Fagositik aktivasyon yoluyla lökosit işaretlemede Tc-99m poli (l-laktik) asit mikrokürelerinin kullanımı İrfan Peksoy 1, Betül Arıca 2, Meral Tayan Ercan 3, H.Süheyla Kaş 2, Mürvet Tuncel 4, Burçin Şener 5, Ayşe Aşansü 3, Işıl S.Ünsal 6, Ali Kemal Oğuz 7 1 Zonguldak Karaelmas Üniversitesi Tıp Fakültesi Nükleer Tıp Anabilim Dalı, Zonguldak 2 Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Eczacılık Teknolojisi Bölümü Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı, Ankara Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi 3 Nükleer Tıp, 4 Anatomi, 5 Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji ve 7 Fizik Tedavi ve Rehabilitasyon Anabilim Dalları, Ankara 6 Hacettepe Üniversitesi Deney Hayvanları Laboratuarı, Ankara Amaç: Bu çalışmanın amacı Tc-99m poli (l-laktik) asit (PLA) mikrokürelerini lökositleri fagositik yolla işaretleyebilmek için hazırlamak ve gerekli optimum şartları belirlemektir. Yöntem: PLA polimerlerinden (MA:52.000 D) çözücü buharlaştırma yöntemi ile PLA mikroküreleri (1-5 µm) hazırlandı. Daha sonra ph 3 te kalay klorürle Tc-99m ile işaretlendi, işaretleme verimi % 95 in ve stabilitesi ise 24 saat içinde % 70 in üzerinde bulundu. 50 ml heparinli kan gönüllü sağlıklı erişkin insanlardan alınarak oda sıcaklığında sedimantasyona bırakıldı ve lökositten zengin plazma elde edildi. 1 ml de hazırlanan 50 mci Tc-99m-PLA mikroküresi lökosit çökeleğine ilave edilip rotator bir mekanik sallayıcıda 37 o C de 1. saat inkubasyona bırakıldı. Tc-99m PLA ile işaretlenen lökositler santrifüj ile süspansiyondan ayrıldı, yıkandı ve trombositten fakir plazma ile süspansiyon yapıldı. Bulgular: Lökositlerin işaretlenme verimi yaklaşık % 70 bulundu. Monositlerin PLA mikrokürelerini fagosite ettiği elektron mikroskobunda gösterildi. Lökositlerin kemotaktik indeksi 2 nin üzerinde bulundu. Lökositlerin canlılığı Tripan mavisi ile değerlendirildi ve % 90 ın üzerinde bulundu. Sonuç: Tc-99m-PLA mikroküreleri ile lökosit işaretlemenin potansiyel değeri olduğu görülmektedir. Monositlerin daha belirgin işaretlenmesi nedeniyle özellikle kronik inflamasyonda kullanılabilir. Anahtar kelimeler: L-Polilaktik asit, mikroküre, fagositik işaretleme, lökosit işaretleme, inflamasyon, enfeksiyon Phagocyting labeling of leukocytes with Tc-99m PLA (poly l-lactic acid) microspheres Objective: The aim of this study was to prepare Tc-99m poly (l-lactic) acid (PLA) particles for phagocyting engulfment by leucocytes and determine optimization conditions. Methods: PLA microspheres (1-5 µm) were prepared from PLA polymeres (MW=52.000) by solvent evaporation from methylene chloride. Then, they were labeled with Tc-99m by stannous chloride reduction at ph 3 with an efficiency of >95% and a stability of >70% at 24 hours. 50 ml heparinized blood was obtained from normal adult volunteers. The precipitate was removed and the sediment was washed with 0.9 NaCl and then centrifuged at 600 rpm for 5 minutes. 50 mci Tc-99m-PLA particles in 1 ml was added to precipitated leukocytes and rotated in mechanical shaker in incubation at 37 o C for 1 hour. Tc-99m-PLA labeled leukocytes were separated by centrifugation, washed and suspended in platelet poor plasma. Results: Leukocytes were labeled with an efficiency of about 70%. The engulfment of PLA particles by monocytes and the integrity of cell membrane afterwards were demonstrated by electron microscopy. Chemotactic index was >2. The viability of leukocytes was >90%, determined with trypan blue. Conclusion: Our results indicated the potential value of leukocyte labeling with Tc-99m PLA microspheres. This may be especially useful in demonstrating chronic infection, because of the preference of monocytes in labeling. Key words: Poly (L-lactic) acid, microspheres, phagocyting labeling, labeling of leucocytes, inflammation, infection Genel Tıp Derg 2004;14(4):125-132 Yazışma adresi: Dr.İrfan Peksoy, Zonguldak Karaelmas Üniversitesi Tıp Fakültesi Nükleer Tıp Anabilim Dalı, 67600, Esenköy, Kozlu, Zonguldak. e-posta: ipeksoy@hotmail.com 125
Nükleer tıpta inflamasyon/enfeksiyon tanısında kullanılan başlıca radyofarmasötikler Ga-67 Sitrat, In-111 oksin ile işaretli lökositler ve Tc-99mhekzametil- propilen-amin-oksim (Tc-99m-HMPAO) ile işaretli lökositlerdir. Bu ajanların kullanımında bazı dezavantajlar vardır. Ga-67 sitrat nonspesifik radyofarmasötik olup, inflamasyonun görüntülenmesinde sensitiftir ancak spesifitesi düşüktür. Çünkü bazı tümörlerde de tutulum göstermektedir. Ayrıca barsak aktivitesi yüksek olduğundan abdominal patolojilerin görüntülenmesinde sorunlarla karşılaşılmaktadır. Yine Ga-67 sitrat ile görüntüleme yapabilmek için genellikle 24 saat beklemek gerekir (1). In-111 ile ya da Tc-99m-HMPAO işaretli lökositler görüntülemede yüksek sensitivite ve spesifiteye sahiptirler. Tc-99m-HMPAO işaretli lökositler In- 111 e göre daha üstün görüntü kalitesine sahiptir. Ancak In-111 geç görüntülemeye olanak tanır (1,2). Ayrıca gerek In-111 oksin ile işaretli lökositler gerekse de Ga-67 sitrat ile yapılan inflamasyon / enfeksiyon görüntülemeleri Tc-99m ile yapılan görüntülemelere oranla daha fazla radyasyon maruziyetine neden olmaktadır (3). Söz konusu görüntüleme ajanlarının maliyeti de yüksektir. Bu nedenle görüntü kalitesi daha iyi olan, maliyet açısından daha ucuz ve spesifik radyofarmasötiklere ihtiyaç vardır. Son yıllarda biyoparçalanır tabii maddelerden üretilen polimerler, L-polilaktik (L-PLA) asit gibi, ilaç imalinde önem kazanmıştır (4,5). L-PLA dan hazırlanan partiküller daha önce radyonüklid tedavi yöntemlerinden radyosinevektomi ve karaciğer tümörlerinin radyoembolizasyonunda kullanılmıştır (6). Ancak L-PLA şimdiye kadar inflamasyonun teşhisinde hiç kullanılmamıştır. Bu çalışmada amacımız öncelikle L-PLA mikrokürelerini hazırlamak, Tc-99m ile işaretlemek ve işaretleme verimini optimize etmektir. Daha sonra bu mikrokürelerle lökositleri fagositik yolla işaretleyerek elde edilen lökositlerin sintigrafik çalışmalar için uygunluğunu değerlendirmektir. Yöntem Materyaller: L-PLA mikrokürelerinin hazırlanmasında biyoparçalanır sentetik polimer; L-polilaktid (molekül ağırlığı 52 000 dalton, Sandoz Pharma AG, Basel, İsviçre) kullanıldı. Mikrokürelerin hazırlanma sonrasında yapışmalarını önleyip dağıtmak için Sodyumkarboksimetil Seluloz (NaCMC) ve Sodyum Oleat (SO) (NaCMC:SO = 4:1) karışımı kullanıldı. Mikroküreleri görüntülemek için Taramalı Elektron Mikroskop (SEM) (Jeol Scanning Elektron Microscope, SEM ASID-10; Japonya) kullanıldı. Mikrokürelerin ortalama partikül büyüklükleri Mastersizer (Mastersizer E Ver.1.2b Serial No: 7387, Malvern Instruments Ltd., Malvern, İngiltere) aletiyle tespit edilmiştir. Tc-99m Jeneratörü, steril serum şişeleri ve % 0,9 NaCl solusyonu Türkiye Atom Enerjisi Kurumu Çekmece Nükleer Araştırma Enstitüsü Reaktöründen temin edildi. Hassas tartım işlemlerinde Precisca-A terazisi kullanıldı. L-PLA mikrokürelerinin Tc-99m ile ve lökositlerin Tc-99m ile işaretli L-PLA mikroküreleriyle işaretlenmesi için rotator (Malincrodt, Hollanda) kullanıldı. Kullanılan lökositler gönüllü sağlıklı erişkin insandan alındı. Radyofarmasötiklerin kalite kontrolünde ITLC-SG (Instant Thin-Layer Chromotography - Silica Gel, Gelman Scientific Co., ABD) kağıtları, çözücü olarak asit Sitrat dekstroz kullanıldı. Lökositlerin partikülleri fagosite ettiğini doğrulamak amacıyla Jeol-JEM, 1200 EX (Tokyo, Japonya) model elektron mikroskop kullanıldı. İşaretleme sonrasında lökositlerin viabilitesini test etmek amacıyla Tripan Blue, kemotaksi deneyleri için Ficoll Histopaque (Sigma Chemical Company, St Louis, ABD), filtreler (millipore 3.0 µm, White SSWP, 25 mm, Millipore Corp., USA), Zymosan A (Sigma Chemical Company, St Louis, ABD) ve Skyes-MOORE çelik kameralarından yararlanıldı. Radyoaktif numunelerin sayılması için gama sayacı (Wallac 1480, Gamma Counter, Finlandiya) kullanıldı. Metodlar: L-PLA mikrokürelerinin hazırlanması: Sentetik polimer L-polilaktid ten mikroküre hazırlanmasında, en sık kullanılan metot olan çözücü buharlaştırma yöntemi kullanıldı. Dispersiyon ortamını oluşturmak için (NaCMC:SO = 4:1) karışımı iyice çözününceye kadar distile su içinde yaklaşık 30 dakika manyetik karıştırıcı ile karıştırıldı. Polimer çözeltisi mekanik karıştırıcıda karışmakta olan NaCMC:SO çözeltisi içinde pastör pipeti yardımı ile toplam 5 dakika içinde damla damla eklendi. Karıştırma işlemi 1 saat boyunca devam etti. Bu süre boyunca metilen 126
klorürün oda sıcaklığında uçması sağlandı (7,8). Tablo 1 de deney değişkenleri gösterilmektedir. Mikroküre morfolojik özelliklerinin incelenmesi: Mikrokürelerin morfolojik özellikleri SEM kullanılarak incelendi; bu amaçla iki taraflı yapışkan bant ile metal levhalar üzerine yapıştırıldı. BIO-RAD Sputter Apartus da 100 Å kalınlıkta altın ile kaplandı. Bu örnekler SEM de 80 kv luk hızlandırılmış voltajda incelenerek fotoğrafları çekildi (Şekil 1). Mikroküre partikül büyüklüğü tayini: Bu amaçla Malvern Mastersizer aleti kullanıldı. Hazırlanan L- PLA mikroküre formulasyonu (10 mg) 1 damla % 10 luk Tween 80 içeren 50 ml deiyonize su içinde 3 dakika ultrasonik banyoda tutuldu ve ölçümler yapıldı. Tc-99m ile PLA mikrokürelerinin işaretlenmesi: Tc-99m jeneratöründen elde edilen Tc-99m perteknetat +7 halinden +5 haline SnCl 2 H 2 O (1 mg/ml) çözeltisi kullanılarak indirgendi. Bu işlemler sırasıyla şu şekilde gerçekleşti: -20 mg L-PLA 3 ml distile su içinde (% 0,001 lik Tween 80 içeren) karıştırılarak çözülmesi sağlandı. -Solusyona 0,2 mg SnCl 2 H 2 O çözeltisi ilave edildi. -50 mci Tc-99m perteknetat (1-2 ml) ilave edildi. -ph 1 N HCl ile 3 e ayarlandı. -Oda sıcaklığında rotatorda 2 saat inkübasyona bırakıldı. -ph 0,5 M NaOH ile Cl ile 7 ye ayarlandı. Tc-99m ile işaretli PLA mikrokürelerinin işaretlenme düzeylerinin kalite kontrolü: Tc-99m ile yapılan işaretlemelerde radyokontaminan olarak Tc-99m perteknetat ve hidrolize Tc-99m (TcO 2 ) bulunabilir. Bunların toplam miktarı % 5 üzerinde olmamalıdır. İşaretlemenin verimini ve işaretli maddenin stabilitesini test etmek amacıyla daha önceden yapılmış ve literatürde yayınlanmış bir metot referans alındı (9). Çözücü olarak ACD ve % 0,9 NaCl kullanıldı. Kalite kontrolde mini kromotografi tekniği kullanıldı. Bu metot için ACD ve SF te sırasıyla şu işlemler yapıldı: -ITLC-SG hazır plakaları 1x10 cm lik şeritler halinde kesildi. -Şeridin bir ucu 1 cm mesafeden orijini göstermek amacıyla işaretlendi. -Tank olarak 30 ml lik vialler kullanıldı. -10 µl lik Tc-99m L-PLA şerit üzerindeki orijin noktasına konuldu. -2 ml çözücü vialin içine konulduktan sonra asendan kromotografi tekniği uygulandı. -Şeritte çözücü ilerledikten 2-4 dakika sonra şerit kurumaya bırakıldı. -Kurutulduktan sonra ortasından kesilerek orijin ve ilerleyen kısmın aktiviteleri gama sayacında sayıldı. ACD de yalnızca partiküller orijinde kaldığından ilerleyen kısımda Tc-99m perteknetat ve TcO 2 bulunur. % 0,9 NaCl de partiküller ve TcO 2 orijinde kalır, yalnızca Tc-99m perteknetat ilerler. Gama sayacındaki ölçümlerle mikrokürelere bağlanan aktivite miktarı hesaplandı. -90. dakikadaki analizden işaretleme verimi, 24. saatteki analizden ise stabilite değerleri elde edildi. Lökositlerin fagositik yolla işaretlenmesi: Lökositlerin işaretlenmesi tam kanda veya lökositler kandan ayrıldıktan sonra yapılabilir. Çalışmamızda her iki metot da denendi. Tam kan ile yapılan çalışmada sağlıklı gönüllü erişkin bir vericiden alınan 10 ml kan Tc-99m-PLA ile 37 0 C de 2 saat rotator ile inkübasyona bırakıldı. Ayrılmış lökositler ile yapılan çalışmada da aynı işlem kandan lökositler ayrıldıktan sonra yapıldı. Lökositlerin tam kandan ayrılmasında sırasıyla şu işlemler yapıldı: -50 ml kan heparinize bir enjektörle sağlıklı gönüllü erişkin bir vericiden alındı ve oda sıcaklığında 1,5 saat sedimantasyona bırakıldı. -Daha sonra plazma eritrositlerden dikkatli bir şekilde ayrılıp, 600 rpm de 5 dakika santrifüje tabi tutuldu. Santrifüj sonrası lökositler ayrıldı. -Lökositler % 0,9 NaCl de dağıtılarak Tc-99m-PLA mikroküreleriyle 37 0 C de 1 saat rotatorda inkubasyona bırakıldı. Bu süreçte lökositlerin fagositoz aktivasyonu göstermeleri beklendi. 127
Fagositik yolla işaretlenen lökositlerin elektron mikroskopla görüntülenmesi: İşaretli lökosit süspansiyonu % 2.5 lik gluteraldehit ile sabitleştirildi. Fiksasyon sonrasında OSO4 ile postsabit edildi. Solüsyon dehidratasyona tabi tutularak Araldit CY212 kullanılarak bloklandı. Bloklardan 60-90nm lik ince kesitler alındı. Uranil asetat ve kurşun sitrat ile kontraslama işlemini takiben elektron mikroskobik inceleme yapılarak fotoğraflar çekildi (10) (Şekil 2). Şekil 1. L-PLA mikrokürelerinin morfolojik özelliklerine ait SEM fotoğrafları Şekil 2. Monositler tarafından fagosite edilmiş ve edilmekte olan PLA mikrokürelerinin elektron mikroskobik görüntüleri Tc-99m-PLA ile lökosit işaretleme verimi: Önce işaretli lökosit süspansiyonunun aktivitesi sayıldı (A). Süspansiyon 600 rpm de 5 dak santrifüj edilip üstte kalan kısım sayılıp atıldı (B). Çökelek (işaretli lökositler ve fagosite edilmemiş PLA partikülleri) % 0,9 NaCl de dilüe edilerek tekrar 600 rpm de 5 dak santrifüj edilip üstte kalan kısım sayılıp atıldı (C). Çökelek tekrar % 0,9 NaCl de dilüe edilerek, Chloramin T ile muamele edildi. Böylece fagosite edilmemiş PLA partiküllerindeki Tc-99m in oksitlenip Tc-99m perteknetat haline dönmesi amaçlandı. Bu işlemden sonra süspansiyon 600 rpm de 5 dak santrifüj edilip üstte kalan kısım sayılıp atıldı (D) ve çökelek aktivitesi (işaretli lökosit) sayıldı (E). İşaretleme verimi (E/A) x 100 olarak hesaplandı. A değeri aradan geçen zaman için düzeltildi. Kemotaksis ve viabilite çalışmaları: Hazırlanan işaretli lökositlerin sintigrafik görüntülemede kullanılabilmesi için fonksiyonların normal olması gerekmektedir. Bu çalışmada nötrofil fonksiyonlarını test etmek amacıyla kemotaksis ve viabilite testleri kulanıldı. Kemotaksis çalışması: Kemotaksis çalışmaları için aynı kişiden alınan kandan iki ayrı lökosit süspansiyonu (kontrol grubu Tc-99m-PLA ile işaretlenen çalışma grubu) hazırlandı. Kontrol grubu ve çalışma grubundan alınan 10 ar ml Ficoll Histopaque eklenip 1600 rpm de 30 dakika çevrildi. Daha sonra üsteki Histopaque tabakası aspire edilerek, alttaki nötrofil içeren sıvı üstüne 3 ml RPMI-1640 besi yeri konarak karıştırıldı. Bu karışım 1200rpm de 10 dakika çevrildi ve üstteki sıvı puar ile alındı. Bu işlem iki kez daha tekrarlandı. Son yıkamadan sonra çöken hücrelerin üzerine 1 ml RPMI-1940 besiyeri eklenerek hücre sayımları yapıldı. Sıvılardaki nötrofil sayısı 5x106 olacak şekilde ayarlandı. Tüm işlemler sırasında, nötrofilerin cam yüzeyine yapışarak kaybedilmelerini önlemek için plastik tüpler kullanıldı. Kemoattraktan olarak Zimosan A ile aktive serum (ZAS) kullanıldı. ZAS hazırlamak için sağlıklı üç denekten alınan kan, oda sıcaklığında 20 dakika pıhtılaşması için bekletildi. Sonra +4 0 C de 1400 rpm de 15 dk çevrildi. Ayrılan serumlar karıştırıldıktan sonra komplemanı alternatif yoldan aktive etmek için 5 mg/ml Zymason-A ile karıştırıldı. 1 saat 37 0 C de bekletildikten sonra 600 g de 20 dk çevrilerek Zymason-A çöktürüldü. Üsteki aktive serumun kemotaktik aktivitesi normal hücrelerle kontrol edildi. Sonra 0.2 ml lik bölümlere ayrıldı ve -20 0 C de donduruldu. Kemotaksis milipor filtre yöntemi ile tayin edildi. Bunun için 3 µm filtre ile ayrılan alt ve üst bölümlerden oluşan Skyes- MORE çelik kameralarından yararlanıldı. Alt bölümüne 0.5 ml ZAS, üst bölümüne de 0.5 ml 128
lökosit süspansiyonu kondu. Kontrol için bir başka grup kamera alt bölümüne 0.5 ml RPMI-1640 konup çelik kameralar 1 saat 37 0 C de % 5 CO 2 içeren nemli havada bekletildi. Bu süre sonunda filtreler, üst kısım üstte olacak şekilde alınarak aşağıdaki işlemler sırasıyla takip edilip boyandı. 1. Absolü etanol (5 dakika) 2. Distile su (2 dakika) 3. Hemotoksilen Eosin (1 dakika) 4. Distile su (2 dakika) 5. Çeşme suyu (10 dakika) 6. % 70 etanol (2 dakika) 7. % 95 etanol (3 dakika) 8. % 80 etanol + % 20 butanol (5 dakika) 9. Ksilol (10 dakika) Boyama işlemi sonrasında filtre üzerinde 1 damla immersiyon yağı damlatıldı, filtre lam ve lamel arasına konulup mikroskop altında 40 x büyütmede filtre içinde en ileri giden iki hücrenin kat ettikleri mesafe mikrometre olarak ölçüldü. Ölçümler her filtre için en az 10 alanda yapıldı ve ortalaması alındı. ZAS ile alınan nötrofil ilerlemesi kemotaksis cevabı, RPMI-1640 ile elde edilen ilerleme gelişigüzel migrasyonu göstermektedir. Bu iki değer birbirine bölünerek kemotaktik indeks (CI) hesaplandı (11,12). Viabilite testi: Nötrofillerin canlılığını saptamak amacıyla Tripan Blue testi uygulandı ve sırasıyla şu işlemler yapıldı: -Distile su ile % 2 lik (10 ml de 2 g) Tripan Blue solüsyonu hazırlandı. -Bu solüsyon 1/7 oranında SF ile dilüe edildi. -3 damla nötrofil süspansiyonuna 3 damla Tripan Blue karışımı konulup oda sıcaklığında 5 dk. bekletildi. -Elde edilen karışım lam üzerine konulup lamelle kapatılıp nötrofiller sayıldı. Boyanan ve boya almayan nötrofiller sayıldı, boyanan lökositler canlılığını yitirmiş olarak kabul edildi. Nötrofillerin herhangi bir deneysel çalışmada kullanılabilmesi için toplam hücre sayısının en az % 70 inin canlı olması gerekmektedir (13,14). Bulgular Mikrokürelerin morfolojik özelliklerine ait bulgular: SEM kullanılarak çekilen fotoğraflarda mikroküreler düzgün yüzeyli ve küresel olarak görüntülendi (Şekil 1). Mikrokürelein partikül büyüklüklerine ait bulgular: Malvern Mastersizer aleti kullanılarak yapılan çalışmada mikrokürelerin ortalama partikül büyüklüğü d(0.5) 5.58 µm olarak tespit edildi. Mikroküre büyüklük aralığı 0,2-47,3 µm arasında değişmekteydi. Mikrokürelerin % 13.98 i 10 µm ve daha üzeri büyüklükte bulundu. Tc-99m L-PLA mikrokürelerin kalite kontrolü: İnce tabaka kromatografisi ile yapılan kalite kontrol çalışmaları sonucunda PLA mikrokürelerinin Tc-99m ile işaretleme veriminin yüksek olduğu bulundu. Yapılan her çalışma için 10., 15., 20., 30., 40., 45., 60., 70., 75., 90., 120., 150., 165., 180., 215., 240., 360., 1440. dakikalarda ITLC-SG ile ACD de ve % 0,9 NaCl de bağlanma yüzdelerine bakıldı. Bağlanma yüzdesi ilk 70-90 dakika içinde % 90-95 düzeylerine kadar çıktı, 2. saatte ve ilk 6 saat içinde % 95 in üzerinde, 24. saatte ise % 70 in üzerinde saptandı. ACD de yalnız mikroküre orijinde kaldığından, ACD de 2. saatte orijinde kalan kısım % 95.03 ± 0.11 ortalama değer; mikrokürelerin bağlanma yüzdesi olarak kabul edildi. % 0,9 NaCl de orijinde kalan kısım % 98.55 ± 0.92 bulundu. ACD de ilerleyen kısımda Tc-99m perteknetat ve hidrolize Tc-99m (TcO 2 ) bulunduğundan % Tc-99m perteknetat + hidrolize Tc-99m (TcO 2 ) miktarı 100-95.03 = % 4.97 ± 0.11 olarak hesaplandı. % 0,9 NaCl de yalnızca Tc-99m perteknetat ilerlediğinden % Tc-99m perteknetat miktarı: 100-98.55 ± 0.92 = % 1.45 ± 0.92 olarak hesaplandı. Hidrolize Tc-99m (TcO 2 ) miktarı ise % 3.22 ± 0.98 bulundu Tam kanda yapılan lökosit işaretleme çalışmaları: Yapılan sayım ve ölçümlerde lökosit işaretleme verimi % 3.23 bulundu. Verim çok düşük olduğundan lökositleri ayırarak yapılan çalışmaya ağırlık verildi. Ayrılmış lökositlerle yapılan lökosit işaretleme çalışmaları: Çalışmanın başlangıcında kullanılan 50 mci Tc-99m perteknetatın 2 saat L-PLA mikroküreleriyle inkübasyonu ve 1 saat lökositlerle 129
Tablo. Çözücü buharlaştırma yöntemi kullanılarak hazırlanan mikroküre formulasyonunda deney değişkenleri Parametre Deney Koşulları Polimer Madde L-PLA (52 000 D) Çözücü Metilen Klorür Dispersiyon Ortamı NaCMC:SO (4:1) Sıcaklık Karıştırma Hızı Karıştırma Süresi Santrifüjleme Yıkama Kurutma 25 o C 1700 rpm 1 saat 2500xg. 10 dakika Distile su, 4 kez Vakumlu etüv Saklama Buzdolabı(+4 o C) inkübasyonu sonrasında kalan aktivite 36.75 mci olarak hesaplandı. Lökositlerin Tc-99m L-PLA mikroküreleri ile rotatorda inkübasyonundan hemen sonra süspansiyonun aktivitesi (36.75) tespit edildi, anlatılan yöntemlerin uygulanmasından sonra yalnızca lökositlerde kalan aktivite (Tc-99m-PLA- BKH) bulundu. (25.41 ± 3.74 mci). % işaretleme verimi (25.41 / 36.75) x 100 = 70.6 ± 5.56 olarak tespit edildi. İşaretli lökositlerin elektron mikroskobunda görüntülenmesi: Şekil 2 de izlendiği gibi lökositlerin L-PLA mikrokürelerini fagosite ettiği tespit edildi. Kemotaksi çalışmaları: Yapılan nötrofil kemotaksisi testleri sonucunda random migrasyonda ortalama CI 3.39 ± 0.16, çalışma grubunda ise 2.44 ± 0.17 olarak bulundu. Viabilite testleri: Tripan Blue ile yapılan viabilite testleri sonucunda nötrofillerin herhangi bir deneysel çalışmada kullanılabilmesi için en az % 70 oranında canlı hücre bulunması gerekmekteydi. Çalışmamızda bütün viabilite testleri bu değerin üzerindeydi. Ortalama değerler kontrol grubunda % 90.33 ± 5.13, çalışma grubunda 88.67 ± 8.49 bulundu. Tartışma Fagositik yolla lökosit işaretleme çalışmaları 1950 li yıllarda da tarif edilmiş, 1980 li yılların sonlarında Tc-99m-Kalay kolloid bu amaçla rutin kullanılabilecek aşamaya gelmiş ve ticari kitleri üretilmiştir (15-19). Fagositik yolla lökosit işaretleme total kanda lökosit işaretlemeye olanak tanıması yönü ile klasik olarak kullanılan metotlara (In-111 ve Tc- 99m-HMPAO) göre ön plana çıkmıştır. Literatürde PLA mikroküreleri kullanılarak fagositik etkinlikle lökosit işaretleme çalışması bulunmamaktadır. L- PLA mikroküreleri biyoparçalanır olmaları, vücutla geçiminin iyi olması ve doğal kaynaklardan elde edilmesi nedeni ile in vivo ortamlarda kullanım için uygun partiküllerdir. Biyolojik sistemler için üretilen sentetik ya da doğal polimerler içerisinde FDA onayı almış polimerlerdir (18). Öncelikle partiküllerin fagositoz için uygun büyüklükte olup olmadığını tespit etmek için Malvern Mastersizer aleti ile çalışma yapılmıştır. Çalışmamızda partikül büyüklükleri ortalama 5.58 µm olarak bulunmuştur. Bu büyüklük literatürde tarif edilen fagositoz için ideal büyüklüğün biraz üzerindedir. Literatürde fagositoz için ideal partikül büyüklüğünün 1-5 µm olduğu belirtilmektedir (16). İstenilen boyutların üzerinde olduğu için lökosit işaretleme verimini düşürmüş olabilir. Tc-99m ile işaretlenmesi ile partikül büyüklüklerinde değişme izlenmemiştir. PLA mikrokürelerine Tc-99m perteknetat bağlanması mikroküre yüzeylerinde bulunan hidroksil ve karboksil grupları ile mümkün olmaktadır. PLA mikrokürelerini oluşturan polimerlerin serbest uçlarında bu gruplar bulunmaktadır. Ayrıca bağlanmayı etkileyen en önemli olaylardan biri de mikroküre büyüklüğüdür. Mikroküre büyüklüğü arttıkça yüzey alanı küçüleceği için bağlanma oranı azalır. Bunun tersine mikroküre boyutları azalırsa yüzey alanı büyüyeceği için bağlanma oranı artar. PLA mikroküreleri ile mikrokürelerin bağlanma yüzdesi 2. saatte % 95.03 ±0.11 olarak bulunmuştur. Bulunan bu değer bir radyofarmasötik için ideal bağlanma yüzdesi sınırlarındadır. Ancak mikroküre büyüklüğü standardize edilirse bağlanma oranı daha da yüksek bulunabilir. Tc-99m perteknetat ile yapılan işaretlemelerde radyokontaminan olarak Tc0 2 ve Tc- 99m perteknetat bulunabilir. Çalışmamızda TcO 2 oranı % 3.52, Tc-99m perteknetat oranı % 1.45 hesaplanmıştır. TcO 2 miktarının Tc-99m perteknetata kıyasla daha fazla olmasının nedeni, kullanılan SnCl 2.H 2 O miktarının Tc yi indirgemeye yeterli olmamasından kaynaklanmaktadır. Ancak bu miktar çalışmanın sonuçlarını etkileyecek düzeyde değildir. Fagositik yolla lökosit işaretleme tam kan ile çalışmaya imkan tanımaktadır (15,16,18,20). Tam kan ile yapılan çalışmalar lökosit işaretleme için In- 130
111 ve Tc-99m-HMPAO ile yapılan işaretlemelere göre daha kısadır. Çünkü lökositleri ayırmak için yaklaşık 1-2 saatlik sedimantasyon süresi bu metoda gerekmemektedir. Böylece lökositlerin viabilitesi daha iyi korunmakta ve daha önemlisi uzun süren laboratuar hazırlık aşaması kısalmaktadır. Ancak çalışmamızda bu metotla yapılan lökosit işaretleme verimi % 3.23 gibi düşük düzeylerde bulunmuştur. Bunun nedeni olarak L-PLA mikrokürelerinin Tc- 99m ile bağlanmasına olanak veren yüzey gruplarının plazma proteinleri ile reaksiyona girerek kaplandığı ve yabancı cisim olarak algılanmadığı için lökositlerle etkileşiminin kısıtlandığı düşünülmüştür. İleri bir çalışma olarak plazma ayrılarak SF ile dilüe edilip işaretleme verimi tekrar kontrol edilebilir. Lökositlerin ayrılmasından sonra yapılan lökosit işaretleme çalışmasında işaretleme verimi % 70.6 ± 5.6 olarak tespit edilmiştir. Bu miktar literatürde tarif edilen Tc-99m-HMPAO verimine kıyasla yüksek olup sintigrafik çalışma için yeterli kabul edilebilir. Ancak Sn kolloid ile yapılan bir çalışmada (16) bağlanma % 81 ± 5.6 olarak bildirilmiştir (ortalama partikül büyüklüğü 2.1 µm). Ancak bu çalışmada filtreler kullanılarak partikül büyüklüklerinin istenilen ölçüde olması sağlanmıştır. Aynı şekilde PLA partiküllerinin filtre kullanılarak ideal büyüklüklerde olması sağlandığında çalışmamızda bulunan bağlanma yüzdesinden daha yüksek değerler bulunabilir. Elektron mikroskobu ile işaretli lökositler tarafından mikrokürelerin fagosite edildiği gösterilmiş, böylece çalışmanın doğruluğu kanıtlanmıştır. Elektron mikroskop görüntülerinde büyük partiküllerin fagosite edildiği de izlenmektedir. Bu durum lökosit işaretleme açısından bir avantaj sayılsa bile lökositin kemotaksis fonksiyonunu olumsuz yönde etkileyeceği bir gerçektir. Ayrıca sedimantasyon süresinin uzun olması, fagositoz için gerekli inkübasyon süresinin uzun olması, santrifüjlerin yapılması ve bunların zaman alması lökositin canlılığını etkileyici ve travmatize edici işlemlerdir. Bu nedenle işaretleme sonunda lökosit fonksiyonları mutlaka test edilmelidir. Çalışmamızda viabilite testi ile ulaşılan sonuçlarda lökositlerin büyük oranda canlı olduğu saptanmıştır. Yine yapılan kemotaksi deneylerinde mikrokürelerin fagositozundan sonra kemotaksis indeksinin normal olduğu bulunmuştur. L-PLA mikroküreleri ile lökositleri fagositik yolla işaretleyerek yapılan çalışma şimdiye kadar literatürde bulunmamaktadır. Literatürde Tc-99m Sn kolloid ile yapılan çalışmalar ile lökositlerin yüksek oranda işaretlendiği rapor edilmiştir. Partikül büyüklüklerinin optimizasyonu ile literatürde tespit edilen oranlara yakın, belki daha yüksek oranda lökosit bağlama verimi elde edilebilir. Bunun için üretilen partiküllerin filtrelerden geçirilerek belli bir aralıkta olması sağlanabilir. Ayrıca mikrokürelerin üzeri kompleman-3b (C3b) ile kaplanarak lökositler tarafından kolayca tanınması ve daha hızlı fagosite edilmesi sağlanabilir. Lökosit işaretleme genel olarak zaman alıcı bir iştir ve özellikle total kanda fagositik yolla yapılırsa sedimantasyon süresi gerekmediğinden alternatif in vitro yollara göre daha kısa sürmektedir. Literatür bilgileri ile karşılaştırıldığında en büyük eksikliğin tam kan ile lökosit işaretleme çalışmasının başarısız oluşudur. Bu çalışmada total kanda işaretleme başarısız olduğundan lökositleri ayırarak işaretleme şekli seçilmiştir. Bu nedenle lökositlerin işaretleme süreleri uzamıştır. Ancak çalışmamızda lökositlerin viabilitesi ve kemotaksisi normal sınırlarda bulunmuştur. Klasik olarak lökosit işaretlemede kullanılan In-111 ve Tc-99m-HMPAO ile kıyaslandığında bu ajanlardan daha ucuz olması yönüyle avantajlıdır. Bu metotla Tc-99m-HMPAO dan çok daha yüksek işaretleme verimi elde edilmiştir. In-111 ile bu açıdan kıyaslandığında benzer oranda işaretleme verimi vardır. Bu metodlar ile tam olarak kıyaslama yapılabilmesi için çalışmanın geliştirilmesine ihtiyaç vardır. Sonuç L-PLA mikroküreleri içerdiği karboksil ve hidroksil gruplarıyla Tc-99m ile yüksek oranda bağlanma göstermiştir. Bu nedenle Nükleer Tıp`da görüntüleme amacıyla kullanılabilir. Tc-99m ile işaretli mikroküreler lökositler tarafından yüksek oranda fagosite edildiğinden fagositik aktivasyon ile lökosit işaretlemede de kullanılabilir. Çalışmamızda ortaya çıkan sonuçlar; L-PLA mikrokürelerinin fagositik aktivasyon ile başarılı bir biçimde lökosit işaretleme amacıyla kullanılabileceğini göstermektedir. Ancak yöntemin deneylerle daha da geliştirilmesine ihtiyacı vardır. 131
İleride yapılacak çalışmalarda şu hususlar araştırılmalıdır: 1) İşaretlemenin kandan plazma ayrıldıktan sonra yapılmasının işaretleme verimine etkisine bakılmalı, 2) PLA mikrokürelerinin optimal boyutlarda (1-5 µm) hazırlandıktan sonra işaretlenmesi, bunun lökosit işaretlemede verimine etkisi araştırılmalı, 3) lökositlerdeki morfolojik değişikliği minimuma indirmek için lökositlerle Tc- 99m PLA mikrokürelerinin inkübasyon süresi kısaltılmalı (fagositoz için gerekli süre) ve 4) hayvan modelleri geliştirilmeli ve işaretli lökositler enfekte dokularda çalışılmalıdır. Kaynaklar 1. Wilson MA, de da Pena R. Infection. In: Michael A. Wilson, Editör. Textbook of Nuclear Medicine. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers;1998. p.189-210. 2. Goldsmith SJ, Palestro CJ, Vallabhajosula S. Infectious Diseases. In: Henry N. Wagner, Editor. Principles of Nuclear Medicine. Philadelphia, WB Saunders Company. p.728-45. 3. Treves ST, Conolly LP, O Tuama L, Stabin M, Larar GN, Swift P. Pediatrics. In: Henry N. Wagner, Editor. Principles of Nuclear Medicine. Philadelphia, WB Saunders Company. p.1137-70. 4. Bozdag S, Calis S, Kas HS, Ercan MT, Peksoy İ, Hincal AA. In vitro evaluation and intra-articular administration of biodegradable microspheres containing naproxen sodium. J Microencapsul 2001;18:443-56. 5. Tuncay M, Calis S, Kas HS, Ercan MT, Peksoy İ, Hincal AA. Diclofenac sodium incorporated PLGA (50:50) microspheres: Formulation considerations and in vitro/in vivo evaluation. Int J Pharm 2000;195:179-88. 6. Mumper RJ, Mills BJ, Ryo UY, Jay M. Polymeric microspheres for radionuclide synovectomy containing neutron-activated holmium-166. J Nucl Med 1992:33:398-402. 7. Pişkin E. Polimer based drug delivery systems. In: Hıncal AA, Kas HS, editor. Biomedical science and technology. New York:Plenium Pres; 1998. p.1-16. 8. Kitchell JP, Wise DL. Poly(lactic/glycolic acid) biodegradable drug-polymer matrix systems. Methods Enzymol 1985;112:436-48. 9. Ercan MT. Rapid determination of hydrolised-reduced technetiun 99m in particulate radiopharmaceuticals. Appl Radiat Isot 1992:43;1175-7. 10. Glauert AM. Practical Methods in Electron Microscopy. Amsterdam, Oxford;1975. 11. Boyden S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leukocytes. J Exp Med 1962:115; 454-66. 12. Zigmond SH, Hirs JG. Leukocytes locomotion and chemotaxis. New methods for evaluation and demonstration of a cell derived factor. J Exp Med 1973:137;387-410. 13. Welling M, Feitsma HI, Blok D, Calame W, Ensing GJ, Goedemans W, et al. A new 99mTc labelling method for leucocytes: in vitro and in vivo comparison with 99mTc- HMPAO. Q J Nucl Med 1995:39:89-98. 14. Daher AH, Fortenberry JD, Owens ML, Brown LA. Effects of exogenous nitric oxide on neutrophil oxidative function and viability. Am J Respir Cell Mol Biol. 1997;16:407-12. 15. Hanna RW, Lomas FE. Identification of factors affecting technetium 99m leucocyte labelling by phagocytic engulfment and development of an optimal technique. Eur J Nucl Med 1986;12:159-62. 16. Hanna R, Braun T, Levendel A, Lomas F. Radiochemistry and biostability of autologous leucocytes labelled with 99mTcstannous colloid in whole blood. Eur J Nucl Med 1984;9:216-9. 17. Hirsch JI, Tatum JL, Fratkin MJ, Apostolides DL, Quint RI. Preparation and evaluation of a 99mTc-SnF2 colloid kit for leukocyte labeling. J Nucl Med 1989;30:1257-63. 18. Mock BH, English D. Leukocyte labeling with technetium- 99m tin colloids. J Nucl Med 1987;28:1471-7. 19. Jain R, Shah NH, Malick AW, Rhodes CT. Controlled drug delivery by biodegradable poly(ester) devices: Different preparative approaches. Drug Dev Ind Pharm 1998;24:703-27. 20. English D, Andeson BR. Labelling of phagocytes from human blood with Tc-99m Sulphur colloid. J Nucl Med 1975;16:5-10. 132