SÜTTEN İZOLE EDİLEN LAKTİK BAKTERİLER VE STREPTOKOKLARIN ENZİM AKTİVİTELERİ. Elif ORHAN YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ GAZİ ÜNİVERSİTESİ

SÜTTEN İZOLE EDİLEN LAKTİK BAKTERİLER VE STREPTOKOKLARIN ENZİM AKTİVİTELERİ Elif ORHAN YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ARALIK 2013 ANKARA

ii

iii

iv SÜTTEN İZOLE EDİLEN LAKTİK BAKTERİLER VE STREPTOKOKLARIN ENZİM AKTİVİTELERİ (Yüksek Lisans Tezi) ELİF ORHAN GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Aralık 2013 ÖZET Araştırmada çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin bazı enzim özellikleri ve gıda patojeni bakteriler üzerine inhibitör aktivitelerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu nedenle 30 çiğ süt örneğinden 74 laktik bakteri izolatı izole edilip adlandırılmıştır. Adlandırılan türler; 10 Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, 9 Lb. casei, 6 Lb. rhamnosus, 5 Lb. acidophilus, 5 Lb. coryniformis ssp. tourquens, 3 Lb. plantarum ssp. plantarum, 5 Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides, 3 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum, 9 Pediococcus pentosaceus, 6 P. dextrinicus, 1 P. inopinatus, 1 P. acidilactici, 4 Streptococcus lactis, 1 S. cremoris, 2 Enterococcus faecalis, 1 E. faecium ve 3 Lactococcus lactis ssp. lactis olarak tespit edilmiştir. Çiğ sütten izole edilen laktik bakterilerin proteaz, lipaz, elastaz, α-amilaz enzim özellikleri ve hemolitik aktiviteleri araştırılmıştır. 74 izolatın 70 inde proteolitik aktivite tespit edilmiştir. 36 izolat (%51,4) zayıf (+), 34 izolat (%48,6) orta (++) proteolitik aktivite göstermiştir. İzole edilen laktik bakterilerin, Elastinli Nutrient Agarda araştırılan elastaz enzim özellikleri saptanmamıştır. Trybutrin Agarda lipolitik aktiviteleri araştırılan laktik bakterilerde, Leu. mesenteroides ssp. dextranicum türünün zon çapı 4 mm olarak tespit edilmiştir. Diğer suşlarda zon çapı gözlenmemiştir. α-amilaz enzim aktiviteleri Nişasta Agar besiyerinde test edilmiştir. Lb. plantarum ssp. plantarum, Lb. casei, Lb. coryniformis ssp. tourquens, Pediococcus pentosaceus ve Leu. mesenteroides

v ssp. dextranicum türlerinde α-amilaz (+) aktivite göstermiştir. Kanlı Agarda hemolitik aktiviteleri incelen laktik bakterilerden, S. lactis, Lactococcus lactis ssp. lactis ve Enterococcus faecium türleri (+) aktivite gösterirken diğer türlerde hemolitik aktivite gözlenmemiştir. Çiğ sütten izole edilen 17 farklı bakteri türünün her birinden bir suş alınarak inhibitör etki çalışılmıştır. Bu bakterilerin inhibitör etkisi kuyu difüzyon metoduyla Nutrient Agar ve %0,2 glikozlu Nutrient Agarda çalışılmıştır. Tüm inhibitör etkisi çalışılan bakteri türleri, Staphylococcus aureus, Listeria Monocytogenes ve Salmonella typhimurium üzerine inhibitör etki göstermiştir. Ancak E. coli ve Klebsiella pneumoniae üzerine etki göstermemiştir. En büyük etkiyi Lb. delbrueckii ssp. lactis Nütrient Agarda 12 mm, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 18 mm zon çapıyla L. monocytogenes ve S. typhimurium üzerine göstermiştir. Bu koşullarda %0,2 glikozlu ortamda zon çapları daha büyük gözlenmiştir. Çalışılan tüm laktik bakteri türleri E. coli ve K. pneumoniae üzerine etki göstermemiştir. Bilim Kodu : 203.1.010 Anahtar Kelimeler : Laktik asit bakterileri, Enzim aktivitesi, İnhibitör aktivite Sayfa Adedi : 124 Tez Yöneticisi : Prof. Dr. Güven Uraz

vi ENZYME ACTIVITIES OF LACTIC BACTERIA AND STREPTOCOCCUS ISOLATED FROM MILK (M. Sc. Thesis) ELİF ORHAN GAZİ UNIVERSITY GRADUATE SCHOOL OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES December 2013 ABSTRACT The research of some enzyme characteristics and the inhibitory activity of pathogenic bacteria in food aimed to determine of lactic acid bacteria isolated from raw milk. Therefore, 74 isolates of lactic acid bacteria isolated was named from 30 raw milk samples. Species named; has been identified as 10 Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, 9 Lb. casei, 6 Lb. rhamnosus, 5 Lb. acidophilus, 5 Lb. coryniformis ssp. tourquens, 3 Lb. plantarum ssp. plantarum, 5 Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides, 3 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum, 9 Pediococcus pentosaceus, 6 P. dextrinicus, 1 P. inopinatus, 1 P. acidilactici, 4 Streptococcus lactis, 1 S. cremoris, 2 Enterococcus faecalis, 1 E. faecium ve 3 Lactococcus lactis ssp. lactis. Lactic bacteria were investigated protease, lipase, elastase, α-amylase enzyme characteristics and hemolytic activities isolated from raw milk. Proteolytic activity was determined of 74 isolates in 70 isolates. 36 isolates (51.4%), weak (+), 34 isolates (48.6%), moderate (+ +) has shown proteolytic activity. The isolated from lactic bacteria, elastase enzyme characteristics appeared to function on the nutrient Agar in Elastin researched. Lactic bacteria investigated lipolytic activities on the Tributyrin Agar, Leu. mesenteroides ssp. dextranicum species detected zone diameter of 4 mm. The other strains was not observed zone diameter. α- Amylase enzyme activities were tested on Starch Agar. Lb. plantarum ssp. plantarum, Lb. casei, Lb. coryniformis ssp. tourquens, Pediococcus pentosaceus

vii and Leu. mesenteroides ssp. dextranicum species demonstrated α-amylase (+) activity. Lactic bacteria were examined hemolytic activity on Colombia blood agar. S. lactis, Lactococcus lactis ssp. lactis ve Enterococcus faecium species demonstrated hemolytic (+) activity. On the other hand the other species was not observed hemolytic activity. Isolated from raw milk 17 different bacterial species taking from each strain was studied inhibitory effect. These bacteria was studied inhibitory effect in the well diffusion method Nutrient Agar and 0,2% glucose Nutrient Agar. While Lactic bacteria strains were showed on the S. aureus, L. Monocytogenes and S. typhimurium an inhibitory effect when they showed no effect on the E. coli and K. pneumoniae. In these conditions a larger zone diameters has been observed in glucose medium. In these circumstances the most greatest impact, Lb. delbrueckii ssp. lactis strain showed zone diameter 18mm on the L. monocytogenes and S. typhimurium. In these conditions a larger zone diameters has been observed in 0,2% glucose Nutrient Agar medium. All species studied lactic bacteria had no effect on E. coli and K. pneumoniae. Science Code : 203.1.010 Key Word : Lactic acid bacteria, Enzyme activity, Inhibitory effects Page Number : 124 Supervisor : Prof. Dr. Güven Uraz

viii TEŞEKKÜR Çalışmalarımda, öncelikle tez konumu belirlememde, konuyla ilgili literatür araştırmalarımda ve laboratuvar çalışmalarımda maddi ve manevi desteklerini benden esirgemeyen değerli hocam Prof. Dr. Güven URAZ a teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca yüksek lisans öğrenciliğim sürecinde maddi ve manevi desteklerinden dolayı sevgili aileme ve laboratuvar çalışmalarımda değerli bilgileri ve manevi desteklerinden dolayı Yrd. Doç. Dr. Ebru Yılmaz hocama ve çok değerli laboratuvar arkadaşlarıma teşekkür ederim.

ix İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET.. ABSTRACT TEŞEKKÜR ÇİZELGELERİN LİSTESİ. ŞEKİLLERİN LİSTESİ.. RESİMLERİN LİSTESİ. iv vi viii xiii xvii xx 1. GİRİŞ 1 2. LİTERATÜR ARAŞTIRMASI.... 3 2.1. Laktik Asit Bakterilerinde Proteolitik Aktivite.. 6 2.2. Laktik Asit Bakterilerinde Lipolitik Aktivite..... 8 2.3. Laktik Asit Bakterilerinde α-amilaz Enzimi.. 9 2.4. Laktik Asit Bakterilerinde Elastaz Enzimi...... 10 2.5. Laktik Asit Bakterilerinde Hemolitik Aktivite 11 2.6. Laktik Asit Bakterilerinin Sınıflandırılması..... 11 2.7. Laktik Asit Bakterilerinin Fizyolojik ve Biyokimyasal Özellikleri... 12 2.8. Laktik Asit Bakterilerinin Morfolojik Özellikleri.... 12 2.9. Laktik Asit Bakterileri Nerede Bulunur... 13 2.10. Laktik Asit Bakterilerinde İnhibitör Etki... 16 3. MATERYAL VE METOT. 22 3.1. Çiğ Süt Örneklerinden Laktik Asit Bakterilerinin İzolasyonunda KullanılanYöntemler 24 3.1.1. Örnek alma ve örneklerin analize hazırlanması 24

x Sayfa 3.1.2. Laktik asit bakterilerinin izolasyonu ve adlandırılması... 25 3.2. Çiğ Sütten İzole Edilen Laktik Asit Bakterilerinin Proteolitik Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi. 33 3.2.1. İzole edilen bakterilerin proteolitik aktivitelerinin belirlenmesinde kullanılan besiyeri.. 33 3.2.2. İzole edilen bakterilerin proteolitik aktivitelerinin değerlendirilmesinde kullanılan yöntem...... 33 3.3. Çiğ Sütten İzole Edilen Laktik Asit Bakterilerinin Lipolitik Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi.... 34 3.3.1. İzole edilen bakterilerin lipolitik aktivitelerinin belirlenmesinde kullanılan besiyeri. 34 3.3.2. İzole edilen bakterilerin lipolitik aktivitelerinin değerlendirilmesinde kullanılan yöntem...... 34 3.4. İzole Edilen Laktik Asit Bakterilerinde Elastaz Varlığının Araştırılması... 34 3.5. İzole Edilen Laktik Asit Bakterilerinde -Amilaz Varlığının Araştırılması.... 35 3.5.1. Yöntem.. 35 3.5.2. Kullanılan besiyerleri.... 35 3.6. Laktik Asit Bakterilerinin Hemolitik Aktivitelerinin Belirlenmesi. 37 3.6.1. Yöntem.. 37 3.6.2. Kullanılan besiyerleri..... 37 3.7. Laktik Asit Bakterilerinin Patojen Bakteriler Üzerine İnhibitör Etkisi... 37 3.7.1. Nutrient agar da kuyu difüzyon yöntemi... 38 3.7.2. %0,2 lik glikoz içeren nutrient agar da kuyu difüzyon yöntemi.. 38 3.7.3. Kuyu difüzyon yönteminde kullanılan besiyeri..... 39

xi Sayfa 3.7.4. Laktik asit bakterileri ve indikatör patojen bakterilerin aktifleştirilmesinde kullanılan besiyerleri... 39 3.8. Laktik Asit Bakterilerinin İzolasyonunda Kullanılan Temel Besiyerleri... 40 3.9. Laktik Asit Bakterilerinin İdentifikayonunda Kullanılan Besiyerleri ve Uygulanan Testler.. 41 3.9.1. Gram boyama.... 41 3.9.2. Katalaz testi... 42 3.9.3. Vankomisin duyarlılık testi... 42 3.9.4. MRS broth da gaz testi. 43 3.9.5. 10 0 C ve 45 0 C de üreme... 44 3.9.6. Arginin hidrolizi... 45 3.9.7. Esculin hidrolizi 46 3.9.8. %6,5 NaCl de üreme. 47 3.9.9. Karbonhidrat fermentasyon besiyeri. 47 4. BULGULAR.. 49 4.1. Laktik Asit Bakterilerinin Proteolitik Aktivitelerinin Değerlendirilmesi. 55 4.1.1. Proteaz enzim varlığının araştırılması.. 55 4.1.2. Elastaz enzim varlığının araştırılması... 59 4.2. Laktik Asit Bakterilerinin Lipolitik ve -Amilaz Aktivitelerinin Değerlendirilmesi... 59 4.3. Laktik Asit Bakterilerinde Hemolitik Aktivitelerinin Değerlendirilmesi. 64 4.4. Laktik Asit Bakterilerinin Bazı Patojen Bakteriler Üzerine İnhibitör Etkilerinin Değerlendirilmesi... 65

xii Sayfa 4.4.1. Laktik asit bakterilerinin Staphylococcus Aureus üzerine inhibitör etkilerinin değerlendirilmesi... 65 4.4.2. Laktik asit bakterilerinin Listeria monocytogenes üzerine inhibitör etkilerinin değerlendirilmesi... 71 4.4.3. Laktik asit bakterilerinin Salmonella typhimurium üzerine inhibitör etkilerinin değerlendirilmesi.. 78 4.4.4. Laktik asit bakterilerinin Klebsiella pneumoniae üzerine inhibitör etkilerinin değerlendirilmesi.. 84 4.4.5. Laktik asit bakterilerinin E. coli üzerine inhibitör etkilerinin değerlendirilmesi... 90 5. TARTIŞMA-SONUÇ 102 KAYNAKLAR. 115 ÖZGEÇMİŞ.. 124

xiii ÇİZELGELERİN LİSTESİ Çizelge Sayfa Çizelge 3.1 Çiğ süt örneklerinin toplandığı illere göre dağılımı 22 Çizelge 3.2 Çizelge 3.3. Çizelge 3.4. Çizelge 3.5. Çizelge 3.6. Çizelge 3.7. Çizelge 3.8. Çizelge 3.9. Çizelge 4.1. Gram pozitif katalaz negatif bakterilerin cins seviyesinde adlandırılmalarında kullanılan testler.. 24 Obligat homofermentatif Lactobacillus türlerinin fizyolojik karakterleri. 25 Fakültatif heterofermentatif Lactobacillus türlerinin fizyolojik karakterleri. 26 Pediococcus türlerinin identifikasyonunda kullanılan fizyolojik testler. 26 Leuconostoc türlerinin adlandırılmasında kullanılan fizyolojik testler. 27 Streptococcus türlerinin adlandırılmasında kullanılan biyokimyasal testler... 28 Laktik asit bakteri izolatlarına uygulanan biyokimyasal testler.. 29 BBL Crystal Gram Positive ID kit ile uygulanan testlerin tablosu. 32 Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin cinslere göre dağılımı.. 49 Çizelge 4.2. Çiğ süt örneklerinin toplandığı illerin cinslere göre dağılımı. 50 Çizelge 4.3. Çizelge 4.4. Çizelge 4.5. Çizelge 4.6. Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin türlere göre dağılımı 51 Proteolitik aktivitesi araştırılan Laktik asit bakterilerinin Kalsiyum Kazeinat agarda oluşturdukları zon çaplarının değerleri 55. Proteolitik aktivite gösteren laktik bakteri izolatlarının cinslere göre dağılımı.. 57 Lipolitik aktivitesi gözlenen laktik bakteri türlerinde lipaz aktivite zon çapları (mm). 60

xiv Çizelge Çizelge 4.7. Laktik asit bakterilerinde α-amilaz enzim aktivitesi... Sayfa 61 Çizelge 4.8. Çizelge 4.9. Çizelge 4.10. Çizelge 4.11. Çizelge 4.12. Çizelge 4.13. Çizelge 4.14. Çizelge 4.15. Çizelge 4.16. Çizelge 4.17. Çizelge 4.18. Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin lipoliz zon çapları ve Amilaz aktiviteleri 62 Hemolitik aktivite gösteren laktik asit bakterilerinin türlere göre dağılımı... 64 Lactobacillus türlerinin indikatör S. aureus üzerine oluşturdukları zon çapları.. 66 Pediococcus türlerinin indikatör S. aureus üzerine oluşturdukları zon Çapları... 67 Leuconostoc türlerinin indikatör S. aureus üzerine oluşturdukları zon çapları 68 Streptococcus türlerinin indikatör S. aureus üzerine oluşturdukları zon çapları 69 Enterococcus türlerinin indikatör S. aureus üzerine oluşturdukları zon çapları 70 Lactobacillus türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine oluşturdukları zon çapları... 71 Pediococcus türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine oluşturdukları zon çapları 73 Leuconostoc türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine oluşturdukları zon çapları.... 74 Streptococcus türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine oluşturdukları zon çapları 75 Çizelge 4.19. Enterococcus türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine oluşturdukları zon çapları 77 Çizelge 4.20. Çizelge 4.21. Lactobacillus türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine oluşturdukları zon çapları 78 Pediococcus türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine oluşturdukları zon çapları 80

xv Çizelge Çizelge 4.22 Leuconostoc türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine oluşturdukları zon çapları Sayfa 81 Çizelge 4.23. Çizelge 4.24. Çizelge 4.25. Çizelge 4.26. Çizelge 4.27. Çizelge 4.28. Çizelge 4.29. Çizelge 4.30. Çizelge 4.31. Çizelge 4.32. Çizelge 4.33 Çizelge 4.34. Çizelge 4.35. Çizelge 4.36. Streptococcus türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine oluşturdukları zon çapları 82 Enterococcus türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine oluşturdukları zon çapları 83 Lactobacillus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine oluşturdukları zon çapları 84 Pediococcus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine oluşturdukları zon çapları 86 Leuconostoc türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine oluşturdukları zon çapları 87 Streptococcus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine oluşturdukları zon çapları 88 Enterococcus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine oluşturdukları zon çapları 89 Lactobacillus türlerinin indikatör E. coli üzerine oluşturdukları zon çapları 90 Pediococcus türlerinin indikatör E. coli üzerine oluşturdukları zon Çapları... 92 Leuconostoc türlerinin indikatör E. coli üzerine oluşturdukları zon Çapları... 93 Streptococcus türlerinin indikatör E. coli üzerine oluşturdukları zon Çapları... 94 Enterococcus türlerinin indikatör E. coli üzerine oluşturdukları zon Çapları... 95 Lactobacillus suşlarının tüm indikatör test bakterilerine karşı inhibitör etkisi.. 98 Pediococcus suşlarının tüm indikatör test bakterilerine karşı inhibitör etkisi. 99

xvi Çizelge Çizelge 4.37. Leuconostoc suşlarının tüm indikatör test bakterilerine karşı inhibitör etkisi. Sayfa 99 Çizelge 4.38. Çizelge 4.39. Streptococcus suşlarının tüm indikatör test bakterilerine karşı inhibitör etkisi.. 101 Enterococcus suşlarının tüm indikatör test bakterilerine karşı inhibitör etkisi.. 101

xvii ŞEKİLLERİN LİSTESİ Şekil Şekil 4.1. Şekil 4.2. Sayfa Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin cinslere göre dağılımı. 50 Şekil 4.2. Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin tür sayısına göre dağılımı... 52 Şekil 4.3. İzole edilen Lactobacillus türlerinin % lik dağılımı 53 Şekil 4.4. İzole edilen Pediococcus türlerinin % lik dağılımı.. 53 Şekil 4.5. İzole edilen Leuconostoc türlerinin % lik dağılımı.. 54 Şekil 4.6. İzole edilen Streptococcus türlerinin % lik dağılımı 54 Şekil 4.7. Şekil 4.8. Şekil 4.9. Şekil 4.10. Şekil 4.11. Şekil 4.12. Şekil 4.13. Proteolitik aktivite gösteren laktik bakteri izolatlarının cinslere göre dağılımı... 58 Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması... 66 Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması 67 Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması. 68 Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması. 69 Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması 70 Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda L. monocytogenes üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması. 72

xviii Şekil Şekil 4.14 Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda L. monocytogenes üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması. Sayfa 73 Şekil 4.15. Şekil 4.16. Şekil 4.17. Şekil 4.18. Şekil 4.19. Şekil 4.20. Şekil 4.21. Şekil 4.22. Şekil 4.23. Şekil 4.24. Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda L. monocytogenes üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması. 74 Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda L. monocytogenes üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması 76 Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda L. monocytogenes üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması 77 Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. typhimurium üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması 79 Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. typhimurium üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması. 80 Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. typhimurium üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması. 81 Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. typhimurium üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması 82 Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S.typhimurium üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması 83 Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda K. pneumoniae üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması 85 Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda K. pneumoniae üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması 86

xix Şekil Şekil 4.25. Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda K. pneumoniae üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması. Sayfa 87 Şekil 4.26. Şekil 4.27. Şekil 4.28. Şekil 4.29. Şekil 4.30. Şekil 4.31. Şekil 4.32. Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda K. pneumoniae üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması 88 Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda K. pneumoniae üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması 89 Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda E. coli üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması. 91 Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda E.coli üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması. 92 Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda E.coli üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması. 93 Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda E.coli üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması. 94 Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda E. coli üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması. 95

xx RESİMLERİN LİSTESİ Resim Sayfa Resim 2.1. Laktik bakteri cinslerinin morfolojik görüntüleri 13 Resim 3.1. MRS broth da gaz testi 44 Resim 3.2. Arginin hidrolizi.. 45 Resim 3.3. Esculin hidrolizi.. 46 Resim3.4. Karbonhidrat hidrolizi. 48 Resim 4.1. Calsium caseinate agarda proteolitik zon çapları 58 Resim 4.2. Elastinli nutrient agar da elastaz enzimi varlığı.. 59 Resim 4.3. Luria Bertani-nişasta agar da -Amilaz enzim varlığı.. 61 Resim 4.4. Kanlı agarda laktik asit bakterilerinin hemolitik aktivitesi. 64

1 1. GİRİŞ Süt mikroflorasının doğal üyeleri olan laktik asit bakterileri; fermente süt ürünlerinin elde edilmesinde, olgunlaşmasında, tat ve aroma oluşumunda görev alırlar. Ayrıca bu ürünlerin üretim aşamasında starter suş kullanımı büyük önem taşımaktadır. Starter suşların büyük bir kısmı laktik asit bakteri grubunda yer alan, özellikleri belirlenmiş mikroorganizmalardır. Laktik bakteriler fermente ürün teknolojisinde kullanıldığında proteaz, lipaz, elastaz, -amilaz gibi enzim aktivitelerinin varlığı önem taşımaktadır. Ayrıca aroma oluşumunda bu özellikleri olan bakteriler tercihen ürüne ilave edilmektedir. Proteaz enzim aktivitesinin varlığı süt proteinlerini etkileyen önemli bir enzim aktivitesidir. Fermente ürün elde edilmesinde bu enzimi salgılayan bakteriler gereklidir. Bu nedenle araştırmada çiğ süt örneklerinden laktik asit bakterilerinin izolasyonu yapılmıştır. Morfolojik, fizyolojik ve biyokimyasal özelliklerine göre çeşitli testlerle tür bazında adlandırılmıştır. Özellikle süt endüstrisinde fermente ürünlerin oluşumunda, aroma ve tekstürün oluşumunda önemli bir yeri olan enzim aktivitelerinin, izole edilen bakterilerde varlığının araştırılması amaçlanmıştır. Protez, lipaz, elastaz ve -amilaz enzimleri gıda fermentasyonunda, özellikle süt ürünlerinin fermentasyonunda aktivite gösterirler. Fermente süt ürünlerinde olgunlaşma, renk, koku ve lezzetin oluşumu laktik bakterilerin salgıladıkları bu enzimler sayesinde gerçekleşir. Süt mikroflorasının önemli üyeleri olan laktik bakterileri ( lactobacillus, pediococcus, leuconostoc ve streptococcus) izole edilerek, adlandırılan türlerin enzimatik özellikleri belirlenmiştir. Ayrıca laktik bakteriler metabolizmaları sonucu organik asit, hidrojen peroksit, bakteriosin gibi ürünler salgılamaktadır. Ürettikleri bu ürünler laktik asit bakterilerine inhibe edici özellik kazandırmaktadır. Bu özellik ile birçok patojen bakteri üzerinde inhibitör etki göstermektedirler. Bu amaçla çiğ sütten izole edilip adlandırılan laktik bakterilerin patojen özellikteki Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae ve E.coli

2 bakterilerine karşı inhibitör etkisi araştırılmıştır. Gıda patojeni olan bu bakteriler süt ve süt ürünlerinde bozulmalara, koku ve lezzet değişimlerine neden olmaktadırlar. Ayrıca süt ürünlerinden, bu patojenlerin insanlara kontaminasyonu sonucu çeşitli enfeksiyonlar oluşmaktadır ve bazı enfeksiyonlar ciddi sonuçlara neden olmaktadırlar. Laktik asit bakterilerinin fermentasyonu sonucu ortamda bulunan karbonhidratların miktarı azalır ve antimikrobiyal aktiviteye sahip organik moleküller ( laktik, asetik, formik, propiyonik asit) ve antimikrobiyal bileşikler ( hidrojen peroksit, diasetil ve bakteriyosin) oluşur. Oluşan bu organik moleküller ve antimikrobiyal bileşikler ile laktik bakteriler gıda patojeni bakteriler üzerinde inhibitör etki oluştururlar. Araştırmada laktik bakterilerin, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium Klebsiella pneumoniae ve E.coli üzerinde inhibitör etkileri belirlenmiştir.

3 2. LİTERATÜR ARAŞTIRMASI Laktik asit bakterileri (LAB) endüstriyel açıdan önemli mikroorganizmalar olup, endüstriyel gıda fermantasyonlarında çeşitli şekillerde kullanılmaktadırlar. Laktik asit bakterileri özellikle süt ürünlerinin üretiminde starter kültür olarak kullanılan bakterilerdir. Starter kültür; belirli sayıda canlı mikroorganizmaların tek veya kombine kültürlerinin taze, donmuş veya liyofilize formlarını içeren, fermente gıda ürünlerinin imalatında kullanılan ve enzimatik özellikleri sayesinde, fermentasyon olaylarını hızlandıran ve arzu edilen nitelikte ürünlerin elde edilmesine olanak sağlayan mikroorganizmalardır [1]. Süt ve süt ürünlerinde fermente ürünlerde Laktik Asit Bakterilerinin starter kültür özellikleri büyük önem taşır. Laktik Asit Bakterileri gıdalarda starter kültür olarak kullanıldıklarında fermente ürünlerin tat, doku, besleyici değer gibi bazı ürün karakteristiklerine de katkıda bulunmaktadırlar [2, 3]. Bu enzimatik karakterle oluşmaktadır. Yani Süt ürünlerinde starter kültürlerin kullanılmalarında temel amaç kendine özgü özellikler taşıyan ürünün elde edilmesidir [4, 5, 6, 7, 8]. Adıgüzel 2001 yılında çiğ sütten izole ettiği laktik asit bakterilerinin inhibitör etkilerini incelediği bir çalışmasında, 110 çiğ süt örneğinden 249 laktik asit bakterisi izole etmiştir. 144 S. faecalis, 14 S. durans, 22 S. lactis, 4 S. cremoris, 5 P. urinequi, 12 P. pentosaceus, 10 P. halophilus, 4 P. damnosus, 6 L. dextrinicus, 2 L. pseudomesenteroides, 1 L. lactis ve 1 L. cremoris izole etmiştir [9]. 2002 yılında Çetin in yapmış olduğu araştırmada, 10 çiğ süt örneğinden 27 izolat laktik asit bakterisi izole etmiştir. Bu 27 izolatın 5 i Lactococcus lactis ssp. lactis, 11 i Enterococcus ssp., 1 i Lactococcus raffinolactis ve 1 İ Lactococcus lactis ssp. cremoris olarak tespit edilmiştir [10].

4 Akkuzu (2004), pastörize süt ve pastörize sütlerden hazırlanmış 60 kefir örneğinden laktik asit bakterilerini izole etmiştir. İzole edilen bakteriler; 3 Pediococcus acidilactici, 1 Lactobacillus helveticus, 1 Leuconostc lactis, 1 Leuconostoc cremoris, 22 Enterococcus faecalis, 5 Enterococcus faecium, 10 Enterococcus durans, 1 Enterococcus hirae, 4 Enterococcus dispar, 41 Streptococcus lactis, 3 Streptococcus raffinolactis, 1 Streptococcus thermophilus ve 1 Streptococcus acidominimus olarak belirlemiştir [11]. Yüksekdağ ın 2005 yılında kefirden izole ettiği laktik asit bakterilerileriyle yaptığı bir çalışmada, 21 Lactobacillus izole etmiştir. 1 Lb. acidophilus, 2 Lb. helveticus, 4 Lb. casei, 3 Lb. bulgaricus, 6 Lb. lactis, 3 Lb. plantarum ve 2 Lb. brevis dir. İzole ettiği 21 Streptococcus izolatı ise 4 S. lactis, 3 S. thermophilus, 3 S. durans ve 11 S. cremoris dir. Bu izolatların proteolitik aktivitelerine bakıldığında, maximum proteolitik aktivite Lb. acidophilus türünde gözlenirken minimum aktivite Lb. plantarum türünde gözlemlenmiştir [12]. Arslan ve Uraz ın 2005 yılında yaptıkları bir çalışmada, 50 çiğ süt örneğinden 32 laktik asit bakteri izolasyonu yapılmıştır. Adlandırılan 32 bakterinin 14 ü Lactobacillus, 9 u Pediococcus, 4 ü Leuconostoc ve 5 ini Streptococcus olarak tespit etmişlerdir [13]. Coşkun un 2006 yılında yaptığı çalışmasında, hem çiğ sütteki hem de çiğ sütten üretilen 6 grup beyaz peynirlerdeki laktik asit bakterilerinin izolasyonu ve identifikasyonu yapılmıştır. Çiğ sütten toplam 10 bakteri izole edilmiştir. 1 Pediococcus pentosaceus, 3 Streptococcus lactis, 1 Enterococcus hirae ve 5 Enterococcus faecalis adlandırılmıştır. 6 grup beyaz peynirde ise 90 gün olgunlaşma süresinde toplam 144 laktik bakteri izole edilip adlandırılmıştır. 61 Lactococcus lactis ssp. lactis, 23 E. faecalis, 11 Lb. plantarum, 9 Lb. paracasei ssp. paracasei, 4 S. avium, 7 E. hirae, 6 P. pentosaceus, 6 S. casseliflavus ve 13 E. faecium dur [14]. 2009 yılında Tatlı nın yaptığı bir çalışmada; 50 geleneksel süt ürününden 72 adet laktik asit bakterisi izole edilmiştir. Bu izolatların cinslere göre dağılımı; 46

5 Lactobacillus ssp. %64, 15 Bifidobacterium ssp. %21, 10 Streptococcus ssp. %14 ve 1 Enterococcus ssp. %1 olarak belirlenmiştir [15]. Gheytanchi ve arkadaşlarının 2010 yılında yapmış olduğu bir çalışmada; 50 süt ve peynir örneğinden 41 Lactobacillus izole etmişlerdir. Bunlardan 3 Lb. acidophilus, 6 Lb. casei subsp. casei, 7 Lb. casei subsp. rhamnosus, 3 Lb. delbrueckii subsp. lactis, ve 7 Lb. plantarum izole edilip adlandırılmıştır [16]. Karakuş ve arkadaşlarının (1992), yaptığı bir çalışmada, olgunlaşmanın başlangıcında peynir florasında L. lactis ssp. lactis baskın tür iken, E. faecalis ve E.faecium bakterilerinin ikinci en önemli tür olduğunu tespit etmişlerdir. Peynir olgunlaşmasında proteolitik ve lipolitik aktivitelerinin önemini vurgulamışlardır [17]. Uraz ve Gündoğan (1998), 10 haftalık olgunlaşma periyodu boyunca Beyaz peynir florasında Bacillus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, S. aureus ve koliform grubu bakteri tespit ettiklerini ve Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus ve Streptococcus cinsi bakterilerin olgunlaşma boyunca dominant mikroorganizmalar olduğunu ve diğer bakteri türlerinden daha yüksek sayıda bulunduklarını bildirmişlerdir [18]. Gürsoy ve ark. (2001) az yağlı Beyaz peynir üretiminde, olgunlaşmayı hızlandırmak amacıyla ısıl işlem uygulanmış (65 C de 20 dak.) starter kültür (Lb. helveticus veya Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus; 0.5 g/100g) başarıyla kullanılabileceklerini bildirmişlerdir. Olgunlaşmanın 30. gününde proteoliz düzeyinin arzu edilen seviyelere yükseldiğini ve Lb. helveticus kullanımının daha iyi sonuç verdiğini tespit etmişlerdir [19]. Gürsel ve arkadaşları (2003), az yağlı Beyaz peynir üretiminde, olgunlaşmayı hızlandırmak süretiyle tekstür, tad ve aromayı iyileştirmek amacıyla, -20º C de 8 gün süre ile muhafaza edilen Lb. helveticus ve Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus bakterilerini yardımcı kültür olarak kullanmışlardır. Yardımcı kültür kullanımının peynirlerin genel bileşimini etkilemediğini, ancak olgunlaşmayı hızlandırdığını ve

6 özellikle Lb. helveticus un az yağlı Beyaz peynir üretiminde herhangi bir olumsuzluğa yol açmadığını bildirmişlerdir [20]. Topisirovic ve arkadaşları (2009), fermente ürünlerden elde ettikleri 26 enterokok türünün proteolitik ve antimikrobiyel özellikleri üzerine yaptıkları çalışlmada (37) ß- kazein e karşı 25 enterokok türünün güçlü veya orta derecede proteolitik aktivite gösterdiğini saptamışlardır [21]. Enterococcus faecalis, E. faecium ve bunların ortak kullanımıyla hazırlanmış peynirlerde lipolize olan katkıları incelendiği bir araştırmada (Rasouli Pirouzan ve arkadaşları 2010), olgunlaşma süresince lipoliz indeksinin önemli ölçüde kontrol grubuna nazaran daha yüksek olduğu saptanmıştır. Bu peynirlerde serbest yağ asiti miktarının daha fazla olduğu bildirilmiştir. Bu sonuç ilave enterokokların peynirde lipolize katkıda bulunduğunu göstermektedir [22]. 2010 yılında Yıldırım ın yaptığı çalışmada; dört farklı Lactococcus lactis ssp. lactis suşu kullanılarak üretilen beyaz peynirde, 90 gün boyunca proteoliz ve lipoliz düzeyleri ile L. monocytogenes in kalıcılığı incelenmiştir. Beyaz peynirde proteoliz ve lipoliz düzeyinin suştan suşa bağlı olduğunu göstermiştir. L. lactis ssp. lactis LL23 suşu ie yapılan peynirde kazein fraksiyonlarının proteoliz düzeyi daha yüksek bulunurken, L. lactis ssp. lactis LL27 suşu ile yapılan peynirde serbest yağ asitleri düzeyi çok daha yüksek saptanmıştır. 90 günlük depolama sonunda sadece LL27 suşunun Listeria monocytogenes in gelişimini inhibe ettiği belirlenmiştir [23]. 2.1. Laktik Asit Bakterilerinde Proteolitik Aktivite Proteolitik aktivite, mikroorganizmalarca salgılanan proteolitik enzimler ile proteinlerin hidrolize edilmesidir. Proteolitik aktivite, hem starter kültürlerin asit oluşturma fonksiyonu hem de fermente ürünün özellikleri açısından önemlidir. Süt proteinleri 20 aminoasitin karmaşık bir şekilde bağlanmasıyla meydana gelirler. Vücut tarafından sentezlenemeyen tüm aminoasitleri içerirler. Bu fizyolojik ve

7 beslenme özellikleri yanı sıra süt teknolojisi bakımından da önemli özelliklere sahiptir. Çünkü süt proteinleri süt ürünlerinin ya ana maddesidir veya önemli bileşenlerindendir [24,25]. Proteoliz olayı özellikle sütün ana protein yapısı kazeinin polipeptid ve oligopeptidler üzerinden serbest aminoasitlere kadar proteinlerin parçalanma olayıdır [24,26,27]. Laktik bakterilere ait proteolitik enzimlerden proteaz enzimi, Streptococcus salivarus ssp. thermophilus un dışında tüm türlerde ortaya konulmuştur. Fakat sayıları ve etkinlikleri oldukça farklılık göstermektedir [24]. Çeşitli çalışmalarda yoğurdun, Lb. bulgaricus ile S. thermophilus bakterilerinin simbiyotik yaşamaları sonucu oluştuğu ortaya çıkarılmıştır [28,29]. Yoğurt ile yoğurt sütü karşılaştırıldığında da yoğurtta, proteolitik aktivitenin, yoğurt bakterilerinin etkinliğiyle daha yüksek oluştuğu Tamime ve Deeth (1980) tarafından tespit edilmiştir [30]. Laktik bakteriler diğer mikroorganizmalarla karşılaştırıldığında zayıf bir proteolitik aktiviteye sahip olmasına karşın peynirin olgunlaşmasında önemli rol oynayan birçok sayıda proteolitik sistemi yapılarında barındırmalarından ötürü olgunlaşmada önemli mikroorganizmalardır [31]. Özellikle Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Lactobacillus helveticus ve Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus adı geçen özelliklerinden ötürü süt ürünü starteri olarak kullanılır ve büyük bir ekonomik öneme sahiptirler [32]. Proteolitik aktiviteye sahip bakterilerin etkinliğiyle; bakterilerin esansiyel azot ve sülfür bağlarının karşılanmasıyla hem gelişmeleri teşvik edilir hem de glikoliz olayı hızlanır, protein parçalanma ürünleriyle diğer bakterilerin metabolik gereksinimleri karşılanır ve tipik aroma maddelerinin, tat bileşenlerinin oluşumu sağlanır [18,33].

8 Yapılan araştırmalarda, laktik asit bakterilerinde, laktik asit üretimi ve proteolitik aktivitenin cins, tür ve suşlar arasında farklılık gösterdiği belirlenmiştir [34, 35]. Tekinşen ve Atasever (1994), Lb. bulgaricus türünün yüksek proteolitik aktivite gösterdiğini belirtmişlerdir [36]. Perez ve arkadaşları (2003) tarafından yapılan bir çalışma sonucunda, çeşitli suşlar arasında Lactococcus cinsinin Lactobacillus cinsine oranla daha yüksek proteolitik aktivite gösterdiğini tespit etmişlerdir [37]. Herros ve ark. (2003), değişik inkübasyon sürelerinde lactobacillus cinsinin ve enterococcus cinsinin yüksek proteolitik aktivite gösterdiğini tespit etmişlerdir [38]. 2.2. Laktik Asit Bakterilerinde Lipolitik Aktivite Süt içinde bulunan en önemli bileşenlerden birisi de süt lipitleridir. Süt yağı, lipaz enziminin etkinliği ile yağ asidi ve gliserine parçalanır. Lipaz süte özgü, doğal ve mikrobiyal kaynaklı olabilir. Yıllarca laktik asit bakterilerinin lipaz aktivitesi olmadığı varsayılmıştır. Genetik bilimindeki ilerlemelere bağlı olarak laktik asit bakterilerinin (LAB) genetiği üzerine yapılan çalışmalar, spesifik bakteriyel enzimlerin fermente ürün oluşumundaki rolünü açıklamaya imkan tanımıştır. Laktik asit bakterileri starter veya ilave kültür olarak süt ürünlerinin fermentasyonunda kullanılır [39]. Süt endüstrisinde laktik asit bakterilerinin proteoliz ve lipoliz aktiviteleriyle, fermente ürünlerde tekstür, aroma ve lezzet oluşumu sağlanır [37]. Laktik asit bakterilerinin lipaz aktivitesi tür ve cinslere göre farklılık gösterir. Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum en yüksek lipolitik aktiviteye sahip olurken yoğurt kültürünü oluşturan (Lb. bulgaricus ile S. thermophilus) her iki türün lipolitik aktivitesi oldukça sınırlıdır.

9 Süt trigliseridlerinin enzimatik hidrolizi (lipoliz) yüksek konsantrasyonlarda kısa ve orta zincirli yağ asitlerini açığa çıkarır. Lipoliz, birçok peynirde, lezzet gelişimi için gereklidir [40]. Sütte ve süt ürünlerinin birçoğunda serbest yağ asitlerinin oluşumu arzu edilmediği halde, karakteristik peynir aromasını meydana getirdiklerinden bazı peynir çeşitlerinde bu asitlerin oluşumu arzu edilir. Collins ve ark. (2003) starter laktik asit bakterilerinin otolizi ile Cheddar peynirinin olgunlaşması sırasında serbest yağ asitlerinin (SYA) artan birikimi arasında bir ilişki gözlemlemişlerdir ve bunun peynirde intrasellüler lipolitik aktivitenin artan oranına bağlı olabileceğini ifade etmişlerdir [41]. Laktik bakterilerin lipaz ve esterazının pastörize sütten yapılmış Cheddar ve Hollandatip peynirlerde başlıca lipolitik aktivitiye sahip ajan oldukları görülmüştür. Bu varsayım kültür kullanılmadan üretilen peynirlerde, starter kültür kullanılanlara nazaran daha düşük düzeyde serbest yağ asitlerinin bulunması ile açıklanmaktadır [42,43]. Enterococcus faecalis, E. faecium ve bunların ortak kullanımıyla hazırlanmış peynirlerde lipolize olan katkıları incelendiği bir araştırmada, olgunlaşma süresince lipoliz indeksinin önemli ölçüde kontrol grubuna nazaran daha yüksek olduğu saptanmıştır. Bu peynirlerde serbest yağ asiti miktarının daha fazla olduğu bildirilmiştir. Bu sonuç ilave enterokokların peynirde lipolize katkıda bulunduğunu göstermektedir [22]. 2.3. Laktik Asit Bakterilerinde α-amilaz Enzimi Bir karbohidraz olan alfa-amilaz enzimi ticari olarak kullanılan ilk enzimdir. Alfa-amilaz enzimi, ham ve çözünür nişasta molekülündeki alfa-1,4 glikozidik bağlarını parçalayarak glikoz, maltoz, maltotrioz ve alfa-limit dekstrinlerin oluşumunu katalize eden yaygın bir grup enzimdir. Nişasta, çok sayıda glikoz molekülünün farklı şekillerde bağlanmasıyla oluşmuş polisakkarit özellikte bir bileşiktir [44]. Bazı bakteriler ve mantarlar tarafından

10 üretilen alfa-amilaz, beta-amilaz, glikoamilaz ve glikoizomeraz gibi enzimler nişastayı parçalama yeteneğine sahiptirler. Bu enzim günümüzde tekstil ve kağıt endüstrisinde, nişastanın sıvılaştırılmasında, ekmek, glikoz ve fruktoz şurupları ve tutkal üretiminde, alkol fermantasyonunda kullanılmaktadırlar [4]. Endüstriyel olarak üretilen ilk enzim 1894 yılında tedavi amaçlı kullanılan amilazdır. Şu an Bacillus, Aspergillus ve Rhizopus türleri en önemli endüstriyel amilaz kaynakları olarak bilinmektedir. Bununla birlikte son yıllarda mikrobiyal kaynaklı amilazlar da araştırılmaktadır. Laktik asit bakterilerinde alfa amilaz enziminin varlığıyla ilgili bazı çalışmalar yapılmıştır. Laktik asit bakterileri cins seviyesinde incelendiğinde özellikle Lactobacillus cinsinde bu enzimin varlığı tespit edilmiştir [29]. Rodriguez-Sanoja ve arkadaşlarının 2005 yılında yapmış olduğu bir çalışmada, Lactobacillus plantarum ve Lactobacillus amylovorus un alfa amilaz enzim üretimleri karşılaştırılmış. Her iki bakterinin -amilaz enzim kapasitesi, iyot-boyama gücü ve nişastadan indirgeyici şekerlerin üretiminde azalma ölçülerek çözünür patates nişastası üzerinde incelenmiştir. Lb. amylovorus un alfa amilaz enziminin Lb. plantarum a göre 10 kat daha fazla nişasta hidrolize ettiğini tespit etmişlerdir. Benzer şekilde, Lb. amylovorus α-amilaz enzimi 10 kat daha fazla şeker azalttığını rapor etmişlerdir [45]. 2.4. Laktik Asit Bakterilerinde Elastaz Enzimi Elastaz proteolitik bir enzimdir ve yapay tatlandırıcı aspartamın ( N- benziloksikarbonil-l-aspartil fenilalanin metilesteri) sentezi için kullanılan bir enzimdir. Metalloproteinazlardan olan elastaz, elastin ve diğer proteinlerin daha basit moleküllere ayrılmasını katalize eden, genellikle aminoasitlerin karbonil gruplarının bulunduğu bağlardaki polipeptit zincirini kıran, serin endopeptidazların bir grubudur. Bu enzim birçok bakteriye virülans özellik kazandırmaktadır. Laktik asit bakterilerinde elastaz enzimiyle ilgili araştırmalara rastlanmamıştır. Araştırmamızda izole edip adlandırdığımız laktik asit bakterilerinde de elastaz enziminin varlığı saptanmamıştır.

11 2.5. Laktik Asit Bakterilerinde Hemolitik Aktivite Laktik asit bakterilerinde hemolitik aktivitenin belirlenmesi önemli bir kriterdir. Gıda endüstrisinde starter kültür olarak kullanım potansiyeli olan miroorganizmaların, hemolize neden olmayan -hemolitik suşlar olması gerekmektedir [46, 47]. Laktik bakterilerinde hemolitik aktivite genellikle streptococcaceae familyasına ait Streptococcus ve Lactococcus cinsi ve Enterococcus cinsi bakterilerde görülebilmektedir [24]. Hemolitik aktivite 3 şekilde gerçekleşmektedir. Kanlı agar ortamında üretildiklerinde koloni etrafında şeffaf zon oluşturanlar -hemolitik, koloni çevresinde tam olmayan, yeşilimsi bir hemoliz yapanlar -hemolitik ve hemoliz yapmayan bakteriler -hemolitiktir. 2008 yılında Anas ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada, Cezayirde çiğ keçi sütünden izole edilen 64 Lactobacillus suşunun hemolitik aktivitelerini incelemişlerdir. Lactobacillus suşlarında hemolitik aktivitenin olmadığı rapor etmişlerdir. Hemolitik aktivite yokluğu süt için kullanılan starter kültür seçiminde bir kriter oluşturmaktadır [48]. 2.6. Laktik Asit Bakterilerinin Sınıflandırılması Mikrobiyoloji bilim dalının doğuşu ile birlikte, gıda endüstrisinde ekonomik öneme sahip olarak bilinen laktik asit bakterileri ile ilgili çalışmalar da başlamıştır. İlk kez 19. yüzyıl sonlarında süt ve süt ürünlerinde fermantasyona yol açan bakteriler; laktik asit bakterileri olarak isimlendirilmiş ve daha sonraki yıllarda Lactobacillaceae familyası içinde sınıflandırılmışlardır. Beijerinck (1901), laktik asit bakterilerini Lactobacillales takımında incelemiştir. Lactobacillales takımı 16S rrna sekans birimleri temel alındığında filogenetik analizleri sınırlı olmakla beraber, bu takım içinde Lactobacillaceae familyası ve yakın akrabaları Aerococcaceae, Carnobacteriaceae, Enterococcaceae, Leuconostocaceae ve Streptococcaceae familyaları bulunmaktadır [49].

12 Axelsson un 1993 de yapmış olduğu sınıflandırmaya göre; laktik asit bakterileri grubuna dahil birçok cins olduğu saptanmıştır. Genel olarak laktik asit bakterileri; Lactobacillus, Pediococcus, Streptococcus ve Leuconostoc cinslerini içermektedir. Son yıllarda yapılan genetik çalışmalar sonucunda ise Lactococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Weissella ve Vagococcus cinsleri de laktik asit bakterileri içinde yer almaktadır [16, 50, 53,54]. 2.7. Laktik Asit Bakterilerinin Fizyolojik ve Biyokimyasal Özellikleri Laktik bakteriler morfolojik açıdan değişken özellikler gösterirken fizyolojik açıdan benzer özellikler göstermektedirler. Tüm üyeler; Gram pozitif, katalaz negatif, Sporolactobacillus inulinus hariç spor oluşturmayan, fakültatif anaerobik, Pediococcus cinsi hariç yalnız tek düzlemde bölünen ve bazı istisnalar hariç hareketsiz olan bakterilerdir. Gram- pozitif bakteriler içerisinde guanin-sitozin (G+C) oranı en düşük olan bakterilerdir [16, 24, 51]. Glikozu katabolize ederek ana ürün olarak laktik asit oluşturmalarıyla karakterize edilirler. Sütü asitleştirme yeteneğindedirler. Değişik sıcaklıklarda gelişebilirler. Oksijene ve farklı NaCl konsantrasyonlarına karşı toleranslıdırlar. Arjininden amonyak oluşturabilme ve eskülini hidrolize edebilme yeteneğine sahiptirler. Safra tuzlarına ve ph nın farklı değerlerine karşı direnç gösterebilirler. 2.8. Laktik Asit Bakterilerinin Morfolojik Özellikleri Laktik bakterilerin morfolojik özellikleri cins ve türlerine göre farklılıklar göstermekle birlikte genel olarak kok, düzgün çubuk ve düzensiz çubuk olmak üzere üç farklı formda görünümleri vardır (Resim 2.1) [24, 51, 52]. Streptokok, laktokok ve enterokok cinsi ikili veya zincir şeklinde sıralanmış ovoid hücrelerden oluşurken, lökonostok cinsi ikili zincir şeklinde sıralanmış mercimek formunda hücrelerden oluşmaktadır. Pediokok cinsinde ise tetrat şeklinde dizilmiş yuvarlak hücre formu tipiktir. Laktobasil cinsinde bulunan türler ise; tekli, ikili veya uzun zincir formunda düzgün çubuk şeklindeki hücrelerden oluşmaktadır [24].

13 Lactobacillus sp Leuconostoc sp Pediococcus sp Streptococcus sp Resim 2.1. Laktik bakteri cinslerinin morfolojik görüntüleri 2.9. Laktik Asit Bakterileri Nerede Bulunur Laktik asit bakterilerinin doğal bulunma ortamları genellikle besin içeriği bakımından zengin olan ortamlardır. Örneğin süt ve süt ürünlerinde bulunmaktadırlar. Sütün doğal florasını oluşturdukları için süt asidi bakterileri de denilmektedir. Bazı üyeleri insan organizmasında, ağız florasında bulunup, intestinal ve ürogenital sistemin mikroflorasını da oluşturmaktadır [53, 55]. Lactobacillus genusu: Çubuk şeklinde olan bu bakteriler, düzgün çubuk, kokobasil veya uzun zincir oluşturan çubuk şeklinde bulunabilirler. Çok az tür veya suşun dışında hareketsizdirler. Katalaz enzimi üretmezler. Spor oluşturmazlar anaerob veya mikroaerofildirler. Lactobacillus genusu türleri doğada oldukça fazla yaygındır. Silajda, hayvan ve insan bağırsağında bulunurlar. Normal süt florasında yer alırlar.

14 Çiğ sütlerde bu genusa ait birçok bakteriyi belirlemek mümkündür. Süt asidi miktarı %1-3 arasında değişir. Patojen özellik göstermezler. Aksine oluşturdukları antibakteriyel özellikteki maddeler sayesinde saprofit ve patojen bakterilerin gelişmelerini engellerler. Proteinleri parçalama özellikleri tür ve suşlara göre değişiklik gösterir. Hücrenin iç kısmındaki hücre çeperi ve peptidaz aktivitesiyle bağdaştırılan proteolitik aktivite, hücre çeperinin yüzeyindeki enzimlerin büyük moleküllü proteinleri hidrolize ederek hücrenin içine taşıyabilecek derecede küçük peptidlerin oluşumunu sağlamasıyla gerçekleşir. Hücre içi peptidazlar peptidleri aminoasitlere kadar parçalar ve mikroorganizmanın gelişmesinde kullanılabilir şekle sokar. Lactobacilluslar bu özellikleri nedeniyle yoğurt ve benzeri ürünlerin yapımında ve sert peynirlerin olgunlaştırılmasında kültür olarak kullanılırlar. Bu bakteriler süt ürünlerinde tat ve aroma oluşumunda önemli rol oynarlar [24, 56]. Laktik asit bakterileri, glukozu homofermentatif ve heterofermentatif yolla katabolize etmelerine göre ikiye ayrılırlar. Homofermentatif laktik asit bakterileri glukozu fruktozdifosfat yolu ile parçalayarak sonuçta %90 oranında laktik asit oluştururlar. Heterofermentatif laktik asit bakterileri ise glukozu hegzosmonofosfat yolu ile parçalayarak laktik asit yanında etanol, asetik asit ve CO2 gibi yan ürünler meydana getirirler [24]. Heterofermentatif laktik asit bakterileri Fruktozdifosfat yolunun önemli enzimlerinden aldolaz ve trioz-fosfat izomeraz enzimine sahip olmadıkları için Fruktozdifosfat yolunu kullanamamaktadır [24, 57]. Homofermetatif türler: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii ile bunun iki alt türü olan Lactobacillus delbruecki ssp. bulgaricus ve Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis tir. Bu bakteriler pentoz ve glukonatları fermente edemezler ve glukozdan gaz oluşturamazlar.

15 Heterofermentatif türler: Lactobacillus acetotolerans, Lactobacillus casei, Lactobacillus maltaromicus, Lactobacillus plantarum, Lactobacilus rhamnosus, Lactobacillus coryniformis ssp. torquens ve Lactobacillus sake örnek verilebilir. Bu bakteriler fermentasyon sonucunda laktik asit, asetik asit ve CO2 üretebilirler. Pediococcus genusu Pediococcus cinsi bakteriler iki veya dörtlü kok şeklindedir, tekli hücre veye zincir oluşturmaları nadirdir. Hareketsizdirler ve endospor oluşturmazlar. Kemoorganotrofturlar. Fermentasyon homolaktik olup DL-laktik asit üretirler. Mikroaerofilik olup, yüzeyde gelişmeleri zayıftır. Bazı non-hem katalaz aktivitesine sahip olmalarına rağmen genel olarak katalaz (-) tirler. Glukoz, früktoz ve mannozdan asit oluşturup gaz oluşturmazlar. Saprofitler özellikle bozulmuş birada ve süt ürünlerinde bulunurlar [24, 57]. Leuconostoc genusu Leuconostoc cinsi bakteriler yuvarlak veya çoğunlukla mercimek tanesi şeklinde olup ikili veya zincir şeklinde bulunurlar. Hareketsizdirler ve spor oluşturmazlar. Katalaz negatif olan genusun bazı türleri hem varlığında ve diğer H 2 O 2 aktivite varlığında, gelişme sırasında H 2 O 2 i parçalayabilirler. Sitokrom sistemleri yoktur. Arginin i hidrolize etmezler. Sütü çok seyrek olarak asitleştirir ve pıhtılaştırırlar. Proteolitik değillerdir. Fakültatif anaerobturlar. Patojen özellik göstermezler. Ayrıca Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum türü laktik asit bakterileri içerisinde en yüksek lipolitik aktiviteyi gösteren bakteridir [24, 57]. Streptococcus genusu Streptococcus cinsi bakteri hücreleri yuvarlaktan ovale kadar değişen şekilde olup ikili veya zincir şeklinde bulunurlar. Hareketsizdirler. Ancak ara sıra hareketli suşları mevcuttur. Kemoorganotrof yapıdadırlar. Karbonhidratlardan fermentatif metabolizmaları sonucu laktik, asetik, formik asit ile alkol, karbonhidrattan ise CO 2 oluştururlar. Besin gereksinimleri kompleks ve değişkendir. Katalaz testi genellikle negatif olup değişken sonuç vermektedir. Fakültatif anaerobdurlar. O 2 veya diğer H

16 akseptörleri karbonhidrat metabolizmasının son ürününü değiştirebilirler. Optimum gelişme sıcaklığı 37 C 0 dir [24, 57]. Lactococcus genusu Lactococcus bakteri hücreleri düzgün oval şekillidir. İkili formu kısa zincir formuna göre daha çok görülür. Bazı suşları uzun zincir oluşturabilir. Mannitol, trehaloz, sükroz, arabinoz, ksiloz, laktoz, maltoz ve glukozdan asit üretirler. Proteolitik aktiviteye sahiptirler. Bazı suşları bir bakteriosin olan nisini üretirler. Birçok gram (+) bakteriye karşı inhibitör etki gösterirler. Kanlı agarda α veya γ reaksiyon verirler. Optimum gelişme sıcaklıkları 30 C 0 dir. Süt ürünlerinde adil kontaminant olarak bulunurlar [24,57]. 2.10. Laktik Asit Bakterilerinde İnhibitör Etki Laktik asit bakterilerinin en önemli özelliklerinden biri, ortamda bulunan gıda kaynaklı, patojen ve kontaminant mikroorganizmaların ( Staphylococcus aureus, E. coli, Salmonella, Listeria monocytogenes gibi) gelişimini engellemeleri ve ölümlerine sebep olmalarıdır [58, 59, 60]. Gıdaların korunmasında laktik asit bakterilerinin antimikrobiyal madde üretim yeteneklerinden yararlanılır [61]. Fermentasyon sonucu ortamda bulunan karbonhidratların miktarı azalır ve antimikrobiyal aktiviteye sahip organik moleküller ( laktik, asetik, formik, propiyonik asit) ve antimikrobiyal bileşikler (hidrojen peroksit, diasetil ve bakteriyosin) oluşur [62, 63, 64, 65, 66]. Süt ve süt ürünlerinde, gıdaların bozulmasına sebep olan ve patojen özellikteki bakterilerin inhibisyonunda en önemli faktörlerden biri ph dır. Laktik asit bakterilerinin üretmiş olduğu organik asitlerle bu mikroorganizmalar üzerinde inhibitör etki oluşabilmektedir. Süt ve süt ürünlerinde ph dışında inhibitör etkiyi oluşturan en önemli faktörlerden biri bakteriosinlerdir. Bakteriosinler protein veya protein kompleksleri olup, laktik asit bakterileri tarafından da üretilen antimikrobiyal

17 maddelerdir. Laktik asit bakterilerinin bakteriosinleri bazı gram (+) ve gram (-) bakteriler üzerinde inhibitör etki oluşturur [ 67, 68 ]. Çalışmamızda çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin, gıda patojeni (S. aureus, L. monocytogenes, Salmonella typhimurium, E. coli ve K. pneumoniae) bakteriler üzerine inhibisyon etkileri araştırılmıştır. Staphylococcus aureus enterotoksin üretebilen, dünyanın hemen her ülkesinde gıda kaynaklı hastalıklara yol açan patojen bir bakteridir. Gram (+), katalaz (+) düzenli veya düzensiz kümeler oluşturan kok şeklinde bakterilerdir. Bu bakteri mastitis, süt hayvanlarında cilt hastalıkları ile süt ve mamülleri tüketicilerinde gıda kaynaklı intoksikasyonlara neden olmaktadır. Bunların esas önemleri olası enterotoksin üretebilme yetilerinden kaynaklanmaktadır [69]. Laktik bakterilerin gram (+) ve gram (-) patojenler üzerine inhibisyonu dahil olmak üzere birçok yararları vardır. Çeşitli araştırmacılar Lactococcus lactis in S. aureus a karşı antagonistik etki gösterdiğini bildirmişlerdir [ 64, 70, 71]. Çon ve Gökalp in 2000 yılında kuyu difüzyon tekniği kullanarak yaptıkları bir çalışmada, Lactobacillus plantarum un S. aureus a karşı inhibitör etki gösterdiğini belirlemişlerdir. Aynı çalışmada Pediococcus pentosaceus suşlarının, E. coli ye karşı inhibitör etkisinin bulunmadığını göstermişlerdir [29]. Adıgüzel 2001 yılında çiğ sütten izole ettiği laktik asit bakterilerinin inhibitör etkilerini incelediği bir çalışmasında, 110 çiğ süt örneğinden 249 laktik asit bakterisi izole etmiştir. 144 S. faecalis, 14 S. durans, 22 S. lactis, 4 S. cremoris, 5 P. urinequi, 12 P. pentosaceus, 10 P. halophilus, 4 P. damnosus, 6 L. dextrinicus, 2 L. pseudomesenteroides, 1 L. lactis ve 1 L. cremoris izole etmiştir. İnhibitör etkisi incelen Listeria monocytogenes ve S. aureus bakterilerinde Pediococcus pentosaceus ve Leuconostoc dextrinicus etkili bulunmuştur [9].

18 Kılıç 2003 yılında insan vajinasından izole ettiği Lactobacillus suşlarının S. aureus a karşı inhibitör etkisini incelemiştir. Lactobacillus acidophilus suşunun S. aureus üzerine etki oluşturduğunu ve zon çapının 14 mm olduğunu gözlemlemiştir [72]. Ammor ve arkadaşları (2006) bazı laktik asit bakteri suşlarının Biyofilm oluşturmada etkili S. aureus üzerine antagonistik etki oluşturduğunu rapor etmişlerdir [73]. 2008 yılında Anas ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada, Cezayirde çiğ keçi sütünden izole edilen 64 Lactobacillus suşunun S. aureus a karşı inhibitör etkisini incelemişlerdir. 64 suştan sadece 11 i inhibe edici etki göstermiştir. Bu suşlar tür düzeyinde mikrobiyolojik ve biyokimyasal testlerle adlandırılmıştır. S. aureus a etki gösteren türler, Lb. plantarum, Lb. rhamnosus, Lb. acidophilus, Lb. sakei subsp. sakei, Lb. casei ve Lb. paracasei. subsp. paracasei dir. Ancak en yüksek etkiyi Lb. plantarum türünün gösterdiğini bildirmişlerdir [48]. Karska-Wysocki ve arkadaşları (2010), Lactobacillus acidophilus ve Lactobacillus casei suşlarının metsilin dirençli S. aureus üzerinde antibakteriyel aktivitesini incelemişlerdir. S. aureus üzerinde, Lb. casei 2cm, Lb. acidophilus 3 cm zon çapı oluşturarak antibakteriyel aktivite gösterdiklerini rapor etmişlerdir [74]. Altuntaş ve arkadaşları 2010 yılında çiğ süt ve peynir örneklerinden izole ettiği laktik asit bakterilerinin antimikrobiyel aktivitelerini incelemişlerdir. 3 çiğ süt ve 9 peynir örneğinden 63 laktik asit bakterisi izole etmişlerdir. L. monocytogenes ve S. aureus üzerine inhibitör etkilerine bakıldığında, Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactobacillus plantarum ve Lactobacillus paracasei ssp. paracasei suşlarının etki gösterdiğini tespit etmişlerdir. Listeria monocytogenes üzerine en yüksek etkiyi Lactococcus lactis ssp. lactis suşunun gösterdiğini rapor etmişlerdir [75]. Listeria monocytogenes, doğada çok yaygın bir şekilde bulunan hem insan hem hayvanlarda çeşitli hastalıklara yol açan patojen bir bakteridir. Gram (+) düzgün, sınırları belli kısa çubuk bakterisidir. Süt endüstrisindeki önemi, süt ve mamülleri bazlı gıda zehirlenmelerine neden olarak sık sık karşılaşılması ve günümüzde süt ve

19 mamullerinin L. monocytogenes içermemesinin sağlanmasının bir kalite kriteri kabul edilmesine gerek duyulmasından kaynaklanmaktadır [69]. Garcia ve arkadaşları 1993 yılında laktik asit bakterilerinin Listeria monocytogenes e karşı inhibitör etkilerinin tespit etmişlerdir. Çalışmalarında besiyerine %0,2 oranında glikoz ilave etmişlerdir [76]. Garriga ve arkadaşlarının 1993 yılında yaptığı bir çalışmada da Lactobacillus suşlarının Listeria monocytogenes üzerine inhibitör etkisini tespit etmek için besiyerine %0,2 oranında glikoz ilave etmişlerdir. Araştırmaları sonucunda bu suşların Listeria monocytogenes e karşı inhibisyon oluşturduğu tespit edilmiştir. Bu araştırmalarda inhibitör etknin tespiti için besiyerine %0,2 glikoz ilave edilmiştir. Bizim çalışmamızda da inhibitör etkiyi saptamak için hem nutrient agar besiyeri hem de %0,2 glikoz ilaveli nutrient agar besiyeri kullanılmıştır [77]. Schillinger ve arkadaşları (2001) çalışmalarında, laktik asit bakterilerinin Listeria monocytogenes üzerine bakteriosin etkisini incelemişlerdir. Gıda patojeni olarak bilinen L. monocytogenes üzerine gıdalara ilave edilen ve bakteriosin sentezleyen laktik bakterilerin etkisi tespit edilmiştir [78]. Salmonella gıda kaynaklı enfeksiyonlara yol açan büyük bir problem teşkil eden patojen bir bakteridir. Salmonella kümes ve kümes hayvanlarından elde edilen mamüllerde, et ve et ürünlerinde, süt ve süt ürünlerinde iyi bilinen bir kontaminanttır. Salmonella genusu gram (-), spor oluşturmayan, küçük, çubuk şeklinde bir bakteridir. Gıda kaynaklı salmonellosis vakalarının çoğu süt ve süt ürünü kaynaklı olmamasına rağmen süt ve mamülleri yine de salgılarda önemli bir kaynağı oluşturmaktadır [69]. 2003 yılında Çadırcı Lactobacillusların bazı gram (+) ve gram (-) bakteriler üzerine inhibitör etkisini incelediği bir çalışmada; Lb. plantarum un Salmonella üzerine inhibitör etki gösterdiğini tespit etmiştir [79].

20 E. coli, ilk kez 1885 te tanımlanan ve büyük ölçüde diyarenin bir nedeni olarak ortaya çıkan patojen bir bakteridir. Enterobacteriacea familyasının bir üyesi olan E. coli peritrik flagella içerebilen ya da hareketsiz olabilen gram (-), spor oluşturmayan düz çubuk şeklinde bir bakteridir. Patojenitesine göre 4 gruptur; Enteropatojenik (EPEC), Enterotoksijenik (ETEC), Enteroinvasiv (EIEC) ve Enterohaemorejenik E. coli (EHEC) dir. ETEC suşları insanlarda ve hayvanlarda şiddetli diyareye yol açmaktadır ve temel kaynağı süt ve süt mamulleridir [69]. Chuayana ve arkadaşları 2003 yılında, süt ürünlerinden izole ettikleri laktik asit bakteri kültürlerinin S. aureus, E. coli ve Salmonella typhi üzerine antimikrobiyel etkilerini araştırmışlardır. Streptococcus spp. ve Lactobacillus spp. suşları S. aureus a karşı bakterisidal etki gösterirken Salmonella typhi ve E. coli ye karşı bakteriostatik etki gösterdiğini rapor etmişlerdir [80]. 2005 yılında Rodriguez ve arkadaşları yaptıkları bir çalışmada Lactococcus lactis suşlarından elde edilen ve pediosin üreten iki transformatın peynirin olgunlaştırılması sırasında L. monocytogenes, S. aureus ve E. coli 0157:H7 üzerindeki antimikrobiyel aktivitesini araştırmışlardır. Pediosin üreten Lactococcus lactis in L. monocytogenes, S. aureus ve E. coli O157:H7 nin gelişimini engellediğini tespit etmişlerdir [82]. Arslan nın 2005 yılında yapmış olduğu bir çalışmada, çiğ sütten izole edilen Lactobacillus, Pediococcus, Streptococcus ve Leuconostoc türlerinin, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus ve B. subtilis indikatör bakterileri üzerine inhibitör etkisini incelemiştir. Çiğ sütten izole edilen laktik bakterilerin tüm indikatör bakterilere karşı etki oluşturduğunu bildirmiştir [13]. Etöz 2006 yılında yapmış olduğu bir çalışmada, kefirden izole edilen Lb. casei, Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus, Leu. cremoris, Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium bakterilerinin, Staphylococcus, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter, Listeria, Esherichia, Aeromonas, Pseudomonas ve Proteus indikatör bakterilerine karşı antimikrobiyal aktiviteleri araştırılmıştır. Stapylococcus aureus,

21 Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium ve Klebsiella pneumoniae üzerine en yüksek antimkrobiyal aktiviteyi Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis göstermiştir. Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus ve Leu. cremoris hepsinde etki gösterirken, S. aureus ve Listeria monocytogenes üzerinde Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus en etkili tür olarak bildirilmiştir [83]. Gonzalez ve arkadaşlarının 2006 yılında yaptıkları çalışmada, 395 laktik asit bakteri suşunun peynir yapımı ve olgunlaştırılması süresince antimikrobiyal aktivitelerini araştırmışlardır. Lactococcus lactis ssp. lactis suşlarının S. aureus ve Listeria monocytogenes üzerine antibakteriyel etki gösterdiğini bildirmişlerdir [81]. Tuncer ve arkadaşlarının 2008 yılında yaptığı bir çalışmada, bozadan izole ettikleri laktik asit bakterilerinin antimikrobiyel etkisini incelemişleridir. E. coli de inhibitör etki gözlenmezken, S. aureus üzerine L. lactis ssp. lactis suşunun etkili olduğunu tespit etmişlerdir [84]. 2008 yılında İşleroğlu ve arkadaşlarının yapmış olduğu bir çalışmada, Tokat yöresine ait geleneksel bir peynirden antimikrobiyel aktiviteye sahip bir bakteri izole edilip karakterize edilip adlandırılmıştır. Adlandırılan Enterococcus faecalis tarafından üretilen antimikrobiyel maddenin L. monocytogenes ve E. coli üzerine etkisi araştırılmıştır. L. monocytogenes e karşı inhibitör etki gösteriken E. coli ye etkili olmadığını gözlemlemişlerdir [55]. Dixit ve arkadaşları 2013 yılında Lactobacillus acidophilus suşlarının Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, S. aureus, E. coli ve Salmonella typhi üzerine antibakteriyal etkilerini incelemişlerdir. 5 Lactobacillus acidophilus suşundan 3 tanesi etkili bulunmuştur. NCIM 2903 nolu suş tüm patojen bakterilerde etkili bulunurken, NCIM 2285 nolu suş P. aeruginosa ve Salmonella typhi üzerine etkisiz diğer bakterilerde etkili bulunmuştur. NCIM 2660 nolu suş ise, P. aeruginosa ve K. pneumoniae üzerinde zayıf inhibitör etki gösterirken Salmonella typhi de inhibitör etki göstermiştir [85].

22 3. MATERYAL VE METOD Araştırmamızda Nisan 2011- Mart 2012 tarihleri arasında Ankara ve çeşitli illerden toplanan 30 çiğ süt örneği materyal olarak kullanılmıştır. Alınan 30 çiğ süt örneğinden laktik asit bakterileri ( Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Streptococcus) izole edilmiştir. Daha sonra izole edilen bakterilerin identifikasyonu yapılmıştır. Toplam laktik asit bakterilerinin sayısı 74 olarak belirlenmiştir. Süt örnekleri Ankara, Burdur, Kırıkkale, Konya ve Bursa illerinden toplanmıştır. (Çizelge3.1.) Çizelge 3.1. Çiğ süt örneklerinin toplandığı illere göre dağılımı Çiğ Süt Örneklerinin Toplandığı İller Çiğ Süt Örneklerinin Sayısı ANKARA 13 BURDUR 5 KIRIKKALE 4 KONYA 4 BURSA 4 TOPLAM 30 İzole edilen laktik asit bakterilerinin adlandırılmasında manuel biyokimyasal testler yapılmıştır. Bergey s Manual of Systematic Bacteriology e göre biyoşimik özellikler karşılaştırılarak adlandırılması yapılmıştır. Ayrıca Pediococcus pentosaceus, Enterococcus faecalis, E. faecium ve Lactococcus lactis ssp. lactis türlerinin adlandırılmasında ilave olarak BBL Crystal Rapid Gram-Positive ID Kit kullanılmıştır. Tür seviyesinde adlandırılması yapılan izolatların proteaz, lipaz, elastaz, -amilaz ve hemoliz aktiviteleri araştırılmıştır. Bunun yanında bazı patojen bakteriler (Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Klebsiella pneumoniae, E. coli, Salmonella typhimurium) üzerine inhibitör etkileri araştırılmıştır. Lactobacillus cinsine ait izole edilen türler; Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, Lactobacillus casei, Lb. rhamnosus, Lb. acidophilus, Lb. coryniformis ssp. torquens, Lb. plantarum ssp. plantarum dur. Pediococcus cinsine ait izole edilen türler; Pediococcus pentosaceus, P. dextrinicus, P. inopinatus, P. acidilactici dir.

23 Leuconostoc cinsine ait izole edilen türler; Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides, Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum dur. Streptococcus lardan Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris türleri, Enterococcus lardan Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium ve Lactococcus lactis ssp. lactis türleri izole edilmiştir. Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc ve Streptococcus bakterilerinin izolasyonu amacıyla çiğ süt örnekleri steril şişelerle alınmıştır. Örnekler, zenginleştirme besiyeri olan pepton water da 10-1, 10-2 ve 10-3 e kadar dilüsyon yapılarak sulandırılmıştır. 10-2 ve 10-3 dilüsyonlarından laktik asit bakterilerinin üretildiği selektif bir besiyeri olan MRS (De Man Rogosa Sharp) agara ekim yapılmıştır [86]. MRS besiyerinde üreyen bakteriler önce morfolojilerine göre ayrılmış ve çeşitli biyokimyasal testler uygulanmıştır. Laktik asit bakterilerinin cins ve tür dağılımlarının belirlenebilmesi amacıyla, izole edilen bakteriler Gram boyama ile morfolojik olarak tespit edildikten sonra katalaz ve vankomisin testlerine tabi tutulmuştur. Laktik asit bakterileri katalaz negatif özellik gösterirler. Katalaz negatif olan izolatlara vankomisin testi yapılmıştır. Vankomisine dirençli olanlar Leuconostoc, Pediococcus ve Lactobacillus, vankomisine duyarlı olanlar Streptococcus cinslerine ait bakterilerdir. Vankomisine dirençli olan bakterilerin MRS broth da gaz oluşumu değerlendirilmiştir. MRS broth da gaz oluşturanlar Leuconostoc, gaz oluşturmayanlar Pediococcus, değişken reaksiyon gösterenler ise Lactobacillus cinsine ait kabul edilerek cins seviyesinde adlandırılmaları yapılmıştır (Çizelge 3.2).

24 Çizelge 3.2. Gram pozitif katalaz negatif bakterilerin cins seviyesinde adlandırılmalarında kullanılan testler Katalaz (Negatif) Vankomisin(30 µg disk) Duyarlı Dirençli Streptococcus Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacillus Pozitif MRS Broth' da gaz Negatif Leuconostoc Lactobacillus Pediococcus Lactobacillus Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc ve Streptococcus şüphesi olan izolatların tür seviyesinde identifikasyonu için, 10 0 C ve 45 0 C de üreme, %6,5 NaCl de üreme, esculin hidrolizi, arginin hidrolizi ve karbonhidrat fermentasyon testleri kullanılmıştır. 3.1. Çiğ Süt Örneklerinden Laktik Asit Bakterilerinin İzolasyonunda Kullanılan Yöntemler 3.1.1. Örnek alma ve örneklerin analize hazırlanması Araştırmada Türk Standartları Ensitüsünde (TSE-1018) belirtilen esaslara göre çiğ süt örnekleri 200 ml lik steril şişelerle alınmıştır [87]. Analiz için laboratuara getirilen örneklerin %0,1 lik Pepton water (Merck 1.07228) kullanılarak 10-1, 10-2,10-3 lük dilüsyonları hazırlanmıştır [88, 89]. 10-2 ve 10-3 lük dilüsyonlardan 0,1 ml alınarak MRS ve Standart Plate Count Agar (PCA) yayma ekim yapılmıştır. besiyerine dragalski özesiyle

25 3.1.2. Laktik asit bakterilerinin izolasyonu ve adlandırılması Lactobacillus suşlarının izolasyonu ve adlandırılması Araştırmada Lactobacillus ların izolasyonu için MRS besiyerine ekim yapılarak 37 0 C de 24-48 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyondan sonra farklı görünümdeki koloniler Gram boyama ile boyanarak, sporsuz zincir şeklinde basil olan koloniler MRS besiyerine tekrar tek koloni ekimi ile ekilmiştir. MRS besiyerinde üretilen bakteriler katalaz, vankomisin, MRS broth da gaz testleri yapılarak cins seviyesinde adlandırılmıştır [90]. Cins seviyesinde adlandırılan Lactobacillus lara 10 0 C de üreme, arginin, esculin ve karbonhidrat fermentasyon testleri uygulanmıştır. Obligat homoermentatif Lactobacillus türleri için galaktoz, laktoz, maltoz, rafinoz, sükroz, mannitol, salisin karbonhidratları, fakültatif heterofermentatif Lactobacillus türleri için mannitol, rafinoz, sükroz, ksiloz, arabinoz ve sorbitol karbonhidratları kullanılmıştır [91, 92]. Tür seviyesinde adlandırmak amaçlı yapılan tüm bu testler sonucunda obligat (zorunlu) homofermentatif Lactobacillus türlerinden 10 Lb. delbrueckii ssp. lactis, 5 Lb. acidophilus adlandırılmıştır (Çizelge 3.3). Fakültatif heterofermentatif Lactobacillus türlerinden 9 Lb. casei, 6 Lb. rhamnosus, 5 Lb. coryniformis ssp. tourquens ve 3 Lb. plantarum ssp. plantarum izole edilip adlandırılmıştır (Çizelge 3.4). Çizelge 3.3. Obligat homofermentatif Lactobacillus türlerinin fizyolojik karakterleri Lactobacillus Türleri 10 0 C de üreme Arginin Lb.delbrueckii ssp.lactis - d d + + - + - + Lb.acidophilus - - + + + d + - + d: değişken 11-89% Galaktoz Laktoz Maltoz Rafinoz Sükroz Mannitol Salisin

26 Çizelge 3.4. Fakültatif heterofermentatif Lactobacillus türlerinin fizyolojik karakterleri Lactobacillus Türleri 10 0 C de üreme Lb. casei + + - + - + - + Lb. rhamnosus + + d + - + - + Lb. coryniformis ssp. tourquens + - - + - + - - Lb. plantarum ssp. plantarum + + d + + + d + d: değişken 11-89% Esculin Arabinoz Mannitol Rafinoz Sükroz Ksiloz Sorbitol Pediococcus suşlarının izolasyonu ve adlandırılması Çiğ süt örneklerinden Pediococcus ların izolasyonu için MRS besiyerine ekim yapılarak 37 0 C de 24-48 saat inkübasyona bırakılmıştır. Besiyerinde üreyen farklı koloniler Gram boyama ile boyanarak gram pozitif, iki boyutlu olarak bölündüklerinden çift halde veya tetrat formda kok olan koloniler tekrar MRS besiyerine tek koloni olarak ekilmiştir. Katalaz negatif, vankomisin dirençli ve MRS broth da gaz oluşturmayanlar Pediococcus cinsine ait olduğu düşünülerek adlandırmaya devam edilmiştir. Tür seviyesinde adlandırmak için Pediococcus cinsine ait olarak belirlenen suşlara 45 0 C de üreme, %6,5 NaCl de üreme, arginin hidrolizi ve arabinoz, ksiloz, galaktoz, maltoz, laktoz karbonhidratlarının fermentasyon testleri uygulanmıştır [93, 94, 95]. Yapılan bu testler sonucunda 9 Pediococcus pentosaceus, 6 Pediococcus dextrinicus, 1 Pediococcus inopinatus, 1 Pediococcus acidilactici adlandırılmıştır (Çizelge 3.5). Çizelge 3.5. Pediococcus türlerinin identifikasyonunda kullanılan fizyolojik testler Pediococcus Türleri Arginin hidrolizi %6,5 NaCl de üreme 45 0 cc de üreme P. pentosaceus + + d d + + + + P. dextrinicus - - - - d + - d P. inopinatus - + - - + + - + P. acidilactici + + + + + - d d d: değişken 11-89% Ksiloz Galaktoz Maltoz Arabinoz Laktoz

27 Leuconostoc suşlarının izolasyonu ve adlandırılması Çiğ süt örneklerinden Leuconostoc ların izolasyonu için MRS besiyerine ekim yapılarak 37 0 C de 24-48 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda üreyen koloniler Gram boyama ile boyanarak mikroskopta gram pozitif, çift veya zincir şeklinde kok morfolojisine sahip olup olmadığı gözlenmiştir. Leuconostoc olduğu düşünülen koloniler tekrar MRS besiyerinde üretilip katalaz, vankomisin ve MRS broth da gaz testine alınmıştır. Katalaz negatif, vankomisin dirençli ve MRS broth da gaz oluşturanlar Leuconostoc cinsine ait olarak tespit edilmiştir. Tür adlandırmasında, esculin hidrolizi, rafinoz, sükroz, laktoz, mannitol, salisin ve ksiloz karbonhidratlarının fermentasyon testleri yapılmıştır [95, 96]. Bu testlerin sonucunda 5 L. mesemteroides ssp. mesenteroides, 3 L. mesenteroides ssp. dextranicum adlandırılmıştır (Çizelge 3.6). Çizelge 3.6. Leuconostoc türlerinin adlandırılmasında kullanılan fizyolojik testler Leuconostoc Türleri L. mesemteroides ssp. mesenteroides + d d + d d d L. mesenteroides ssp. dextranicum + d d + + - - d: değişken 11-89% Esculin Ksiloz Rafinoz Sükroz Laktoz Salisin Mannitol Streptococcus suşlarının izolasyonu ve adlandırılması Araştırmamızda çiğ süt örneklerinden Streptococcus ların izolasyonu için MRS besiyerine ekim yapılıp 37 0 C de 24-48 saat inkübasyona bırakılmıştır. Besiyerinde üreyen koloniler Gram boyama ile boyanmıştır. Gram pozitif, çift, uzun veya kısa zincirler oluşturan koklar MRS besiyerine tekrar tek koloni olarak ekilmiştir. Bakterilere önce katalaz ve vankomisin testi uygulanmıştır. Katalaz negatif, vankomisin duyarlı olanlar Streptococcus cinsine ait olarak tespit edilmiştir.

28 Streptococcus ların tür adlandırılmalarında 10 0 C ve 45 0 C de üreme, %6,5 NaCl de üreme, arginin hidrolizi esculin hidrolizi, sükroz, mannitol, rafinoz karbonhidratlarından fermentasyon testleri yapılmıştır [97, 98]. Testlerin sonucunda ise 4 Streptococcus lactis, 1 Streptococcus cremoris izole edilip adlandırılmıştır (Çizelge 3.7). Çizelge 3.7. Streptococcus türlerinin adlandırılmasında kullanılan biyokimyasal testler Streptococcus Türleri 10 0 C de üreme 45 0 C de üreme %6,5 NaCl de üreme Streptococcus lactis + - - + + - d - Streptococcus cremoris + - - - - d - - d: değişken 11-89% Arginin Esculin Sükroz Mannitol Rafinoz Enterococcus faecalis ve 1 Enterococcus faecium, Streptococcaceae familyasına ait 3 Lactococcus lactis ssp. lactis bakterileri de MRS besiyerinde üretilip cins seviyesinde adlandırılmıştır. Daha sonra tür adlandırmasında 10 0 C-45 0 C de üreme, %6,5 NaCl de üreme, arginin hidrolizi ve galaktoz, maltoz, laktoz, rafinoz karbonhidratlarının fermentasyon testleri uygulanmıştır. İzole edilen tüm laktik bakteri suşlarına uygulanan bioşimik testler Çizelge 3.8. de gösterilmiştir. İzole edilen Laktik asit bakterilerinin identifikasyonunda yapılan biyoşimik testler kullanılarak manual adlandırılmaları yapılmıştır. Bununla beraber BBL Crystal Gram Positive ID Kit, Pediococcus pentosaceus ve Lactococcus lactis ssp. lactis bakterilerinin adlandırılmasında kullanılmıştır. BBL Crystal Gram Positive ID Kit; Çizelge 3.9. da gösterilen enzim ve biyokimyasal testlerin bir arada bulunduğu kuyucuk sisteminden oluşur. Bu sisteme göre kuyucuklardaki renk değişimlerine göre testler pozitif ve negatif değerlendirmeye alınarak, 10 basamaklı rakamsal bir kod oluşturulur. Bilgisayar programında, hesaplanan kod ile bakteri izolatının morfolojik (kok veya basil) şekline göre bakterilerin identifikasyonu yapılmaktadır.

29

30

31

32

33 3.2. Çiğ Sütten İzole Edilen Laktik Asit Bakterilerinin Proteolitik Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi 3.2.1. İzole edilen bakterilerin proteolitik aktivitelerinin belirlenmesinde kullanılan besiyeri Calsium caseinate Agar (Merck 1.05409) Bileşimi Pepton Et özütü Pepton from casein Calsium caseinate Kalsiyum klorid Tripotasyum sitrat monohidrat Disodyum hidrojen fosfat Potasyum dihidrojen fosfat Sodyum klorid Agar gr/l 4,0 gr 2,0 gr 2,0 gr 3,5 gr 0,2 gr 0,35 gr 0,105 gr 0,035 gr 5,0 gr 13,0 gr Yukarıda verilen maddeler 1000 ml distile su içerisinde çözdürülür. Bu maddelere ilave olarak 5-7,5 gr/l Skim milk eklenir. 121 0 C de 15 dakika otoklavda steril edilir, steril petri kutularına 12,5 er ml taksim edilir. 3.2.2. İzole edilen bakterilerin proteolitik aktivitelerinin değerlendirilmesinde kullanılan yöntem Calsium Caseinate Agar besiyerine proteolitik aktivitesi test edilecek olan izolat, nokta ekim yöntemiyle ekilir. 37 0 C de 24-48 saat inkübasyona bırakılır. İnkübasyon sonrası etrafında berrak zon görülen koloniler proteolitik aktivitesi pozitif olarak değerlendirilir. Zon çapları mm olarak ölçülür. 4 mm nin üzerinde zon çapı olan bakteri izolatları proteolitik aktif olarak değerlendirilir.

34 3.3. Çiğ Sütten İzole Edilen Laktik Asit Bakterilerinin Lipolitik Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi 3.3.1. İzole edilen bakterilerin lipolitik aktivitelerinin belirlenmesinde kullanılan besiyeri Tributyrin Agar (Merck 1.01957) Bileşimi Pepton Maya özütü Tributrin (Glycerol tributyrate) Agar gr/l 5,0 gr 3,0 gr 10,0 gr 15,0 gr Yukarıda verilen maddeler 1000 ml distile su içerisinde çözdürülür. 121 0 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir. Steril petri kutularına 12,5 er ml taksim edilir. 3.3.2. İzole edilen bakterilerin lipolitik aktivitelerinin değerlendirilmesinde kullanılan yöntem İçeriği verilen Tributyrin Agar besiyerine lipolitik aktivitesi test edilecek olan izolat, nokta ekim yöntemiyle iğne öze ile ekilir. 37 0 C de 24-48 saat inkübasyondan sonra etrafında berrak zon oluşan koloniler lipolitik aktivitesi pozitif olarak değerlendirilir. 3.4. İzole Edilen Laktik Asit Bakterilerinde Elastaz Varlığının Araştırılması Laktik asit bakterilerinde, elastaz varlığının araştırılmasında; elastinli nutrient agar besiyeri hazırlanır. Nutrient agarın hazırlanışı: 8 gr nutrient buyyon ve 20 gr noble agar 1000 ml distile suda çözdürülerek, ph= 7,5 e ayarlanır. 121 0 C de 15 dakika steril edildikten sonra steril petrilere dağıtılmıştır. Sonra 4 0 C de saklanmıştır.

35 Elastinli tabakanın hazırlanışı: 2,4 gr nutrient buyon, 6 gr noble agar ve 1 gr elastin 300 ml distile suda çözdürülerek, ph= 7,5 e ayarlanmış ve buzdolabında bir gece kurutulan nutrient agar üzerine ikinci bir tabaka olacak şekilde, her bir petri kabına, ikinci tabak olarak, 5 ml kadar dökülmüştür. Elastin-nutrient agara, bakteri kültürlerinden çizgi şeklinde ekim yapılarak önce 24-48 saat 37 0 C de sonra 48 saat +4 0 C de inkübe edilmiştir. Ekim bölgelerinde şeffaf zonların varlığı gözlenmiştir. Her izolatın elastolitik aktivitesi; aşağıda belirtilen formüle göre değerlendirilmiştir. Üreme Genişliği (mm) / (Üreme genişliği(mm) + şeffaf zon (mm)) Bu formüle göre, oran 1 den ne kadar küçükse bakteri suşunun enzim üretiminin o kadar fazla olduğu belirtilmiştir. Oran 1 e eşit ise bakteri enzim üretmiyor, demektir [99]. 3.5. İzole Edilen Laktik Asit Bakterilerinde -Amilaz Varlığının Araştırılması 3.5.1. Yöntem Laktik asit bakterileri, α-amilaz aktivitesinin belirlenebilmesi için önce Luria Bertani broth da 37 C de kültüre alınmıştır. Üreyen bakterilerden steril öze yardımıyla Luria Bertani-Nişasta Agar besiyerine çizgi yöntemiyle ekim yapılarak, 37 C de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. [100]. Bakteri kolonileri geliştikten sonra plak iyodin boyasıyla boyanmıştır. İyodin boyası nişastalı zemini maviye boyayacağından, maviye boyanmış zemin etrafında beyazımsı halka oluşturan koloniler α-amilaz pozitif olarak değerlendirilmiştir. 3.5.2. Kullanılan besiyerleri Luria Bertani Broth (Difco 244610) Bileşimi gr/l

36 Tryptone Yeast Extract Sodium chloride 10 gr 5 gr 10 gr Besiyerinden 25 Gram tartılıp 1000 ml distile su içinde çözdürülür. Homojenize olması için 1 dakika süre boyunca kaynatılır, 5 er ml olacak şekilde tüplere dağıtılır ve 121 C'de otoklavda 15 dakika steril edilir. Luria Bertani- Nişasta Agar Bileşimi Tripton Maya Ekstraktı NaCl Agar Nişasta gr/l 10 gr 5 gr 10 gr 15 gr 5 gr Yukarıda verilen maddeler 1000 ml distile su içerisinde çözdürülür. 121 0 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir. Steril petri kutularına 12,5 er ml taksim edilir. İyodin Boyası (100 ml) Metanol Potasyum iyodid İyodin (iyot) 50 ml 10 gr 1 gr Yukarıda belirtilen miktarlarda kimyasal malzemeler hazırlanarak bir erlenin içerisine konur. Bir miktar saf su ilave edilerek manyetik karıştırıcıda çözdürülür. Hacim saf su ile 100 ml ye tamamlanır.

37 3.6. Laktik Asit Bakterilerinin Hemolitik Aktivitelerinin Belirlenmesi 3.6.1. Yöntem İzole edilen laktik asit bakterilerinde hemolitik aktivitenin belirlemesi için 37 0 C de 18 saat geliştirilen bakteri kültürlerinden ticari olarak temin edilen ve %5 koyun kanı içeren Tryptose Blood Agar Base ortamına çizgi yöntemiyle ekim yapılmıştır. 37 0 C de 24 saat inkübasyondan sonra kolonilerin etrafında parlak zon oluşumu hemoliz pozitif olarak değerlendirilmiştir. 3.6.2. Kullanılan besiyerleri Tryptose Blood Agar Base ( Oxoid CM233) Bileşimi gr/l Tryptose Lab-lemco powder Sodyum klorid Agar 10,0 gr 3,0 gr 5,0 gr 12,0 gr Tryptose Blood Agar Base den 30 gram tartılıp, 1000 ml distile su içinde çözdürülür. 121 0 C de 15 dakika steril edilen besiyeri 47 0 C ye kadar soğutultuktan sonra içerisine %5 oranında kan ilave edilip karıştırıldıktan sonra steril plaklara 12,5 ml taksim edilir. 3.7. Laktik Asit Bakterilerinin Patojen Bakteriler Üzerine İnhibitör Etkisi Araştırmamızın diğer bir aşamasında çiğ sütten izole edilerek adlandırılan laktik asit bakterilerinin Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, E.coli, Klebsiella pneumoniae ve Salmonella typhimurium patojen bakteriler üzerine inhibitör etkileri çalışılmıştır. Bu amaçla Nutrient agar, %0,2 glikoz ilave edilmiş Nutrient agar besiyerleri kullanılmıştır. Bu besiyerlerinde kuyu difüzyon yöntemiyle inhibitör etki

38 araştırılmıştır. Kuyu difüzyon yöneminde test bakterisi olarak laktik asit bakterileri, indikatör bakteri olarak da patojen bakteriler kullanılmıştır. S. aureus, L. monocytogenes, E.coli, K. pneumoniae ve S. typhimurium patojen bakterileri G.Ü, Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü, Mikrobiyoloji Laboratuarında izole edilip adlandırılmış saf kültürler olup kontrol testleri yapılmıştır. 3.7.1. Nutrient agar da kuyu difüzyon yöntemi Laktik asit bakterilerinin inhibitör etkileri agar kuyu difüzyon yöntemi kullanılarak tespit edilmiştir. Bu yöntemde Nutrient Agar besiyeri kullanılmıştır [101]. Öncelikle indikatör olarak kullanılan patojen bakteriler (S. aureus, L. monocytogenes, E.coli, K. pneumoniae ve S. typhimurium) 37 0 C de Brain Heart Infusion broth da aktifleştirilmiştir. Nutrient agar besiyeri 121 0 C de 15 dakika steril edilmiştir. Besiyerinin ısısı 37 0 C ye düşünce aktifleştirilen patojen bakteriler steril pipet ile 100 ml besiyerinde 1 ml olacak şekilde ilave edilmiştir. Besiyeri homojen oluncaya kadar karıştırılıp steril petri kutularına 25 er ml taksim edilmiştir. Besiyerinin donması için bir süre beklendikten sonra agar üzerinde 10 mm çapında steril kuyu açar ile belirli aralıklarla kuyular açılmıştır. Açılan kuyulara dipleri kapanacak şekilde steril Nutrient agar damlatılmıştır. MRS broth da aktifleştirilen laktik asit bakteri kültürlerinden kuyulara 50-100 µl pipetlenmiştir. Laktik asit bakterilerinin difüze olmaları için petri kutuları 2 saat buzdolabında bekletilmiştir. Daha sonra buzdolabından alınarak 37 0 C de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda oluşan inhibisyon zon çapları ölçülmüştür. Ölçüm işlemi 10 mm lik kuyu çapında dışında oluşan inhibisyon zonu ölçülerek yapılmıştır. 3.7.2. %0,2 lik glikoz içeren nutrient agar da kuyu difüzyon yöntemi Laktik asit bakterilerinin indikatör bakteriler üzerine inhibitör etkilerinin organik asitten kaynaklanıp kaynaklanmadığını saptamak için önce asit etkileri önlenmeden yukarıda anlatıldığı gibi kuyu difüzyon yöntemi uygulanıp test sonuçları gözlenmiştir. İkinci uygulamada organik asit etkileri önlenerek testler tekrar

39 edilmiştir. Organik asit etkisinin engellenmesi için Nutrient agar besiyerinin içerisine %0,2 oranında glikoz ilave edilmiştir [77]. Böylece asit formu nötralize edilmiştir. 3.7.3. Kuyu difüzyon yönteminde kullanılan besiyeri Nutrient Agar (LAB M -LAB8) Bileşimi Lab-Lemco powder Yeast extract Peptone Sodium chloride Agar Distile su gr/l 1gr 2 gr 5 gr 5 gr 15 gr 1000 ml ph 7,4±0,2 ye ayarlanıp 121 0 C de 15 dakika steril edilmiştir. Daha sonra petri kutularına 25 er ml taksim edilmiştir. 3.7.4. Laktik asit bakterileri ve indikatör patojen bakterilerin aktifleştirilmesinde kullanılan besiyerleri MRS Broth ( LABM- LAB94) Bileşimi Pepton Yeast extract Beef extract Glucose Di-potassium hydrogen phosphate Sodium asetate Tri amonium citrate Magnesium sulphate 7 H 2 O Manganase sulphate 4 H 2 O Tween 80 Distile su gr/l 10 gr 5 gr 10 gr 20 gr 2 gr 5 gr 2 gr 0,02 gr 0,05 gr 1,08 ml 1000 ml

40 ph 6,2±0,2 ye ayarlanıp tüplere 10 ar ml taksim edilip, 121 0 C de 15 dakika steril edilmiştir. BHI (Brain Heart Infusion ) (OXOİD CM 375) Bileşimi gr/l Calf brain infusion solids Beef heart infusion solids Protease peptone Sodium chloride Glucose Disodium phosphate Distile su 12,5 gr 5 gr 10 gr 5 gr 2 gr 2,5 gr 1000 ml ph 7,4±0,2 ye ayarlanıp tüplere 10 ar ml taksim edilip, 121 0 C de 15 dakika steril edilmiştir. 3.8. Laktik Asit Bakterilerinin İzolasyonunda Kullanılan Temel Besiyerleri MRS (De Man Rogosa Sharpe) Agar (OXOID CM 361) Bileşimi gr/l Peptone Yeast extract Beef extract Glucose Sorbitan mono-oleate Di-potasium hydrogen phosphate Sodium asetate 3 H 2 O Tri amonium citrate Magnesium sulphate 7 H 2 O Manganase sulphate 4 H 2 O Agar Distile su 10 gr 8 gr 4 gr 20 gr 1 gr 2 gr 5 gr 2 gr 0,02 gr 0,05 gr 10 gr 1000 ml

41 ph 6,2±0,2 ye ayarlanıp 121 0 C de 15 dakika steril edilir. Sonra petri kutularına yaklaşık 25 er ml taksim edilir. Standart Plate Count Agar (PCA) (LABM- LAB149) Bileşimi gr/l Tripton Maya özütü Glikoz Agar Distile su 5 gr 2,5 gr 1 gr 15gr 1000 ml ph:7,0 ±0,2 ayarlandıktan sonra 121 C de 15 dakika steril edilerek steril petri kutularına dağıtılır. Peptone Water (MERCK 1.07228) Bileşimi Peptone Sodium chloride Distile su gr/l 10 gr 5 gr 1000 ml ph 7,4±0,2 ye ayarlanıp tüplere 9 ar ml taksim edilip, 121 0 C de 15 dakika steril edilmiştir. 3.9. Laktik Asit Bakterilerinin İdentifikayonunda Kullanılan Besiyerleri ve Uygulanan Testler 3.9.1. Gram boyama Klasik Gram boyama yöntemindeki Kristal Viyole, Lügol, %70 lik Alkol ve Bazik Fuksin hazırlanarak Gram boyama yapılmıştır. Mikroskopta 100x büyütmede, immersiyon yağı kullanılarak inceleme yapılmıştır.

42 3.9.2. Katalaz testi Lam üzerine saf laktik asit kültürü kolonilerinden bir öze dolusu alınıp, koloni üzerine iki üç damla %3 hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) damlatılarak karıştırılmıştır. Lam üzerinde gaz kabarcıklarının oluşmaması katalaz negatif olarak değerlendirilmiştir. 3.9.3. Vankomisin duyarlılık testi Laktik asit bakterilerinin cins seviyesinde adlandırılmasında vankomisin (30µg disk) antibiyotiğine karşı bakteri izolatlarının duyarlılığı test edilmiştir. Öncelikle Mueller hinton agar besiyerine tek koloni ekimi yapılan izolatlar, 0,5 Mc farland bulanıklığında serum fizyolojiğe inoküle edilmiştir. Daha sonra Mueller hinton agar besiyerine steril eküvyon ile serum fizyolojikten yayma ekimi yapılarak vankomisin antibiyotik diskleri yerleştirilmiştir. 37 0 C de 24 saat inkübasyon sonunda antibiyotik diski etrafında oluşan zon çapları ölçülerek değerlendirilmiştir. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) kriterlerine göre laktik asit bakterilerinin vankomisine duyarlılığı; zon çapı 17 ise duyarlı, 17 ise dirençli olarak değerlendirilmiştir. Mueller Hinton Agar (OXOID CM 0337) Bileşimi Beef dehydrated infusion from Casein hydrolysate Strach Agar gr/l 30,0 gr 17,5 gr 1,5 gr 17 gr Mueller hinton agar besiyeri içeriğine göre tartılıp 1000 ml distile su içinde çözdürülür. 121 0 C de 15 dakika steril edilir. Serum Fizyolojik Bileşimi gr/l

43 Sodyum chloride (NaCl) Distile su 9 gr 1000 ml Hazırlanan bileşim tüplere 1 ml olarak aktarılıp, 121 0 C de 15 dakika otoklavda steril edilir. Bakteri kültürlerinden 0,5 Mc farland bulanıklığında tüplere inoküle edilir. 3.9.4. MRS broth da gaz testi MRS Broth ( LABM- LAB94) Bileşimi Pepton Yeast extract Beef extract Glucose Di-potassium hydrogen phosphate Sodium asetate Tri amonium citrate Magnesium sulphate 7 H 2 O Manganase sulphate 4 H 2 O Tween 80 Distile su gr/l 10 gr 5 gr 10 gr 20 gr 2 gr 5 gr 2 gr 0,02 gr 0,05 gr 1,08 ml 1000 ml ph 6,2±0,2 ye ayarlanıp, içinde durham tüpü bulunan tüplere 9 ar ml taksim edilip, 121 0 C de 15 dakika steril edilmiştir. Steril öze ile inoküle edilen laktik asit kültürleri 37 0 C de 24 saat inkübasyona bırakılır. İnkübasyon sonunda durham tüplerinde hava kabarcığının gözlenmesi gaz (+) olarak değerlendirilmiştir (Resim 3.1).

44 gaz (+) gaz (-) Resim 3.1. MRS broth da gaz testi 3.9.5. 10 0 C ve 45 0 C de üreme Laktik asit bakterilerinin saf kültüründen Todd Hewit Broth a ekim yapılmıştır. Tüpler 10 0 C de 7 gün, 45 0 C de 1 gün inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonucunda bulanıklığın görülmesi pozitif reaksiyon olarak değerlendirilmiştir. Todd Hewit Broth ( LABM LAB75) Bileşimi Infusion from 450 gr fat-free minced meat Tryptone Sodium bicarbonate Sodium chloride Di-potasium phosphate Distile su gr/l 10 gr 20 gr 2 gr 2 gr 0,4 gr 1000 ml ph 7,4±0,2 ye ayarlanıp tüplere 5 er ml taksim edilip, 121 0 C de 15 dakika steril edilmiştir.

45 3.9.6. Arginin hidrolizi Bileşimi gr/l Peptone 1 gr Sodium chloride 5 gr Di-potasium hydrogen phosphate 0,3gr Agar 3 gr Phenol red 0,01 gr L- arginine monohydrochloride 10 gr Distile su 1000 ml ph 7,4±0,2 ye ayarlanıp tüplere 4 er ml taksim edilip, 121 0 C de 15 dakika steril edilmiştir [90]. Arginin hidrolizi için laktik bakteri kültürlerinden 3-4 koloni, hazırlanan tüplere inoküle edilip, 37 0 C de 24-48 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda besiyerinin portakal sarıdan mor renge dönüşmesi arginin pozitif olarak değerlendirilmiştir (Resim 3.2). Resim 3.2. Arginin hidrolizi Pembe-mor arginin (+) / Portakal sarı arginin (-)

46 3.9.7. Esculin hidrolizi Bile Esculin Agar ( DIFCO 0879-17) Bileşimi gr/l Esculin Ferrik citrate Peptone NaCl Distile su 1 gr 0,5 gr 10 gr 5 gr 1000 ml 121 0 C de 15 dakika steril edilip, yaklaşık 25 er ml petri kutularına taksim edilmiştir. Laktik kültürlerin esculin hidrolizi, çizgi ekim yöntemiyle inkübasyon sonunda besiyerinde siyaha doğru renk değişikliği ile kontrol edilmiştir (resim 3.3). Resim 3.3. Esculin hidrolizi - Siyah (+)

47 3.9.8. %6,5 NaCl de üreme Bileşimi Peptone Lab- Lemco powder Glucose NaCl Distile su gr/l 10 gr 10 gr 10 gr 65 gr 1000 ml ph 7,4±0,2 ye ayarlanıp tüplere 5 er ml taksim edilip, 121 0 C de 15 dakika steril edilmiştir [93]. Laktik bakteri kültürleri %6,5 NaCl içeren tüplere inoküle edilerek 37 0 C de 24-72 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda bulanıklığın gözlenmesi pozitif reaksiyon olarak değerlendirilmiştir. 3.9.9. Karbonhidrat fermentasyon besiyeri Purple Broth Base Bileşimi Protease peptone Beef extract Sodium chloride Brom cresol purple Distile su gr/l 10 gr 1 gr 5 gr 0,02 gr 1000 ml ph 6,8±0,2 ye ayarlanıp, tüplere 9 ml pipetlenerek 121 0 C de 15 dakika steril edilmiştir. Bakterilerin biyoşimik testlerinde kullanılmak üzere hazırlanmış temel besiyeridir. Besiyerinin rengi indikatör maddeden dolayı koyu menekşe rengindedir.

48 Karbonhidrat Solüsyonu Laktoz, galaktoz, maltoz, rafinoz, sükroz, salisin, mannitol, ksiloz, sorbitol, arabinoz. Karbonhidrat 1 gr Distile su 10 ml Yukarıda adı geçen şeker solüsyonları 0,2-0,45 µm lik membran filtreleriyle steril edilmiştir. Steril şeker solüsyonu steril pipetle 1 ml, daha önce hazırlanmış temel besiyeri üzerine ilave edilmiştir. Şeker içeren besiyerine aktif bakteri kültüründen ekim yapılıp 7 gün 37 0 C de inkübe edilmiştir. Şekeri kullanarak asit üreten bakteri türleri tüplerdeki indikatör koyu menekşe rengini sarıya dönüştürdüğü gözlenmiştir (Resim 3.4). Mor (-) sarı (+) Resim 3.4. Karbonhidrat hidrolizi

49 4. BULGULAR Araştırmamızda Nisan 2011-Mart 2012 tarihleri arasında Ankara ili çevresi ve çeşitli illerden toplanan 30 çiğ süt örneğinden Lactobacillales takımına ait 74 izolat izole edilip adlandırılmıştır. 74 Laktik asit bakteri izolatının Lactobacillaceae familyasına ait 38 i Lactobacillus (%51,4), 17 si Pediococcus (%23) cinsine aittir. Leuconostocaceae familyasına ait 8 Leuconostoc (%10,8) izolatı, Streptococcaceae familyasına ait 5 Streptococcus (%6,8), 3 Lactococcus (%4) izolatı ve Enterococcaceae familyasından 3 Enterococcus (%4) izolatı tespit edilmiştir (Çizelge 4.1 ve Şekil 4.1). Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin adlandırılmasında cins ve tür özelliklerine göre biyokimyasal testler yapılmış ve Bergey s Manual of Systematic Bacteriology referansına göre adlandırılmıştır. Tür seviyesinde identifikasyonu yapılan laktik asit bakterilerinin proteaz, lipaz, elastaz, -amilaz, hemolitik enzim aktiviteleri çalışılmıştır. Ayrıca bu izolatların bazı patojen bakterilere karşı inhibitör etkisi araştırılmıştır. Çizelge 4.1.Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin cinslere göre dağılımı İzole Edilen Bakteri Cinsi İzolat Sayısı % Lactobacillus 38 51,4 Pediococcus 17 23 Leuconostoc 8 10,8 Streptococcus 5 6,8 Lactococcus 3 4 Enterococcus 3 4 Toplam 74 100

50 Şekil 4.1. Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin cinslere göre dağılımı Araştırmada, çeşitli illerden çiğ süt örnekleri toplanmıştır. Ankara dan toplanan 13 adet çiğ süt örneğinden 37 izolat elde edilmiştir. 37 izolatın 18 i Lactobacillus, 8 i Pediococcus, 5 i Leuconostoc, 5 i Streptococcus ve 1 Lactococcus cinsi olarak izole edilmiştir. Burdur dan toplanan 5 adet çiğ süt örneğinden 13 izolat elde edilmiştir. 13 izolatın 8 i Lactobacillus, 4 ü Pediococcus ve 1 Leuconostoc cinsi olarak izole edilmiştir. Kırıkkale den toplanan 4 adet çiğ süt örneğinden 8 izolat elde edilmiştir. 8 izolatın 3 ü Lactobacillus, 3 ü Enterococcus, 1 Pediococcus ve 1 Leuconostoc cinsi olarak izole edilmiştir. Konya dan toplanan 4 çiğ süt örneğinden 11 izolat elde edilmiştir. 11 izolatın 5 i Lactbacillus, 4 ü Pediococcus, 1 Leuconostoc ve 1 Lactococcus cinsi olarak izole edilmiştir. Bursa dan toplanan 4 çiğ süt örneğinden 5 izolat elde edilmiştir. 5 izolatın 4 ü Lactobacillus ve 1 Lactococcus cinsi olarak izole edilmiştir. Bu durumda tür çeşitliliği bakımından en fazla olan il Ankara olarak tespit edilmiştir. Laktik asit bakterileri arasında en fazla izole edilen cins ise Lactobacillus olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.2). Çizelge 4.2. Çiğ süt örneklerinin toplandığı illerin cinslere göre dağılımı Çiğ sütten izole edilen örnekler Çiğ süt örneklerinin toplandığı iller Ankara Burdur Kırıkkale Konya Bursa Toplam Lactobacillus 18 8 3 5 4 38 Pediococcus 8 4 1 4-17 Leuconostoc 5 1 1 1-8 Streptococcus 5 - - - - 5 Lactococcus 1 - - 1 1 3 Enterococcus - - 3 - - 3 Toplam 37 13 8 11 5 74

51 Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin tür dağılımları çizelge 4.3. de gösterilmektedir. İzole edilen laktik asit bakterileri; 10 Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, 9 Lactobacillus casei, 6 Lb. rhamnosus, 5 Lb. acidophilus, 5 Lb. coryniformis ssp. torquens, 3 Lb. plantarum ssp. plantarum, 9 Pediococcus pentosaceus, 6 P. dextrinicus, 1 P. inopinatus, 1 P. acidilactici, 5 Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides, 3 Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum, 4 Streptococcus lactis, 1 Streptococcus cremoris, 3 Lactococcus lactis ssp. lactis, 2 Enterococcus faecalis ve 1 Enterococcus faecium olarak belirlenmiştir. Çizelge 4.3. Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin türlere göre dağılımı CİNSLER LACTOBACİLLUS LEUCONOSTOC ENTEROCOCCUS STREPTOCOCCUS PEDİOCOCCUS TÜRLER İZOLAT SAYISI Lb. delbrueckii ssp. lactis 10 13,5 Lactobacillus casei 9 12,2 Lactobacillus rhamnosus 6 8,2 Lactobacillus acidophilus 5 6,8 Lb. coryniformis ssp. torquens 5 6,8 Lb. plantarum ssp. plantarum 3 4 Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides 5 6,8 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum 3 4 Enterococcus faecalis 2 2,7 Enterococcus faecium 1 1,3 Streptococcus lactis 4 5,4 Streptococcus cremoris 1 1,3 Pediococcus pentosaceus 9 12,2 Pediococcus dextrinicus 6 8,2 Pediococcus inopinatus 1 1,3 Pediococcus acidilactici 1 1,3 LACTOCOCCUS Lactococcus lactis ssp. lactis 3 4 TOPLAM 74 100 % İzole edilen laktik asit bakterilerinin % lik dağılımı; %13,5 Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, %12,2 Lactobacillus casei, %8,2 Lactobacillus rhamnosus, %6,8 Lactobacillus acidophilus, %6,8 Lb. coryniformis ssp. torquens, %4 Lb. plantarum

52 ssp. plantarum, %6,8 Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides, %4 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum, %2,7 Enterococcus faecalis, %1,3 Enterococcus faecium, %5,4 Streptococcus lactis, %1,3 Streptococcus cremoris, %12,2 Pediococcus pentosaceus, %8,2 Pediococcus dextrinicus, %1,3 Pediococcus inopinatus, %1,3 Pediococcus acidilactici, %4 Lactococcus lactis ssp. lactis olarak tespit edilmiştir (Şekil 4.2). Şekil 4.2. Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin tür sayısına göre dağılımı Çiğ sütten izole edilen 38 Lactobacillus bakterisi; 10 u(%26,3) Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, 9 u(%23,7) Lactobacillus casei, 6 sı(%15,8) Lb. rhamnosus, 5 i(%13,1) Lb. acidophilus, 5 i(%13,1) Lb. coryniformis ssp. torquens, 3 ü(%8) Lb. plantarum ssp. plantarum olarak tanımlanmıştır. Lactobacillus bakterilerinin tür dağılımı şekil 4.3. te gösterilmektedir.

53 Şekil 4.3. İzole edilen Lactobacillus türlerinin % lik dağılımı Çiğ sütten izole edilen 17 Pediococcus bakterisi; 9 u (%52,9) Pediococcus pentosaceus, 6 sı (%35,3) Pediococcus dextrinicus, 1 i (%5,9) Pediococcus inopinatus, 1 i (%5,9) Pediococcus acidilactici olarak tanımlanmıştır. (şekil 4.4.) Şekil 4.4. İzole edilen Pediococcus türlerinin % lik dağılımı

54 Çiğ sütten izole edilen 8 Leuconostoc bakterisi; 5 i (%62,5) Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides, 3 ü ( %37,5) Leu. mesenteroides ssp. dextranicum olarak tanımlanmıştır. Şekil 4.5. te gösterilmektedir. Şekil 4.5. İzole edilen Leuconostoc türlerinin % lik dağılımı Çiğ sütten izole edilen Streptococcus cinsi 5 izolatın; 4 (%80) ü Streptococcus lactis ve 1 (%20) i Streptococcus cremoris olarak adlandırılmıştır. (Şekil 4.6.) Şekil 4.6. İzole edilen Streptococcus türlerinin % lik dağılımı Ayrıca Enterococcus cinsine ait toplam 3 izolatın 2 (%66,6) si Enterococcus faecalis ve 1 (%33,3) i Enterococcus faecium olarak tanımlanmış ve toplam 3 (%100) izolat Lactococcus lactis ssp. lactis türü izole edilip adlandırılmıştır.

55 4.1. Laktik Asit Bakterilerinin Proteolitik Enzim Aktivitelerinin Değerlendirilmesi 4.1.1. Proteaz enzim varlığının araştırılması Araştırmada, çiğ sütten izole edilen 74 laktik bakteri izolatının Calsiyum Kazeinat Agar da 37 0 C de proteolitik aktiviteleri çalışılarak, Proteaz enzim aktivite zon çapları belirlenmiştir. Toplam 74 izolatın 70 (%94,6) inde proteolitik aktivite gözlenirken, 4 (%5,4) izolatta proteolitik aktivite gözlenmemiştir. Laktik asit bakterilerinin proteolitik aktiviteleri cins bazında değerlendirildiğinde izole edilen Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus ve Enterococcus cinsinin proteolitik aktivite gösterdiği tespit edilmiştir (Çizelge 4.4). Çizelge 4.4. Proteolitik enzim aktivitesi araştırılan Laktik asit bakterilerinin kalsiyum kazeinat agar da oluşturdukları zon çaplarının değerleri İzolat no Tür ismi Proteaz enzim aktivite zon çapı (mm) M1 Lactobacillus casei 5 M2 Lb. rhamnosus 4 M3 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum 8 M4 Enterococcus faecalis 3 M5 Lactobacillus casei 3 M6 Lb. delbrueckii ssp. lactis 4 M7 Enterococcus faecalis 5 M8 Lb. rhamnosus 5 M9 Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides 6 M10 Pediococcus pentosaceus 6 M11 Pediococcus dextrinicus 4 M12 Lb. plantarum ssp. plantarum 4 M13 Lb. delbrueckii ssp. lactis 5 M14 Lactobacillus casei 5 M15 Lb. rhamnosus 7 M16 Lactococcus lactis ssp. lactis 7 M17 Lactobacillus casei 6 M18 Lb. rhamnosus 5 M19 Lactobacillus casei 5 M20 Lb. coryniformis ssp. torquens 6 M21 Lactococcus lactis ssp. lactis 8 M22 Lactococcus lactis ssp. lactis 7 M23 Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides 6 M24 Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides 5 M25 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum 6

56 Çizelge 4.4. (Devam) Proteolitik enzim aktivitesi araştırılan Laktik asit bakterilerinin kalsiyum kazeinat agar da oluşturdukları zon çaplarının değerleri İzolat no Tür ismi Proteaz enzim aktivite zon çapı (mm) M26 Lb. plantarum ssp. plantarum 3 M27 Lactobacillus casei 6 M28 Pediococcus pentosaceus 5 M29 Lb. coryniformis ssp. torquens 6 M30 Enterococcus faecium 5 M31 Lb. coryniformis ssp. torquens 5 M32 Lb. delbrueckii ssp. lactis 6 M33 Pediococcus pentosaceus 8 M34 Lactobacillus acidophilus 6 M35 Pediococcus pentosaceus 5 M36 Lb. delbrueckii ssp. lactis 6 M37 L. coryniformis ssp. torquens 7 M38 Pediococcus inopinatus 2 M39 Lb. delbrueckii ssp. lactis 5 M40 Pediococcus dextrinicus 6 M41 Lactobacillus acidophilus 6 M42 Pediococcus dextrinicus 6 M43 Pediococcus pentosaceus 6 M44 Streptococcus cremoris 5 M45 Lb. rhamnosus 4 M46 Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides 5 M47 Pediococcus dextrinicus 5 M48 Lb. plantarum ssp. plantarum 5 M49 Lactobacillus acidophilus 7 M50 Lb. delbrueckii ssp. lactis 5 M51 Pediococcus dextrinicus 5 M52 Pediococcus pentosaceus 6 M53 Lb. delbrueckii ssp. lactis 5 M54 Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides 6 M55 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum 7 M56 Lb. coryniformis ssp. torquens 5 M57 Pediococcus acidilactici 7 M58 Lb. rhamnosus 7 M59 Streptococcus lactis 6 M60 Lactobacillus acidophilus 6 M61 Lb. delbrueckii ssp. lactis 4 M62 Pediococcus pentosaceus 4 M63 Pediococcus pentosaceus 5 M64 Lactobacillus casei 6 M65 Streptococcus lactis 5 M66 Pediococcus pentosaceus 5 M67 Lb. delbrueckii ssp. lactis 5 M68 Pediococcus dextrinicus 4 M69 Lactobacillus casei 4 M70 Streptococcus lactis 5 M71 Lactobacillus acidophilus 6 M72 Lactobacillus casei 4 M73 Streptococcus lactis 6 M74 Lb. delbrueckii ssp. lactis 6 4mm (-) / 4-5mm: zayıf (+) / 6-8mm: orta kuvvetli (++) / 11mm kuvvetli (+++)

57 Araştırmada izole edilen Lactobacillus cinsine ait toplam 38 bakteri suşunun 20 (%52,6) sinde zayıf (+) proteolitik aktivite gözlenirken, 16 (%42,1) sında orta kuvvetli (++) proteolitik aktivite gözlenmiştir ve 2 (%5,3) laktobasil izolatında proteolitik aktivite gözlenmemiştir. İzole edilen 8 Leuconostoc cinsi izolatın 6 (%75) sında orta kuvvetli (++) proteolitik aktivite gözlenirken, 2 (%25) sinde zayıf (+) proteolitik aktivite gözlenmiştir. Pediococcus cinsine ait 17 bakteri suşundan 7 (%41,2) sinde orta kuvvetli (++) proteolitik aktivite gözlenirken, 9 (%52,9) izolatta zayıf (+) proteolitik aktivite gözlenmiştir ve 1 (%5,9) izolatta aktivite gözlenmemiştir. 5 Streptococcus cinsi izolatın 2 (%40) sinde orta kuvvetli (++) proteolitik aktivite gözlenirken, 3 (%60) ünde zayıf (+) proteolitik aktivite gözlenmiştir. 3 Enterococcus cinsi izolatın 2 (%66,6) sinde zayıf (+) proteolitik aktivite gözlenirken, 1 (%33,3) izolatta aktivite gözlenmemiştir ve izole edilen Lactococcus lactis ssp. lactis suşuna ait toplam 3 izolatın 3 (%100) ünde de orta kuvvetli (++) proteolitik aktivite gözlenmiştir (Çizelge 4.5 ve Şekil 4.7). Çizelge 4.5. Proteolitik enzim aktivitesi gösteren laktik bakteri izolatlarının cinslere göre dağılımı Laktik Bakteri Cinsleri Zayıf(+) Proteolitik Aktivite Orta(++) Toplam izolat sayısı Lactobacillus 20 16 36 Pediococcus 9 7 16 Leuconostoc 2 6 8 Streptococcus 3 2 5 Enterococcus 2-2 Lactococcus - 3 3 Toplam 36 34 70

58 Şekil 4.7. Proteolitik aktivite gösteren laktik bakteri izolatlarının cinslere göre dağılımı Proteolitik aktivite gösteren 70 izolatın 36 (%51,4) sında zayıf (+) proteolitik aktivite gözlenirken, 34 (%48,6) ünde orta kuvvetli aktivite gözlenmiştir. Laktik asit bakteri türlerinden 5 Lb. acidophilus, 3 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve 3 Lactococcus lactis ssp. lactis suşlarının izole edilen bütün suşlarında orta kuvvetli proteolitik aktivite tespit edilmiştir. 8 mm lik zon çapı ile en yüksek proteolitik aktivite; Lactococcus lactis ssp. lactis, Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Pediococcus pentosaceus türlerine ait suşlarda olduğu gözlenmiştir. Resim 4.1 de zon çaplarının değerlendirilmesine ait örnek görülmektedir. Resim 4.1. Calsium caseinate agarda proteolitik zon çapları

59 4.1.2. Elastaz enzim varlığının araştırılması Çalışmada, çiğ sütten izole edip adlandırdığımız laktik asit bakterilerinin Elastinli Nutrient Agar da elastaz enziminin varlığı araştırılmıştır. Laktik bakteri kültürlerinden çizgi ekimi yapılan elastinli nuttrient agar da ekim bölgelerinde şeffaf zonların görülmesi beklenmiştir. Ancak 74 laktik asit bakteri suşunun hiç birisinde şeffaf zon çapı gözlenememiştir. Araştırmamızda izole edilen Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Lactococcus ve Enterococcus cinsi laktik asit bakterilerinin elastaz enzim aktivitelerinin olmadığı gözlenmiştir (Resim 4.2). Resim 4.2. Elastinli nutrient agar da elastaz enzimi varlığı Elastaz (-) 4.2. Laktik Asit Bakterilerinin Lipolitik ve -Amilaz Enzim Aktivitelerinin Değerlendirilmesi Araştırmada çiğ sütten izole edilen 74 laktik asit bakterisinin Tributyrin Agar da lipolitik aktiviteleri ve Luria Bertani-nişasta agar da -amilaz enzim aktiviteleri çalışılmıştır. 74 laktik asit bakterisinin Tributyrin agar da lipolitik zon çapı ölçümleri değerlendirilmiştir. 12 laktik bakteri suşunda zon çapı gözlenmiştir. 2 Lb. acidophilus, 2 Lb. delbrueckii ssp. lactis, 2 P. pentosaceus, 2 P. dextrinicus, 2 Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides ve 1 E. faecalis türünde lipolitik zon çapı 2 mm

60 olarak ölçülmüştür. Bununla beraber 1 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum suşunda lipolitik zon çapı 4 mm olarak kaydedilip, lipolitik aktivite gösterdiği kabul edilmiştir. Zon çapları 2 mm ve 4 mm olarak ölçülen laktik bakteri suşları Çizelge 4.6. da gösterilmektedir. Çizelge 4.6. Lipolitik enzim aktivitesi gözlenen laktik bakteri türlerinde lipaz aktivite zon çapları (mm) Cins ismi İzolat no Tür ismi Lipaz enzim aktivite zon çapı(mm) M49 Lb. acidophilus 2 mm Lactobacillus M60 Lb. acidophilus 2 mm M39 Lb. delbrueckii ssp.lactis 2 mm M74 Lb. delbrueckii ssp.lactis 2 mm M10 P. pentosaceus 2 mm Pediococcus M43 P. pentosaceus 2 mm M11 P. dextrinicus 2 mm M40 P. dextrinicus 2 mm M9 L. mesenteroides ssp. mesenteroides 2 mm Leuconostoc M54 L. mesenteroides ssp. mesenteroides 2 mm M25 L. mesenteroides ssp. dextranicum 4 mm Enterococcus M4 E. faecalis 2 mm Lipaz enzim akivitesi araştırılan laktik asit bakterileri cins bazında değerlendirildiğinde; Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc ve Enterococcus cinslerinde lipolitik enzim zon çapları gözenirken, Streptococcus ve Lactococcus cinslerinde lipolitik enzim zon çapları gözlenmemiştir. 4 mm lik zon çapıyla Leu. mesenteroides ssp. dextranicum türünün bir suşunda lipolitik aktivite tespit edilmiştir. Çiğ sütten izole edilen laktik bakteri suşlarının Luria Bertani- nişasta agar da - amilaz enzim aktiviteleri araştırılmıştır. 74 laktik asit bakterisinin 6 izolatında - amilaz enzim varlığı tespit edilmiştir. -amilaz enzim aktivitesi Lactobacillus, Pediococcus ve Leuconostoc cinslerinde gözlenirken, Streptococcus, Lactococcus ve Enterococcus cinslerinde gözlenmemiştir. -amilaz enzim aktivitesi gözlenen laktik bakteri türleri Çizelge 4.7. de gösterilmiştir.

61 Çizelge 4.7. Laktik asit bakterilerinde -Amilaz enzim aktivitesi Cins ismi Lactobacillus Pediococcus İzolat no Tür ismi -Amilaz enzim aktivitesi M26 Lb. plantarum ssp. plantarum + M27 Lb. casei + M56 Lb. coryniformis ssp. torquens + M28 Pediococcus pentosaceus + M33 Pediococcus pentosaceus + Leuconostoc M55 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum + Laktik asit bakterilerinden -Amilaz enzim aktivitesi pozitif olan suşlar; Lactobacillus cinsine ait 1 Lb. plantarum ssp. plantarum, 1 Lb. casei, 1 Lb. coryniformis ssp. torquens olarak tespit edilmiştir. Pediococcus cinsinden 2 Pediococcus pentosaceus suşunda -amilaz enzim aktivitesi vardır. Leuconostoc cinsinden 1 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum da -amilaz enzim aktivitesi belirlenmiştir. Resim 4.3 de -amilaz enzim aktivitesinin pozitif olduğu bir örnek görülmektedir. Resim 4.3. Luria Bertani-nişasta agar da -Amilaz enzim varlığı

62 Çiğ sütten izole edilip adlandırılan laktik asit bakterilerinin lipolitik ve -amilaz enzim aktiviteleri değerlendirilmiştir. Lipaz ve -amilaz enzim zon çapları gözlenmiştir. Tür seviyesinde bakıldığında hem lipaz hem -amilaz enzim aktivitesi gördüğümüz örnekler olmuştur. Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Pediococcus pentosaceus türlerinde lipaz ve -amilaz enzim aktivitesi belirlenmiştir. Farklı suş olmalarına rağmen aynı türde hem lipaz hem -amilaz enzim aktivitesi tespit edilmiştir. Çizelge 4.8. de laktik bakteri suşlarının lipolitik zon çapları ve -amilaz aktiviteleri gösterilmektedir. Çizelge 4.8. Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin lipoliz zon çapları ve -Amilaz enzim aktiviteleri İzolat no Tür ismi Lipaz enzim aktivite zon çapı(mm) -Amilaz enzim aktivitesi M1 Lactobacillus casei M2 Lb. rhamnosus M3 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum M4 Enterococcus faecalis 2 M5 Lactobacillus casei M6 Lb. delbrueckii ssp. lactis M7 Enterococcus faecalis M8 Lb. rhamnosus M9 Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides 2 M10 Pediococcus pentosaceus 2 M11 Pediococcus dextrinicus 2 M12 Lb. plantarum ssp. plantarum M13 Lb. delbrueckii ssp. lactis M14 Lactobacillus casei M15 Lb. rhamnosus M16 Lactococcus lactis ssp. lactis M17 Lactobacillus casei M18 Lb. rhamnosus M19 Lactobacillus casei M20 Lb. coryniformis ssp. torquens M21 Lactococcus lactis ssp. lactis M22 Lactococcus lactis ssp. lactis M23 Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides M24 Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides M25 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum 4 M26 Lb. plantarum ssp. plantarum + M27 Lactobacillus casei + M28 Pediococcus pentosaceus + M29 Lb. coryniformis ssp. torquens

63 Çizelge 4.8. (Devam) Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin lipoliz zon çapları ve -Amilaz enzim aktiviteleri İzolat no Tür ismi Lipaz enzim aktivite zon çapı(mm) -Amilaz enzim aktivitesi M30 Enterococcus faecium M31 Lb. coryniformis ssp. torquens M32 Lb. delbrueckii ssp. lactis M33 Pediococcus pentosaceus + M34 Lactobacillus acidophilus M35 Pediococcus pentosaceus M36 Lb. delbrueckii ssp. lactis M37 Lb. coryniformis ssp. torquens M38 Pediococcus inopinatus M39 Lb. delbrueckii ssp. lactis 2 M40 Pediococcus dextrinicus 2 M41 Lactobacillus acidophilus M42 Pediococcus dextrinicus M43 Pediococcus pentosaceus 2 M44 Streptococcus cremoris M45 Lb. rhamnosus M46 Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides M47 Pediococcus dextrinicus M48 Lb. plantarum ssp. plantarum M49 Lactobacillus acidophilus 2 M50 Lb. delbrueckii ssp. lactis M51 Pediococcus dextrinicus M52 Pediococcus pentosaceus M53 Lb. delbrueckii ssp. lactis M54 Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides 2 M55 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum + M56 Lb. coryniformis ssp. torquens + M57 Pediococcus acidilactici M58 Lb. rhamnosus M59 Streptococcus lactis M60 Lactobacillus acidophilus 2 M61 Lb. delbrueckii ssp. lactis M62 Pediococcus pentosaceus M63 Pediococcus pentosaceus M64 Lactobacillus casei M65 Streptococcus lactis M66 Pediococcus pentosaceus M67 Lb. delbrueckii ssp. lactis M68 Pediococcus dextrinicus M69 Lactobacillus casei M70 Streptococcus lactis M71 Lactobacillus acidophilus M72 Lactobacillus casei M73 Streptococcus lactis M74 Lb. delbrueckii ssp. lactis 2

64 4.3. Laktik Asit Bakterilerinde Hemolitik Enzim Aktivitelerinin Değerlendirilmesi Çalışmada çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin hemolitik aktivitesi kanlı agar da araştırılmıştır (Resim 4.4). 74 laktik asit bakterisinin Streptococcus, Lactococcus ve Enterococcus cinsine ait 5 izolatta hemolitik aktivite gözlenirken 69 izolatta hemolitik aktivite gözlenmemiştir. Hemolitik aktivite gösteren 5 izolatın 2 (%40) si Streptococcus lactis, 2 (%40) si Lactococcus lactis ssp. lactis ve 1 (%20) izolatın Enterococcus faecium türüne ait olduğu tespit edilmiştir. Çizelge 4.9. da hemolitik aktivite gösteren laktik bakteri türleri gösterilmiştir. Çizelge 4.9. Hemolitik enzim aktivitesi gösteren laktik asit bakterilerinin türlere göre dağılımı Cins ismi İzolat no Tür ismi Hemolitik enzim aktivitesi M65 Streptococcus lactis + Streptococcus M70 Streptococcus lactis + M44 Streptococcus cremoris - Enterococcus M30 Enterococcus faecium + Lactococcus M16 Lactococcus lactis ssp. lactis + M21 Lactococcus lactis ssp. lactis + Resim 4.4. Kanlı agarda laktik asit bakterilerinin hemolitik aktivitesi

65 4.4. Laktik Asit Bakterilerinin Bazı Patojen Bakteriler Üzerine İnhibitör Etkilerinin Değerlendirilmesi Araştırmada laktik asit bakterilerinin bazı patojen bakterilere karşı, Nutrient Agar da agar kuyu difüzyon yöntemiyle inhibitör etkileri incelenmiştir. Laktik asit bakterilerinden 6 Lactobacillus, 4 Pediococcus, 2 Leuconostoc, 2 Streptococcus, 2 Enterococcus ve 1 Lactococcus suşu toplam 17 laktik bakteri türünün patojen bakteriler üzerine inhibitör etkisi araştırılmıştır. Bu patojenler Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Klebsiella pneumoniae, E. coli ve Salmonella typhimurium türleridir. Laktik bakteri suşlarının indikatör bakterilere inhibisyon etkileri nutrient agar ve %0,2 glikoz ilave edilmiş nutrient agarda çalışılmıştır. Laktik asit bakterilerinin patojen bakteriler üzerindeki inhibitör etkisi, inhibisyon zon çapları ölçülerek değerlendirilmiştir. 4.4.1. Laktik asit bakterilerinin Staphylococcus aureus üzerine inhibitör etkilerinin değerlendirilmesi Lactobacillus türlerinin S. aureus üzerine inhibitör etkisi Lactobacillus cinsi; Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, Lactobacillus casei, Lb. rhamnosus, Lb. acidophilus, Lb. coryniformis ssp. torquens ve Lb. plantarum ssp. plantarum türlerinin Nutrient Agarda indikatör S. aureus üzerine inhibisyon zon çapları 2 mm ve 10 mm, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 6 mm ve 12 mm olarak ölçülmüştür. Lactobacillusların S. aureus üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Çizelge 4.10 ve Şekil 4.8 de gösterilmiştir.

66 Çizelge 4.10. Lactobacillus türlerinin indikatör S. aureus üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no Lactobacillus Türleri Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) S. aureus S. aureus M36 Lb. delbrueckii ssp. lactis 8 12 M19 Lb. casei 10 10 M34 Lb. acidophilus 6 8 M58 Lb. rhamnosus 2 6 M37 Lb. coryniformis ssp. tourquens 10 10 M48 Lb. plantarum ssp. plantarum 8 10 Şekil 4.8. Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması Lactobacillusların glikoz ilave edilen besiyeri ortamında S. aureus u etkileyen inhibisyon zon çapı daha büyük gözlenmiştir. Bu koşullarda Lb. delbrueckii ssp. lactis 12 mm ile en büyük zon çapına sahiptir. Glikozlu ortamda en düşük etki 6 mm zon çapıyla Lb. rhamnosus suşunda gözlenmiştir. Sonuç olarak Laktobasiller S.aureus üzerine etkili bulunmuştur.

67 Pediococcus türlerinin S. aureus üzerine inhibitör etkisi Pediococccus cinsi; Pediococcus inopinatus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus dextrinicus ve Pediococcus pentosaceus türü test bakterilerinin indikatör S. aureus üzerine inhibitör etkilerine bakılmıştır. Nutrient Agarda S. aureus üzerine zon çapları 4-6 mm, glikoz ilave edilmiş Nutrient Agarda 6-8 mm olarak ölçülmüştür. Pediococcus türlerinin S. aureus üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılmıştır. Çizelge 4.11. ve Şekil 4.9. da Pediococcus bakterilerinin S. aureus üzerine oluşturdukları zon çapı ölçümleri gösterilmiştir. Çizelge 4.11.Pediococcus türlerinin indikatör S. aureus üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no Pediococcus Türleri Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) S. aureus S. aureus M38 Pediococcus inopinatus 4 6 M57 Pediococcus acidilactici 6 8 M40 Pediococcus dextrinicus 6 8 M10 Pediococcus pentosaceus 4 6 Şekil 4.9. Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması

68 Pediococcus türlerinin S. aureus üzerine inhibitör etkisi %0,2 glikoz ilave edilmiş Nutrient besiyeri ortamında daha yüksek oranda tespit edilmiştir. Glikozlu ortamda 8 mm zon çapı ile Pediococcus acidilactii ve P. dextrinicus S. aureus üzerine en yüksek etkiyi göstermiştir. P. inopinatus ve P. pentosaceus türlerinin zon çapları ise 6 mm olarak ölçülmüştür. Sonuç olarak Pediococcus suşlarının S. aureus üzerine etkili olduğu tespit edilmiştir. Leuconostoc türlerinin S. aureus üzerine inhibitör etkisi S. aureus bakterisine karşı inhibitör etkisi incelen Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides suşlarının nutrient agarda zon çapları 8 mm ve 9 mm olarak ölçülmüştür. %0,2 glikoz ilave edilmiş nutrient agarda her iki suşun zon çapları 12 mm olarak belirlenmiştir. Çizelge 4.12. ve Şekil 4.10 da her iki ortamdaki zon çapı ölçümleri gösterilmiştir. Çizelge 4.12. Leuconostoc türlerinin indikatör S. aureus üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no Leuconostoc Türleri Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) S. aureus S. aureus M55 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum 8 12 M25 Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides 9 12 Şekil 4.10. Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması

69 Glikoz ilave edilmiş ortamda Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides suşlarının S. aureus üzerindeki inhibisyon zon çapları 12 mm olarak ölçülmüştür. Sonuç olarak Leuconostoc suşlarının S. aureus a inhibitör etki gösterdiği tespit edilmiştir. Streptococcus türlerinin S. aureus üzerine inhibitör etkisi Streptococcus cinsi: Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris ve Lactococcus lactis ssp. lactis türlerinin S. aureus üzerine inhibitör etkisi nutrient agar ve glikozlu nutrient agarda incelenmiştir. Nutrient agarda zon çapları 4 mm ve 8 mm olarak, glikozlu nutrient agarda 6 mm ve 10 mm olarak ölçülmüştür. Streptococusların indikatör S. aureus a inhibitör etkisi her iki ortamda zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Çizelge 4.13. ve Şekil 4.11 de gösterilmiştir. Çizelge 4.13. Streptococcus türlerinin indikatör S. aureus üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no Streptococcus Türleri Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) S. aureus S. aureus M59 Streptococcus lactis 4 6 M44 Streptococcus cremoris 6 6 M21 Lactococcus lactis ssp. lactis 8 10 Şekil 4.11. Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması

70 %0,2 glikoz ilave edilmiş Nutrient Agarda zon çapları daha yüksek gözlenmiştir. 10 mm zon çapıyla L. lactis ssp. lactis suşu S. aureus üzerine en yüksek inhibitör etkiyi göstermiştir. Streptococcus lactis ve Streptococcus cremoris glikozlu ortamda S. aureus üzerine zon çapları 6 mm olarak belirlenmiştir. Enterococcus türlerinin S. aureus üzerine inhibitör etkisi Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium suşlarının S. aureus üzerine inhibitör etkisi incelenmiştir. Nutrient Agarda Enterococcus suşlarının zon çapları 2 mm, %0,2 glikoz ilave edilmiş Nutrient Agarda 4 mm ve 7 mm olarak ölçülmüştür. Enterococcus türlerinin S. aureus a etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılmıştır. Zon çapı ölçümleri Çizelge 4.14. ve Şekil 4.12. de gösterilmiştir. Çizelge 4.14. Enterococcus türlerinin indikatör S. aureus üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no Enterococcus Türleri Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) S. aureus S. aureus M4 Enterococcus faecalis 2 4 M30 Enterococcus faecium 2 7 Şekil 4.12. Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması

71 Glikoz ilave edilmiş ortamda S. aureus üzerine en yüksek etkiyi 7 mm zon çapıyla Enterococcus faecium göstermiştir. Enterococcus faecalis in zon çapı ise 4 mm olarak ölçülmüştür. Sonuç olarak Enterococcus suşları S. aureus üzerine etkili bulunmuştur. 4.4.2. Laktik asit bakterilerinin Listeria monocytogenes üzerine inhibitör etkilerinin değerlendirilmesi Lactobacillus türlerinin L. monocytogenes üzerine inhibitör etkisi Lactobacillus cinsi; Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, Lactobacillus casei, Lb. rhamnosus, Lb. acidophilus, Lb. coryniformis ssp. torquens ve Lb. plantarum ssp. plantarum türlerinin Nutrient Agarda indikatör L. monocytogenes üzerine inhibisyon zon çapları 8 mm ve 12 mm, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 10 mm ve 18 mm olarak ölçülmüştür. Lactobacillusların L. monocytogenes üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Çizelge 4.15 ve Şekil 4.13 de gösterilmiştir. Çizelge 4.15. Lactobacillus türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no Lactobacillus Türleri Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) L.monocytogenes %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) L.monocytogenes M36 Lb. delbrueckii ssp. lactis 12 18 M19 Lb. casei 12 16 M34 Lb. acidophilus 8 12 M58 Lb. rhamnosus 12 16 M37 Lb. coryniformis ssp. tourquens 8 10 M48 Lb. plantarum ssp. plantarum 10 12

72 Şekil 4.13. Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda L. monocytogenes üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması Yapılan ölçümlerde, %0,2 glikoz ilave edilmiş Nutrient besiyerinde zon çapları daha yüksek gözlenmiştir. Glikozlu ortamda indikatör L. monocytogenes üzerinde 18 mm zon çapıyla Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis en yüksek etkiyi oluşturmuştur. Lb. coryniformis ssp. tourquens suşu ise 10 mm zon çapıyla L. monocytogenes üzerinde en düşük etkiye sahip olduğu tespit edilmiştir. Pediococcus türlerinin L. monocytogenes üzerine inhibitör etkisi Pediococccus cinsi; Pediococcus inopinatus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus dextrinicus ve Pediococcus pentosaceus türü test bakterilerinin indikatör L. monocytogenes üzerine etkisi Nutrient Agarda zon çapları 6-8 mm, glikoz ilave edilmiş Nutrient Agarda 10-14 mm olarak ölçülmüştür. Pediococcus türlerinin L. monocytogenes üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılmıştır. Çizelge 4.16. ve Şekil 4.14. de Pediococcus bakterilerinin L. monocytogenes üzerine oluşturdukları zon çapı ölçümleri gösterilmiştir.

73 Çizelge 4.16. Pediococcus türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no Pediococcus Türleri Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) L.monocytogenes L.monocytogenes M38 Pediococcus inopinatus 7 14 M57 Pediococcus acidilactici 6 10 M40 Pediococcus dextrinicus 8 12 M10 Pediococcus pentosaceus 6 14 Şekil 4.14. Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda L. onocytogenes üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması %0,2 glikozlu Nutrient Agar ortamında Pediococcus suşlarının L. monocytogenes üzerinde daha büyük zon çapları oluşturduğu gözlenmiştir. Bu koşullarda Pediococcus inopinatus ve Pediococcus pentosaceus suşları 14 mm zon çapıyla en yüksek etkiyi göstermiştir. Glikozlu ortamda en düşük zon çapı ölçümü 10 mm olup Pediococcus acidilactici suşunda gözlenmiştir.

74 Leuconostoc türlerinin L. monocytogenes üzerine inhibitör etkisi Leuconostoc cinsi; Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides türlerinin Nutrient Agarda indikatör L. monocytogenes üzerine etkisi 10 mm zon çapı, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 12-14 mm zon çapı olarak gözlenmiştir. Leuconostocların L. monocytogenes üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Çizelge 4.17 ve Şekil 4.15 de gösterilmiştir. Çizelge 4.17. Leuconostoc türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no M55 M25 Leuconostoc Türleri Leu. mesenteroides ssp. dextranicum Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) L.monocytogenes %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) L.monocytogenes 10 12 10 14 Şekil 4.15. Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda L.monocytogenes üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması

75 Leuconostoc suşlarının L. monocytogenes üzerine etkisi glikoz ilave edilen besiyeri ortamında daha yüksek gözlenmiştir. Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides suşunun zon çapı 14 mm, Leu. mesenteroides ssp. dextranicum suşunun zon çapı ise 12 mm olarak tespit edilmiştir. Sonuç olarak Leuconostocların L. monocytogenes üzerinde inhibitör etki gösterdiği bulunmuştur. Streptococcus türlerinin L. monocytogenes üzerine inhibitör etkisi Streptococcus cinsi: Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris ve Lactococcus lactis ssp. lactis türlerinin L. monocytogenes üzerine inhibitör etkisi nutrient agar ve glikozlu nutrient agarda incelenmiştir. Nutrient agarda zon çapları 6 mm ve 10 mm olarak, glikozlu nutrient agarda 10 mm ve 17 mm olarak ölçülmüştür. Streptococusların indikatör L. monocytogenes e inhibitör etkisi her iki ortamda zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Çizelge 4.18. ve Şekil 4.16 da gösterilmiştir. Çizelge 4.18. Streptococcus türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no Streptococcus Türleri Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) L.monocytogenes %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) L.monocytogenes M59 Streptococcus lactis 8 14 M44 Streptococcus cremoris 6 10 M21 Lactococcus lactis ssp. lactis 10 17

76 Şekil 4.16. Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda L. monocytogenes üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması Yapılan ölçümler sonucunda Streptococcuslar glikoz ilave edilmiş besiyeri ortamında L. monocytogenes üzerinde daha büyük etki göstermiştir. Bu koşullarda glikozlu ortamda en yüksek inhibitör etki Lactococcus lactis ssp. lactis suşunda gözlenmiştir. L. monocytogenes üzerindeki etkisi 17 mm zon çapı olarak tespit edilmiştir. En düşük etki ise 10 mm zon çapı ile Streptococcus cremoris suşunda gözlenmiştir. Enterococcus türlerinin L. monocytogenes üzerine inhibitör etkisi Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium suşlarının indikatör L. monocytogenes üzerine inhibitör etkisi incelenmiştir. Nutrient Agarda Enterococcus suşlarının zon çapları 8 mm, %0,2 glikoz ilave edilmiş Nutrient Agarda 12 mm ve 16 mm olarak ölçülmüştür. Enterococcus türlerinin L. monocytogenes e etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılmıştır. Zon çapı ölçümleri Çizelge 4.19. ve Şekil 4.17. de gösterilmiştir.

77 Çizelge 4.19. Enterococcus türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no Enterococcus Türleri Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) L.monocytogenes L.monocytogenes M4 Enterococcus faecalis 8 12 M30 Enterococcus faecium 8 16 Şekil 4.17. Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda L.monocytogenes üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması Enterococcusların L. monocytogenes e etkileri glikozlu besiyeri ortamında artış göstermiştir. Enterococcus faecium suşunun zon çapı 16 mm olarak tespit edilmiştir. L. monocytones üzerinde en büyük etkiyi oluşturmuştur. Enterococcus faecalis suşu ise L. monocytogenes e oluşturduğu zon çapı 12 mm olarak belirlenmiştir. Sonuç olarak Enterococcus türleri L. monocytogenes e etkili bulunmuştur.

78 4.4.3. Laktik asit bakterilerinin Salmonella typhimurium üzerine inhibitör etkilerinin değerlendirilmesi Lactobacillus türlerinin S. typhimurium üzerine inhibitör etkisi Lactobacillus cinsi; Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, Lactobacillus casei, Lb. rhamnosus, Lb. acidophilus, Lb. coryniformis ssp. torquens ve Lb. plantarum ssp. plantarum türlerinin Nutrient Agarda indikatör S. typhimurium üzerine etki ettiği zon çapları 4 mm ve 10 mm, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 6 mm ve 18 mm olarak ölçülmüştür. Lactobacillusların S. typhimurium üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. (Çizelge 4.20. ve Şekil 4.18. ) Çizelge 4.20. Lactobacillus türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no Lactobacillus Türleri Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) S. typhimurium S. typhimurium M36 Lb. delbrueckii ssp. lactis 10 18 M19 Lb. casei 8 8 M34 Lb. acidophilus 8 9 M58 Lb. rhamnosus 6 10 M37 Lb. coryniformis ssp. tourquens 4 6 M48 Lb. plantarum ssp. plantarum 8 10

79 Şekil 4.18. Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S.typhimurium üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması Nutrient Agar ve %0,2 glikozlu Nutrient Agar ortamı karşılaştırıldığında, Lactobacilluslar glikozlu ortamda S. typhimurium üzerine daha büyük etki göstermiştir. Bu koşullarda 18 mm zon çapıyla Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis en yüksek etkili suş olarak belirlenmiştir. S. typhimurium üzerine en düşük etkiyi gösteren suş ise 6 mm zon çapıyla Lb. coryniformis ssp. torquens olarak tespit edilmiştir. Sonuç olarak Lactobacilluslar S. typhimurium a etkili bulunmuştur. Pediococcus türlerinin S. typhimurium üzerine inhibitör etkisi Pediococccus cinsi; Pediococcus inopinatus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus dextrinicus ve Pediococcus pentosaceus suşlarının indikatör S. typhimurium üzerine etkisi Nutrient Agarda zon çapları 4-6 mm, glikoz ilave edilmiş Nutrient Agarda 5-10 mm olarak ölçülmüştür. Pediococcus türlerinin S. typhimurium üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılmıştır. Çizelge 4.21. ve Şekil 4.19. da Pediococcus bakterilerinin S. typhimurium üzerine oluşturdukları zon çapı ölçümleri gösterilmiştir.

80 Çizelge 4.21. Pediococcus türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no Pediococcus Türleri Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) S. typhimurium S. typhimurium M38 Pediococcus inopinatus 4 6 M57 Pediococcus acidilactici 6 10 M40 Pediococcus dextrinicus 6 8 M10 Pediococcus pentosaceus 4 5 Şekil 4.19. Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. typhimurium üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması Pediococccus türlerinin her iki ortamdaki zon çapı ölçümleri karşılaştırıldığında %0,2 glikozlu Nutrient Agarda zon çaplarında artış olduğu gözlenmiştir. Glikozlu ortamda Pediococcus acidilactici 10 mm zon çapıyla S. typhimurium üzerinde en yüksek etkiyi göstermiştir. En düşük etkiyi Pediococcus pentosaceus suşu göstermiş olup, zon çapı 5 mm olarak tespit edilmiştir.

81 Leuconostoc türlerinin S. typhimurium üzerine inhibitör etkisi Leuconostoc cinsi; Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides türlerinin Nutrient Agarda indikatör S. typhimurium üzerine etkisi 6mm ve 7mm, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 8-10 mm zon çapı olarak gözlenmiştir. Leuconostocların S. typhimurium üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Zon çapı ölçümleri Çizelge 4.22 ve Şekil 4.20 de gösterilmiştir. Çizelge 4.22. Leuconostoc türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no Leuconostoc Türleri Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) S. typhimurium S. typhimurium M55 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum 6 8 M25 Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides 7 10 Şekil 4.20. Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S.typhimurium üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması

82 Leuconostoc suşlarının S. typhimurium üzerine etkisi glikozlu besiyeri ortamında artış göstermiştir. Bu koşullarda Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides suşunun zon çapı 10 mm, Leu. mesenteroides ssp. dextranicum suşunun zon çapı 8 mm olarak belirlenmiştir. Sonuç olarak Leuconostoclar indikatör S. typhimurium a etkili bulunmuştur. Streptococcus türlerinin S. typhimurium üzerine inhibitör etkisi Streptococcus cinsi: Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris ve Lactococcus lactis ssp. lactis türlerinin S. typhimurium üzerine inhibitör etkisi Nutrient Agar ve glikozlu Nutrient Agarda incelenmiştir. Nutrient agarda zon çapları 6 mm ve 8 mm olarak, glikozlu Nutrient Agarda 8 mm ve 10 mm olarak ölçülmüştür. Streptococusların indikatör S. typhimurium a inhibitör etkisi her iki ortamda zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Çizelge 4.23. ve Şekil 4.21 de gösterilmiştir. Çizelge 4.23. Streptococcus türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no Streptococcus Türleri Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) S. typhimurium S. typhimurium M59 Streptococcus lactis 6 10 M44 Streptococcus cremoris 6 8 M21 Lactococcus lactis ssp. lactis 8 8 Şekil 4.21. Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. typhimurium üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması

83 Yapılan ölçümler sonucunda Streptococcuslar glikoz ilave edilmiş besiyeri ortamında S. typhimurium üzerinde daha büyük etki göstermiştir. Bu koşullarda glikozlu ortamda en yüksek inhibitör etki 10 mm zon çapıyla Streptococcus lactis suşunda gözlenmiştir. Streptococcus cremoris ve Lactococcus lactis ssp. lactis suşlarının zon çapı ise 8 mm olarak belirlenmiştir. Enterococcus türlerinin S. typhimurium üzerine inhibitör etkisi Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium suşlarının S. typhimurium üzerine inhibitör etkisi Nutrient Agarda zon çapları 7 mm ve 8 mm olarak, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda zon çapları 8 mm olarak ölçülmüştür. Enterococcusların indikatör S. typhimurium a etkisi her iki ortamdaki zon çapı ölçümleri karşılaştırılarak yapılmıştır. Çizelge 4.24. ve Şekil 4.22. de zon çapı ölçümleri gösterilmiştir. Çizelge 4.24. Enterococcus türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no Enterococcus Türleri Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) S. typhimurium S. typhimurium M4 Enterococcus faecalis 7 8 M30 Enterococcus faecium 8 8 Şekil 4.22. Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S.typhimurium üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması

84 Nutrient Agar ve Glikozlu Nutrient Agar ortamı karşılaştırıldığında, Enterococcus faecalis suşunun S. typhimurium üzerindeki etkisinin glikozlu ortamda artış gösterdiği tespit edilmiştir. Glikozlu ortamda Enterococcus faecalis in zon çapı 8 mm olarak belirlenmiştir. Enterococcus faecium suşunun S. typhimurium a etkisi her iki ortamda eşit olduğu tespit edilmiştir ve zon çapı 8 mm olarak belirlemiştir. 4.4.4. Laktik asit bakterilerinin Klebsiella pneumoniae üzerine inhibitör etkilerinin değerlendirilmesi Lactobacillus türlerinin K. pneumoniae üzerine inhibitör etkisi Lactobacillus cinsi; Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, Lactobacillus casei, Lb. rhamnosus, Lb. acidophilus, Lb. coryniformis ssp. torquens ve Lb. plantarum ssp. plantarum türlerinin Nutrient Agarda indikatör K. pneumoniae üzerine etki ettiği zon çapları 2 mm, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 2 mm ve 4 mm olarak ölçülmüştür. Lactobacillusların K. pneumoniae üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. (Çizelge 4.25. ve Şekil 4.23. ) Çizelge 4.25. Lactobacillus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no Lactobacillus Türleri Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) K. pneumoniae K. pneumoniae M36 Lb. delbrueckii ssp. lactis 2 3 M19 Lb. casei 2 3 M34 Lb. acidophilus 2 2 M58 Lb. rhamnosus 2 3 M37 Lb. coryniformis ssp. tourquens 2 2 M48 Lb. plantarum ssp. plantarum 2 4

85 Şekil 4.23. Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda K.pneumoniae üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması Lactobacillus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerindeki etkisi Nutrient Agar ve glikozlu Nutrient Agar ortamında karşılaştırılmıştır. Glikozlu ortamda zon çaplarında artış gözlenmiştir. En yüksek zon çapı ölçümü Lb. plantarum ssp. plantarum suşuna ait olup, glikozlu ortamda zon çapı 4 mm olarak belirlenmiştir. Lb. rhamnosus, Lb. casei ve Lb. delbrueckii ssp. lactis suşlarının zon çapları 3 mm olarak tespit edilmiştir. Sonuç olarak Lactobacilluslar K. pneumoniae üzerine etkili bulunmamıştır. Bunun sebebinin K. pneumoniae nin kapsüllü patojen bir bakteri olmasından kaynaklandığı düşünülmektedir. Pediococcus türlerinin K. pneumoniae üzerine inhibitör etkisi Pediococccus cinsi; Pediococcus inopinatus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus dextrinicus ve Pediococcus pentosaceus suşlarının indikatör K. pneumoniae üzerine etkisi Nutrient Agarda zon çapları 2 mm, glikoz ilave edilmiş Nutrient Agarda 2-3 mm olarak ölçülmüştür. Pediococcus türlerinin K. pneumoniae üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılmıştır. Çizelge 4.26. ve Şekil 4.24. te Pediococcus bakterilerinin K. pneumoniae üzerine oluşturdukları zon çapı ölçümleri gösterilmiştir.

86 Çizelge 4.26. Pediococcus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no Pediococcus Türleri Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) K. pneumoniae K. pneumoniae M38 Pediococcus inopinatus 2 2 M57 Pediococcus acidilactici 2 3 M40 Pediococcus dextrinicus 2 2 M10 Pediococcus pentosaceus 2 2 Şekil 4.24. Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda K. pneumoniae üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması Pediococcus türlerinin her iki ortamdaki zon çapı ölçümleri karşılaştırıldığında iki ortamda da benzer sonuçlar olduğu gözlenmiştir. Glikozlu ortamda sadece Pediococcus acidilactici suşunun zon çapında artış olduğu gözlenmiştir ve 3 mm olarak kaydedilmiştir. Sonuç olarak Pediococcus türleri K. pneumoniae üzerine etkili bulunmamıştır.

87 Leuconostoc türlerinin K. pneumoniae üzerine inhibitör etkisi Leuconostoc cinsi; Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides türlerinin Nutrient Agarda indikatör K. pneumoniae üzerine etkisi 1 mm ve 2 mm, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 2 mm zon çapı olarak gözlenmiştir. Leuconostocların K. pneumoniae üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Zon çapı ölçümleri Çizelge 4.27 ve Şekil 4.25 de gösterilmiştir. Çizelge 4.27. Leuconostoc türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no Leuconostoc Türleri Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) K. pneumoniae K. pneumoniae M55 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum 1 2 M25 Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides 2 2 Şekil 4.25. Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda K. pneumoniae üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması

88 Yapılan ölçümler sonucunda Leuconostoc suşlarının Nutrient Agar ve Glikozlu Nutrient Agar da K. pneumoniae üzerine etkisi karşılaştırıldığında değişiklik olmadığı gözlenmiştir. Sonuç olarak Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides K. pneumoniae ye etkili bulunmamıştır. Streptococcus türlerinin K. pneumoniae üzerine inhibitör etkisi Streptococcus cinsi: Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris ve Lactococcus lactis ssp. lactis türlerinin K. pneumoniae üzerine inhibitör etkisi Nutrient Agar ve glikozlu Nutrient Agarda incelenmiştir. Nutrient agarda zon çapları 2 mm olarak, glikozlu Nutrient Agarda 2 mm ve 4 mm olarak ölçülmüştür. Streptococusların indikatör K. pneumoniae ye inhibitör etkisi her iki ortamda zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Çizelge 4.28. ve Şekil 4.26 da gösterilmiştir. Çizelge 4.28. Streptococcus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no Streptococcus Türleri Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) K. pneumoniae K. pneumoniae M59 Streptococcus lactis 2 4 M44 Streptococcus cremoris 2 3 M21 Lactococcus lactis ssp. lactis 2 2 Şekil 4.26. Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda K. pneumoniae üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması

89 Nutrient Agar ve glikozlu Nutrient Agarda yapılan ölçümler sonucunda Streptococcus suşlarının K. pneumoniae ye etkileri her iki ortamda da değişiklik göstermemiştir. Ancak Streptococcus lactis suşunun zon çapı glikozlu ortamda artış göstermiş olup 4 mm olarak tespit edilmiştir. Streptococcus cremoris in zon çapı 3 mm ve Lactococcus lactis ssp. lactis suşunun zon çapı 2 mm olarak belirlenmiştir. Enterococcus türlerinin K. pneumoniae üzerine inhibitör etkisi Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium suşlarının K. pneumoniae üzerine inhibitör etkisi Nutrient Agarda zon çapları 2 mm ve 4 mm olarak, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda zon çapları 3 mm ve 4 mm olarak ölçülmüştür. Enterococcusların indikatör K. pneumoniae ye etkisi her iki ortamdaki zon çapı ölçümleri karşılaştırılarak yapılmıştır. Çizelge 4.29. ve Şekil 4.27. de zon çapı ölçümleri gösterilmiştir. Çizelge 4.29. Enterococcus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no Enterococcus Türleri Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) K. pneumoniae K. pneumoniae M4 Enterococcus faecalis 2 3 M30 Enterococcus faecium 4 4 Şekil 4.27. Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda K. pneumoniae üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması

90 Enterococcus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerindeki etkisi her iki ortamda karşılaştırıldığında zon çapı ölçümlerinde değişiklik gözlenmemiştir. Bu koşullarda Enterococcus faecalis suşunun zon çapı glikozlu ortamda 3 mm, Enterococcus faecium suşunun zon çapı ise 4 mm olarak tespit edilmiştir. 4.4.5. Laktik asit bakterilerinin E. coli üzerine inhibitör etkilerinin değerlendirilmesi Lactobacillus türlerinin E. coli üzerine inhibitör etkisi Lactobacillus cinsi; Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, Lactobacillus casei, Lb. rhamnosus, Lb. acidophilus, Lb. coryniformis ssp. torquens ve Lb. plantarum ssp. plantarum türlerinin Nutrient Agarda indikatör E. coli üzerine etki ettiği zon çapları 2 mm, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 2 mm ve 4 mm olarak ölçülmüştür. Lactobacillusların E. coli üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. (Çizelge 4.30. ve Şekil 4.28. ) Çizelge 4.30. Lactobacillus türlerinin indikatör E. coli üzerine oluşturdukları zon Çapları Suş no Lactobacillus Türleri Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) E.coli %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) E.coli M36 Lb. delbrueckii ssp. lactis 2 2 M19 Lb. casei - 2 M34 Lb. acidophilus 2 2 M58 Lb. rhamnosus 2 2 M37 Lb.coryniformis ssp. tourquens - 2 M48 Lb. plantarum ssp. plantarum 2 4

91 Şekil 4.28. Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda E. coli üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması Lactobacillus türlerinin indikatör E.coli üzerindeki etkisi Nutrient Agar ve glikozlu Nutrient Agar ortamında karşılaştırılmıştır. her iki ortamda da değişiklik gözlenmemiştir. Ancak Lb. plantarum ssp. plantarum suşunun zon çapı glikozlu ortamda 4 mm olarak belirlenmiştir. Pediococcus türlerinin E. coli üzerine inhibitör etkisi Pediococccus cinsi; Pediococcus inopinatus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus dextrinicus ve Pediococcus pentosaceus suşlarının indikatör E. coli üzerine etkisi Nutrient Agarda zon çapları 2 mm, glikoz ilave edilmiş Nutrient Agarda 2-3 mm olarak ölçülmüştür. Pediococcus türlerinin E. coli üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılmıştır. Çizelge 4.31. ve Şekil 4.29. da Pediococcus bakterilerinin E. coli üzerine oluşturdukları zon çapı ölçümleri gösterilmiştir.

92 Çizelge 4.31. Pediococcus türlerinin indikatör E. coli üzerine oluşturdukları zon Çapları Suş no Pediococcus Türleri Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) E.coli E.coli M38 Pediococcus inopinatus 2 3 M57 Pediococcus acidilactici 2 2 M40 Pediococcus dextrinicus - 3 M10 Pediococcus pentosaceus 2 2 Şekil 4.29. Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda E. coli üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması Yapılan ölçümler sonucunda Pediococcus suşlarının indikatör E. coli ye etkileri Nutrient Agar ve glikozlu Nutrient Agar ortamında karşılaştırılmıştır. Her iki ortamda da zon çapı ölçümleri değişiklik göstermemiştir. Pediococcus inopinatus ve Pediococcus dextrinicus suşlarının glikozlu ortamda zon çapları 3 mm, Pediococcus acidilactici ve Pediococcus pentosaceus suşlarının ise 2 mm olarak belirlenmiştir.

93 Leuconostoc türlerinin E. coli üzerine inhibitör etkisi Leuconostoc cinsi; Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides türlerinin Nutrient Agarda indikatör E. coli üzerine etkisi 2 mm, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 1 mm ve 3 mm zon çapı olarak gözlenmiştir. Leuconostocların E. coli üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Zon çapı ölçümleri Çizelge 4.32 ve Şekil 4.30 da gösterilmiştir. Çizelge 4.32. Leuconostoc türlerinin indikatör E. coli üzerine oluşturdukları zon Çapları Suş no Leuconostoc Türleri Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) E.coli E.coli M55 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum - 1 M25 Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides 2 3 Şekil 4.30. Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda E.coli üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması

94 Leuconostoc türlerinin E. coli üzerine inhibitör etkileri incelendiğinde, Nutrient Agar ve glikozlu Nutrient Agar ortamında zon çapı ölçümleri düşük oranda gözlenmiştir. Bu koşullarda Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides glikozlu ortamda 3 mm, Leu. mesenteroides ssp. dextranicum suşu ise 1 mm zon çapı olarak tespit edilmiştir. Streptococcus türlerinin E. coli üzerine inhibitör etkisi Streptococcus cinsi: Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris ve Lactococcus lactis ssp. lactis türlerinin E. coli üzerine inhibitör etkisi Nutrient Agar ve glikozlu Nutrient Agarda incelenmiştir. Nutrient agarda zon çapları 0-2 mm olarak, glikozlu Nutrient Agarda 2 mm olarak ölçülmüştür. Streptococusların indikatör E. coli ye inhibitör etkisi her iki ortamda zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Çizelge 4.33. ve Şekil 4.31 de gösterilmiştir. Çizelge 4.33. Streptococcus türlerinin indikatör E. coli üzerine oluşturdukları zon Çapları Suş no Streptococcus Türleri Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) E.coli E.coli M59 Streptococcus lactis 2 2 M44 Streptococcus cremoris - 2 M21 Lactococcus lactis ssp. lactis - 2 Şekil 4.31. Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda E. coli üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması