20, 80, 74-80 (2011) doi: 10.5053/ekoloji.2011.8010 ARAÞTIRMA NOTU Caddebostan (Ýstanbul) Rekreasyon Alanlarýndaki Fekal Kirlilik Ýndikatörü Enterococcus spp. Bakterilerinin Klasik ve Moleküler Yöntem ile Belirlenmesi Nüzhet Cenk SESAL 1*, Ýskender KARALTI 2, Barlas DÝNGÝLYAN 3, Figen Esin KAYHAN 1 Birkan AÇIKGÖZ 1 1Marmara Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, 34722 Göztepe, Ýstanbul- TÜRKÝYE 2Yeditepe Üniversitesi- Týp Fakültesi Mikrobiyoloji Laboratuarý- 34755 Ataþehir, Ýstanbul - TÜRKÝYE 3Marmara Üniversitesi, Doða Bitkileri ve Su Ürünleri Araþtýrma Merkezi, Göztepe, 34722 Ýstanbul-TÜRKÝYE *Corresponding author: csesal@marmara.edu.tr Özet Ýstanbul Anadolu yakasýnýn Caddebostan plajlarý çok sayýda insanýn tercih ettiði önemli rekreasyon alanlarýndan biri olmasý nedeniyle halk saðlýðý bakýmýndan mikrobiyolojik kirlenmenin incelenmesi büyük önem taþýmaktadýr. Çalýþmamýzda; sonbahar (Ekim), kýþ (Ocak), ve özellikle de yaz (Haziran, Temmuz, Aðustos) aylarýnda Caddebostan rekreasyon alanýnda denizdeki fekal kirliliðin indikatörü olarak belirtilen Enterococcus spp. nin klasik plak sayým ve moleküler düzeyde Q-PCR yöntemleri ile belirlenmesi ve bu yöntemlerin karþýlaþtýrýlmasý amaçlanmýþtýr. Literatürde Enterococcus spp. bakterisinin dayanýklý olmasý nedeniyle 8 günlük fekal kirliliði ifade ettiði belirtilmiþtir. Fekal kirlilik; hava sýcaklýðý, yaðýþ (kar, yaðmur, vs.), rüzgar gibi parametrelere göre deðiþkenlik gösterebileceðinden çalýþmamýzda, örnek numunelerinin alýndýðý gün dahil olmak üzere 8 gün öncesine kadar gerçekleþen hava durumu raporlarý ile örneklerden elde edilen sonuçlar karþýlaþtýrýlmýþtýr. Yaz aylarýnda yapýlan ölçümlerde bakteri sayýlarýnýn daha fazla arttýðý izlenmiþtir. Klasik ve moleküler iki yöntemin sonuçlarý arasýnda logaritmik olarak pozitif bir korelasyon görülmüþtür. Anahtar Kelimeler: Enterococcus spp., Fekal kirlenme, Plak sayým metodu, Q-PCR. Enterococcus spp. Indicator of Fecal Pollution is Detected by Classical and Molecular Methods from Recreation Areas in Caddebostan (Istanbul) Abstract Caddebostan beaches are one of the most important recreational area in Anatolian side of Istanbul. Microbiologically investigation of fecal contaminants will be most important for public health. In our study, we aim to investigate Enterococcus spp. that marked of the source of fecal pollution in autumn (October), winter (January), and especially summer (June, July, August) by culture-based traditional and molecular methods such as plate count and Q-PCR method respectively. Enterococcus spp. expressed at last 8 days of fecal pollution because of its resistant in literature. Fecal pollution may be changed with some parameters such as weather, precipitation (snow, raining, vs.), wind. Because of this reason, including the day of the sample collected until the 8 days before the sample collection date reports of the weather was compared with results from the samples. The number of Enterococcus spp. was accelerated in summer months. Logarithmic positive correlation was found between classical and molecular methods. Keywords: Enterococcus spp., Fecal pollution, Plate count methods, Q-PCR. Sesal NC, Karaltý Ý, Dingilyan B, Kayhan FE, Açýkgöz B (2011) Caddebostan (Ýstanbul) Rekreasyon Alanlarýndaki Fekal Kirlilik Ýndikatörü Enterococcus spp. Bakterilerinin Klasik ve Moleküler Yöntem ile Belirlenmesi. 20 (80): 74-80. GÝRÝÞ Çevre kirliliði günümüzde doðayý ve doðal dengeleri etkileyen en önemli faktördür. Çevre kirliliðinin bir parçasý olan deniz kirliliði ise deniz kaynaðýnýn kimyasal, fiziksel, bakteriyolojik ve ekolojik özelliklerinin olumsuz yönde deðiþmesi Geliþ: 08.09.2010 / Kabul: 15.03.2011 74
Caddebostan (Ýstanbul) Rekreasyon Alanlarýndaki Fekal Kirlilik... biçiminde gözlenen ve doðrudan ya da dolaylý olarak biyolojik kaynaklarda, insan saðlýðýnda, balýkçýlýkta, deniz suyu kalitesinde ve deniz suyunun diðer amaçlarla kullanýlmasýnda engelleyici bozulmalar yaratacak madde ya da enerji atýklarýnýn boþaltýlmasý olarak tanýmlanmaktadýr (Alemdar ve ark. 2009). Özellikle yaz aylarýnda havalarýn ýsýnmasý ile birlikte halkýn eðlence mekanlarýný (rekreasyon alanlarý) daha fazla tercih etmelerinden dolayý deniz suyu kalitesinin belirlenmesi büyük önem taþýmaktadýr. Deniz suyu kalitesini belirleyen parametreler mikrobiyolojik parametreler, fizikokimyasal parametreler ve kirlilik indikatörü olan diðer maddeleri içeren baþlýklar altýnda bir bütün olarak tanýmlanmýþtýr (Anonymous 2004). Çevre ve Orman Bakanlýðý'nýn 31.12.2004 tarihli su kirliliði yönetmeliðinde fekal koliform ve fekal Streptococcus türleri yüzme suyu kalitesini mikrobiyolojik olarak incelemek için kullanýlmasý gereken parametreler olarak belirtilmiþtir. Echericihia coli (E. coli) ve Enterococcus spp. sayýsýnýn fazla olmasý durumunda hastalýk yapabilen, ortamda patojen bakterilerin varlýðýný gösteren indikatör türler olarak tercih edilmektedir (Bucak ve Karlik 2011). Saðlýk Bakanlýðý Mavi Bayrak Projesi ve Deniz Kirliliði Analiz projesi kapsamýnda; Tekirdað, Çanakkale, Ýstanbul, Kocaeli, Bursa, Balýkesir, Ýzmir, Muðla, Antalya, Adana ve Ýçel illerinde belirlenen noktalarda insan kaynaklý mikrobiyolojik kirlilikte indikatör tür olan E. coli ve Enterococcus spp. türlerinin sürekli izlenmesi gerekmektedir. Ayrýca, Avrupa Birliði (AB) uyum sürecinde ön hazýrlýk amacýyla 2002 yýlýndan itibaren tüm kýyýlarda bu parametrelerin izlenmesine baþlanmýþtýr. Günümüzde özellikle bakterilerin tanýmlanmasý için rutin olarak kültür-tabanlý tanýmlama yöntemleri ve takiben biyokimyasal testler kullanýlmaktadýr. Bakterilerin tanýmlanmasýnda bütün yöntemlerin avantajlarýnýn ve dezavantajlarýnýn olduðu bilinmektedir. Epidemiyolojik çalýþmalar standart fekal indikatörler ile insanlarda hastalýk yapabilme riski arasýndaki iliþki üzerinde durmuþlardýr. Enterococcus faecalis çevre sularýndan izole edilerek mikrobiyal kaynak tayininde insan fekal indikatörü olarak tespit edilmiþtir (Wheeler ve ark. 2002). Dick ve ark. (2004) fekal indikatörlerin rekreasyon alanlarýndaki fekal kirliliðin tespiti için çok önemli olduðunu ve bütün su sistemleri için tek bir bakteriyel indikatörün yeterli olamayacaðýný belirtmiþlerdir. Ayrýca Amerika Çevre Koruma Ajansý (EPA) tarafýndan içme sularýnýn indikatör bakterisi olarak total koliform grubunun, deniz için Enterococci spp., tatlý sular için E. coli bakterilerinin kullanýlabileceði belirtilmiþtir (Anonymous 2000). Ashbolt ve ark. (2007) yaptýklarý çalýþmada, geleneksel plak sayým metodu ve en muhtemel sayý metodu (most probable number metod) ile bakteri sayýmýnýn 24-72 saat arasýnda zaman gerektirdiði ve Amerika Çevre Koruma Ajansý ndan onay almýþ olan kolorimetrik bir yöntemin geliþtirilmesi ile bu zamanýn 18 saate kadar düþürüldüðü belirtmiþler. Noble ve ark. (2006) Los Angeles çevresinde Santa Monica körfezinde yaptýklarý çalýþmada, fekal kirliliði 6 saat içinde kütle tabanlý ölçüm sistemi ile E. coli ve Enterococcus spp. gibi fekal indikatör bakteriler ile tespit etmiþler. Yüzme suyu analiz iþlemlerinin doðru, çabuk ve ucuz olarak gerçekleþtirilmesi bazý hastalýk ve etmenlerinin erken teþhis edilmesini saðlayacaktýr. Son yýllarda yapýlan çalýþmalar rekreasyon alanlarýndaki kirlenmeyi gösteren indikatör türlerin tespitinin kýsa sürede gerçekleþtirilmesi ve böylece insan saðlýðý açýsýndan daha erken tedbir alýnmasý üzerine kurulmaktadýr. Bu nedenle hem zaman hem de güvenilirlik açýsýndan bir çok araþtýrýcý tarafýndan yeni teknikler araþtýrýlmaktadýr. Belirtilen sebeplerden dolayý plajlarda bulunan bakterilerin tanýmlanmasý için testlerin çabuk, doðru, güvenilir ve ucuz olarak yapýlmasý gerekliliði ortaya çýkmýþtýr. Çalýþmada; Ýstanbul ilinin Kadýköy ilçesinde Caddebostan rekreasyon alanlarýnýn mikrobiyal indikatörlerinden Enterococcus spp. türünün kültür tabanlý plak sayým metodu ve moleküler olarak q-pcr yöntemi ile tespit edilmesi, böylelikle deniz suyu kalitesinin belirlenmesi ve en son olarak bu yöntemlerin birbirleri ile kýyaslanmasý amaçlanmýþtýr. MATERYAL VE METOT Örneklerin Toplanmasý Ýstanbul'un Kadýköy ilçesinin Caddebostan plajlarýndan 2008-2009 tarihleri arasýnda yaz, sonbahar ve kýþ mevsimlerinde toplam 5 defa su numunesi alýnmýþtýr. Su numuneleri Çevre ve Orman Bakanlýðý'nýn yüzme suyu yönetmeliði'ne uygun olarak Caddebostan plajlarýnda belirlenen noktalardan ve su yüzeyinin 50 cm altýndan özel düzenek yardýmý ile toplanmýþtýr (Þekil 1). Örnek toplama iþlemi sýrasýnda denize giren kiþi sayýsý, rekreasyon alanýnda gözlenen kuþlarýn sayýsý, 75
Sesal ve ark. denizin üzerinde bulunan tekne sayýsý, plajlara veya plajlarýn yakýnýna kanalizasyon vb. akýntýlarýn varlýðý ve denizde alglerin durumu gibi gözlemler kayýt edilmiþtir. Bununla birlikte örneklerin ph ve iletkenlik deðerleri ölçülmüþ, örnek toplanan tarih ve 8 gün önceki hava raporlarý toplanmýþtýr. Toplanan deniz suyu numuneleri test iþleminin gerçekleþtirilmesi için steril renkli nötr cam þiþelere alýnarak, soðuk zincir içerisinde en kýsa zamanda Marmara Üniversitesi Doða Bitkileri ve Su Ürünleri Araþtýrma ve Uygulama Merkezi'ne getirilmiþtir. Örneklerin Mikrobiyal Analizi Örneklerin analizleri için kültür-tabanlý klasik yöntem olarak plak sayým ve moleküler yöntem olarak ise Q-PCR yöntemi tercih edilmiþtir. Plak Sayým Metodu Laboratuara getirilen su örneklerinin ilk 24 saat içinde membran filtrasyon yöntemi ile ekimleri gerçekleþtirilmiþtir. Ekim iþlemi için þiþeler iyice çalkalandýktan sonra 100 ml deniz suyu örneði 0,45 μm filtreden geçirilmiþ ve filtreler AZÝD (Sartorius) besiyerine aseptik teknikler kullanýlarak aktarýlmýþtýr. 48 saat 37 C de inkübasyona tabii tutularak besiyerlerinin üzerinde bakterilerin çoðalmasý saðlanmýþ ve ortaya çýkan koloniler koloni oluþturma ünitesi (CFU) olarak sayýlmýþtýr. Petri kabý üzerinde sayýlamayacak kadar çok bakteri (>300 adet) olduðunda örnekler %10 oranýnda seyreltilerek sayýlma iþlemi gerçekleþtirilmiþtir (Anonymous 2000). Q-PCR Yöntemi Laboratuara getirilen deniz suyu örneklerinden plak sayým yönteminde olduðu gibi elde edilen filtreler steril ependorf tüplere aktarýlmýþtýr. Filtreler DNA izolasyonu için kullanýlýncaya kadar -20 C'de saklanmýþtýr (Siefring ve ark. 2008, Shanks ve ark. 2009). Bakterilerden DNA Ýzolasyonu ve Q-PCR Aletinin Kalibrasyonu Saklanan filtrelerden DNA izolasyonu piyasada ticari olarak satýlan ve üretici firmalarýn talimatlarýna uygun olarak Promega, Qiagen ve Invitrogen gibi izolasyon kitleri kullanýlarak gerçekleþtirilmiþtir. Ýzole edilen DNA' larýn varlýðý %0,8'lik agaroz jelde yürütülerek ve görüntüleme sistemi (Vilber Lourmat) kullanýlarak test edilmiþtir. Q-PCR aletinin kalibrasyonu için Entrerococcus spp. bakterileri Mc Farland standartýna göre 10 7 CFU olacak þekilde çoðaltýlmýþ, DNA izolasyonlarý 76 gerçekleþtirilmiþ ve örnekler 10 7-10 1 olacak þekilde dilüsyona tabi tutularak Q-PCR aletinde ölçümleri yapýlarak kalibrasyon eðrisi oluþturulmuþtur (Þekil 2) (Ludwig ve ark. 2000, Sivaganesan ve ark. 2008). Primer ve Proplarýn Seçimi Bakterilere spesifik primerler ECST748F, ENC854R ve prob olarak da GPL813TQ kullanýlarak q-pcr (Roche light cycler 2.0) ile bakteriler tanýmlanmýþtýr (Sivaganesan 2008). Q- PCR aletinde bakteri DNA'larýnda elde edilmek istenilen hedef bölgenin çoðaltýlmasý saðlanmýþ ve elde edilen hedef DNA kopya sayýsýna göre 100 ml'lik su numunesinde ne kadar bakterinin olduðu belirlenmiþtir (Þekil 3). Ýstatistiksel deðerlendirme Elde edilen sonuçlarýn ortalamalarý hesaplanmýþ ve bulunan ortalamalar kullanýlarak ki-kare testi (x 2 ) ile gruplar arasýndaki farklar belirlenmiþtir. Yapýlan çalýþmalarda SPSS 15 versiyonu kullanýlmýþtýr. BULGULAR Caddebostan sahilinde Haziran, Temmuz, Aðustos, Ekim ve Ocak aylarýnda örneklerin toplanmasý sýrasýnda denize giren kiþi sayýsý, denizin üzerinde bulunan tekne sayýsý ve benzeri gözlemler (Tablo 1) kayýt edilmiþ, örneklerin ph ve iletkenlik deðerleri ölçülmüþ, örnek toplanan tarih ve 8 gün önceki hava raporlarý ortalamalarý belirtilmiþtir (Tablo 2). Örnek toplama iþlemi sýrasýnda denize giren kiþi sayýsý, denizin üzerinde bulunan tekne sayýsý, kuþlar, plajlara veya yakýnýna kanalizasyon gibi akýntýnýn varlýðý ve denizde alglerin durumu gibi gözlemler tablo 1 de gösterilmiþtir (Tablo1). Örneklerin ölçülen ph, iletkenlik deðerleri ile birlikte, örnek toplanan tarih ve 8 gün önceki hava raporlarý ortalamalarý tablo 2 de belirtilmiþtir (Tablo2). Toplanan su numunelerinin yaz aylarýndaki ph ortalamalarý 8,59 olarak ölçülmüþtür. Rekreasyon alanlarýndan alýnan örneklerde ölçülen ph, TDS ve iletkenlik deðerleri Çevre ve Orman Bakanlýðýnýn Yönetmeliði'nde belirtilen deðerlere göre iyi su kategorisine girmektedir. Sýcaklýðýn fazla olduðu aylarda da iletkenlik ve TDS deðerleri daha yüksek bulunmuþtur. Örneklerden plak sayým yöntemi gibi klasik yöntem ve Q-PCR moleküler yöntemi kullanýlarak elde edilen Enterococcus spp. ölçüm deðerleri aþaðýda verilen tablolarda belirtilmiþtir (Tablo 3,4). Yaz ile kýþ aylarýnda yalnýz canlý bakterilerin incelendiði kültür tabanlý yöntemin ölçüm sonuçlarý
Caddebostan (Ýstanbul) Rekreasyon Alanlarýndaki Fekal Kirlilik... Þekil 1. Örneklerin toplandýðý noktalar. 1: Caddebostan 1 nolu plaj; 2: Caddebostan 2 nolu plaj; 3: Caddebostan 3 nolu plaj. Þekil 2. Q-PCR yönteminde kalibrasyon sýrasýnda elde edilen Standart eðri. karþýlaþtýrýldýðýnda Enterococcus spp. sayýsýnýn yaz aylarýnda arttýðý, rüzgar hýzýnýn ise düþtüðü gözlenmiþtir. Yaz ve kýþ aylarýndaki bakteri sayýlarý istatistiksel olarak karþýlaþtýrýldýðýnda aralarýndaki fark anlamlý (p<0,01) bulunmuþtur. Ayrýca klasik yöntem ile qpcr yönteminin sonuçlarýný ayrý ayrý gruplandýrarak karþýlaþtýrmak için kullandýðýmýz ki-kare istatistik testine göre iki grup arasýnda logaritmik olarak pozitif bir korelasyon olduðu (p> 0,05) belirlenmiþtir. TARTIÞMA Ýstanbul ilinin Kadýköy ilçesinde bulunan rekreasyon alanlarýnýn mikrobiyal kirleticilerinden Enterococcus spp. türünü q-pcr ve kültür tabanlý plak sayým metodu ile belirlemeyi, bu yöntemleri kýyaslamayý ve deniz suyu kalitesini tespit etmeyi amaçladýðýmýz çalýþmamýzda; günümüzde çeþitli kaynaklarda fekal kirleticilerin araþtýrýlmasýnda bilimsel olarak en yeni tekniklerden biri olarak gösterilen moleküler yöntemlerden q-pcr yöntemi ve klasik plak sayým tekniði kullanýlarak bakterilerin tanýmlanmasý saðlanmýþtýr. 77
Sesal ve ark. Þekil 3. Q-PCR yönteminde Enterococcus spp. türlerinin DNA amplifikasyonlarýnýn görüntüsü. Tablo 1. Örnek alýmý sýrasýnda yapýlan gözlemler. Tablo 2. Örneklerin kimyasal analizleri ve 8 gün önceki hava raporlarýnýn ortalamasý. *Numunelerin toplandýðý gün ve numunelerin toplandýðý günden önceki 8 güne ait ölçümlerin ortalamasý Tablo 3. Toplanan örneklerden klasik yöntem ile elde edilen sonuçlar. 78 Tablo 4. Toplanan örneklerden Q-PCR yönteminden elde edilen sonuçlar.
Caddebostan (Ýstanbul) Rekreasyon Alanlarýndaki Fekal Kirlilik... Çalýþmamýzda olduðu gibi birçok çalýþmada bakterilerin tanýmlanmasý için geliþtirilen yeni tekniklerin avantaj ve dezavantajlarý geleneksel yöntemlerle karþýlaþtýrýlmaktadýr. Örneðin Haugland ve ark. (2005) fekal kirlilik indikatörlerinden Enterococcus cinsi bakterileri, Michigan ve Erie göllerindeki rekreasyon alanlarýndan toplanan 100 ml lik su örneklerinden 3 saatten daha az bir zaman zarfýnda tanýmlanmadýklarýný belirtmiþler. Metotta yaptýklarý ölçümleri, yöntem 1600 olarak adlandýrýlan ve mei agar besiyeri üzerindeki Enterococcus cinsi koloni oluþturma ünitelerinin tanýmlanmasý ile karþýlaþtýrmýþlar. Ýki yöntemin karþýlaþtýrýlmasýnda kullanýlan regresyon analizi sonuçlarýna göre iki yöntem arasýnda logaritmik olarak pozitif korrelasyon olduðunu belirtmiþler. Noble ve ark. (2006) rekreasyon alanlarýndan alýnan su örnekleri üzerine EPA onaylý membranfiltrasyon metodu ile q-pcr metodunu karþýlaþtýrmalý olarak uygulamýþlar ve her iki metodun uygulanmasýndan elde edilen verilerin istatistiksel analizleri yapýldýðýnda sonuçlarýn benzer olduðunu ifade etmiþler. Çalýþmamýzda da ayný iki metod uygulanmýþ ve benzer sonuçlar elde edilmiþtir. Yapýlan çalýþmalar göstermektedir ki kýsa sürede, güvenilir ve özgün olarak bakterilerin tanýmlanmasýnda moleküler teknikler önemli bir yer tutmaktadýr. Domingo JWS ve ark. (2003) 16S rdna q-pcr metodu ile tatlý su örneklerinde yaptýklarý çalýþmada, su örneklerinde Enterococcus faecalis' in tanýmlanmasý için nükleik asit ekstrasyonuna gerek kalmadan E. faecalis hücrelerini 3 saatten az bir süre içinde tespit edebildiklerini belirtmiþler. Shannon ve ark. (2007) belediyenin atýk sulardaki Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, E. coli O157:H7, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella sp., ve Staphylococcus aureus bakterilerini 13 prob ve primer seti kullanarak TaqMan q-pcr ile analizi gerçekleþtirmiþler. Çalýþmamýzda elde ettiðimiz sonuçlara göre bakteri sayýmý için her iki yönteminde kullanýlabileceði gözlenmiþtir. Fakat yapýlacak olan su numuneleri ölçümlerinde q-pcr testinin deðerlendirmelerde geçerli olabilmesi için gerekli akreditasyon çalýþmalarý yapýldýktan sonra kullanýlabileceðini ve böylece yapýlan testin güvenilirliðinin artacaðýný düþünmekteyiz. Q-PCR testinin en önemli faydalarýndan biri testin çabuk, doðru ve özgün sonuç vermesidir. Bilindiði gibi günümüzde rutin olarak yapýlan plak sayým yönteminde harcanan zaman 24-48 saat arasýndadýr. Q-PCR testi bu zamaný 3 saat gibi kýsa bir sürede gerçekleþtirebilmektedir. Böylece q-pcr testi ile yapýlacak olan analizlerde zaman kaybý önlenecektir. Bilindiði gibi klasik metotlarda membran filtrasyonundan geçirilen filtreler besiyerleri üzerine konarak etüvde inkübasyona býrakýlmaktadýr. Bu arada etüvün içerisinde birden fazla petri kabý olacaðý düþünüldüðünden bulaþma riskinin fazla olabileceði bilinmektedir. Q-PCR yönteminde ise yapýlan iþlemler steril bir ortamda yapýlacaðýndan dolayý bulaþma riski en aza inmektedir. Yine yapýlan klasik yöntemde aseptik çalýþma koþullarýnýn tam gerçekleþtilmemesi, besiyerinde çeþitli etkenlere baðlý olarak istenmeyen bakterilerin üremesine veya ortam þartlarýndan kaynaklý bakteri sayýsýnýn deðiþmesi gibi etkenlere baðlý olarak farklý sonuçlar verebilmektedir. Bu da klasik yöntem ile yapýlan bakteri tanýmlanmasýnýn güvenilirliðini azaltmaktadýr. Q-PCR ile ölçüm yapýlmasýnýn en önemli kusuru ise yapýlan iþlemin pahalý aletler gerektirmesi, kullanýlacak kimyasallarýnýn pahalý olmasý, aletlerin ve kimyasallarýn yurtdýþýndan getirilmesi nedeniyle yurtdýþýna baðýmlý olunmasý ve yapýlacak testlerin kesinlikle bu konu üzerinde iyi yetiþmiþ kiþi veya kiþiler tarafýndan gerçekleþtirilmesi zorunluluðudur. Sonuç olarak çalýþmamýzda plak sayým metodu gibi q-pcr metodunun da rekreasyon alanlarýnda bulunan bakterilerin tanýmlanmasýný için kullanýlabileceðini ve iki yöntemin avantaj ve dezavantajlarýnýn olduðu belirlenmiþtir. TEÞEKKÜR Bu araþtýrma FEN-A-090909-0303 nolu proje kapsamýnda Marmara Üniversitesi Bilimsel Araþtýrma Projeleri Birimi tarafýndan ve Ýstanbul Büyükþehir Belediyesi tarafýndan desteklenmiþtir. Örnek toplama sýrasýnda yardýmcý olan Atmosferik Fizik ve Biyofizik Laboratuarý çalýþanlarý ile birlikte, membran filtrasyon ve kültür tabanlý yöntemin yapýldýðý Marmara Üniversitesi Doða Bitkileri ve Su Ürünleri Araþtýrma ve Uygulama Merkezi baþkaný Prof. Dr. Engin ÖZHATAY nezdinde tüm çalýþanlara teþekkür ederiz. 79
Sesal ve ark. KAYNAKLAR Alemdar S, Kahraman T, Agaoglu S, Alisarli M (2009) Bitlis Ýli Icme Sularinin Bazi Mikrobiyolojik ve Fizikokimyasal Ozellikleri. 19 (73): 29-38. Anonymous (2000) Improved enumeration methods for recreational water quality indicators: Enterococci and Escherichia coli. Report EPA-821-R-97-004. United States Environmental Protection Agency, Cincinnati. Anonymous (2004) Çevre ve Orman Bakanlýðý Su Kirliliði Yönetmeliði, Resmi Gazete Sayýsý: 25687, Ankara. Ashbolt N, Fujioka R, Glymph T, McGee C, Schaub S, Sobsey M, Toranzos G (2007) Pathogen indicators and indicators of fecal contamination. In: Report of the Experts Scientific Workshop on Critical Research Needs for the Development of New or Revised Recreational Water Quality. EPA 823-R-07 006; U.S. Environmental Protection Agency, Office of Water, Office of Research and Development: Warrenton, VA, Chapter 2, 35 56. Bucak IO, Karlik B (2011) Detection of Drinking Water Quality Using CMAC Based Artificial Neural Networks. 20 (78): 75-81. Dick LK, Field KG (2004) Rapid estimation of numbers of fecal Bacteriodetes by use of a quantitative PCR assay for 16S rrna genes. Applied and Environmental Microbiology 70: 5695-5697. Domingo JWS, Siefring SC, Haugland RA (2003) Real-time PCR method to detect Enterococcus faecalis in water. Biotechnology Letters 25: 261-265 Haugland RA, Siefring SC, Wymer LJ, Brenner KP, Dufour AP (2005) Comparison of Enterococcus density measurements by quantitative polymerase chain reaction and membrane filter culture analysis at two freshwater recreational beaches. Water Research 39: 559-568. Dick LK, Field KG (2004) Rapid estimation of numbers of fecal bacteroidetes by use of a quantitative PCR assay for 16S rrna genes. Applied and Environmental Microbiology 70 (9): 5695-5697. Ludwig W, Schleifer KH (2000) How quantitative is quantitative PCR with respect to cell counts? Systematic and Applied Microbiology 23: 556-562. Noble RT, Griffth JF, Blackwood AD, Fuhrman JA, Gregory JB, Ximena H, Liang X, Bera AA, Schiff K (2006) Multitiered approach using quantitative-pcr to track sources of fecal pollution affecting Santa Monica Bay, California. Applied and Environmental Microbiology 72 (2): 1604-1612. Shanks OC, Kelty CA, Sivaganesan M, Varma M, Haugland RA (2009) Quantitative PCR for genetic markers of human fecal pollution. Applied and Environmental Microbiology 75 (17): 5507-5513. Shannon KE, Lee DY, Trevors JT, Beaudette LA (2007) Application of real-time quantitative PCR for the detection of selected bacterial pathogens during municipal wastewater treatment. Science of the Total Environment 382: 121-129 Siefring SC, Varma M, Atikovic E, Wymer LJ, Haugland RA (2008) Improved real-time PCR assays for the detection of fecal indicator bacteria in surface waters with different instrument and reagent systems. Journal of Water and Health 6: 225-237. Sivaganesan M, Seifring S, Varma M, Haugland RA, Shanks OC (2008) A Bayesian method for calculating real-time quantitative PCR calibration curves using absolute plasmid DNA standards. BMC Bioinformatics 120 (9): 1-12. Wheeler AL, Hartel PG, Godfrey DG, Hill JL, Segards WI (2002) Potential of Enterococcus faecalis as a human fecal indicator for microbial source tracking. Journal of Environmental Quality 31: 1286-1293. 80