olabilir. Bu nedenle de bu tip peynirlerde Enterococcus ların bulunması istenmez (Giraffa, 2003). Enterococcus faecium, et ve et ürünleri gibi sözkonusu ürünlerde, gıdalarda sıcaklık, ph ve tuza karşı dirençli olmaları nedeniyle sayıları yüksek düzeylere çıkabilmekte ve bozulma yapabilmektedirler (Callewaert ve ark., 2000). Bu yüzden fermente olmayan etlerde bozulmayı önlemek amacıyla bu bakterilerin inhibe edilmeleri gerekmektedir. Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis in pastörizasyon uygulanan konserve domuz etlerinde bozulma yaptıkları bildirilmektedir (Giraffa, 2002) Enterococcus faecium un Starter Kültür Olarak Kullanılması Bu bakteriler peynir ve et ürünlerinin üretiminde normal florada bulunması nedeni ile özellikle ev yapımı birçok peynir üretiminde doğal süt starter kültürleri arasında yer almaktadır (Sarantinopoulos ve ark., 2001; Ross ve ark., 2002; Giraffa, 2003; Saavedra ve ark.,2003). Peynirlerde Enterococcus faecium bulunması, bu ürünlerde organoleptik karakteristiklerin ortaya çıkmasına yardımcı olmaktadır (Sarantinopoulos ve ark., 2002). 7

21 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ Enterococcus faecium Akdeniz ülkelerinde geleneksel peynirlerin üretimi sırasında kulanılmaktadırlar. Asetaldehit, aseton, diasetil gibi tipik flavor bileşikleri üreterek istenen aromanın kazandırılmasına ya da duyusal özelliklerin geliştirilmesine katkıda bulunurlar (El-Din ve ark., 2002; De Vuyst ve ark., 2003). Enterococcus faecium proteolitik enzim üretimi ile peynir üretiminde kazeinin parçalanmasını sağlamaktadır. Ayrıca, peynir yapımı sırasındaki faydalı etkilerinden biri de esterazlarla süt yağını hidrolize etmeleridir (El-Din ve ark., 2002). Enterococcus faecium, peynirlerde aromanın gelişimine katkıda bulunmalarının yanı sıra, peynir kalitesinin arttırılmasında da önem taşırlar (Sarantinopoulos ve ark., 2001; Hugas ve ark., 2003; Saavedra ve ark., 2003). Özellikle Kuzey ve Güney Avrupa ülkelerinde çiğ veya pastörize sütten üretilen peynirlerde Enterococcus faecium doğal starter süt kültürü olarak bulunurlar. Geleneksel bu peynirler, iyi kaliteli çiğ sütlerin pastörize edilip, ºC de saat inkübe edilerek Enterococcus faecium un doğal seleksiyonunun gerçekleştirilmesi ile üretilmektedir (Giraffa, 2003). Portekiz, İspanya, İtalya ve Yunanistan gibi Avrupa ülkelerinde çiğ ya da pastörize sütten üretilen çeşitli geleneksel peynirlerden birçok Enterococcus faecium suşu izole edilmiştir (Devriese ve Pot, 1995; El-Din ve ark., 2002; Gelsomino ve ark., 2003; De Vuyst ve ark., 2003). Enterococcus faecium, geleneksel yöntemle üretilen Mozzarella peynirlerinin yapımında starter kültür olarak kullanılan ve bu peynirlerden izole edilen önemli türdür (El-Din ve ark., 2002). Feta peynirlerinin üretiminde de Enterococcus faecium ve Enterococcus durans baskın laktik mikroflora olarak starter kültürleri oluşturmaktadır (Sarantinopoulos ve ark., 2002). Çalışmalar Enterococcus faecium un Manchego, Armada, Picante, Majoero, Teleme, Monte Veronese, Fontin, Kefalotyri, Caprino, Serra, Vecano ve Comte gibi geleneksel peynirlerin üretimi ve olgunlaştırılmalarında yüksek sayılarda bulunarak, ürün özelliklerini olumlu yönde etkilediğini ve bu peynirlerde starter kültürler olarak kullanılabileceğini ortaya koymuştur (Sarantinopoulos ve ark., 2002). 8

22 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ Enterococcus faecium Cebreiro peynirlerinin yapımında starter kültürler olarak kullanılmaktadır. Mozerella peynirlerinin üretiminde ise Enterococcus faecalis, diğer LAB leri ile birlikte starter kültürlerin hazırlanmasında kullanılmaktadır (Franz ve ark., 1999). Enterococcus faecium K77D suşu fermente süt ürünlerinde starter kültür olarak kullanılmasının İngiltere de ACNFP (Advisory Committee on Novel Foods and Proceses) tarafından tavsiye edilmektedir (El-Din ve ark., 2002). Enterococcus faecium yardımcı kültürler olarak da kullanılmaktadır. Enterococcus faecium türlerinin yardımcı kültürleri olarak kullanılma nedeni, peynirin olgunlaştırılmasını hızlandırmak, istenen tadı elde etmek ya da probiyotik özelliklerinden yararlanmak şeklinde ifade edilmektedir (Giraffa, 2003). Akdeniz ülkelerinde birçok küçük işletmelerde, çiftlik ve yerel kasaplarda, geleneksel veya ev yapımı fermente et ürünlerinin üretimi, starter kültürler kullanılmadan, doğal floraya bağlı olarak gerçekleştirilmektedir. Ev yapımı bu ürünler yüksek ph ya sahip olmaları nedeniyle, Enterococcus lar için iyi bir gelişme ortamı sağlamaktadır. Böylece Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis bu ürünlerin fermantasyonu süresince yüksek sayılarda bulunabilmekte ve fermantasyona katkıda bulunmaktadır. Doğal yolla üretilen bu ürünler birçok ülkede eskiden beri beğenilerek tüketilmektedir (Hugas ve ark., 2003). Enterococcus faecium un fermente et ürünlerindeki rolleri ve sucuklardaki biyokimyasal aktiviteleri ilgili bazı araştırmalarda, Enterococcus faecium un sucuk aromasına glikolitik, proteolitik ve lipolitik aktiviteleri ile katkıda bulundukları ifade edilmiştir. Ayrıca taze etlerde kırmızı renk oluşumunu sağlayan metyoglobinin indirgenme reaksiyonlarında da rol aldığı bildirilmektedir (Hugas ve ark., 2003) Enterococcus faecium un Probiyotik Özellikleri Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium un bazı suşları probiyotik olarak kullanılmaktadır (Devriese ve ark., 1995; Klein ve ark., 1998; Hammes ve Hertel, 2001; İnanç, 2005). Enterococcus faecalis sadece hayvanlarda probiyotik olarak kullanılırken, Enterococcus faecium hem insanlarda, hem de çiftlik 9

23 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ hayvanlarında probiyotik olarak kullanılmaktadır (Semedo ve ark., 2003; Bozkurt ve Aslım, 2004). Enterococcus faecium türleri çiftliklerde hayvanların gelişiminde ve hastalıkların önlenmesinde ve hayvan yemi üretiminde probiyotik olarak kullanılmaktadır (Devriese ve ark., 1995; Çakır ve ark., 2002). Hayvan yetiştiriciliğinde bu bakterilerin probiyotik olarak kullanılması hem hastalıklara karşı direncin, hem de hayvanların gelişiminin arttırılmasında pozitif sonuçlar vermektedir. Ayrıca ürettikleri ve diğer bakterilerin gelişmesini inhibe eden bileşikleri sayesinde intestinal kas tabakasında hızla çoğalarak patojenik bakterilere karşı ilk savunma tabakasını oluşturmaktadırlar (Yaman ve Esendal, 2004). Enterococcus faecium, hayvan beslenmesinde antibiyotiklerin kullanılmasına alternatif olarak gösterilmektedir (Hammes ve Hertel, 2001). Enterococcus faecium un ticari probiyotik preparatları bulunmaktadır (Sanders, 1999; Cocconcelli ve ark., 2003). Bu bakterilerin hayvanlarda ve insanlarda probiyotik olarak gastroenteritisin tedavisinde ve mikrobiyal dengenin korunmasına katkıda bulunduğu bildirilmektedir (Hugas ve ark., 2003). Enterococcus faecium un immun sisteminin güçlendirilmesi, kanser ve diyarenin önlenmesi gibi olumlu etkileri olduğu tespit edilmiştir (Rinkinen ve ark., 2003; Temmerman ve ark., 2003). Son yıllarda Enterococcus faecium 68 (SF68) içeren preparatların akut enteritis, turist diyaresi ve diğer bağırsak bozukluklarına karşı kullanıldığı rapor edilmiştir. (Papamanoli ve ark., 2003; Linaje ve ark., 2004) Enterococcus faecium un İndikatör Olarak Kullanılması Enterococcus faecium gıdalarda starter kültür ve probiyotik olarak kullanıldıkları gibi, gıda kontaminantları olarak da karşımıza çıkmaktadır (Eaton ve Gasson, 2001). İlk olarak fekal çevrelerde fark edildikleri için fekal kontaminasyonun indikatörleri olarak tanımlanırlar (Gelsemino ve ark., 2001; Samakupa ve ark., 2003) ve içme sularında hijyenin ve fekal kontaminasyonun indikatörü olarak kullanılırlar (Arizcun ve ark., 1997; Frahm ve Obst, 2003; Kühn ve ark., 2003). 10

24 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ Enterococcus faecium intestinal ve çevresel kontaminasyonla et ve süt ürünleri gibi hayvansal orijinli gıdalarda kolonize olmaktadır. Enterococcus faecium un aside olan toleransı ve indikatör olarak kullanılan koliformların aside karşı bu bakterilerden daha hassas olmaları nedeniyle Enterococcus faecium un gıdaların üretimi sırasında yetersiz hijyenik uygulamaların ve kontaminasyon seviyesinin tespitinde daha iyi sonuç vereceği bildirilmektedir (Birollo ve ark., 2001; Mannu ve ark., 2003). Bu organizmalar, gıda üretimi ile gıdaların dondurulması aşamalarında ve işletmelerde yetersiz sanitasyonu göstermede önemli indikatörler olarak kullanılmaktadırlar (Karapınar, 1995; Giraffa, 2002; Doming ve ark., 2003). Enterococcus spp. nin indikatör olarak kullanımları sınırlı olmakla birlikte, bazı gıdalarda belirli sayıların üzerinde bulunmaları sanitasyon koşullarının yetersizliğinin göstergesi olarak kullanılmaktadır. Ancak ICMSF komisyonu Enterococcus lar için herhangi bir mikrobiyolojik limit önermemiştir (Karapınar, 1995) Enterococcus faecium un Antimikrobiyel Özellikleri Son yıllarda gıdaların raf ömrünü uzatmak, gıda güvenliğini sağlamak amacıyla daha az kimyasal madde kullanımı ve minimum proses görmüş gıda elde etmeye eğilim vardır. Yeşil teknoloji adı verilen bu uygulamalar için bakteriyosin gibi mikrobiyel metabolitlerin kullanılmasının yeni bir biyokoruyucu yöntem olabileceği belirtilmektedir (Ross ve ark., 2002). Enterococcus faecium, Listeria, Clostridium, Bacillus, Staphylococcus cinsine ait bazı patojen bakterileri inhibe edebilen ya da öldürebilen enterocin adı verilen bakteriyosinleri üretmektedir (Callewaert ve ark., 2000; Hammes ve Hertel, 2001). Enterocin ler gram pozitif bakterilere karşı aktif olmalarına rağmen, bu bileşiklerin gram negatif Vibrio cholerae ya karşı antibakteriyel etkisi olduğu belirlenmiştir (O Keeffe ve ark, 1999). Enterococcus faecium belirtilen bu inhibisyon etkisinden dolayı, gıda endüstrisinde bozulma yapan ya da gıda kaynaklı patojen bakterilere karşı gıdaların raf ömrünü uzatmakta ve güvenliğini sağlamaktadır (Leroy ve ark., 2003; Strompfova ve ark., 2003; Linaje ve ark., 2004). 11

25 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ Entecoccus faecium ve Enterococus faecalis suşlarının ürettikleri enterocin ler, diğer bakteriyosinlere göre daha iyi fizikokimyasal özellik ve biyolojik aktivite gösterdikleri için, teknolojik potansiyel taşıyan bakteriyosinlerdir (Ennahar ve ark., 2001; Park ve ark., 2003; Moreno ve ark., 2003). Bu bileşiklerin gelecekte tarımda ve endüstriyel atıkların değerlendirilmesinde de kullanım alanı bulabileceği düşünülmektedir (Marekova ve ark., 2003). Ayrıca biyomedikal uygulamalar, bu bileşiklerin ineklerde mastitis tedavisinde kullanılabileceklerini göstermektedir (Strompfova ve ark., 2003). Bakteriyosin üreten Enterococcus faecium un aynı zamanda iyi bir rekabetçi olması da bu organizmanın teknolojik açıdan önemini artırmaktadır. Bu özellikleri nedeniyle Enterococcus faecium gıda fermantasyonlarında starter ya da karışık kültürler olarak kullanım alanı bulmaktadır (Sarantinopoulos ve ark., 2002). Yakın zamanda yapılan çalışmalar, bakteriyosin üreten suşların starter kültür olarak kullanımları soğutulmuş ve fermente gıdaların muhafazasında yoğunlaşmıştır (Bayizit ve Yılsay, 2000). Bakteriyosinlerin teknolojik uygulamaları, peynir üretimi sırasında bakteriyosin üreten suşların peynirlere ikinci bir kültür ya da koruyucu bir kültür veya probiyotik kültürler olarak eklenmesi şeklindedir. Enterococcus faecium türlerinin ikinci starter kültür olarak mikroorganizmanın kendisinin kullanılmasının yanı sıra, ürettiği bakteriyosin de saflaştırılarak gıdalara eklenebilmektedir (Callewaert ve ark., 2000; Giraffa, 2003; Leroy ve ark., 2003; Saavedra ve ark., 2003). Enterococcus faecium un ürettiği enterocin ler anti-listeria aktivitesi gösteren en önemli bakteriyosinler arasındadır (Carnio ve ark., 1999; Ennahar ve ark., 2001; Herranz ve ark., 2001; Moreno ve ark., 2003). Cheddar peynirlerinin üretiminde Enterococcus faecium, Listeria aktivitesinin inhibisyonu için kullanılmaktadır (Leroy ve ark., 2003; Saavedra ve ark., 2003). Et ürünlerinin üretiminde Enterococcus faecium un bakteriyosinojenik veya biyokoruyucu starter kültürler olarak kullanılması, bu ürünlerin doğal yolla dayandırılmalarını sağlamaktadır (Hugas ve ark., 2003). 12

26 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ Bakteriyosin üreten Enterococcus faecium suşları gastrointestinal yolda istenilen populasyonun devamlılığı açısından da önem taşımaktadır (Strompfova ve ark., 2004) Enterococcus faecium un Patojenitesi Gıdalarda sıklıkla kullanılan Enterococcus faecium un virülans faktörleri tam olarak bilinmemektedir (Lund, 2003; Lukasova ve Sustackova, 2003; Semedo ve ark., 2003). Enterococcus faecalis in Enterococcus faecium dan daha fazla virulans faktör taşıdığı bildirmektedir (Franz ve ark., 2001). Enterococcus ların virulans faktörleri taşıyıcı dokusuna yapışma, invazyon, hemoliz, agregasyon maddeleri, fermente gıdalarda biyojenik amin üretimi ve gelatinase, hyaluronidase, cytolycin, Esp (enteroccal surface protein) gibi yüksek moleküler ağırlıklı ekstraselüler yüzey proteini ve diğer toksik maddeleri salgılamaları ile plazmid üretimi olarak sayılabilir (Giraffa, 2002; De Vuyst ve ark., 2003; Semedo ve ark., 2003). Enterococcus faecium un patojenitelerindeki en önemli faktör ise bu organizmaların antibiyotiklere karşı olan dirençleridir (Butaye ve ark., 1999; Franz ve ark., 2001). Antibiyotiklere karşı direnç hem doğal olarak bulunabilmekte, hem de antibiyotiğe karşı duyarlı türlerin yeni genler kazanması ya da mutasyona uğramaları sonucunda sonradan da kazanılabilmektedir. Enterococcus faecium türlerilerinin virulansı kullanılan antibiyotiklere olan direnç nedeniyle artmaktadır (Giraffa, 2002; Ünlü ve ark., 2002; Lukasova ve Sustackova, 2003) Enterococcus faecium un Hemolitik Özellikleri Enterococcus larda hemolitik aktivite önemli virulans faktör olarak ortaya çıkmaktadır (Linaje ve ark., 2004). Beta-hemoliz daha çok Enterecoccus faecalis ve Enterecoccus faecium türlerinde meydana gelmektedir. Hemolitik aktivitenin bulunmaması süt ürünlerinde kullanılacak bakteriyosin üreten starter kültürleri için 13

27 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ bir seçim kriteridir. Ancak bir suşun hemolitik aktiviteye sahip olmaması bu suşun virulans özellik taşımadığını göstermemektedir (De Vuyst ve ark., 2003) Enterococcus faecium un Antibiyotik Direnci Enterococcus cinsi bakteriler genellikle düşük virulansa sahip olmalarına rağmen, Enterococcus faecium ve Enterococcus faecelis kullanılan antibiyotiklere karşı dirençli olmaları nedeniyle, klinik terapilerde önemli problemlere neden olmaktadır (Panagea ve Chadwick, 1996; Giraffa ve ark., 2000; Bodil ve ark., 2002; Peters ve ark., 2003). Amerika da sağlıklı bireylerin ortalama % 5-20 sinde Enterococcus kolonizasyonu ya da enfeksiyonu rapor edilmiştir (Namdari, 1998). Enterococcus faecalis enfeksiyonların % ından sorumlu iken, Enterococcus faecium ise % 5-15 inden sorumlu olduğu bildirilmiştir (El-Din ve ark., 2002; Erdem ve ark., 2004). Amerika da Enterococcus faecium, hastane enfeksiyonlarına en sık neden olan ikinci bakteridir (Wegener ve ark., 1997; Klare, 2003). Bu bakteriler klinik uygulamalarda kullanılan bir çok antibiyotiğe karşı dirençlidirler (Lukasova ve Sustackova, 2003). Bazı kaynaklarda Enterococcus faecium un antibiyotiklere karşı Enterococcus faecalis ten daha dirençli olduğu belirtilmektedir (Quednau ve ark., 1999). Antibiyotiklerin uygunsuz bir şekilde hayvan beslenmesinde gelişim arttırıcı olarak kullanılması, dirençli Enterococcus faecium türlerinin ortaya çıkmasında selektif ajan rolü taşımaktadır (Gaukel ve Spieβ, 1998; Quednau ve ark., 1999; Butaye ve ark., 2000; Giraffa, 2002; Cocconcelli ve ark., 2003). Kullanılan bu antibakteriyeller arasında insan tedavisinde de kullanılan antibiyotikler bulunmaktadır (Gaukel ve Spieβ, 1998; Butaye ve ark., 1999). İnsan tedavisinde ve hayvanlarda gelişim arttırıcı olarak kullanılan antibakteriyeller arasında çapraz direnç bulunmaktadır. Çapraz direnç sonucunda hayvan gelişiminde kullanılan antimikrobiyellere direnç, insanlarda tedavi amacıyla kullanılan ilaçlara dirençle sonuçlanmaktadır (Emborg ve ark., 2003) li yılların sonunda ilk defa glikopeptidlere karşı dirençli Enterococcus (GRE) tespit edilmiş ve bunun neden olduğu enfeksiyon güçlükle tedavi 14

28 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ edilebilmiştir (Peters ve ark., 2003). Vancomycin ve teicpoplanine karşı direnç, gıda kaynaklı Enterococcus lar arasında en sık izole edilen direnç fenotipidir (Giraffa, 2002). Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis bu glikopeptidlere karşı direnç kazanmışlardır (Willey ve ark., 1999; Başustaoğlu ve ark., 2001). Teicoplanin ve vancomycin gibi glikopeptidlerin önemi, çoklu ilaç direnci gösteren türlere ya da penicilin, ampicillin gibi antibiyotiklere karşı alerji gösteren kişilerin klinik tedavisinde kullanılmalarından kaynaklanmaktadır (Giraffa, 2002). Bu antibiyotikler immun sistemi zayıf ya da bastırılmış bireylerde birkaç enfeksiyona karşı en son çare olarak kullanılan antibiyotiklerdir (Salminen ve ark., 1998). Bu nedenle vancomycin e dirençli Enterococcus lar (VRE) halk sağlığı için global bir tehdit olarak ortaya çıkmaktadır (Gelsomino ve ark., 2003). VRE ler çoklu ilaç direnci gösteren bakterilerin yol açtığı enfeksiyonların tedavisinde ve vancomyicin ile tedaviye ihtiyaç duyulan hastalarda tedavinin başarısız olmasına neden olmaktadırlar (Lukasova ve Sustackova, 2003). Bu nedenle hastanelerde vancomycin e dirençli Enterococcus ların ortaya çıkması endişe vermektedir (Gelsomino ve ark., 2003). VRE lerin ortaya çıkmasıyla Enterococcus lar kullanılan bütün antibiyotiklere karşı direnç kazanmış durumdadırlar (Wegener ve ark., 1997). VRE lerin sebep olduğu enfeksiyonlar, Avrupa ve Amerika da önemli bir problem haline gelmiştir (Barton ve Gary, 1995; Eaton ve Gasson, 2002). Son yıllarda Enterocccus faecium en sık ortaya çıkan VRE olarak tanımlanmaktadır (Roberts, 1997; Salminen ve ark., 1998; De Vuyst ve ark., 2003). Vancomycin e dirençli Enterococcus faecium (VREF) suşları, hastane ortamları, insanlar, hayvansal kaynaklar, akuatik habitatlar ve tarımsal ürünlerden izole edilmiştir (Lukasova ve Sustackova, 2003). Yapılan çalışmalar vancomycin e yüksek derecede direnç gösteren Enterococcus faecium suşlarının hayvansal orjinli gıdalarda bulunduğunu göstermiştir (Robredo ve ark., 2000). Vancomycin e dirençli Enterococcus faecium suşları lağım suları ile sulanmış bitkiler, atık sular ve dışkılar gibi çeşitli kaynaklardan çevresel kontaminasyon yoluyla gıdalara ulaşabilmektedir (Giraffa, 2002). Kesim yerlerindeki kötü hijyen koşulları sonucunda karkaslar fekal kontaminasyonla kontamine olarak hayvansal gıdalar bu dirençli türler için bir vektör 15

29 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ olmaktadır (Lemcke ve Bülte, 2000). VREF suşları biftek, kümes hayvanları, domuz ve diğer et ürünlerinden izole edilmiştir (Emborg ve ark., 2003). Kontamine gıdalar aracılığı ile VRE lerin insanlara transfer edilebilme riski endişe doğurmaktadır (Robredo ve ark., 2000; Klare, 2003). Direnç genlerinin gıda zinciri aracılığı ile insanları da etkileyebileceği düşünülmektedir (Peters ve ark., 2003). Pastörize ve çiğ sütlerde antibiyotiğe dirençli Enterococcus ların (ARE) varlığı tespit edilmiştir. ARE ler et ürünleri, yemeye hazır gıdalar ve hatta probiyotik kültürlerde bulunmaktadır. Bu ürünlerde antibiyotik direnç bulunması, direncin gıda zincirine yayılması riskini doğurmaktadır. Kanamycin ve gentamicin e yüksek direnç gösteren Enterococcus faecium türleri Fransız peynirlerinden ve hastanedeki hastalardan izole edilmiştir (Giraffa, 2002). Enterococcus faecium süt endüstrisinde, özellikle de peynir üretiminde starter olarak kullanılmasına rağmen günümüze kadar süt ürünlerinde VRE ile ilgili bir enfeksiyon rapor edilmemiştir (Robredo ve ark., 2000). Gıda kaynaklı Enterococcus faecium türlerinin patojen olduklarına dair hiçbir kanıt bulunmamasına rağmen, bu organizmalar taşıyıcıya adapte olabilen antimkrobiyel direnç ve virulans özellikler taşıyabilirler (Hayes ve ark., 2003). Bu bakteriler, genetik materyallerini değiştirebilmeleri ve genetik bilgilerini diğer türlerle bile paylaşabilmeleri nedeniyle, mevcut genomun değişmesine yol açmakta yada plazmidler aracılığıyla genetik materyallerin hücreler arası transferine neden olmaktadır (Yaman ve Esendal, 2004). Böylece bu organizmalar kendisi bile virulans faktör taşımazken, zararsız bir türü patojen haline dönüştürebilmektedir (Quednau ve ark., 1999; De Vuyst ve ark., 2003). Yapılan konjugasyon çalışmaları klinik Enterococcus türlerindeki transfer sıklığının, gıda kaynaklı veya probiyotik türlere göre daha başarılı olduğunu göstermiştir (Klein, 2003). Yapılan araştırmalar klinik örneklerdeki Enterococcus türlerinin, gıda kaynaklı türlerden daha fazla virulans faktör taşıdığını ve ayrıca starter kültür olarak kullanılan Enterococcus türlerinin, klinik izolatlara göre daha düşük patojeniteye sahip olduklarını göstermektedir (Franz ve ark., 2001). Klinik izolatlardaki virulans faktörlerin etkileri, gıdalardan izole edilen türlerinkinden çok 16

30 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ daha fazladır. Gıdalardan izole edilen Entrococcus faecium suşları genellikle virulans faktör taşımamaktadır (Eaton ve Gasson, 2001). Ancak halen güvenli olarak bilinen bir suşun konjugasyonla bilinen virulans faktörlerden birini kazanma riski vardır. Probiyotik ve starter kültür olarak yüksek sayılarda Enterococcus tüketilmesi sonucunda, virulans gen taşıyan plazmidlerin yayılabileceği düşünülmektedir (Eaton ve Gasson, 2002). Çünkü gıdalarda bulunan Enterecoccus faecalis ve Enterecoccus faecium un antibiyotik direnç taşıyabildikleri tespit edilmiştir (Semedo ve ark., 2003). Ayrıca gıda endüstrisinde starter kültür olarak kullanılan Enterococcus faecium suşlarının, klinik örneklerden izole edilen medikal orijinli patojenlerden in vitro koşullarda transkonjugasyon yoluyla virulans faktörler elde edilebildikleri tespit edilmiştir (Quednau ve ark., 1999; De Vuyst ve ark., 2003). Bu nedenle antimikrobiyel dirençli Enterococcus faecium populasyonları taşıyan gıdaların tüketimi, muhtemel tranferlere aracı olabilir ve taşıyıcıda direnç determinantlarının oluşması ve kolonizasyonu ile sonuçlanabilir (Hayes ve ark., 2003). Günümüzde halen Enterococcus ların fermente gıdalardaki virülans faktörleri ve antibiyotik direnci hakkında çok az veri bulunmaktadır. Gıda ortamındaki gen transferinin ve fermantasyon sırasındaki antibiyotik direnç dinamiklerinin nasıl meydana geldiği ile ilgili bilgilere ihtiyaç duyulmaktadır (Cocconcelli ve ark., 2003). Patojen olan Enterococcus türleri ile gıdalarda güvenli olarak kullanılan kültürler arasındaki fark tam olarak bilinmemektedir (Eaton ve Gasson, 2001). Virülans faktörlerin ortaya çıkması ve fermente gıdalarda kullanılan bakteriyosin üreten ya da koruyucu, starter veya probiyotik olarak kullanılan kültürlerin güvenliği suşa özgüdür. Günümüzde halen Enterococus ların starter kültür olarak kullanılmalarının güvenilir olup olmadığına cevap vermek güçtür (Franz ve ark., 2001). Bu organizmaların endüstriyel alanda ve gıda proseslerinde kullanılmaları halen sorgulanmaktadır (Sarantinopoulos ve ark., 2002). Gıda kültürü olarak kullanılacak Enterococcus türlerinin antibiyotik dirençliliği ve virulans özellikleri açısından güvenilirliliği test edilmelidir (De Vuyst ve ark., 2003). 17

31 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ 2.3. Enterococcus faecium un İzolasyonu İle İlgili Yapılan Çalışmalar Enterococcus faecium un Süt Ürünlerinden İzolasyonu İle İlgili Yapılan Çalışmalar Arizcun ve ark. (1997) koyun sütünden yapılmış Feta, La Serena, Torta del Casar gibi peynirlerde Enterococcus sayımlarının cfu/g civarında olduğunu belirtmişlerdir. Bu peynirlerdeki yüksek orandaki Enterococcus sayımlarının proteolitik ve lipolitik aktivite sonucunda peynirlerin aromalarına olumlu katkıda bulunduklarını belirtmişlerdir. Koyun sütünden üretilen Roncal ve Idiazabal peynirlerinde bulunan Enterococcus sayımlarının, koyun sütünden üretilen diğer peynir çeşitlerine göre daha fazla olduğunu bildirmişlerdir. Yaptıkları çalışmada Roncal ve Idiazabal peynirlerinin 120 günlük olgunlaştırılmasından sonra toplam 282 Enterococcus izole edilerek tanımlanmışlardır. En fazla izole edilen türlerin Enterococcus faecalis ve onu takiben de Enterococcus faecium olduğunu belirtmişlerdir. Bu bakterilerin Indiazabal peynir üretiminde uygulanan dumanlama proseslerinden etkilenmediklerini ifade etmişlerdir. Mannu ve ark. (1999), sığır sütünden üretilen ve üretiminde starter kültür kullanılmayan Pecorino Sardo peynirlerinin mikroflorasını incelemişler ve bu peynirlerde sadece Enterococcus ve Lactococcus türlerinin bulunduğunu tespit etmişlerdir. Gelsomino ve ark. (2001), bu organizmaların sütlere direkt hayvan veya insan dışkısı ya da kontamine su kaynakları, ekipmanlar veya depolama tanklarından bulaştıklarını bildirmişlerdir. Cheddar peynirinin üretimi sırasında çeşitli kaynaklardan izole ettikleri Enterococcus türlerini tanımlamışlar ve sığırlarda izole edilen türler içinde Enterococcus faecium baskın iken; insan dışkısı, süt ve peynirlerde ise Enterococcus casseliflavus ve daha sonra da Enterococcus faecalis in en sık izole edilen tür olduğunu bildirmişlerdir. Süt depolama tankları ve ekipmanlarda ise izole edilen türlerin sadece Enterococcus casseliflavus ve Enterococcus faecalis olduğunu belirtmişlerdir. 18

32 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ El-Din ve ark. (2002), Enterococcus faecium un çiğ sütteki dominant flora olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca peynirlerde sık rastlanma nedenlerinin başında, bu bakterilerin yüksek sıcaklık, tuz ve aside olan toleranslarından ileri geldiğini belirtmişlerdir. Manopoulou ve ark. (2003), Feta peynirlerinden elde edilen 146 izolatın 29 tanesinin Enterococcus faecium olduğunu ve bu türlerin peynir üretiminden olgunlaştırma sonuna kadar varlığını sürdürdüğünü tespit etmişlerdir. Giraffa (2003), pastörizasyondan sonra oluşan çevresel kontaminasyonun, Enterococcus faecium un pastörize sütlerden üretilen peynirlerde doğal mikrofloralar olarak ortaya çıkması ile sonuçlandığını belirtmiştir. Saavedra ve ark. (2003), Arjantin de geleneksel yöntemle üretilmiş Tafi peynirlerinden izole ettikleri Enterococcus türlerinin 122 tanesini Enterococcus faecium olarak tanımlamışlardır Enterococcus faecium un Et Ürünlerinden İzolasyonu İle İlgili Yapılan Çalışmalar Wegener ve ark. (1997), Enterococcus ların et ürünlerine bulaşmasının kesim sırasında olduğunu belirterek, yapılan bir çalışmada farklı kesimhanelerden domuz karkasları üzerindeki Enterococcus sayısının /100 cm 3 olduğu bildirmişlerdir. Bunlar arasındaki dominant mikroflorayı ise Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis in oluşturduğunu belirtmişlerdir. Giraffa (2002), Enterococcus spp. nin çiğ etlerde sayılarının cfu/g civarında olduğununu belirterek, et ürünlerinde fekal veya çevresel kontaminasyonla gıdaların fermantasyonu sırasında çoğaldığını bildirmişlerdir. Papamanoli ve ark. (2002), fermente sucuklardan izole ettikleri LAB lerinin % 4 ünü Enterococcus spp. nin oluşturduğunu tespit etmişlerdir. Hugas ve ark. (2003), yaptıkları bir çalışmada Alman ve İtalyan fermente sucuklarda olgunlaştırma prosesinin sonunda hem starter kültür kullanılan, hem de kullanılmayan sucuklarda Enterococcus konsantrasyonunun arasında olduğu 19

33 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ bildirilmişlerdir. Enterococcus ların sucukların olgunlaştırılması sırasındaki varlığını geniş aralıktaki gelişim sıcaklıkları ve tuza olan yüksek toleransına bağlamışlardır Enterococcus faecium un İzolasyonu İle İlgili Yapılan Diğer Çalışmalar Wessels ve ark. (2002), yaptıkları çalışmada çiğ süt, krema, tereyağı ve fermente süt ürünlerinden izole ettikleri Enterococcus türlerinin 54 tanesinin Enterococcus faecium, 40 tanesinin Enterococcus faecalis, 14 tanesinin ise Enterococcus durans olduğunu bildirmişlerdir. Giraffa (2003), yaptığı çalışmada, Enterococcus faecim un 68 ºC de 30 dakikalık ısıl işlem sonunda canlılığını sürdürebildiğini göstermiştir. Bu nedenle fermente olan ya da olmayan gıdalardaki Enterococcus varlığının kaçınılmaz olduğunu ifade etmiştir. Barakat ve ark. (2000), ticari olarak üretilip, modifiye atmosferle paketlenmiş tavuk etlerinin 3.5 ºC de 7 güne kadar depolanması sırasında oluşan baskın mikrofloranın Lactococcus spp. ve Carnobacterium spp. ile birlikte Enterococcus faecalis olduğunu tespit etmişlerdir Enterococcus faecium un Starter ve Yardımcı Kültür Olarak Kullanılması İle İlgili Yapılan Çalışmalar Gardiner ve ark. (1999), yaptıkları çalışmada probiyotik kültür olarak kullanılan Enterococcus faecium PR88 in Cheddar peynirinde yardımcı kültür olarak kullanımı araştırmışlardır. Yardımcı kültür olarak eklenen bu suşun olgunlaştırma sonunda sayımı alındığında iyi gelişim gösterdiğini tespit etmişlerdir. Ayrıca bu kültürle üretilen peynir ile kontrol örneğini karşılaştırmışlar ve sonuçta PR88 eklenen Cheddar peynirinde uçucu aromatik bazı bileşenlerin daha yüksek seviyelerde bulunduğu gözlemlemişledir. Ayrıca bu suşun, peynir kompozisyonunu etkilemediğini belirterek, yapılan duyusal değerlendirmede PR88 eklenen peynirin daha iyi puanlama aldığını ifade etmişlerdir. 20

34 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ Stanton ve Ross (2000), Lactubacillus ve Enterococcus faecium Fargo 688 kullanarak Cheddar peyniri ve yoğurt üretmişler ve Enterococcus faecium suşunun Cheddar peynirinin aromasını geliştirdiğini belirlemişlerdir. Giraffa ve ark. (2000), Picante peynirlerinden izole edilen Enterococcus faecium suşlarının peynirlerde sitrat metabolizmasını kullanarak olgunlaştırma sırasında asetaldehit, diasetil, aseton gibi uçucu bileşikleri oluşturduklarını ve böylece peynir aromasına katkıda bulunduğu bildirmiştir. Giraffa (2002), probiyotik olarak kullanılan Enterococcus faecium PR88 suşunun Cheddar peynirinin üretiminde kullanıldığında aroma oluşumuna pozitif katkıda bulunduğunu belirtmiştir. Hayaloğlu ve Erginkaya (2001), Mısır da Enterococcus faecalis in tek veya karışık suşlarının kullanılarak yoğurt benzeri bir ürün elde edildiği ve bu bakterinin yeterince proteoltik aktivite göstererek istenen düzeyde asit ve aroma oluşturduğunu belirtmişlerdir. El-Din ve ark. (2002), çiğ sütten yapılan Mısır Domiatti ve Mish peynirlerinden çeşitli Enterococcus türleri izole etmişlerdir. İzole edilen suşların proteolitik ve lipolitik aktivitelerini incelemek amacıyla peynir üretimi yapmışlar ve peynir üretiminde Enterococcus faecium kullanılan örnekleri kontrol örneği ile kıyasladıklarında, bu örneklerin organoleptik özellikleri geliştiren daha fazla suda çözünebilir nitrojen ve toplam serbest amino asit içerdiğini tespit etmişlerdir. Bu özellikleri nedeniyle Enterococcus faecium kültürlerinin geleneksel peynir üretiminde adjunct (yardımcı) kültür olarak kullanılabileceğini belirtmişlerdir. Gülmez ve Güven (2002), Enterococcus faecalis INIA4 suşu ilave edilerek üretilen peynirlerin, duyusal muayenelerde kontrol örneğine göre daha fazla puan aldığını bildirmişlerdir. Franz ve ark. (2003), Enterococcus faecium suşlarını Feta peynirlerinin üretiminde duyusal ve fizikokimyasal özellikleri geliştirmek amacıyla yardımcı kültürler olarak kullanıldıklarını bildirmişlerdir. Sarantinopoulos ve ark. (2002), yaptıkları çalışmada Feta peyniri üretiminde starter kültür olarak Enterococcus faecium FAIR-E 198 ve Enterococcus faecium FAIR-E 243 kültürlerinin kombinasyonu kullanmışlardır. Her iki Enterococcus 21

35 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ faecium suşunun da starter kültür olmayan diğer laktik asit bakterileri, Micrococcus ve koliformlar üzerine olumlu etkide bulunduğunu gözlemlemişlerdir. Bu suşların ana uçucu bileşenler olarak etanol, asetat, aseton, aseteldehit, asetoin ve diasetil ürettiklerini tespit etmişler ve her iki suşun da tamamen olgunlaşmış peynirlerin aroma, tat, renk ve tekstür gibi hemen hemen bütün duyusal özelliklerini olumlu yönde etkilediklerini bildirmişlerdir. Bu çalışma sonunda Enterococcus faecium suşlarını Feta peyniri yapımında karışık kültür olarak kullanımını önermişledir. Giraffa (2003), birkaç çalışmada Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus durans türlerinin Feta, Venaco, Cebreiro ve Hispanico gibi İtalyan yarı pişmiş peynirlerinin üretiminde mezofilik ve termofilik LAB leri ile birlkte starter kültür olarak kullanıldığını bildirmiştir. Ayrıca Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis türlerinin mezofilik ve termofilik LAB leri ile birlikte yarı pişmiş İtalyan peynirlerinin üretiminde yardımcı kültürler olarak kullanıldığını belirtmişlerdir. Aynı çalışmada ürüne ilave edilen bu bakterilerin peynirlerde tat, aroma, renk, yapı gibi hemen hemen tüm duyusal profile pozitif etki yaptığını belirtmiştir. Bu türlerle üretilen peynirlerde çözünür nitrojen, toplam aminoasit, uçucu serbest yağ asitleri, uzun zincirli serbest yağ asitleri ile diasetil ve asetoin içeriğinin yüksek olduğunu bildirmiştir. Hugas ve ark. (2003), fermente sucuklardan izole edilen Enterococcus faecium CTC492 nin sucuk üretiminde starter kültür olarak kullanıldığında, bu suşun proses sonuna kadar gelişim gösterdiğini tespit etmişlerdir Enterococcus faecium un Biyokoruyucu Kültür Olarak Kullanılması İle İlgili Yapılan Çalışmalar Hugas-Maurici ve ark. (1999), Enterococcus faecium CTC492 suşunun Listeria monocytogenes e karşı antimikrobiyel etkisini göstermişlerdir. O Keeffe ve ark., (1999), yapılan çalışmalarda Enterococcus faecium un ürettiği enterocin lerin laktik asit bakterileri, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Clostridium botilinum, Clostridium perfiringens, 22

36 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ Clostridium tyrobutyricum ve diğer Clostridium spp. üzerine antibakteriyel etkilerinin tepit edildiğini belirtmişlerdir. Callewaert ve ark. (2000), bakteriyosin üreten Enterococcus faecium suşlarının, sucukların fermantasyonunda, dilimlenmiş ve vakum paketlenmiş etlerde Listeria monocytogenes ve mukoz oluşturan laktik asit bakterilerinin gelişiminin önlenmesinde kullanıldığını bildirmişlerdir. Ayrıca sucuk üretiminde starter kültür olarak kullandıkları Enterococcus faecium CCM4231 ve Enterococcus faecium RZS C13 suşlarının Listeria spp. yi inhibe ettiğini belirleyerek bu suşları etlerde karışık kültür olarak önermişlerdir. Herranz ve ark. (2001), İspanyol fermente sucuklardan izole ettikleri Enterococcus faecium P21 suşunun Listeria monocytogenes i inhibe ettiğini göstermişlerdir. Sarantinopoulos ve ark. (2002), güçlü anti-listeria aktivitesi gösteren Enterococcus faecium suşlarının silaj, süt ürünleri, balık, sebzeler ve fermente sucuk gibi çeşitli ortamlardan izole edildiğini belirtmişlerdir. Leroy ve ark. (2002), denemelerde Listeria spp. ye karşı aktivite gösteren enterocin lerin hem fermente, hem de fermente olmayan gıdaların doğal olarak korunmalarında büyük bir önem taşıdıkları bildirmişlerdir. Tarelli ve ark. (2002), yaptıkları çalışmada izole ettikleri Enterococcus faecium suşunun Listeria monocytogenes e karşı antagonistik etkisini belirlemişlerdir. De Vuyst ve ark. (2003), bakteriyosin üreten Enterococcus faecium suşlarının peynir yapımında koruyucu kültür ya da karışık kültür olarak kullanıldıklarında, Listeria ve Clostiridium a karşı antibakteriyel etkisi olduğunu ve bu suşların olgunlaştırmaya da katkıda bulunabileceğini bildirmişlerdir. Franz ve ark. (2003), peynirlerden izole edilen Enterococcus faecium WHE 81 suşunun Listeria monocytogenes i inhibe eden enterocin A ve enterocin B ürttiklerini bildirmiştir. Başka bir çalışmada ise fermente sucuk üretiminde bakteriyosin üreten Enterococcus faecium suşlarının kullanılmasının Listeria monocytogenes i inhibe ettiğini belirterek, Enterococcus faecium u fermente sucuk üretiminde biyokoruyucu olarak önermişlerdir. 23

37 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ Giraffa (2003), bakteriyosin üreten Enterococcus faecium suşlarının, geleneksel kimyasal koruyuculara göre daha avantajlı olduğunu ve et ürünlerinde ortaya çıkan patojenlerin gelişimini endellediğini bildirmiştir. Yaptığı çalışmada peynirlerde koruyucu olarak kullanılan Enterococcus faecium kültürlerinin enterocin üretiminin Listeria ya karşı etkisinin olgunlaştırma süresince devam ettiğini ve ürünlerin organoleptik karakteristiklerine ve ticari starter aktivitelerine hiçbir olumsuz etkisinin olmadığını bildirmiştir. Hugas ve ark. (2003), bakteriyosin üreten Enterococcus faecium RZSC13, Enterococcus faecium CCM4231, Enterococcus faecalis AS48 suşlarının model sucuk üretiminde olgunlaştırma sonunda Listera yı inhibe ettikleri belirtmişlerdir. Ayrıca sucuk fermantasyonu sırasında Salmonella, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, ve Staphylococcus aureus gibi majör mikrobiyel tehlikeleri kontrol etmek amacıyla, et ortamında iyi bir yarışçı olan, enterocin A ve B üreten Enterococcus faecium CTC492 starter ya da biyokoruyucu kültür olarak kullanılabileceğini belirtmişlerdir. Çalışmaları sonucunda pişirilerek yemeye hazır gıda ürünlerinin dilimleme ve paketleme sırasında patojen bakterilerle kontamine olması halinde koruyucu herhangi bir etkenin bulunmadığını hatırlatarak, enterocin üreten Enterococcus faecium suşlarının bu ürünlerde kullanım alanı bulabileceğini bildirmişlerdir. Leroy ve ark. (2003), bakteriosin üreten Enterococcus faecium fermente sucukların üretiminde karışık kültür olarak kullanılmasının Listeria sayısını azaltılmasına etki ettiğini bildirerek, ürettikleri model Cheddar peynirinde Enterococcus faecium RZS C5 suşunu karışık kültür olarak tavsiye etmişlerdir. Ayrıca Enterococcus faecium RZS C5 suşunun fermente sucuk üretiminde de Listeria sayımının azalmasına yardımcı olan karışık kültür olarak kullanımıyla ilgili başarılı çalışmalar bulunduğunu belirtmişlerdir. Marekova ve ark. (2003), bu bakterilerin Listeria ve Bacillus gibi gıda kontaminantlarına karşı gıda ürünlerini korumak amacıyla endüstriyel olarak kullanıldıklarını bildirmişlerdir. Çalışmalarında Enterococcus faecium EK 13 suşunun Listeria, Bacillus, Staphylococcus spp. yi inhibe eden bakteriyosin ürettiğini tespit etmişlerdir. 24

38 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ Moreno ve ark. (2003), ürettikleri model Cheddar peynirinde Enterococcus faecium RZS C5 ve Enterococcus faecium DPC 1146 suşlarını karışık kültür olarak kullanmışlar ve bu bakterilerin enterocin üretiminin, peynirin olgunlaştırma aşamasının sonuna kadar devam ederek indikatör Listeria LMG suşunu inhibe ettiğini göstermişlerdir. Park ve ark. (2003), Enterococcus faecium JMC 5804 suşunun Clostridium spp., Listeria monocytogenes ve VRE leri (vancomycin e dirençli Enterococcus) inhibisyon etkisini bulmuşlardır. Työppönen ve ark. (2003), çeşitli et ürünlerinin fermantasyonu sırasında antimikrobiyel bileşik üreten Enterococcus faecium suşlarının kullanımının bu ürünlerdeki Listeria monocytogenes ve E. coli O157:H7 sayısını azalttığını bildirmişlerdir. Simonova ve Laukova (2004), tavşanlardan izole etikleri Enterococcus faecium EF 2019 suşunun antimikrobiyel özellik taşıdığını göstermişlerdir Enterococcus faecium un Probiyotik Kültür Olarak Kullanılması İle İlgili Yapılan Çalışmalar Koneman ve ark. (1994) ise, ishal olan hastalarda Enterococcus faecium un probiyotik olarak kullanıldığı durumlarda ishal süresinin azaldığını bildirmişlerdir. Karahan ve Çakmakçı (1996), domuz bağırsaklarından izole edilen Enterococcus faecalis suşlarının in vitro koşullarda E. coli yi inhibe ettiğini saptamışlardır. Waterman ve Small (1998), fermente et ürünlerinde ısıl işlem uygulanmamasının probiyotik olarak kullanılan bu kültürlerin gastrointestinal yola iletilmesinde etkili olduğunu bildirmişlerdir. Franz ve ark. (1999), Enterococcus faecium suşlarının bazı probiyotik preparatlarının marketlerde gastrointestinal dengeyi geliştirmek için besin katkıları olarak satıldığını dile getirmişlerdir. Gardiner ve ark. (1999), Cheddar peynirlerinin Enterococcus faecium un gastrointestinal yola iletilmesinde etkili bir araç olduğunu belirtmişlerdir. 25

39 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ Sanders (1999), Enterococcus faecium suşlarının farmasetik ürünler şeklinde probiyotik olarak kullanıldığını bildirmiştir. Stanton ve Ross (2000), Lactubacillus ve Enterococcus faecium Fargo 688 kullanarak ürettikleri yoğurt ve Cheddar peyniri ile 21 gün boyunca beslenen domuzların immun sistemini geliştiğini tespit etmişlerdir. Audisio ve ark. (2001) tavuklardan izole edilen Enterococcus faecium CRL1385 probiyotik özellik taşıdığını göstermişlerdir. Doyle (2001), Enterococcus faecium 18C23 suşunun enterotoksijenik E. coli nin intestinal dokuya bağlanmasını önlediğini bildirmiştir. Lund ve ark. (2002), S. thermophilus ve Enterococcus faecium içeren Causida kültürünün kolesterolün düşürülmesinde probiyotik olarak kullanılan bir ticari preparat olduğunu belirtmişleridir. Crittenden ve ark. (2003), probiyotik yoğurt üretmek için çeşitli kültür kombinasyonları denemişler ve en iyi kombinasyonun S. thermophilus ve Enterococcus faecium olduğunu saptamışlardır. Hugas ve ark. (2003), Enterococcus faecium F688 fermente et ürünlerinde probiyotik olarak satılan ticari bir suş olduğunu ve bu suşun sucuklarda olgunlaştırma sonunda 10 7 cfu/g e ulaşabilen iyi bir yarışçı olduğunu bildirmişlerdir. Saavedra ve ark. (2003), Son yıllarda Enterococcus faecium suşlarının, Cheddar peynirlerinde ve fermente et ürünlerinde probiyotik kültürler olarak kullanıldığını belirterek, bu bakterilerin probiyotik etkisinin, kolesterolün sindirim sisteminden kana absobsiyonunun azaltılması şeklinde olduğunu bildirmişlerdir. Tsai ve ark. (2004), probiyotik özellikteki Enterococcus spp. nin ticari preparatlar dışında farklı kaynaklardan da aldıklarına dikkat çekmiş ve geleneksel yöntemle fermente edilen peynir ve süt ürünlerinden Enterococcus faecium izole edildiğini vurgulamışlardır. Yaptıkları çalışmada dışkılardardan izole edilen LAB leri ve bunların fonksiyonel özelliklerini araştırırken izole ettikleri Entreccocus faecium Tm39 suşunun intestinal epitellere bağlanma özelliği gösteren, safraya toleranslı ve Helicobacter pylori ye karşı antagonistik aktivite gösteren bir suş olduğunu tespit etmişlerdir. Çalışmalarında bu suşun vancomycin e direnç göstermediğini ve insan intestinal epitel hücrelerine invasiv etki göstermediğini ifade 26

40 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ ederek, bu suşun gerekli güvenlik değerlendirmelerinden sonra probiyotik kültür olarak kullanılabileceğini ifade etmişlerdir. Strompfova ve ark. (2004), yapılan bir çalışmada Enterococcus faecium içeren ticari bir probiyotik preparat olan Vitacanis in Salmonella enterica ser. typhimurium a karşı koruyucu etki gösterdiğini bildirmişlerdir. Yaptıkları çalışmada 40 köpek dışkısından izole edilen Enterococcus izolatının bakteriosin üretimi, düşük ph, safra toleransı, antibiyotiğe direnç ya da tolerans gibi özelliklerini araştırmışlardır. İzole edilen türler arasında en iyi probiyotik özelliği Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis in gösterdiğini bildirmişlerdir. Bu çalışma sonucunda Enterococcus faecium EF01 suşunun gastrointestinal yolda yaşayabildiğini ve burada kolonize olduğunu ve hedef gram pozitif bakterilere karşı aktivite gösterdiğini ve bu nedenle de yeni bir probiyotik suş olabileceği belirtmişlerdir. Yaman ve ark. (2004), yapılan bir çalışmada Entreccocus faecium un ticari preparatlarının İsrail sazanlarının yem dönüşümünü ve büyüme oranını arttırdığını ve probiyotik kültürün kullanılmaya başlanmasından 14 gün sonra sazan balığının mkroflorasında E. coli tespit edilemediğini bildirmişlerdir. Hlivak ve ark. (2005), yaptıkları değerlendirmeler sonucunda Enterococcus faecium M-74 ün insanlarda probiyotik uygulamalarının kardiyovasküler hastalıkların tedavisinde veya önlenmesinde kullanılabileceğini belirtmişlerdir Enterococcus faecium un Antibiyotik Direnci ve Patojeniteleri İle İlgili Yapılan Çalışmalar Quednau ve ark. (1999), antibiyotik direncin plazmid transferi ile gerçekleştiğini ifade ederek, Enterococcus faecium un türleri tavuklardaki dönor direnç genlerini alabildiğini bildirmiştir. Eaton ve Gasson (2001), gıdalardan ve klinik materyallerden izole edilen Enterococcus türlerinin virülans faktörlerini araştırmışlardır. Yapılan çalışmada Enterococcus faecalis suşlarının hepsinin virulans faktör taşıdığını, ancak medikal izolatların, gıdalarda starter olarak kullanılan izolatlara göre daha fazla virulans 27

41 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ faktöre sahip olduğunu tespit etmişlerdir. İzole edilen Enterococcus faecium suşlarında ise virulans faktöre rastlamamışlardır. Giraffa (2002), İsveç te perakende satışa sunulan tavuklardan izole edilen Enterococcus türlerinde tetracycline, erythoromycin ve vancomycin gibi antibiyotiklere karşı direnç tespit edildiğini ve bacitracin, choloamphenicol, erythoromycin, gentamicin, penicilin, rifampicin, tetracycline ve streptomycine karşı dirençli Enterococcus türlerinin dilimlenmiş et, sucuk, biftek, domuz eti ve çiğ etlerden izole edildiğini bildirmiştir. Lukasova ve Sustackova (2003), sucuk ve çiğ sütten izole edilen Enterococcus türlerinin, tetracycline, chloramphenicol, gentamicin, erythromycin e karşı direnç tespit edildiğini belirterek, bir çalışmada Enterecoccus faecium ve Enterecoccus faecalis in tetracyclin direnç genlerini Lactococcus lactis sub species lactis var diacetylactis in kromozomuna transferinin gösterildiğini bildirmişlerdir. Yaptıkları çalışmada ise Mısır Dominati peynirlerinden izole ettikleri Enterecoccus faecium suşlarının oxacillin, caphazolin e karşı dirençli, ampicillin, amoxicillin ve cefaclor a hassas olduğu tespit etmişlerdir. Cocconcelli ve ark. (2003), model peynir ve fermente sucuk üretiminde klinik kaynaktan alınan Enterococcus faecalis in antibiyotik direnç ve virülans genlerini fermantasyon sırasında gıda kaynaklı Enterococcus faecalis e transfer edebildiğini göstermişlerdir. Erdem ve ark. (2004), hastanede yatan hastalardan izole edilen 17 Enterococcus faecalis ve 10 Enterococcus faecium suşunun aminoglikozidlere karşı yüksek derecede dirençli olduğunu tespit etmişlerdir. Hugas ve ark. (2003), Enterococcus türlerinin konjugasyonla genetik özelliklerini değiştirebilme kabiliyetinde olduklarını belirterek, salam ve çiğ et gibi et ürünlerinden izole edilen Enterococcus türlerinin antibiyotik direnç deteminantlarını Enterococcus faecalis JH2-2 ye transfer ettiklerini bildirmişlerdir. Mannu ve ark. (2003), süt ürünlerinden izole edilen 40 Enterococcus faecium, dışkılardan izole edilen 28 Enterococcus faecium ve klinik izolatlardan izole edilen 28 Enterococcus faecium suşunun antbiyotik direnci ve virulans faktörlerini 28

42 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ araştırmışlardır. Sonuçta kinik izolatların gıda kaynaklı izolatlardan daha patojenik olduğunu göstermişlerdir Enterococcus faecium un Vancomycin Direnci İle İlgili Yapılan Çalışmalar Wegener ve ark. (1996), kesimhanelerden ve marketlerden aldıkları et ürünlerinden izole ettikleri Enterococcus faecium suşlarında vancomycin direnci tespit etmişlerdir. Giraffa ve Sisto (1997), peynirlerden izole edilen Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis suşlarının vancomycin e direnç göstermediğini tespit etmişlerdir. Robredo ve ark. (2000), 18 farklı süpermarketten alınan 101 tavuk, domuz ve hindi etlerinde ve 50 kesimhaneden alınan tavuk dışkılarında VRE varlığını araştırmışlardır. Tavuk örneklerinin % 27.2 sinde, tavuk dışkılarının ise % 16 sından VRE tespit edilmiştir. VRE lerin 11 tanesi Enterococcus durans, 10 tanesi Enterococcus faecalis, 10 tanesi ise Enterococcus faecium olarak tanımlanmıştır. Başustaoğlu ve ark. (2001), Ankara da akut lösemi olan bir hastanın kanından vancomycin e dirençli Enterococcus faecium izole ederek, bu olayın Türkiye de izole edilen ilk glikopeptide dirençli Enterococcus faecium suşu olduğunu bildirmişlerdir. Yaptıkları çalışmada 1266 alet, 176 rektal örnek ve hastanede bir haftadan fazla kalan hastalarda vancomycin e dirençli Enterococcus türlerinin varlığını araştırmışlar, ancak hiçbir örnekten vancomyine dirençli Enterococcus faecium izole edememişlerdir. Hauben (2003), vancomycin e dirençli 148 Enterococcus türünün pastörize et ürünleri ile fermente sucuklarda gelişebilme özelliklerini araştırmışlar ve 143 Enterococcus faecium suşunun bütün et ürünlerinde canlılığını sürdürebildiğini belirtmişlerdir. 29

43 3. MATERYAL VE METOT Ayşegül KARAKAŞ 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal Araştırmada Adana ilindeki çeşitli market ve pazardan temin edilen farklı firmalara ait olan 30 beyaz peynir örneği ve 20 sucuk örneği kullanılmıştır Referans Suşlar Araştırmada referans suş olarak, Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Balcalı Hastanesi nden temin edilen Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis suşları kullanılmıştır Besiyerleri verilmiştir. Araştırmada kullanılan besiyerleri ve kullanım amaçları Çizelge 3.1 de Kimyasal Maddeler Araştırmada kullanılan kimyasal maddeler aşağıda belirtilmiştir. Kimyasal Maddeler Özellik Sodium azide Merck Vancomycin MP Biomedicals Koyun Kanı RSHM 30

44 3. MATERYAL VE METOT Ayşegül KARAKAŞ Çizelge 3.1. Araştırmada Kullanılan Besiyerleri ve Kullanım Amaçları Besiyeri Özellik Kullanım Amacı Kanamycin Aesculin Azide Agar (KAA) Bile Esculin Azide Agar (BEA) Merck Acumedia Enterococcus İzolasyonu ve Sayımı Enterococcus İzolasyonu ve Sayımı İnkübasyon Koşulları 37 ºC de Saat, Aerob 37 ºC de 24 Saat, Aerob Trypticase Soy Agar Merck Hemoliz 37 ºC de 24 Saat, Aerob Trypticase Soy Agar -Broth (CASO) ManRogosa Sharpe Agar- Broth (MRS) M17 Agar- Broth Glikoz Fosfat Broth Merck Merck Merck % 6.5 NaCl de Gelişim Değişik Sıcaklıklarda Gelişim % 6.5 NaCl de Gelişim Değişik Sıcaklıklarda Gelişim % 6.5 NaCl de Gelişim Değişik Sıcaklıklarda Gelişim Glikozdan Gaz Üretimi 37 ºC de 48 Saat, Aerob 10 ºC de 48 Saat, Aerob 45 ºC de 48 Saat, Aerob 37 ºC de 48 Saat, Aerob 10 ºC de 48 Saat, Aerob 45 ºC de 48 Saat, Aerob 37 ºC de 48 Saat, Aerob 10 ºC de 48 Saat, Aerob 45 ºC de 48 Saat, Aerob 37 ºC de 48 Saat, Aerob 3.2. Metot Örneklerin Analize Hazırlanması Beyaz peynir ve sucuk örnekleri laboratuara getirilerek aynı gün analize alınmıştır. Örneklerde Enterococcus faecium varlığını belirlemek ve sayım için 90 ml seyreltme sıvısı (%0.85 NaCl, % 0.1 pepton) bulunan erlen içerisine 10 ar g. peynir 31

45 3. MATERYAL VE METOT Ayşegül KARAKAŞ ve sucuk örnekleri tartılmış ve Ultraturax homojenizatörde 5000 devirde 10 d. homojenizasyon işlemi uygulanarak, 10 d. bekletilmiştir. Daha sonra hazırlanan örneklere 10-1 lik dilüsyonlarla gerekli seyreltmeler yapılmıştır Enterococcus faecium un İzolasyonu ve Sayımı Gerekli seyreltmeleri yapılan örnekler Kanamycin Aesculin Azide Agar ve Bile Aesculin Azide Agar besiyerlerine yayma kültürel ekim yöntemi kullanılarak ekilmiştir. BEA besiyerine sterilizasyondan sonra, 0.2 g/l sodium azide eklenerek besiyeri selektif hale getirilmiştir. BEA besiyeri 24 saat 37 ºC de, KAA besiyeri ise saat 37 ºC de inkübe edildikten sonra, koloni etrafında siyah halka oluşturan bakteriler şüpheli koloniler olarak değerlendirilerek, bu kültürlerin sayımları alınmıştır. Ayrıca şüpheli koloniler sürme ekim yöntemi ile Man Rogosa Sharpe (MRS) agarda saflaştırılmıştır Enterococcus faecium un Tanımlanması Enterococcus faecium un tanımlanması için yapılan analizler ve işlem basamakları şekil 3.1. ve 3.2 de özetlenmiştir. Şüpheli koloniler gram boyamaya tabi tutulmuş ve gram (+) koklar belirlenerek, katalaz testi yapılmıştır. Katalaz (-) olan suşların değişik sıcaklıklardaki ve % 6.5 NaCl tuzda gelişimleri ile glikozdan gaz üretme gibi özellikleri tespit edilmiştir. 32

46 3. MATERYAL VE METOT Ayşegül KARAKAŞ Gram Pozitif, Katalaz Negatif, Kok Şekilli İzolatlar % 6.5 NaCl ve 10 0 C ve 45 0 C de Gelişim EVET Glikozdan Gaz Üretimi HAYIR Biyokimyasal Analizler (API 20STREP) Şekil 3.1. Enterococcus faecium un Tanımlanması (Klein, 2003) 33

47 3. MATERYAL VE METOT Ayşegül KARAKAŞ 0.2 g/l Sodium Azide Peynir ve Sucuk Örnekleri BEA BEA ve KAA Besiyerlerinde 37 ºC de 24 s. İnkübasyon Siyah Halkalı Koloniler Gram (+)/ Katalaz (-) Kok Tuz Toleransı (+) Sıcaklık Toleransı (+) %6.5 NaCl İçeren MRS, MRS, M17,CASO Broth-agar M17, CASO Broth-agar 37 ºC de 48 s.inkübasyon 10 ºC ve 45 ºC de 48 s. İnkübasyon Glikozdan Gaz Üretimi (-) Glikoz Fosfat Broth 37 ºC de 48 s. İnkübasyon Biyokimyasal Tanımlama (API 20 Strep) Enterococcus spp. Vanomycin Direnci CASO Agar (4 ve 6 µg ml -1 vancomycin) Hemoliz MRS Agar (%1 Koyun Kanı) (37 ºC de 24 s. İnkübasyon) (37 ºC de 24 s. İnkübasyon) Gelişim (-) Gelişim (+) Koloni Etrafında Şeffaf Zon Dirençsiz Dirençli β-hemoliz Şekil 3.2. Enterococcus faecium un İzolasyonu ve Tanımlanması 34

48 3. MATERYAL VE METOT Ayşegül KARAKAŞ Tuz Toleranslarının Belirlenmesi İzolatların tuz toleranslarını belirlemek amacıyla % 6.5 NaCl içeren MRS broth-agar, M17 broth-agar, CASO broth-agar besiyerleri kullanılmıştır. Kültürler 4000 devirde 15 d. santrifüj edilerek besiyeri atılmıştır. 1 ml saf su ile sulandırıldıktan sonra yukarıda belirtilen besiyerlerine ekim yapılmıştır. Kültürlerin 37 ºC de 48 saat inkübasyondan sonra gelişimleri incelenmiştir Sıcaklık Toleranslarının Belirlenmesi İzolatların sıcaklık toleranslarının belirlenmesi için MRS broth-agar, M17 broth-agar, CASO broth-agar hazırlanmıştır. 48 saat inkübasyondan sonra suşların 10 ºC ve 45 ºC deki gelişimleri incelenmiştir (Facklam ve ark., 2002) Glikozdan Gaz Üretimi İzolatların glikozdan gaz üretimlerini test etmek amacıyla glikoz fosfat broth içeren tüplere durham tüpü konularak 37 ºC de 24 saat inkübe edilmiş ve gaz üretmeyen kültürler değerlendirmeye alınmıştır. % 6.5 tuz içeren besiyerinde, 10 ºC de ve 45 ºC de gelişim gösteren ve glikozdan gaz üretmeyen kültürler biyokimyasal analizlere tabi tutulmuştur (Facklam ve ark., 2002) API Testi Elde edilen kültürlerin bazı biyokimyasal özelliklerini değerlendirmek amacıyla API 20 Strep (Biomeriux) test kiti kullanılmıştır. Bu test kiti Streptococcus ve Enterococcus türlerinin tanımlanması için 20 biyokimyasal test içermektedir. API sistemindeki biyokimyasal testlere göre elde edilen pozitif ve negatif sonuçlar bilgisayar programında değerlendirilmiştir. Şekil 3.3 de API 20 Strep sisteminin uygulaması gösterilmektedir (Biomerieux, 2004). 35

49 3. MATERYAL VE METOT Ayşegül KARAKAŞ Koloni API Suspension Medium 2 ml 100 µl 500µl VP HIP ESC PYRA αgal βgur βgal PAL LAP ADH API GP Medium RIB ARA MAN SOR LAC TRE INU RAF AMD GLYG RIB GLYC : Mineral Yağ Ekleme 37 ºC de 4 Saat İnkübasyon VP HIP ESC PYRA αgal βgur βgal PAL LAP ADH RIB ARA MAN SOR LAC TRE INU RAF AMD GLYG VP VP1 + VP2 (10 Dakika Bekleme) HIP NIN (10 Dakika Bekleme) PYRA, αgal, βgur, βgal, PAL, LAP ZYMA + ZYMB (Biyokimyasal Reaksiyondaki Renk Değişimine Göre Değerlendirme) API Lab Bilgisayar Programında Okuma (Not: API 20 Strep Analytical Profile Index te sonuç vermeyenler 37 ºC de 24 saatlik inkübasyon sonunda tekrar değerlendirme yapılmıştır) Şekil 3.3. API 20 Strep Test Sistemi (Biomerieux, 2004) 36

50 3. MATERYAL VE METOT Ayşegül KARAKAŞ Vancomycin Direnç Testi Vancomycin direncini tespit etmek amacıyla BEA besiyerlerine 4 µg ml -1 ve 6 µg ml -1 vancomycin eklenerek sürme ekim yapılmıştır. Ekim yapan kültürlerden vancomycin içeren besiyerinde gelişim gösterenler vancomycin e dirençli olarak değerlendirilmiştir (Facklam ve ark., 2002) Hemoliz Testi Enterococcus türlerinin hemoliz varlığının araştırılmasında % 1 (w/v) koyun kanı içeren Trypticase soy agara ekim yapılmıştır. Kanlı agarda üretildiklerinde koloni çevresinde şeffaf bir zon oluşturan koloniler β hemoliz özelliği göstermektedirler (Wilke, 2005). Çizelge 3.2 de Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis in bazı karakteristikleri verilmiştir. 37

51 3. MATERYAL VE METOT Ayşegül KARAKAŞ Çizelge 3.2. Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis in Bazı Karakteristikleri (Koneman ve ark., 1994; Domig ve ark., 2003) KARAKTERİSTİKLERİ Enterococcus faecium Enterococcus faecalis Hareketlilik C'de Gelişim C'de Gelişim C'de Gelişim + + %6.5 NaCl' de Gelişim + +/- ph 9.6 da Gelişim + + %40 Safrada Gelişim C'de 30 dak. Direnç + + % 0.04 Tellurite de Gelişim - + % 0.01 Tetrazolium da Gelişim - + Sarı Pigment Üretimi - Hemoliz D +/- Hareketlilik - - Glikozdan Gaz Üretimi - - Katalaz Testi - - Argininden Amonyak Üretimi + + Mannitolden Asit Üretimi + + Arginin Hidrolizi + Hippurate Hidrolizi D+ Voges-Proskauer Reaksiyonu + D-Xylose den Asit Üretimi D- L-Rahamnose den Asit Üretimi D- Sükrozdan Asit Üretimi D+ + Laktozdan Asit Üretimi + + Mellibiose den Asit Üretimi D+ - Raffinozdan Asit Üretimi - - Melezitose den Asit Üretimi - + Adonitolden Asit Üretimi - Sorbitolden Asit Üretimi D- + Laktik Asit Üretimi L APPA - PYRA + Alkali Fosfataz - Piruvat Fermantasyonu - D-Arabitol - L-Arabitol - Dulcital - 2-Ketoglukan - APPA: Alanil-Fenilalanil-Prolinerylamidase; PYRA:Pyrolidonylarylamidase; D: Değişken; L: L (+) Laktik Asit; D +: Genellikle Pozitif; D -: Genellikle Negatif; + : Pozitif; - : Negatif 38

52 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ayşegül KARAKAŞ 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Araştırmada 20 sucuk ve 30 peynir örneğinde Enterococcus faecium varlığı araştırılmıştır. Bu ürünlerden izole edilen Enterococcus faecium suşlarının ve diğer Enterococcus spp. nin tanımlamaları yapılarak, vancomycin dirençleri ve virulans faktör olan hemoliz varlığı araştırılmıştır. Ayrıca elde edilen sonuçlar referans olarak kullanılan klinik kökenli Enterococcus spp. ile karşılaştırılmştır Enterococcus faecium un İzolasyonu ve Tanımlanması Enterococcus faecium un İzolasyonu BEA ve KAA agardan sucuk ve peynir örneklerine ait olan ve izole edilen şüpheli koloniler gram boyamaya tabi tutularak, gram (+) kok olanlara katalaz testi uygulanmıştır. Katalaz (-) olan kolonilerin, 10 ºC ve 45 ºC sıcaklıklardaki ve % 6,5 NaCl tuzda gelişimleri incelenmiş ve bu koşullarda gelişme gösteren suşların glikozdan gaz oluşturma özellikleri değerlendirilmiştir. Glikozdan gaz oluşturmayan suşlar, daha sonra tanımlanmak üzere stok kültür olarak saklanmıştır. Çizelge 4.1 de peynir ve sucuk örneklerinden elde edilen analiz sonuçları görülmektedir. Çizelge 4.1. Peynir ve Sucuk Örneklerinden Elde Edilen Analiz Sonuçları Örnek No İzolat No Kaynak Gram Boyama Şekil Katalaz Testi %6.5 NaCl' de Gelişim 10 ºC' de Gelişim 45 ºC' de Gelişim 1 1 Peynir - Çubuk 1 2 Peynir - Çubuk 2 3 Peynir + Kok Peynir + Kok Peynir + Çubuk 2 6 Peynir - Kok 3 7 Peynir + Kok Peynir - Çubuk 4 9 Peynir + Kok Peynir + Kok Peynir + Kok Peynir - Çubuk 5 13 Peynir + Kok Glikozdan Gaz Üretimi 39

53 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ayşegül KARAKAŞ Çizelge 4.1. Peynir ve Sucuk Örneklerinden Elde Edilen Analiz Sonuçları Örnek No İzolat No Kaynak Gram Boyama Şekil Katalaz Testi %6.5 NaCl' de Gelişim 10 ºC' de Gelişim 45 ºC' de Gelişim Glikozdan Gaz Üretimi 5 14 Peynir - Kok 6 15 Peynir + Kok Peynir + Kok Peynir + Kok Peynir + Kok Peynir - Çubuk 7 20 Peynir - Kok 7 21 Peynir + Kok Peynir - Kok 8 23 Peynir + Kok Peynir + Kok Peynir + Kok Peynir - Çubuk 8 27 Peynir + Kok Peynir + Kok Peynir + Kok Peynir - Çubuk Peynir - Çubuk Peynir + Kok Peynir - Kok Peynir + Kok Peynir + Kok Peynir + Kok Peynir + Çubuk Peynir - Kok Peynir - Kok Peynir - Kok Peynir + Çubuk Peynir - Kok Peynir + Kok Peynir + Kok Peynir + Kok Peynir + Kok Peynir - Kok Peynir + Kok Peynir - Kok Peynir + Çubuk Peynir - Kok Peynir + Kok Peynir + Kok Peynir + Kok Peynir + Kok Peynir - Çubuk Peynir - Kok Peynir - Kok Peynir + Kok Peynir + Kok Peynir + Çubuk Peynir - Çubuk 40

54 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ayşegül KARAKAŞ Çizelge 4.1. Peynir ve Sucuk Örneklerinden Elde Edilen Analiz Sonuçları Örnek No İzolat No Kaynak Gram Boyama Şekil Katalaz Testi %6.5 NaCl' de Gelişim 10 ºC' de Gelişim 45 ºC' de Gelişim Glikozdan Gaz Üretimi Peynir + Kok Peynir - Kok Peynir + Kok Peynir - Kok Peynir + Kok Peynir + Kok Peynir + Kok Peynir - Kok Peynir + Kok Sucuk + Kok Sucuk - Kok Sucuk - Kok Sucuk + Kok Sucuk - Kok Sucuk + Çubuk Sucuk + Kok Sucuk + Kok Sucuk + Kok Sucuk + Kok Sucuk + Kok Sucuk + Kok Sucuk + Kok Sucuk + Kok Sucuk - Kok Sucuk - Kok Sucuk + Çubuk Sucuk + Kok Sucuk + Kok Sucuk - Kok Sucuk - Kok Sucuk + Kok Sucuk + Çubuk Sucuk + Kok Sucuk - Kok Sucuk + Kok Sucuk + Kok Sucuk + Kok Sucuk - Kok Sucuk + Çubuk Sucuk - Kok Sucuk + Kok Sucuk + Kok Sucuk + Kok Sucuk + Kok Sucuk + Kok Sucuk + Kok Sucuk - Çubuk 41

55 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ayşegül KARAKAŞ Çizelge 4.1. Peynir ve Sucuk Örneklerinden Elde Edilen Analiz Sonuçları Örnek No İzolat No Kaynak Gram Boyama Şekil Katalaz Testi %6.5 NaCl' de Gelişim 10 ºC' de Gelişim 45 ºC' de Gelişim Glikozdan Gaz Üretimi Sucuk + Kok Sucuk + Kok Sucuk + Kok Sucuk + Kok + Araştırmada 71 i peynir ve 43 ü sucuk örnklerinden olmak üzere toplam 114 suş elde edilmiş ve bu suşların 11 i gram (-) çubuk; 10 u gram (+) çubuk; 23 ü gram (-) kok; 70 i ise gram (+) kok olarak bulunmuştur. Bu suşlardan gram (+) koklar seçilerek diğer analizlere tabi tutulmuştur. Bu suşlardan 15 inin % 6,5 NaCl de gelişim gösterdiği tespit edilmiştir. Tuza dirençli bulunan bu suşlardan 8 inin 10 ºC ve 45 ºC sıcaklıklarda geliştiği, katalaz (-) olduğu ve glikozdan gaz üretmediği bulunmuştur. Daha sonra bu suşların bazı biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi ve tanımlamalarının yapılması amacıyla API testi uygulanmıştır API Testi Enterococcus türlerinin identifikasyonunda fenotipik testlere alternatif olarak API 20STREP gibi hazır kitler kullanılaktadır (O Keeffe ve ark., 1999, Robert ve ark., 1999; Ramotar ve ark., 2000). Bu araştırmada incelenen sucuk ve peynir örneklerinden elde edilen izolatların ve referans suşların fenotipik tanımlamaları yapıldıktan sonra biyokimyasal tanımlamaları API 20STREP (Biomeriux) ile yapılmıştır. Çizelge 4.2 de tanımlanan suşlar, Çizelge 4.3 de ise API 20STREP test kiti ile elde edilen analiz sonuçları verilmiştir. 42

56 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ayşegül KARAKAŞ Çizelge 4.2. Tanımlanan Suşlar Örnek İzolat Elde Edildiği Alındığı Yer ve No No Kaynak Satış Şekli Tür 8 27 Peynir Market/ Ambalajsız Açıkta Enterococcus avium 9 28 Peynir Market/ Ambalajsız Enterococcus Açıkta faecium Peynir Pazar Enterococcus durans Peynir Pazar Enterococcus faecium Peynir Pazar Enterococcus faecium Sucuk Pazar Enterococcus durans Sucuk Pazar Enterococcus faecium Sucuk Pazar Enterococcus avium Sucuk örneklerinden izole edilen suşların API 20 Strep ile tanımlanması sonucunda, 3 ünün Enterococcus spp. ye ait olduğu tespit edilmiş ve bunlardan biri Enterococcus faecium, ikincisi Enterococcus durans ve üçüncüsü ise Enterococcus avium olarak tanımlanmıştır. Analize alınan 30 peynir örneklerinden elde edilen suşlardan 3 ü Enterococcus faecium, biri Enterococcus durans ve diğeri ise Enterococcus avium olarak tanımlanmıştır. Peynir örneklerinde Enterococcus spp. nin bulunma nedeni, yüksek ve düşük sıcaklıklarda gelişebilmeleri, tuz ve aside toleranslarından kaynaklanmaktadır (Franz ve ark., 1999). Gelsomino ve ark. (2001), bu bakterilerin direkt hayvan ya da insan dışkısıyla ya da süt tanklarından ve ekipmanlardan bulaştıklarını belirtmişlerdir. Bu gıdalardan çeşitli Enterococcus türleri izole edilirken, en sık izole edilen türlerin Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis olduğunu bildirmişlerdir. Araştırmada Çizelge 4.2 de gösterilen örnekler pazardan ve marketlerden alınan ve ambalajsız şekilde satılan peynirlerdir. Bu peynirlerden Enterococcus türlerinin izole edilmesi, üretim sırasında Enterococcus türlerinin fekal ya da çevresel kontaminasyonla ürüne bulaştığını ya da bu ürünün üretiminde kullanılan 43

57 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ayşegül KARAKAŞ çiğ sütün yüksek derecede Enterococcus ile kontamine olduğunu düşündürmektedir. Örneklerin marketlerde ve pazar alanlarında ambalajsız şekilde açıkta satışa sunulmuş olması nedeniyle, diğer bir Enterococcus kaynağının ise personel olduğu söylenebilir. Enterococcus cinsi bakteriler fekal ve çevresel kontaminasyonla etlerde kolonize olarak, fermente gıdalarda çoğalabilirler (Giraffa, 2003). Papamoli ve ark. (2002), Enterococcus spp. nin sucukların fermantasyon ekolojisine kolaylıkla adapte olabildiklerini bildirmiştir. Enterococcus türlerinin izole edildiği örnekler pazardan alınan ev yapımı fermente sucuklardır. Araştırmada kullanılan örneklerdeki Enterococcus varlığı bu sucukların üretiminde kullanılan etlerde meydana gelen Enterococcus kontaminasyonunun bir göstergesi olabilir. 44

58 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ayşegül KARAKAŞ Örnek Çizelge 4.3. API 20STREP Test Kiti ile Elde Edilen Biyokimyasal Test Sonuçları İzolat No V P H I P E S C P Y R A α G A L β G U R β G A L P A L Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Enterococcus avium Enterococcus faecium Enterococcus durans Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus durans Enterococcus faecium Enterococcus avium L A P A D H R I B A R A M A N S O R L A C T R E I N U R A F A M D G L Y G β H E M Resim 4.1, 4.2, 4.3 ve 4.4 de izole edilen Enterococcus faecium suşlarının API 20STREP ile tanımlanması görülmektedir. Resim 4.1. Enterococcus faecium (İzolat No: 28) Suşunun API 20STREP ile Tanımlanması 45

59 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ayşegül KARAKAŞ Resim 4.2. Enterococcus faecium (İzolat No: 68) Suşunun API 20STREP ile Tanımlanması Resim 4.3. Enterococcus faecium (İzolat No: 69) Suşunun API 20STREP ile Tanımlanması Resim 4.4. Enterococcus faecium (İzolat No: 104) Suşunun API 20STREP ile Tanımlanması 46

60 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ayşegül KARAKAŞ 4.3. BEA ve KAA Agar Besiyerlerinin Kıyaslanması Araştırmada sucuk ve peynir örnekleri KAA agar ve BEA agar besiyerlerine ekilerek 37 ºC de 24 saatlik inkübasyondan sonra koloni etrafında siyah hale oluşturan bakteriler şüpheli Enterococcus türleri olarak değerlendirilmiştir. Enterococcus cinsi bakterilerin izolasyonlarında 100 den fazla besiyeri modifikasyonları önerilmektedir. En sık kullanılan besiyerleri KAA agar ve BEA agardır. Ancak hiçbir besiyerinin bütün Enterococcus cinsi bakteriler için selektif olmadığı bildirilmektedir (Reuter,1992; Domig ve ark., 2003). Tanımlaması yapılan Enterococcus türlerinin bu besiyerlerinde alınan sayım sonuçları çizelge 4.4 de verilmiştir. Sonuçları Çizelge 4.4. Örneklerden İzole Edilen Enterococcus Türlerinin Sayım İzolat No Kaynak Tür Sayım KAA (kob/g) Sayım BEA (kob/g) 27 Peynir Enterococcus avium 17.5 x 10 1 < Peynir 67 Peynir 68 Peynir 69 Peynir 79 Sucuk 104 Sucuk Enterococcus faecium Enterococcus durans Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus durans Enterococcus faecium 2.3 x 10 6 < x 10 3 < 10 2 x 10 1 < 10 < 10 3 x x 10 1 < x 10 5 < Sucuk Enterococcus avium 3 x 10 3 < 10 Araştırmada fermente sucuklardan izole edilen türlerden biri Enterococcus faecium olarak tanımlanırken, Enterococcus avium ve Enterococcus durans gibi Enterococcus türleri de izole edilmiştir. Bu türlerin sayımları KAA agarda sırasıyla 2 x 10 1 ; 9.4 x 10 5 ; 3 x 10 3 kob/g olarak tespit edilmiştir. Ancak bu türler için BEA agarda alınan sayım sonuçları ise <10 bulunmuştur. 47

61 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ayşegül KARAKAŞ Hugas-Maurici ve ark. (1999), fermente edilerek üretilen kümes hayvanları ve domuz eti ürünleri ile biftekteki Enterococcus sayılarının cfu/g arasında değiştiğini belirtmişlerdir. Franz ve ark. (1999), çeşitli sucuklardan Enterococcus izole edildiğini belirterek, bu ürünlerdeki Enterococcus sayısının ,6 x 10 5 arasında olduğunu bildirmişlerdir. Bu araştırmada sucuklardan elde edilen Enterococcus spp. sayımlarının Franz ve ark. (1999) ve Hugas-Maurici ve ark. (1999) ile paralel olduğu görülmektedir. Araştırmada peynir örneklerinden ise Enterococcus faecium, Enterococcus avium, Enterococcus durans türleri izole edilmiştir. İzole edilen Enteorcoccus faecium türlerinin KAA agarda sayımları ise sırasıyla 2.3 x 10 6 ve 2 x 10 1 kob/g olarak tespit edilirken, BEA agarda alınan sayımlar <10 olarak bulunurken, 69 nolu izolat için 3 x 10 3 kob/g olarak bulunmuştur. Enterococcus spp. psikrotrofik doğası, sıcaklığa direnci, değişik substratlara adaptasyonu ve gelişim koşulları nedeniyle, sayıları sütlerin soğutulması sırasında ya da pastörizasyondan sonra artabilmekte ve bu türler hem çiğ sütün, hem de pastörize sütün mikroflorasının bir parçası olabilmektedir (Giraffa, 2003). Enterococcus ların pastörizasyondan sonra canlılıklarını sürdürebilmeleri sözkonusudur (Arizcun ve ark., 1997). Arizcun ve ark. (1997), peynirlerdeki Enterococcus sayısının cfu/g olduğunu bildirmişlerdir. Franz ve ark. (1999), Enterococcus sayısının farklı peynirlerde cfu/g; tamamen olgunlaştırılmış peynirlerde ise cfu/g olduğunu bildirmişlerdir. Sayılarının peynir çeşidine göre değiştiğini belirterek, Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis in peynirlerden izole edilen baskın türler olduğunu belirtmişlerdir. Cogan ve ark. (2001), Enterococcus ların sayılarının peynirlerde cfu/g a ulaşabildiğini bildirmişlerdir. Sarantinopoulos ve ark. (2003), tamamen olgunlaştırılmış peynirlerde baskın mikroorganizmalar olduklarını vurgulayarak, sayılarının peynirlerde cfu /g; 48

62 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ayşegül KARAKAŞ tamamen olgunlaştırılmış peynirlerde ise cfu/g arasında olduğunu bildirmiştir. Araştırmada peynir örneklerinden elde edilen Enterococcus spp. sayıları kob/g arasında değişmektedir. Araştırmada alınan sayımlar KAA agar besiyerinin daha selektif olduğunu göstermektedir. Resim 4.5 de Enterococcus faecium un KAA besiyerinde, resim 4.6 de ise Enterococcus faecium un BEA besiyerinde koloni görünüşü verilmektedir. Resim 4.5. Enterococcus faecium Suşunun KAA Besiyerinde Görünüşü 49

63 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ayşegül KARAKAŞ Resim 4.6. Enterococcus faecium Suşunun BEA Besiyerinde Görünüşü 4.4. Enterococcus spp. nin Hemoliz Varlığının Belirlenmesi Enterococcus türlerinin hemoliz varlığının araştırılmasında % 1 (w/v) koyun kanı içeren Trypticase soy agara ekim yapılarak 37 ºC de 24 saatlik inkübasyondan sonra, kanlı agarda ürediklerinde koloni çevresinde şeffaf bir zon oluşturan izolatlar β hemoliz özelliği taşıdığı şeklinde değerlendirilmiştir. Çizelge 4.5 de β hemoliz testi sonuçları gösterilmektedir. 50