CMV Moleküler Tanısı Prof. Dr. Dilek Çolak Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji AD Tıbbi Viroloji BD
Sunum Planı Solid organ transplant alıcılarında CMV enfeksiyonu patogenezi Viral yükün önemi Viral yükün saptanması: NAT:kGZ-PZR kgz-pzr testleri ve sonuçlarındaki farklılıklar, farklılıkların önemi kgz-pzr testlerinde standardizasyon çalışmaları 2
Transplantasyon sonrası CMV enfeksiyonu Klinik Viroloji deki gelişmeler CMV tanı ve izlemindeki gelişmeler Hücre kültürü Viral yük tayini 3
Transplantasyon sonrası CMV enfeksiyonu EBV, VZV, Polyoma v, Adeno v. CMV HBV, HCV HSV 0 1 2 3 4 5 6 Transplantasyon sonrası aylar 4
Enfeksiyon şekli Primer CMV enfeksiyonu Sekonder CMV enfeksiyonu Klinik Transplantasyon sonrası CMV enfeksiyonu Reaktivasyon Reenfeksiyon (Süper enfeksiyon) Aktif CMV enfeksiyonu CMV sendromu CMV hastalığı 5
Serolojik: Yüksek Orta Düşük SOT alıcılarında CMV enfeksiyonu riski Risk Durumu Verici (V), Alıcı (A) Seropozitivite (+/-) V+/A- V+/A+ > V-/A+ V-/A- Antalya da CMV seropozitiflik oranı toplumda %93.6 Ataman S, ve ark. Mikrobiyol Bul 2007 Alangaden GJ, et al. Cumitech 45, ASM 2008 6
Serolojik: Yüksek Orta Düşük SOT alıcılarında CMV enfeksiyonu riski Risk Durumu Verici (V), Alıcı (A) Seropozitivite (+/-) V+/A- V+/A+ > V-/A+ V-/A- Antalya da CMV seropozitiflik oranı toplumda %93.6 Türkiye de CMV seropozitifliği > %90 Ataman S, ve ark. Mikrobiyol Bul 2007 Alangaden GJ, et al. Cumitech 45, ASM 2008 7
SOT alıcılarında CMV enfeksiyonu riski Serolojik: Risk Durumu Yüksek Orta Düşük Verici (V), Alıcı (A) Seropozitivite (+/-) V+/A- V+/A+ > V-/A+ V-/A- Diğer: - Nakledilen organ tipi AC/İB > pankreas, kalp > KC, böbrek - İmmünsüpresyon tedavisi ve derecesi Alangaden GJ, et al. Cumitech 45, ASM 2008 8
CMV Patogenezi Latent Aktif CMV enfeksiyonu İmmünsüpresif tedavi ATG, ALA Akut rejeksiyon tedavisi Sepsis Diğer herpesviruslarla koenfeksiyon Uzun ve kompleks cerrahi A. Humar ın sunumundan değiştirilerek alınmıştır 9
CMV Patogenezi Aktif CMV enfeksiyonu CMV hastalığı Viral yük artışı A. Humar ın sunumundan değiştirilerek alınmıştır 10
CMV Patogenezi Latent CMV enfeksiyonu Aktif CMV enfeksiyonu viral replikasyon Direkt etkiler CMV Sendromu Ateş, halsizlik, kas ağrısı Lökopeni, trombositopeni, KCFT CMV Hastalığı Hepatit Pnömoni Kolit Kardit Nefrit Pankreatit Retinit İndirekt etkiler Değişen immün yanıta bağlı: Graft rejeksiyonu, fonk. bozukl. Fırsatçı enf: Bakteriyel, fungal Virus etkileşimi: EBV/PTLD, HHV6, HCV Ateroskleroz Bronşiolitis obliterans Diabetes mellitus Azalmış graft ve hasta yaşamı 11
CMV Patogenezi Latent CMV enfeksiyonu Yüksek viral yük Aktif CMV enfeksiyonu viral replikasyon Düşük viral yük Direkt etkiler CMV Sendromu Ateş, halsizlik, kas ağrısı Lökopeni, trombositopeni, KCFT CMV Hastalığı Hepatit Pnömoni Kolit Kardit Nefrit Pankreatit Retinit İndirekt etkiler Değişen immün yanıta bağlı: Graft rejeksiyonu, fonk. bozukl. Fırsatçı enf: Bakteriyel, fungal Azalmış graft ve hasta yaşamı Virus etkileşimi: EBV/PTLD, HHV6, HCV Ateroskleroz Bronşiolitis obliterans Diabetes mellitus 12
CMV Patogenezi Latent CMV enfeksiyonu Yüksek viral yük Aktif CMV enfeksiyonu viral replikasyon Düşük viral yük Direkt etkiler İndirekt etkiler Eşit miktarda virus sirkülasyonu olduğunda uzun süreli düşük düzey viremi viral piklerden daha önemli! Regoes RR, et al. Proc R Soc B 2006 13
SOT alıcılarında CMV replikasyon dinamikleri Seropozitif alıcıda: - Pik viral yük daha düşük - Viremi süresi daha kısa - Tedavi süresi daha kısa Atabani SF, et al. Am J Transplant 2012 14
SOT alıcılarında CMV replikasyon dinamikleri Seropozitif alıcıda: - Pik viral yük daha düşük - Viremi süresi daha kısa - Tedavi süresi daha kısa Atabani SF, et al. Am J Transplant 2012 15
SOT alıcılarında CMV replikasyon dinamikleri CMV seropozitif alıcıda CMV viral yükü daha yavaş artıyor Razonable RR, Hayden RT. Clin Microbiol Rev 2013 16
SOT alıcılarında CMV replikasyon dinamikleri CMV seropozitif alıcıda asemptomatik viremi daha fazla Emery VC, et al. J Clin Virol 2012 17
CMV: Önlenmesi Profilaksi Transplantasyon sonrası tüm hastalara ya da belirlenen riskli gruba 3-6 ay antiviral verilmesi Tedavi - Pre-emptif (erken) tedavi Transplantasyon sonrası monitörizasyon ile viral replikasyonun erken dönemde saptanması; viral yük eşik değere ulaştığında antiviral tedavinin başlanması - Semptomatik tedavi Klinik hastalık tedavisi 18
CMV: Önlenmesi Profilaksi Transplantasyon sonrası tüm hastalara ya da belirlenen riskli gruba 3-6 ay antiviral verilmesi Viral yük takibi? Tedavi - Pre-emptif (erken) tedavi Transplantasyon sonrası monitörizasyon ile viral replikasyonun erken dönemde saptanması; viral yük eşik değere ulaştığında antiviral tedavinin başlanması Viral yük takibi - Semptomatik tedavi Klinik hastalık tedavisi Viral yük takibi 19
SOT alıcılarında CMV replikasyonu saptanması Viral yük önemli! CMV nükleik asit amplifikasyon testleri (NAT) 20
CMV NAT Hedef: DNA RNA Duyarlılık: Yüksek Daha düşük Özgüllük: Daha düşük Yüksek 21
CMV NAT Hedef: DNA RNA Duyarlılık: Yüksek Daha düşük Özgüllük: Daha düşük Yüksek Kantitatif Gerçek Zamanlı PZR kgz-pzr 22
CMV NAT: kgz-pzr Hedef: DNA polimeraz/glikoprotein B/Çok erken (IE) protein/vd Matriks: Plazma/Tam kan/serum/lökosit Nükleik asit ekstraksiyonu Otomatize/Manual PZR döngü farklılıkları Saptama farklılıkları (farklı problar) Raporlama farklılıkları Kopya/mL, IU/mL, genom/ml, kopya/lökosit, vd 23
CMV kgz-pzr: DNA ekstraksiyon farkı Ekstraksiyon farklı Amplifikasyon aynı Verheyen J, et al. J Clin Virol 2012 24
CMV kgz-pzr: Amplifikasyon farkı KHT hastalarına ait 98 serum LightCycler 2.0 LightCycler 480 Sonuçlar arasında korelasyon var ancak %10.2 örnekte fark>0.5 log10 kopya/ml 1.17 log10 (x14.8 kat) Przybylski M, et al. J Clin Virol 2012 25
CMV kgz-pzr: Farklılıklar önemli mi? Pang XL, et al. Am J Transplant 2009
CMV kgz-pzr: Farklılıkların sonuçları Testlerin saptama alt ve üst sınırları, dinamik ölçüm aralığı değişir Her ölçüm teste spesifik Bildirilen her cut off (eşik değer) teste spesifik Tanı ve tedavi için ortak bir cutoff/eşik değer yok Hasta farklı laboratuvarlarda test yaptırırsa Sonuçlar ilişkili olmadığı için klinisyenin karar vermesi güçleşiyor Gereksiz antiviral tedavi Maliyet Antiviral direnç gelişimi 27
CMV Standartları DSÖ 1.CMV Standardı, Kasım 2010 NIBSC 09/162, CMV Merlin suşu, Tris-HCL, HSA 5x10 6 IU/mL Yeni jenerasyon testler bu standarda göre geliştiriliyor Cobas Ampliprep/CobasTaqman CMV Testi FDA onayı: Antiviral tedaviye virolojik yanıt ölçümü Farklı testler/laboratuvarlar arasındaki sonuçların uyumunu sağlayacağı düşünülüyor 28
CMV kgz-pzr: Farklı testlerin karşılaştırılması Akdeniz Üniv. Hastanesi, Ocak- Mart 2013 287 plazma + 18 QCMD 2011 CMV DNA paneli Toplam 305 örnek CAP/Cobas Amplicor Monitor CMV (CAM) Saptama alt sınırı 600 kopya/ml Dinamik ölçüm aralığı 600-100000 kopya/ml Başlangıç volümü 325 µl CAP/Cobas TaqMan CMV (CTM) Saptama alt sınırı 50 kopya/ml Dinamik ölçüm aralığı 150-10000000 kopya/ml Başlangıç volümü 500 µl 29
CMV kgz-pzr: Farklı testlerin karşılaştırılması Akdeniz Üniv. Hastanesi, Ocak- Mart 2013 287 plazma + 18 QCMD 2011 CMV DNA paneli Toplam 305 örnek CAM ve CTM: kalitatif sonuçların karşılaştırılması* TESTLER CAM Negatif Pozitif TOPLAM Negatif 40 1 41 CTM Pozitif 108 156 264 TOPLAM 148 157 305 *Sonuçlar arasında korelasyon iyi (r=0.878, p<0.001) 30
CMV kgz-pzr: Farklı testlerin karşılaştırılması Akdeniz Üniv. Hastanesi, Ocak- Mart 2013 287 plazma + 18 QCMD 2011 CMV DNA paneli Toplam 305 örnek Ölçülen ortanca değerler CAP/CAM 508 kopya /ml (aralık:0-3720000) CAP/CTM 153 kopya/ml (aralık:0-10000000) Eşdeğer kopya/ml değerleri CAP/CAM CAP/CTM 600 432(393 IU/mL) (duy %74.5, özg %97.5) 1000 557(507 IU/mL) (duy %78.4, özg %97.2) 3000 1590(1447 IU/mL)(duy %81.3, özg %98.3) 31
CMV kgz-pzr: Farklı testlerin karşılaştırılması 57 plazma, böbrek tx hastaları; Laboratuvar tasarımı kgz-pzr Başlangıç volümü 200 µl Hedef pp65 CAP/Cobas TaqMan CMV (CTM) Başlangıç volümü 500 µl Hedef UL54 DSÖ 1.CMV Standardı 5x10 6 IU/mL 5x10 2 IU/mL (beş dilüsyon) 3 farklı çalışma, 2 tekrar 30 28 sonuç 1 kopya/ml 3.8 IU/mL 32 Mannonen L, et al. J Med Virol 2014
CMV kgz-pzr: Farklı testlerin karşılaştırılması 57 plazma, böbrek tx hastaları; LT kgz-pzr: - Standart sonuçları CAP/CTM sonuçlarından daha düşük kopya/ml - Plazma sonuçları CAP/CTM sonuçlarından 1.95 kat daha yüksek kopya/ml - DSÖ 1.CMV Standardı hasta örneklerini yansıtmıyor olabilir - Bu sorun DSÖ 1.CMV standardının hazırlandığı suşla ilgili olb Mannonen L, et al. J Med Virol 2014 33
CMV kgz-pzr Sonuçları: Laboratuvar Bakış Açısı Aynı örnek farklı testlerle farklı sonuçlar verebilir Bildirilen sonuçlar ve cutoff (eşik) değerleri teste spesifiktir, tüm testler için ortak bir eşik değer henüz tanımlanmamıştır. Viral yük düzeyi ve artışların izlenmesi daha anlamlıdır Hastalar hep aynı testle izlenmelidir DSÖ standardı testlerde bir standardizasyon sağlamakla birlikte; özellikle farklı ekstraksiyon yöntem ve cihazlarından kaynaklanan farklılıklar olmaya devam edecektir Kraft CS, et al. Clin Infect Dis 2012 34
CMV kgz-pzr Sonuçları: Laboratuvar Bakış Açısı Kantite edilebilen düşük pozitif düzeylerde test sonuçlarının kesinliği iyi değildir (Değişkenlik 0.5 log10) Viral replikasyonda anlamlı fark var diyebilmek için düşük düzeylerde en az 5 kat, orta düzeylerde en az 3 kat artış olmalıdır Viral yük çok yüksek (>10000 kopya/ml) ya da hasta yüksek riskli grupta olmadıkça ardışık değerler daha yol göstericidir Kraft CS, et al. Clin Infect Dis 2012 35
CMV kgz-pzr Sonuçları: Laboratuvar Bakış Açısı Antiviral tedavi başlandığı gün bazal viral yük mutlaka bilinmelidir Tedavi başlandıktan sonra CMV nin plazmada yarılanma ömrü 3-8 gündür en sık 5-7 günlük aralarla viral yük bakılmalıdır, erken dönemde artış olması direnç göstergesi değildir Tedavi ile viral yük negatifleşmelidir (bir hafta ara ile ardışık iki negatif sonuç). Sürekli artış olması ya da başlangıçta düşmenin ardından yükselmesi antiviral direnci akla getirmelidir Kraft CS, et al. Clin Infect Dis 2012 36
CMV Patogenezinde immünite
T hücre bazlı yöntemler Akış sitometri : Akım hücre ölçer: Flow cytometry (FC) Tetramer bazlı FC Sitokin FC ELISPOT Quantiferon Hücre içi ATP ölçümü
Hücre içi Sitokin boyama akış sitometri Tetramer bazlı akış sitometri HCMV spesifik T hücre yanıtının izlemi Akış sitometri Crough T.Clin Microbiol 2009;22:76-98
CMV immünite geç gelişen grupta : CMV inf.gelişme riski 2.6 X CMVD gelişme riski 6.4 X Fatal komplikasyon gelişme riski 2.4 X Gratama J W et al. Blood 2010;116:1655-1662
Biz ne yaptık,yapıyoruz? CMV spesifik CD4 ve CD8 + T lenfosit ölçümü sitokin akış sitometri- lab.standardizasyon ve validasyonu tamamladık. n:21 böbrek tx 0.,1.,3.,6.aylarda CD4 + IFN-γ T,CD8 + IFN-γ T yanıtı çalıştık ( kontrol n:20)