T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ

T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TEK HÜCREDE REAL TIME PCR İLE BETA TALASEMİ MUTASYONLARININ TANIMLANMASI Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı Genetik Doktora Programı Doktora Tezi Dr. Burak DURMAZ DANIŞMAN Prof. Dr. Ferda ÖZKINAY İZMİR 2009

T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TEK HÜCREDE REAL TIME PCR İLE BETA TALASEMİ MUTASYONLARININ TANIMLANMASI Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı Genetik Doktora Programı Doktora Tezi Dr. Burak DURMAZ DANIŞMAN Prof. Dr. Ferda ÖZKINAY İZMİR 2009

DEĞERLENDİRME KURULU ÜYELERİ (Adı Soyadı) (İmza) Başkan : Prof.Dr. Ferda ÖZKINAY... (Danışman) Üye : Prof.Dr. Erol TAVMERGEN... Üye : Doç. Dr. Özgür ÇOĞULU... Üye : Prof. Dr. Sevgi MİR... Üye : Yrd. Doç. Dr. Elçin BORA... Doktora Tezinin kabul edildiği tarih:...

ÖNSÖZ Doktora eğitimimin her aşamasında desteğini hissettiğim, çalışma azmini her zaman örnek aldığım, tezim boyunca hep yanımda olan, bana olan inancı ve güveni için tez danışmanım Prof. Dr. Ferda ÖZKINAY a, Eğitimimdeki katkıları için, başarı ve sonuca ulaşmada örnek aldığım ve desteğini hiçbir zaman esirgemeyen Sayın Prof. Dr. Cihangir ÖZKINAY a, Doktora eğitimim boyunca, desteğini ve yardımlarını her zaman hissettiğim Sayın Prof. Dr. Sevgi MİR e Çalışmalarım ve doktora eğitimim boyunca sürekli iletişimde olduğumuz, her konuda desteklerinden dolayı Sayın Prof. Dr. Erol TAVMERGEN ve Sayın Prof. Dr. Ege TAVMERGEN GÖKER e, Tez çalışmalarım süresince, yardım ve desteklerini gördüğüm Sayın Prof. Dr. Yeşim AYDINOK a, Araştırma şevki ve bilimsel azmi ile beni motive eden, her çalışmada aynı heyecanı duyabilmemi sağlayan Sayın Doç. Dr. Özgür ÇOĞULU ya, Doktora eğitimim süresince her soruma ve sorunuma soğukkanlılığıyla uygun çözümler bulan Sayın Doç. Dr. Cumhur GÜNDÜZ e, Doktora eğitimime katkıları olan Doç. Dr. Sacide PEHLİVAN a, Eğitimim boyunca bana doğru yolu gösteren, bilgisini sonuna kadar bizlerle paylaşan Sayın Yrd. Doç. Dr. Haluk AKIN a, Doktora eğitimim boyunca ve tezimin moleküler analizleri sırasında desteğini ve dostluğunu her zaman gördüğüm Sayın Yrd. Doç. Dr. Hüseyin ONAY a, I

Her konuda destek ve yardımlarını gördüğüm çok sevgili dostlarım, doktora ve doktor arkadaşlarım, Sayın Yrd. Doç. Dr. Elçin BORA, Sayın Uz. Dr. Tufan ÇANKAYA, Uz. Dr. Emin KARACA, Uz. Dr. Aslıhan EKMEKÇİ, Dr. Ali VAHABİ, Dr. Filiz HAZAN, Dr. Ayça AYKUT, Dr. Erhan PARILTAY, Dr. Özgür KIRBIYIK, Dr. Mehmet AKGÜL, Dr. Esra ATAMAN, Dr. Taha ÖZDEMİR, Dr. Esra ARSLAN ve Dr. Merve SAKA GÜVENÇ e, Tezimin moleküler çalışmalarına çok yardımları olan ve deneyimlerini benimle paylaşan Sayın Dr. Joanne Traeger SYNODINOS ve ekibine, Doktora eğitimim süresince uyumlu bir çalışma ortamının oluşmasını sağlayan Tıbbi Genetik Anabilim Dalı biyolog, teknisyen, sekreter ve diğer çalışanlarına, Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı öğretim üyeleri ve diğer çalışanlarına, Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Aile Planlaması ve Kısırlık Araştırma Merkezi çalışanlarına, Sağlık Bilimleri Ensititüsü nde her türlü destekleri ve yardımları için başta Sayın Melike ÖRK ve Handan ESEN GÖKTEPE olmak üzere tüm çalışanlarına, Maddi desteklerinden dolayı Ege Üniversitesi Araştırma Projeleri Komisyonu na, Doktora eğitimimde olduğu kadar tüm hayatım boyunca desteklerini ve sevgilerini hep hissettiğim, mutluluğumun en büyük kaynağı olan canım aileme ve beni her koşulda kabullenen, her sorunumda ve mutluluğumda yanımda olan en büyük desteğim biricik eşim Asude ye sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Siz olmasaydınız bu tez de olamazdı. İzmir, 2009 M. Burak DURMAZ II

İÇİNDEKİLER İÇİNDEKİLER III ŞEKİLLER DİZİNİ VIII TABLOLAR DİZİNİ XI KISALTMALAR DİZİNİ XIV BÖLÜM I-GİRİŞ 1 1. Giriş ve Amaç 1 1.1. Araştırmanın Konusu 1 1.2. Araştırmanın Amacı 2 1.3. Araştırmanın Önemi 3 2. Genel Bilgiler 5 2.1. Anormal hemoglobinler ve Talasemi Sendromları 5 2.1.1. Hemoglobin Yapısı ve Fonksiyonu 5 2.1.2. Hemoglobinopatiler 7 2.1.2.1. Varyant Hemoglobinler 8 2.1.2.1.1. Orak hücreli anemi (Hemoglobin S) 8 2.1.2.1.2. Hemoglobin C 9 2.1.2.1.3. Hemoglobin E 10 2.1.2.2. Talasemi Sendromları 10 III

2.2. Beta Talasemi ve Klinik Önemi 10 2.2.1. Beta Talasemi Patofizyolojisi 11 2.2.2. β Talasemi Klinik Fenotipleri 12 2.3. Beta Talasemide Genotip-Fenotip İlişkisi 15 2.3.1. Beta Globin Geni 15 2.3.2. Beta Talasemide Klinik Farklılıkların Altındaki Mekanizmalar 16 2.3.2.1. Primer Modifiye Edici Faktörler (Beta talasemi alleleri) 17 2.3.2.2. Sekonder Modifiye Edici Faktörler 18 2.3.2.3. Tersiyer Modifiye Edici Faktörler 19 2.4. Beta Talasemi Mutasyonlarının Epidemiyolojisi 20 2.5. Beta talasemide Moleküler Tanı 24 2.5.1. Moleküler Tanıda Kullanılan Yöntemler 25 2.5.1.1. Beta Globin Strip Assay 25 2.5.1.2. DNA Dizi Analizi 26 2.5.1.3. Real-time PCR 26 2.6. Beta Talasemide Prenatal Tanı 28 2.7 Preimplantasyon Genetik Tanı 30 2.7.1. Preimplantasyon Genetik Tanı Uygulamaları 31 2.7.2. Preimplantasyon Genetik Tanıda (Tek Hücre PCR ında) IV

Karşılaşılan Sorunlar 32 2.7.2.1. DNA nın stabilitesi ve PCR amplifikasyonu 32 2.7.2.2. Kontaminasyon 33 2.7.2.3. Allel dropout (ADO) 34 2.7.3. Preimplantasyon Genetik Tanıda (Tek Hücre PCR ında) Kullanılan Multipleks PCR ve Mikrosatellit Tekrar Dizileri 36 2.7.4. Preimplantasyon Genetik Tanıda (Tek Hücre PCR ında) Kullanılan Bağlantı (Linkaj Analizi) 37 BÖLÜM II-GEREÇ VE YÖNTEM 38 2.1. Olguların seçimi 38 2.2. Çalışmada Kullanılan Kimyasal Malzeme, Tamponlar ve Aletler 39 2.2.1. Periferik Kandan DNA İzolasyonu 39 2.2.2. Periferik Kandan Tek Hücre (lenfosit) Ayrıştırması ve DNA İzolasyonu 39 2.2.3. Nested, Real-time PCR 41 2.2.4. Mikrosatellit Markır Analizi 41 2.2.4.1. Heterozigotluk Araştırması İçin Mikrosatellit Markır Analizi 41 2.2.4.2. Tek Hücre Çalışmasında Kullanılan Mikrosatellit Markır Analizi 42 2.3. Heterozigotluk Araştırması Amaçlı Mikrosatellit Markır Analizi Çalışma Protokolü 43 2.3.1. Periferik Kandan DNA İzolasyonu 43 2.3.2. Mikrosatellit Markır Analizi İçin PCR İşlemi 44 V

2.3.3. Mikrosatellit Markır Analizi Sonuçlarının Görüntülenmesi 47 2.3.4. Allel Frekansı ve Heterozigotluk Oranının Hesaplanması 47 2.4. Periferik Kandan Tek Hücre (Lenfosit) Ayrıştırması ve DNA İzolasyonu Çalışma Protokolü 48 2.4.1. Periferik Kandan Tek Hücre (Lenfosit) Ayrıştırması 49 2.4.2. Tek Hücrede (Lenfosit) PCR işlemi 51 2.5. Nested, Real-time PCR 55 2.6. Tek Hücre Çalışmasında Kullanılan Mikrosatellit Markır Analizi Sonuçlarının Görüntülenmesi 60 2.7. Tek Hücre Analizinde Uygulanan Tüm İşlem Basamaklarının Özeti 62 BÖLÜM III-BULGULAR 63 3.1. Heterozigotluk Araştırması Amacıyla Yapılan Mikrosatellit Markır Analizi Bulguları 63 3.1.1. Çalışma Grubunun Genel Özelliklerinin Karşılaştırılması 63 3.1.2. Mikrosatellit Markır Analizi Sonuçları 64 3.1.3. Mikrosatellit Markır Analizi İstatistik Sonuçları 64 3.2. Periferik Kandan Tek Hücre (Lenfosit) Ayrıştırması, DNA İzolasyonu ve Tek Hücre PCR Sonuçları 66 3.2.1. Çalışma Grubunun Genel Özelliklerinin Karşılaştırılması 66 3.2.2. Tek hücre PCR ve Mikrosatellit Markır Analizi Sonuçları 67 3.2.3. Tek hücre PCR ve Mikrosatellit Markır Analizi Sonuçlarının Değerlendirilmesi 89 VI

BÖLÜM IV- TARTIŞMA 90 BÖLÜM V-SONUÇLAR VE ÖNERİLER 105 BÖLÜM VI- ÖZET-ABSTRACT 106 BÖLÜM VII- YARARLANILAN KAYNAKLAR 108 EKLER 126 ÖZGEÇMİŞ 130 VII

ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 1. Hemoglobin zincirlerinin yapısında bulunan globin zincirleri ve bunları kodlayan gen bölgeleri 6 Şekil 2. Hemoglobin zincirlerinin prenatal ve postnatal dönemdeki sentez yerleri, bu bölgelerde rol alan hücre tipleri ve sentez yüzdeleri 7 Şekil 3. Beta globin gen bölgesi, beta globin yapısı ve mutasyon yerlerine ve sınıflamasına göre genotip-fenotip ilişkisi 15 Şekil 4. Dünyada 1000 canlı doğumda gözlenen major hemoglobinopati sıklıklarının dağılımı 21 Şekil 5. Türkiye de beta talasemi hasta dağılımı 22 Şekil 6. Taşıyıcı taraması ve mutasyon analizi için MCV, MCH, HbA2 ve HbF düzeylerine göre değerlendirme akış şeması 24 Şekil 7. Light cycler çalışma prensibi 28 Şekil 8. Mononükleer hücre elde etmek için kullanılan yöntemin şematik görünümü 50 Şekil 9. Beta globin (HBB) geni şematik görünümü 52 Şekil 10. Light Cycler da kullanılan hibridizasyon probları, kapsadıkları örnek mutasyonlar 58 Şekil 11. Tek hücre analizinde uygulanan tüm işlem basamaklarının özeti 62 VIII

Şekil 12. Mikrosatellit markırların heterozigotluk çalışması amacıyla seçilen 100 olgunun doğum yerleri 64 Şekil 13. Bir olguya ait mikrosatellit markır analizi sonucu 65 Şekil 14. Olgu 1 için D prob seti kullanılarak elde edilen anne, baba ve tek lenfosite ait LC erime eğrisi analizi 68 Şekil 15. Sırasıyla tek lenfositlerden birine ait, anne ve babanın mikrosatellit markır analizi sonuç görüntüsü 69 Şekil 16. Olgu 2 için E prob seti kullanılarak IVSI-110 için yapılan LC erime eğrisi analizi 70 Şekil 17. Olgu 2 için F prob seti kullanılarak CD39 için yapılan LC erime eğrisi analizi 71 Şekil 18. Olgu 3 için C prob seti kullanılarak HbS için yapılan LC erime eğrisi analizi 73 Şekil 19. Olgu 4 için F prob seti kullanılarak CD39 için yapılan LC erime eğrisi analizi 75 Şekil 20. Olgu 5 için E prob seti kullanılarak IVSI-110 için yapılan LC erime eğrisi analizi 77 Şekil 21. Olgu 6 için E prob seti kullanılarak IVSI-110 için yapılan LC erime eğrisi analizi 79 IX

Şekil 22. Olgu 7 için D prob seti kullanılarak IVSI-6 için yapılan LC erime eğrisi analizi 81 Şekil 23. Olgu 8 için B prob seti kullanılarak CD8 için yapılan LC erime eğrisi analizi 83 Şekil 24. Olgu 9 için E prob seti kullanılarak IVSI-110 için yapılan LC erime eğrisi analizi 85 Şekil 25. Olgu 9 için A prob seti kullanılarak IVSII-745 için yapılan LC erime eğrisi analizi 86 Şekil 26. Olgu 10 için G prob seti kullanılarak IVSII-1 için yapılan LC erime eğrisi analizi 87 X

TABLOLAR DİZİNİ Tablo 1. Beta talasemide genotipik ve fenotipik özellikler 14 Tablo 2. Hafif ve sessiz HBB geni mutasyonları 17 Tablo 3. Türkiye de ve dünyada beta talasemi mutasyon görülme sıklıkları (%) 23 Tablo 4. Mikrosatellit markır analizinde kullanılan markırların primer dizileri, PCR ürün büyüklükleri ve tekrar dizileri 45 Tablo 5. PCR işleminde kullanılan malzemeler ve miktarları 46 Tablo 6. Heterozigotluk araştırması amaçlı mikrosatellit markır analizinde kullanılan PCR basamakları 47 Tablo 7. Lizis PCR basamakları 51 Tablo 8. HBB geninin belirli bölgesini çoğaltmak için kullanılan primerlerin dizileri, PCR ürün büyüklükleri 53 Tablo 9. Tek hücre PCR işleminde kullanılan malzemeler ve Miktarları 53 Tablo 10. Tek hücre PCR işlemi PCR basamakları 54 Tablo 11. Nested PCR miksi hazırlanırken kullanılan malzemeler ve miktarları 56 Tablo 12. Nested PCR da kullanılan primerlerin dizileri, PCR ürün büyüklüğü 56 XI

Tablo 13. Light Cycler da kullanılan problar, tarayabildikleri örnek mutasyonlar, prob dizileri, erime ısıları (Tm) ve mutasyon saptamada kullandıkları diziler 57 Tablo 14. LC cihazında kullanılan nested PCR ve mutasyon saptama program koşulları 60 Tablo 15. D11S4891, D13S314, GABRB, D11S2362 mikrosatellit markırları için saptanan alleller, boyutları(s), allel sayıları(n) ve allel frekansları (f) 65 Tablo 16. D11S4891, D13S314, GABRB3, D11S2362 mikrosatellit markırları için saptanan allel sayısı, beklenen ve gözlenen heterozigotluk oranları 66 Tablo 17. Toplam 10 çocuğa ait yaş, mutasyon, ebeveyn mutasyon ve ebeveynlerin akrabalık durumları bilgileri 67 Tablo 18. Olgu 1, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları 69 Tablo 19. Olgu 2, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları 72 Tablo 20. Olgu 3, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları 74 Tablo 21. Olgu 4, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları 76 XII

Tablo 22. Olgu 5, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları 78 Tablo 23. Olgu 6, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları 80 Tablo 24. Olgu 7, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları 82 Tablo 25. Olgu 8, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları 84 Tablo 26. Olgu 9, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları 86 Tablo 27. Olgu 10, hasta çocuk, anne ve babasına ait mikrosatellit 88 markır analizi sonuçları XIII

KISALTMALAR DİZİNİ PGT: Preimplantasyon Genetik Tanı IVF: In Vitro Fertilizasyon PCR: Polimeraz zincir reaksiyonu DNA: Deoksiribonükleik asit HLA: İnsan lökosit antijeni Hb: Hemoglobin ALA: δ-aminolevulinik asit MCV: Mean corpuscular volume LCR: Lokus kontrol bölgesi HBB: Hemoglobin beta (Beta globin geni) UTR: Untranslated region UGT1: UDP-glukuronosiltransferaz MCH: Mean corpuscular hemoglobin dntp: Deoksinükleotid tri-fosfat ddntp: Dideoksinükleotid tri-fosfat RT-PCR: Revers transkriptaz-pcr MCHC: Mean corpuscular hemoglobin concentration ARMS: Amplification refractory mutation system XIV

DGGE: Denaturing gradient gel electrophoresis SSCP: Single strand conformational polymorphism LC: LightCycler FRET: Flouresance Resonance Energy Transfer CVS: Koryon Villus Örneklemesi ICSI: İntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu FISH: Flouresance in situ hybridization ADO: Allel dropout STR: Short tandem repeats XV

BÖLÜM I GİRİŞ 1. GİRİŞ ve AMAÇ 1.1. Araştırmanın konusu Ülkemiz açısından büyük bir sağlık sorunu olan beta talasemi hastalığını Türkiye de yaklaşık 1,5 milyon kişinin taşıdığı bilinmektedir. Taşıyıcı ve hasta bireylerin hasta çocuğa sahip olmamaları için uygulanabilen birçok yöntem bulunmaktadır. Genetik bilimindeki hızlı ilerlemeler sayesinde artık birçok kalıtsal hastalığın, embriyo döneminde tanısı konulabilmektedir. Sadece sağlıklı embriyoların seçilerek anneye transfer edildiği bu yönteme Preimplantasyon Genetik Tanı (PGT) adı verilmektedir. Bu teknik, genetik hastalıklı çocuk dünyaya getirme riski bulunan ve doğal yolla gebeliğin ilerleyen dönemlerinde invaziv prenatal tanı yöntemleriyle hastalıklı bir fetus nedeniyle gebeliği sonlandırma durumunda kalmak istemeyen çiftler ve gebeliğin sonlandılmasını dini, etik veya psikolojik nedenlerle istemeyen aileler için yeni bir alternatif haline gelmiştir. Bu amaçla, çiftler öncelikle tüp bebek tedavisi programına alınır. Anneden alınan yumurta hücreleri ile babadan alınan sperm hücreleri laboratuvar ortamında döllenir (IVF=In Vitro Fertilizasyon). Döllenmeyi takiben normal gelişim gösteren embriyolar 3. günde 7 8 hücreli aşamaya ulaştığında, 1 ya da 2 blastomer hücresi, her bir embriyodan biyopsi yapılarak alınır ve genetik analiz ile hastalığın embriyoda olup olmadığı belirlenebilir. Embriyo biyopsi yapılarak alınan blastomer, içerisinde eritme solüsyonu bulunan PCR tüplerine aktarılır. Bu yolla serbest kalan DNA daki hastalığın bulunduğu bölge özel dizayn edilmiş primerler kullanılarak tek hücre PCR ı

dediğimiz bir dizi enzimatik reaksiyon ile milyonlarca kopya halinde çoğaltılır. Bu işlemi takiben mutasyon analiziyle sağlıklı veya hastalıklı embriyolar ayırt edilebilir. DNA izolasyonu ve PCR tek hücre çalışmasının en önemli ve en hassas aşamalarıdır. Bu analizler sırasında tüm diğer laboratuvar işlemlerinden arındırılmış ayrı bir oda ve sadece bu işlemler için ayrılmış cihaz ve ekipmanların kullanılması büyük önem taşımaktadır. PGT ve diğer tek hücre PCR ında en önemli zorluk, tek hücre ile çalışma için yüksek beceri ve teknoloji gerektirmesidir. Yaklaşık 5 pg kadar çok az DNA içeren tek bir hücreden multipleks PCR yapmak ve mutasyonları tespit etmek zordur. Bunun için teknik, rutin uygulamaya geçmek için standardize edilmeden önce genomik DNA, dilüe edilmiş genomik DNA ve tek lenfositlerle çalışmak uygun olacaktır. Bu aşamada, anne ve baba mutasyonlarının bilinmesi, tek hücre kaynağından (lenfosit veya blastomer) elde edilen sonuçlarla karşılaştırılması bakımından çok önemlidir. 1.2. Araştırmanın Amacı Bu çalışma ile rutin tanısal PGT çalışmalarına temel oluşturmak üzere beta talasemi mutasyonu önceden bilinen bireylerden elde edilecek lenfositlerden tek hücrede multipleks PCR işlemi yapılarak real time PCR - Light Cycler ile mutasyon analizinin uygulanabilirliğinin test edilmesi amaçlanmıştır. Ayrıca testin güvenilirliğini arttırmak, olası kontaminasyonu görüntülemek ve allel dropout gibi istenmeyen durumları yakalamak amacıyla gen içi ve gen dışı toplam 4 adet mikrosatellit markırın kullanılması planlanmıştır. Bu markırları tek hücre PCR ında kullanmadan önce Türk populasyonundan oluşan 100 bireyde çalışılması ve heterozigotluk oranlarının hesaplanması ve bu konuda literatüre 2

katkıda bulunulması amaçlanmıştır. Bu çalışmanın sonuçlarına göre, tek lenfosit PCR işlemininde standardizasyon sağlandıktan sonra ileride planlanabilecek olan embriyonun genetik yapısının transfer öncesi belirlenebilmesi ve diğer tüm tek hücre çalışmalarına ışık tutması hedeflenmiştir. 1.3. Araştırmanın Önemi Türkiye de beta talasemi, kalıtsal hastalıklar içerisinde en sık gözlenen ve ülkemiz açısından taşıyıcılık oranı yüksek olan bir hastalıktır. Otozomal resesif bir kalıtım gösterdiği için akraba evliliklerin %25 düzeylerinde olduğu ülkemizde bu hastalığın önemi daha da artmaktadır. Talasemi taşıyıcısı olan çiftler, fetusun hasta olma riski açısından amniyosentez veya koryon villus biyopsisi gibi prenatal tanı yöntemlerine başvurabilmektedir. Bu uygulamalar, oluşmuş bir gebeliğin 3. veya 4. ayında yapılmakta ve sonuçlar ileri gebelik haftalarında elde edilmektedir. Etkilenmiş bir bebeğin tanımlanması, gebeliği sonlandırma ile sonuçlanabilmekte, bu durum ailede fiziksel ve psikolojik travmalara yol açmaktadır. PGT henüz gebelik oluşmadan, implantasyon öncesi embriyolarda genetik hastalıkların tanımlanmasını sağlayan bir yöntem olduğundan dolayı dünyada ve ülkemizde dikkat çekmektedir. Özellikle gelişmiş ülkelerde bu yöne doğru bir eğilim mevcuttur ve 100 den fazla tek gen hastalığı için PGT uygulanabilmektedir. Konunun bilimsel alandaki popülerliği de gün geçtikçe artmaktadır. Talasemi hastalığı saptanmış çocuklara sahip ailelerde, PGT ile talasemi tanısı yanında fetusta HLA (human leukocyte antigen) doku tiplerinin belirlenmesiyle doku tipi hasta çocuk ile uygun olanlar seçilebilmekte ve hasta çocuğa tedavi olanağı doğabilmektedir. PGT yöntemiyle aile, prenatal tanı işlemi sonrasında uygulanan gebelik sonlandırılmasına bağlı tıbbi ve psikolojik 3

travmalardan korunacaktır. Ayrıca gebelik öncesi tanı, hasta kişilerin yaşam boyu karşılaştıkları sağlık problemleri, hastalıkların tedavisindeki güçlükler ve yüksek tedavi maliyetleri nedeniyle ailelerin sağlıklı çocuk sahibi olmalarını sağlaması ve hasta kişiler için tedavi olanağı sunması yönleriyle önemlidir. Ülkemizde, özellikle üniversitelerde PGT ve tek hücre PCR çalışmaları oldukça kısıtlıdır. Light cycler cihazını kullanarak tek hücrede real time PCR ile tanı çalışmaları ülkemizde bulunmamaktadır. Bu çalışma, tek hücre PCR işlemi için multipleks ve daha sonra nested PCR işlemlerinin uygulanabilirliğinin test edilmesi bakımından önemlidir. Ayrıca bu çalışmada, Türk populasyonu açısından anlamlılık oranı yüksek mikrosatellit markırların saptanması da planlanmıştır. Bunlardan 2 tanesi beta talasemi geni ile bağlı, 2 tanesi gen dışı bölgeden (beta talasemi geni ile bağlı olmayan) seçildi. Kullanılacak olan markırlar ile ilgili Türk popülasyonunda yapılmış olan herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışma ile seçilen markırların Türk popülsyonundaki heterozigotluk oranları hakkında bilgi sahibi olunacak ve ileride yapılacak olan talasemi ve bu çalışma dışı çalışmalarda bu markırların kullanılabilirliği açısından bir kaynak teşkil edecektir. Bu çalışmayla birlikte beta talasemi hastalığıyla bir adım atılmış olacak, tek hücre izolasyonu ve PCR işlemlerinin test edilebilirliği saptandıktan sonra diğer tek gen hastalıklarının da çalışılabilmesi ve blastomer düzeyinde ileri çalışmaların uygulanabilmesi mümkün olacaktır. 4

2. GENEL BİLGİLER 2.1. Anormal Hemoglobinler ve Talasemi Sendromları 2.1.1. Hemoglobin Yapısı ve Fonksiyonu Hemoglobin (Hb), eritrositlerde bulunan temel oksijen taşıyıcı moleküldür. Arteriyel dolaşımda hemoglobin, oksijen için yüksek affinite gösterirken karbondioksit, organik fosfatlar, hidrojen ve klorid iyonları için düşük afinite gösterir. Venöz dolaşımda ise tam tersi bir afinite göstermektedir (2). Hemoglobinin iki komponenti bulunmaktadır; protein zinciri (globin) ve hem molekülü. Polipeptit tetramer yapısında bulunur ve 2 çift globin zincirinden oluşur (2). Her bir globin zinciri ise bir polipeptid zincir ve bir hem grubu taşıyan 4 subunitten oluşmuştur. Yetişkin hemoglobinin polipeptid zincirleri uzunluk olarak aynı fakat aminoasit dizileri bakımından ayrı alfa ve beta olmak üzere iki çeşittir. Tüm hemoglobinlerin embriyonik ve yetişkin dönemde alfa zincirleri aynıdır. Alfa dışı zincirler normal erişkin hemoglobinin beta zinciri, fetal hemoglobinin gamma zinciri ve HbA 2 nin delta zinciri olarak adlandırılır. Hemoglobinin yapısı embriyonel gelişim sürecinde değişikliğe uğramaktadır (3, 4). Hemoglobin çeşitleri olarak HbA (α 2 β 2 ), HbA 2 (α 2 δ 2 ), HbF (α 2 γ 2 ), Hb Portland (ζ 2 γ 2 ), Hb Gower 1 ( ζ 2 ε 2 ), Hb Gower 2 (α 2 ε 2 ) sayılabilir (Şekil 1). 5

Kromozom 16 Kromozom 11 ζ α α ε γ γ δ β ζ 2 ε 2 α 2 γ 2 α 2 β 2 α 2 δ 2 Hb Gower 1 HbF HbA HbA 2 Embriyonik Fetal Yetişkin Şekil 1. Hemoglobin zincirlerinin yapısında bulunan globin zincirleri ve bunları kodlayan gen bölgeleri (5) Sağlıklı bir bireyde yaklaşık %95 oranında HbA, %3-4 oranında HbA 2 ve %1-2 oranında HbF bulunmaktadır. Embriyonik ve fetal dönemlerde ise Hb Portland ve Hb Gower bulunmaktadır (2) İntrauterin dönemde ilk olarak 8. haftaya kadar Hb Gower-1 (ζ 2 ε 2 ), Gower-2 (α 2 ε 2 ) ve Portland (ζ 2 γ 2 ) görülür, daha sonra 9. haftadan itibaren HbF (α 2 γ 2 ) tüm fetal dönemde temel hemoglobin olarak bulunur. Doğumdan hemen önce gama zincir üretimi kaybolmaya başlar ve 6-9 aydan sonra %2 nin altında bulunur (6). Yetişkin dönemdeki temel hemoglobin olan HbA (α 2 β 2 ) gestasyonel dönemde 1. aydan itibaren görülmeye başlar ve doğumda %30, 10. haftada %50, ve 25-30. haftalarda yetişkin düzeyi olan %95 seviyelerine ulaşır. Yetişkin dönemde görülen diğer bir hemoglobin olan HbA 2 (α 2 δ 2 ) ise doğumdan sonra görülmeye başlar ve tüm yetişkinlik döneminde %1,5 3,5 seviyelerinde bulunur (Şekil 2). 6

Hücre tipi Megaloblast Makrosit Normosit Eritropoezin yeri Karaciğer Kemik iliği Yolk sac Dalak Toplam globin sentez yüzdesi Prenatal dönem (hafta) Doğum Postnatal dönem (hafta) Şekil 2. Hemoglobin zincirlerinin prenatal ve postnatal dönemdeki sentez yerleri, bu bölgelerde rol alan hücre tipleri ve sentez yüzdeleri (7) Hem, Fe +2 atomu içeren protoporfirin yapısında bir moleküldür. Mitokondride süksinil CoA ve glisinden ilk olarak ALA sentetaz aracılığı ile δ- aminolevulinik asit (ALA) oluşur. Porfobilinojen halindeyken sitoplazmaya geçer ve koproporfirinojen halinde mitokondride sentez devam eder ve burada tamamlanır (8). Oksijen her bir hem grubundaki ferröz atomuna geri dönüşümlü olarak bağlanır. Parsiyel oksijen basıncı 100 mmhg olduğunda kırmızı hücrelerdeki hemoglobin oksijen ile tamamen doymuş durumdadır (1). 2.1.2. Hemoglobinopatiler Hemoglobinopatiler, hemoglobinin protein komponenti olan globin zincirinde anormal yapıya veya zincir sentezinde bozukluğa neden olan kalıtsal hastalık grubuna verilen isimdir. Tüm dünyada gözlenen en sık genetik bozukluktur (9). Hemoglobinin tetramer yapısındaki kalıtsal anomaliler, globin 7

zincirindeki yapısal anomaliler (varyant hemoglobinler) ve hemoglobin molekülünün polipeptid zincirlerinden bir veya birden fazlasının sentezini azaltan veya tamamen yok eden moleküler defektler (talasemiler) şeklinde ikiye ayrılır (5). 2.1.2.1. Varyant hemoglobinler 2.1.2.1.1. Orak hücreli anemi (Hemoglobin S) Tüm dünyada gözlenen en sık hemoglobin kalitatif değişikliğidir. Afrika nın bazı bölgelerinde toplumun %10-40 ı taşıyıcı olarak bilinmektedir. Malaryanın endemik olduğu bölgelerde malaryaya karşı koruyucu olduğundan daha sık gözlenir. Hemoglobin S, beta globin geninde 6. pozisyonda glutamik asidin yerine valin geçmesi ile oluşur (10). Deoksijene hemoglobin S uzun katı yapılar şeklinde polimerize olup hücreye orak benzeri görünüm verir. Hemoglobinin deoksijene olmasına yol açan hipoksi, asidoz ve artmış ısıda oraklaşma artar. HbS polimerizasyonu geri dönüşümlüdür; reoksijenizasyon gerçekleştiğinde oraklaşmış hücreler normal şekline döner. Heterozigot HbS olan bireyler genellikle asemptomatiktir. Aşırı hipoksik, asidik ve hiperozmolar çevreye bağlı renal medulla harabiyeti ile mikroskobik hematüri, splenik infarktlar ve ani ölüm görülebilir. Homozigot HbS olan bireylerde hastalığın kliniği aynı aile içinde içinde bile değişiklik göstermektedir. Genellikle 3-4 aylık iken bulgu verirler, o döneme kadar yüksek HbF seviyeleri koruyucu olmaktadır. Yüksek HbF seviyeleri hastalık kliniğini hafiflettiğinden bazı bireylerde yetişkin döneme kadar bulgu vermeyebilir. Ağrılı akut vazookluziv krizler, 3-4 yaşlarında ortaya çıkan sekestrasyon krizleri ve aplastik krizler temel bulgulardır. Enfeksiyonlar, 8

serebrovasküler komplikasyonlar, priapizm, safra kesesi taşları, retinopati gibi komplikasyonlar da görülebilir (10). Başka bir beta globin mutasyonu ile birlikte bileşik heterozigot olan bireyler genellikle semptomatiktir ve homozigot orak hücreli anemi bulguları verirler. HbS ve HbC ile bileşik heterozigot olan bireyler homozigot HbS olan bireylere göre daha hafif klinik bulgu verirler ve retinopatiye eğilim gösterirler; uzun kemik infarktları ve gebelik dönemi komplikasyonlar sıktır. Hafif splenomegali, enfeksiyonlara yatkınlık, hafif anemi görülmektedir. HbS/β + olan bireylerde az da olsa β globin zincir üretimi olduğundan daha hafif klinik gözlenirken HbS/β 0 olan bireylerde hiç β globin zincir üretimi olmadığından homozigot HbS benzeri bulgular gözlenmektedir. Beraberinde α talasemi olması hücre içi HbS seviyelerini azalttığından kliniği hafifletir. HbS ile etkileşime giren HbF düzyeni artıran nedenler (herediter persistan HbF ve bazı ilaçlar) de kliniği hafifletir (11). 2.1.2.1.2. Hemoglobin C HbC tüm dünyada en sık görülen üçüncü hemoglobin kalitatif değişikliğidir. En sık Afrika nın batısında olmak üzere bu bölgede %2-3 lük heterozigotluk oranı bulunmaktadır. Hemoglobin C, β globin zincirinde 6. pozisyonda glutamik asit yerine lizin geçmesi ile oluşur. Hemoglobin S gibi deoksijene olduğunda polimerize olur. Heterozigot HbC hastaları klinik olarak bulgu vermez. Homozigot HbC hastaları da asemptomatiktir, hafif mikrtositik anemi dışında bulgu vermezler (12). 9

2.1.2.1.3. Hemoglobin E Tüm dünyada görülen 2. en sık hemoglobin kalitatif değişikliğidir. En sık güneydoğu Asya da görülmektedir. Hemoglobin E, β globin zincirinde 26. pozisyonda glutamik asit yerine lizin geçmesi ile oluşmaktadır (13). Heterozigot HbE klinik olarak sessizdir. Hafif mikrositoz görülür. Homozigot HbE olan bireylerde belirgin mikrositoz (MCV-mean corpuscular volume: 55-65 fl), hipokromi görülür. Hemoglobin seviyeleri normal veya hafif azalmıştır. HbE nin klinik önemi β talasemi ile birlikteliğinde ortaya çıkmaktadır. Talasemi major gibi klinik oluşturabildiğinden dolayı önemlidir (14). Selüloz asetat elektorforezde alkalin ph da hemoglobin C ile hareket eder, ayırt etmek için asidik ph da sitrat agar elektroforezinde yürütülmelidir. 2.1.2.2. Talasemi Sendromları Talasemi sendromları bir veya daha fazla globin zincirinde yetersiz sentez veya sentez edilememe durumu ile karakterize kalıtsal geniş bir hastalık grubudur. Etkilenmiş globin zincir veya zincirlerine bağlı olarak α, β, γ, δβ, δ ve εγδβ talasemi olarak adlandırılır. 2.2. Beta talasemi ve Klinik Önemi Avrupalı klinisyenler 20. yy başlarında yenidoğan döneminde dalak büyüklüğü ile giden anemi sendromunu tanımlamışlardır (15). Talaseminin ilk klinik tanımlanması ise pediatrist Thomas B. Cooley ve Pearl Lee tarafından yapılmıştır (16). Talasemi terimi ise George Whipple tarafından konmuştur (17, 18). 10

2.2.1. Beta Talasemi Patofizyolojisi Beta talasemi, yapısal olarak normal beta globin zincirinde kantitatif azalma meydana geldiği zaman oluşur (19). Beta zincir üretiminin hepsinde defekt varsa β 0 talasemi, parsiyal defekt varsa β + talasemi olarak adlandırılır (20). Beta talasemide normal alfa globin zincir üretimi normal şekilde devam ederek eritroid prekürsörlerde aşırı alfa globin birikimi oluşmaktadır. Normal bireylerde β:α oranı 0,9:1,1 olarak bulunurken beta talaseminin ağır formlarında 0-0,35 oranlarında bulunmaktadır. Üretilemeyen beta zinciri yerine gama zincir sentezi ve HbF üretilmeye çalışılır ancak gama zincirleri ortamdaki tüm alfa zincirlerini bağlamada yetersiz kalır ve alfa zincirleri hücrede çöker. Eritrositlerde hemoglobin alt üniteleri miktarı artarak oksidasyon ile süperoksit ve hidrojen radikalleri gibi serbest oksijen radikalleri, methemoglobinler ve hemikromlar oluşur. Serbest alfa globin zincirleri tetramer yapısı oluşturamadığından kemik iliğinde kırmızı hücre prekürsörlerinde Heinz body olarak adlandırılan inklüzyon cisimleri şeklinde çökerler. Eritroid prekürsörlerin intramedüller yıkımından ve böylece beta talasemilerde gelişen yetersiz eritropoezden sorumludurlar (21). Tüm bu olaylar sonucunda gelişen inefektif eritropoez anemiye, eritropoetinin aşırı üretimine ve kemik iliğinin aşırı genişlemesine yol açar. Eritropoetik kemik iliği aktivitesinin artması sonucu osteopeni, osteoporoz, kemik hipertrofisi, yüz ve kafatası kemiklerinde deformiteler gibi iskelet anomalileri gözlenir. 11

2.2.2. β Talasemi Klinik Fenotipleri Beta talasemideki temel sorun, eritrositlerde defektif beta globin zincir sentezi ve alfa globin zincir birikimidir. Biriken zincirler kırmızı hücre prekürsörlerinde çöker ve anormal hücre maturasyonuna ve kemik iliğinde prematür yıkıma yol açar. Beta talaseminin klinik spekturumu globin zincir dengesizliğinin derecesine göre değişiklik göstermektedir (22). En ciddi klinik spekturum, HbA nın komplet yokluğu ile karakterize β 0 talasemi olarak adlandırılır (19). Klinik ve laboratuvar bulguları mutasyona ve beraberindeki alfa talasemi durumuna göre değişiklik göstermektedir. Tüm bulgular Tablo 1 de özetlenmiştir (19, 23, 24). Beta talasemi major, homozigot veya bileşik heterozigot şeklinde her iki beta globin zincirini kodlayan gende defekt sonucu oluşur ve genellikle hayatın ilk dönemlerinde kendini belli eden ciddi anemi ile karakterizedir. Beta globin zincirlerinde defekt, periferik kanda veya kemik iliğinde aşırı alfa globin zincirlerinin çökmesi sonucu oluşan hasarlar klinikten sorumludur. Ciddi anemi normalde gama zincir üretiminin azaldığı 3 6. aylarda kendini belli eder. Aneminin nedeni olarak yetersiz eritropoez, periferik kırmızı kan hücrelerinde hemoliz ve progresif splenomegali belirtilmektedir (19). Progresif splenomegali sonucunda plazma hacminde artış ve total kırmızı kan hücrelerinde azalma meydana gelir. Etkisiz eritropoezin sonucu oluşan kemik iliğinde hipertrofi, iskelet değişikliklerine yol açarken değişken derecelerde hepatosplenomegali de görülmektedir. Üretimi yetersiz olan beta globin zincirinin yerine aşırı üretilen gamma ve alfa zincirleri ile oluşan HbF seviyelerinde artış görülür. HbA 2 seviyeleri hastanın genotipine göre %0 6 arasında değişir. Retikülosit seviyeleri 12

genellikle %1 in altındadır. Ciddi anemi (Hb: 3-5g/dL) görülmektedir. Eritrositlerde anizokromi ile birlikte MCV<70 fl olan mikrositoz ve kemik iliğinde belirgin eritroid hiperplazi görülür. Serum ferritin seviyelerinde ise artış vardır. Çocuklarda ve genç erişkinlerde uzun kemiklerde incelme ve kemik iliği boşluklarında genişleme radyolojik anomaliler olarak kendini belli eder. Maksiller sinüslerde genişleme gibi karakteristik yüz görünümleri vardır. Kafatasındaki değişiklikler kulak, burun ve boğazda enfeksiyonlara yatkınlığa yol açar. Kronik anemi ve demir yüklenmesi sonucu hastaların yaşı ilerledikçe hipopituatirizm, hipotirodizm, hipoparatirodizm, diabetes mellitus, kardiyomyopati, testiküler ve overyan yetmezlik görülebilmektedir (25, 26). β talasemi intermedia: Daha hafif beta globin gen mutasyonları sonucu oluşan klinik tanımlamadır. Talasemi major ile minor arasında bir klinik verir. Birçok olgu hafif β + talasemi alleli için homozigot veya hafif β + ve ciddi β + alleli için bileşik heterozigot durumdadır. İntermedia ile major fenotipleri değişkenlik göstermektedir. Özellikle 2 α globin zincirinde yetersiz üretim varsa beklenenden daha hafif bir klinik gözlenebileceğinden prognozu önceden öngörebilmek zordur. Güneydoğu Asya da sık gözlenen HbE, homozigotlarda hafif anemi tablosu yaparken HbE/beta talasemi hiç semptom vermeyen durumdan tranfüzyon bağımlı kliniğe kadar varabilen fenotipik değişiklikler gösterebilmektedir (27). β talasemi minor: Hemoglobin (Hb: 9-12 g/dl) ve MCV (65-75fL) seviyelerinde azalma vardır. Hafif anemi dışında bulgu vermez. 13

Tablo 1. Beta talasemide genotipik ve fenotipik özellikler Klinik sınıf Genotip Özellik Talasemi minor B talasemi trait β/β 0 Sessiz taşıyıcı δβ-talasemi trait β/(δβ) 0 veya + Azalmış MCV, artmış HbA 2, hafiforta anemi Talasemi intermedia β +Africa Talasemi β +Africa /β +Africa Talasemi minordan daha belirgin α + ve β 0 talasemi -α/-α/β/β 0 Heterozigot β 0 -Talasemi major (yüksek HbF ile birlikte) β 0 /β 0 yüksek HbF üretimi ile birlikte Belirgin mikrositoz ve hipokromi 0 veya +/Lepore (δβ) homozigot (δ/β) 0 veya +/Lepore / (δβ) 0 veya +/Lepore Artmış HbA 2, prognoz ileri yaşlarda belirginleşir, transfüzyon ihtiyacı olmayan ılımlı anemi, splenomegali yok Talasemi major β 0 - Talasemi major β 0 /β 0 Cooley anemisi β 0 /hemoglobin E β 0 /β E hücreler, çekirdekli eritrositler, artmış Azalmış MCV, hipokrom, hedef HbF 14

2.3. Beta Talasemide Genotip-Fenotip İlişkisi 2.3.1. Beta Globin Geni Beta globin, 11p15.4 de lokalize diğer beta benzeri genlerle 70 kb lık bölgede bulunan yapısal bir gen tarafından kodlanmaktadır. Bölgede gelişimin farklı dönemlerinde eksprese olan 5 -ε G γ Α γ ψβ-δ β 3 olarak adlandırılan 5 adet fonksiyonel gen bulunmaktadır (7) (Şekil 3). βlcr β gen kümesi 3 HSI Anlamsız ve çerçeve kayması mutasyonları (β 0 ) Promotor bölge mutasyonları (β + ) İntron yapışma yerlerini etkileyen mutasyonlar (β 0 ve β + ) Promotor Transkripsiyonu etkileyen mutasyonlar (β + ) Translasyonun başlamasını etkileyen mutasyonlar (β 0 ) RNA kesim mutasyonları (β + ) Şekil 3. Beta globin gen bölgesi, beta globin yapısı ve mutasyon yerlerine ve sınıflamasına göre genotip-fenotip ilişkisi (28) Beta globin (HBB) geni 1600 bp uzunluğunda ve 146 aminoasidi kodlayan 3 ekzon ve 2 introndan oluşan bir gendir (28, 29). Ekzon 2, hem bağlayan ve 15

heterodimer formasyonundan sorumlu bölge iken ekzon 1 ve 3 beta globin zincirinin non-hem bağlayıcı bölgesini oluşturmaktadır. Genin fonksiyonunda önemli korunmuş bölgeler 5 promotor bölgesi, ekzon-intron birleşme yerleri ve 3 UTR (Untranslated region) bölgesidir. 2.3.2. Beta Talasemi Klinik Farklıkların Altındaki Mekanizmalar Beta talasemi aşırı değişken klinik spekturum göstermektedir. Her iki allelde mutasyon taşımasına rağmen hastalar arasında ciddi klinik farklılıklar gözlenebilmektedir. Homozigot veya bileşik heterozigot durumdaki hastaların en uç bulgu veren kısmında hayatın ilk yıllarında derin anemi bulguları ile giden ve ilk yıllarda kaybedilen olgular var iken major formundan daha hafif geçiren veya tesadüfen rutin kan sayımları sırasında tespit edilen olgular da bulunur. Aynı farklılıklar hetrozigot bireylerde de görülür. Klasik heterozigot olgularda hafif anemi gözlenirken hiçbir bulgu vermeyen hastaların yanında major formu kadar ağır bulgu veren otozomal dominant kalıtıma uyan hastalara da rastlanır (30). Hastalardaki belirgin klinik varyasyonun altında genetik ve çevresel faktörler birlikte rol almaktadır. Genetik faktörlerin bazıları direk olarak beta globin zincir sentezindeki temel defektler iken bazıları ise beta globinden ziyade hastalığın değişik komplikasyonlarını etkileyen faktörlerdir. Bu nedenle genetik modifiye edici faktörleri primer olarak beta globin zincirindeki mutasyonlar, sekonder olarak globin zincir sentezinde yer alan faktörler ve tersiyer olarak globin zincir sentezinde değil komplikasyonların gelişmesini etkileyen faktörler olarak sınıflandırılabilir (7). 16

2.3.2.1. Primer Modifiye Edici Faktörler (Beta Talasemi Alleleri) Beta talasemi hastalarında 200 den fazla mutasyon tariflenmiştir (31). Az miktarda görülen delesyonların dışında genellikle gen fonksiyonunu transkripsiyonel, translasyonel veya post-translasyonel seviyelerde etkileyen nokta mutasyonları görülmektedir (Tablo 2). Mutasyonlar sonucu hiç beta globin zinciri üretilemezse β 0 talasemi, beta zincirinde azalma belirgin ise β + veya hafif bir azalma varsa β ++ talasemi olarak adlandırılır. Tablo 2. Hafif ve sessiz HBB geni mutasyonları Hafif Beta Talasemi Mutasyonları Sessiz Beta Talasemi Mutasyonları -90 C>T 30 T>A CD 27 G>T Knossos 92 C>T -88 C>A 30 T>C IVS1 6 T>C 101 C>T 88 C>T 29 A>G 3 UTR 47 C>G 5 UTR +10 T 87 C>A 28 A>G PolyA AATAAA>AACAAA 5 UTR +33 C>G 87 C>G 5 UTR +22 PolyA G>A AATAAA>AATUAA IVS2 844 C>G 87 C>T CD 19 A>G PolyA Malay AATAAA>AATAGA CAP +1 A>C 86 C>G CD 24 T>A PolyA AATAAA>AATAAC 3 UTR +6 C>G 31 A>G CD 26 G>A (Hb E) 101 C>T Daha sonra anlatılacağı üzere β 0 talasemiler her zaman olmamakla beraber ciddi bir fenotiple ilişkilidir. β + ve β ++ talasemilerde ise klinik, β globin zincirlerindeki etkilerine göre değişiklik göstermektedir. 17

Bazı β talasemi mutasyonları sessiz mutasyonlar olarak adlandırılır. Taşıyıcılarda herhangi bir klinik bulgu vermezler; genellikle talasemi intermedia hastalarının anne ve babaları taranırken saptanır. Akdeniz toplumunda sık gözlenen -101 C>T mutasyonu dışında pek sık olarak görülmezler. Ciddi beta talasemi mutasyonları ile birlikteliklerinde hafif talasemi intermedia şeklinde klinik verirler (32). Hafif beta talasemi mutasyonları çoğunlukla β globin geninin promotor veya polya bölgesinde, bazen de ekzonların yapışma bölgeleri veya intronların ortak bölgelerinde bulunur (31). Klinik olarak heterozigotlarda hafif tanımlanabilen kırmızı hücre değişikliklerine, homozigotlarda ise intermedia benzeri bulgulara yol açar. Ciddi beta talasemi mutasyonları ile birlikteliklerinde ise transfüzyon bağımlı bozukluklara veya intermediadan daha ağır bulgulara yol açar. Hafif beta talasemi mutasyonlarından en sık olarak Afrika populasyonunda promotor bölge mutasyonları, Akdeniz bölgesinde IVSI-6 (T>C) ve güneydoğu Asya ve Hindistan da sık olarak gözlenen HbE ye yol açan CD26 (G>A) sayılabilir (33). 2.3.2.2. Sekonder Modifiye Edici Faktörler Aynı beta globin geni mutasyonunu taşımasına rağmen farklı klinik bulgulara sahip olan olguların bulunmasından dolayı beta talasemi kliniğinde mutasyonların dışında etkili başka faktörlerin de olduğu düşünülmüştür (34). Beta zincir üretimi defektine bağlı alfa zincirinin aşırı birikimi ile oluşan bozukluklar nedeni ile alfa zincirinin klinik üzerine önemi bulunmaktadır. Alfa ve gama globin genlerindeki varyasyonların kliniği etkilediği tespit edilmiştir. 18

Birikimi sonucu hasar oluşturan alfa globin zincirinde defekt bulunması homozigot veya bileşik heterozigot β 0 kliniğini hafifletmektedir (35, 36). Alfa globin geninde delesyonlar sonucu alfa zincir üretimin azalması ile klinik hafiflerken alfa globin zincir üretimini arttıran gen triplikasyonları veya quadriplikasyonları aşırı alfa zincir birikimine yol açıp beta talasemi taşıyıcılarında bile intermediaya varan klinik ağırlaşmaya neden olmaktadırlar (37). Beta globindeki yetersiz üretim sonucu ortamdaki artan alfa zinciri ile gamma zinciri kompleks oluşturup HbF meydana getirmektedir. Beta talasemide HbF seviyelerini etkileyen faktörler ile talasemi kliniği arasında ilişki bulunmaktadır. 2.3.2.3. Tersiyer Modifiye Edici Faktörler Beta talasemi major hastalarında eritrositlerdeki hızlı döngü ve hem ürünlerinin hızlı yıkımı ile ağır klinik bulgu gösterenlerde sarılık ve safra kesesi taşı görülme sıklığı artmıştır. Beta talasemi minor olanlarda biluribin seviyelerini biluribinin hepatik glukuronidasyonununda görevli UDP-glukuronosiltransferaz (UGT1) deki promotor bölge polimorfizminin etkilediği gösterilmiştir. Beta talasemi minor olgularında (TA) 7 TAA polimorfizmine sahip olanlarda hiperbiluribinemi ve safra kesesi taşı görülme sıklığı artmış olarak tespit edilmiştir (38). Transfüzyona ve bağırsaktan artmış emilime bağlı gelişen aşırı demir yükü sonucu kalp ve karaciğer hastalıkları ile diabet gibi komplikasyonlar 19

görülmektedir. Demir birikimi ile sonuçlanan hemokromatozisten sorumlu HFE genindeki değişiklikler beta talasemi minor ve major hastalarındaki aşırı demir birikimi ile ilişkilendirilmiştir (39). Beta talasemi major hastalarında sık görülen sorunlardan biri olan osteoporoz, hipotalamik-pitüer aksın demir birikimine bağlı hasarlanması sonucu oluşan sekonder hipogonadizm nedeni ile oluşmaktadır. Bu komplikasyonun kemik metabolizmasında etkili vitamin D reseptör, kollajen ve östrojen reseptörlerindeki polimorfizmler ile modifiye edildiği düşünülmektedir (40-42). 2.4. Beta Talasemi Mutasyonlarının Epidemiyolojisi Dünyadaki en yaygın tek gen hastalığı olan beta talasemi hastalığı için Dünya Sağlık Örgütü anormal hemoglobin sıklığını %5,1 olarak ve beta talasemi taşıyıcı sıklığını ise 266 milyon olarak bildirmiştir (43). Tüm dünyada klinik olarak bulgu veren 15 milyon talasemik bozukluk taşıyan kişi olduğu tahmin edilmektedir. En sık Yunanistan, İtalya, İspanya gibi Akdeniz ülkelerinde gözlenmektedir. Kıbrıs ta 1/7 oranında taşınmaktadır ve beta talasemi major taşıyan yenidoğan oranı 1/158 olarak belirtilmektedir (Şekil 4). 20

Şekil 4. Dünyada 1000 canlı doğumda gözlenen major hemoglobinopati sıklıklarının dağılımı Türkiye de beta talasemi taşıyıcılığı Çukurova, Akdeniz kıyı şeridi, Ege ve Marmara bölgelerinde sık görülmektedir. Sağlıklı Türk popülasyonunda beta talasemi taşıyıcı sıklığı %2,1 olarak bildirilmiştir (44). Türkiye de yaklaşık 1.300.000 kişi taşıyıcı ve 4000 civarında hasta olduğu belirtilmektedir. Ülkemizdeki beta talasemi hasta dağılımı şekil 5 te verilmiştir. Son 5 yılda Sağlık Bakanlığı nca talaseminin sık görüldüğü 16 merkezde yapılan taramaların sonucuna göre bu bölgelerde taşıyıcılık ortalaması %4,3 olarak belirlenmiştir (45). Yapılan çalışmalarda %22 gebelikte risk belirlemeye ihtiyaç olacağı hesaplanmıştır (46). Aynı literatürde beta talasemi olma olasılığını 1000 konsepsiyonda 0,24, tüm hemogobinopatiler için ise aynı oran 0,41 olarak bildirilmiştir. Bu oranlar nüfusa uygulandığında yılda 28.000 riskli gebelik 21

olasılığı ortaya çıkmaktadır. Taşıyıcılığın ve gebelik oranının bu kadar yüksek olduğu ülkemizde talasemi eradikasyonu için yeni yöntemler uygulanması zorunluluğu ortaya çıkmaktadır. Şekil 5. Türkiye de beta talasemi hasta dağılımı Türkiye de hemoglobinopatilerden en sık olarak %73 talasemi major, %23 orak hücreli anemi ve %4 HbH hastalığı gözlenmektedir. Talasemi major ve intermedia mutasyonlarından en yaygın olarak IVSI-110 (G>A) %41 sıklıkta görülmektedir. Daha sonra sırasıyla %10,3 sıklıkta IVSI-6 (T>C), %8,1 sıklıkta IVSII-1 (G>A), %6,2 sıklıkta IVSII-745 (C>G), %5,7 sıklıkta IVSI-1 (G>A), %4,7 sıklıkta Codon 8 (-AA), %4,2 sıklıkta -30 (T/A), %2,6 sıklıkta Codon 39 (C>T), %2,6 sıklıkta Codon 8/9 ve %1,8 sıklıkta Codon 44 mutasyonları gelmektedir. 22

Tüm bu 10 mutasyon toplam mutasyonların %87,2 sini kapsamaktadır (47). En sık gözlenen IVSI-110 Türkiye genelinde %40 oranında gözlenirken orta Anadolu da %50 den daha sık, Doğu ve Güneydoğu Anadolu da ise %25 den az oranda görülmektedir (48). Türk populasyonunda ve dünyadaki talaseminin sık görüldüğü toplumardaki mutasyon dağılım oranları Tablo 3 de verilmiştir (49). Tablo 3. Türkiye de ve dünyada beta talasemi mutasyon görülme sıklıkları (%) Akdeniz Asya ABD Mutasyon İtalya Yunanistan Türkiye Pakistan Hindistan Çin Tayland Afrikan- Amerikan -88 (C>T) 0,8 21,4-87 (C>G) 0,4 1,8 1,2-30 (T>A) 2,5-29 (A>G) 1,9 60,3-28 (A>G) 11,6 4,9 CAP+1 (A>C) 1,7 CD5 (-CT) 1,2 0,8 CD6 (-A) 0,4 2,9 0,6 CD8 (-AA) 0,6 7,4 CD8/9 (+G) 28,9 12,0 CD15 (G>A) 3,5 0,8 0,8 CD16 (-C) 1,3 1,7 CD17 (A>T) 10,5 24,7 CD24 (T>A) 7,9 CD30 (G>A) 0,9 CD30 (G>C) 3,5 0,9 CD39(C>T) 40,1 17,4 3,5 CD41/42 (-TCTT) 7,9 13,7 38,6 46,4 CD71/72 (+A) 12,4 2,3 IVSI-1 (G>A) 4,3 13,6 2,5 IVSI-1 (G>T) 8,2 6,6 IVSI-5 (G>C) 26,4 48,5 2,5 4,9 IVSI-6 (T>C) 16,3 7,4 17,4 IVSI-110 (G>A) 29,8 43,7 41,9 IVSII-1 (G>A) 1,1 2,1 9,7 IVSII-654 (C>T) 15,7 8,9 IVSII-745 (C>G) 3,5 7,1 2,7 619 bp delesyon 23,3 13,3 Diğer 4,1 2,2 9,7 0,5 0,9 6,8 7,9 10,6 23

2.5. Beta Talasemide Moleküler Tanı Modifiye edici faktörler tarafından etkilenmesi göz önüne alınarak değerlendirilmesine rağmen kabaca talasemi mutasyon taraması tam kan sayımında MCV, MCH, MCHC ve hemoglobin elektroforezi gibi değerlere bakılarak planlanmaktadır. Talasemide moleküler tanı için akış şeması Şekil 6 da verilmiştir (49). PCR temelli teknolojilerin gelişimi ile hızlı, kesin ve güvenli sonuçlar elde edilebilmektedir. Tam kan sayımı + Elektroforez MCV fl: MCH pg: HbA > 78 >27 <%3 < 78 <27 < 78 <27 < 78 <27 Varyant hemoglobin HbA2 HbF >%3,5 %0,1-7 >%3,5 >%3 %2-30 Oraklaşma testi Normal B Talasemi taşıyıcılığı Demir düzeyi Kantitatif HbF F hücre dağılımı Oraklaşma pozitif Oraklaşma negatif Sık mutasyonlar için DNA analizi Düşük Normal DNA analizi HbS Doğrulama Tanımlanmamış mutasyonların belirlenmesi Demir eksikliğini düzelt α talasemi taşıyıcısı α globin gen analizi β gen analizi δβ Talasemi veya HPFH Hb C, D, E, O Arab, Lepore Diğer DNA analizi δ+β talasemi taşıyıcılığı δβ-talasemi taşıyıcılığı Şekil 6. Taşıyıcı taraması ve mutasyon analizi için MCV, MCH, HbA2 ve HbF düzeylerine göre değerlendirme akış şeması 24

2.5.1. Moleküler Tanıda Kullanılan Yöntemler Talasemi hastalığının veya taşıyıcılığının kesin tanısı ancak son yıllarda yeni teknolojilerin gelişmi ile mümkün hale gelen DNA düzeyinde moleküler genetik incelemeler sonucu konabilmektedir. DNA elde edilebilen her durumda bilinen veya bilinmeyen mutasyonların tespitinde farklı yöntemler kullanılabilmektedir. Bilinen mutasyonları taramak için ARMS (amplification refractory mutation system), heterodupleks analizi, restriksiyon enzim analizi, dot-blot analizi, reverse dot-blot analizi (beta globin strip assay), real-time PCR gibi yöntemler uygulanabilirken, bilinmeyen mutasyonların tespitinde DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis), SSCP (single strand conformational polymorphism), DNA dizi analizi gibi yöntemler kullanılabilmektedir (23, 50-52). 2.5.1.1. Beta Globin Strip Assay DNA ürünlerinin PCR ile çoğaltıldıktan sonra membrana sabitleştirilmiş olignükleotid probları ile hibridizasyonu temeli ile gerçekleştirilmektedir. En sık gözlenen Akdeniz ülkelerine spesifik 22 adet mutasyonu kapsamaktadır. Taranan mutasyonlar (-87 (C>G), -30 (T>A), Cd5 (-CT), HbC, HbS, Cd6 (-A), Cd8 (-AA), Cd8/9 (+G), Cd22 (-7bp), Cd30 (G>C), IVSI-1 (G>A), IVSI-2 (T>A), IVSI-5(G>C), IVSI-6 (T>C), IVSI-110 (G>A), IVSI-116 (T>G), IVSI-25 (-25 bp), Cd 36,37 (-T), Cd39 (C>T), Cd44 (-C), IVSII-1 (G>A), IVSII-745 (C>G) ) Türkiye deki talasemi olgularının %84-90 ını kapsamaktadır (53). 25

2.5.1.2. DNA Dizi Analizi Mutasyon belirleme işleminde günümüzde altın standart olan yöntemdir. Dideoksi sonlanma metodu geliştirilmesi ile hızla kullanıma giren sekanslama işlemi, bilinmeyen mutasyonların taranmasında hızlı ve güvenli bir yöntem haline gelmiştir. dntp ve farklı 33P ile işaretli ddntp (DNA uzamasında gerekli 3 -OH grubu olmayan) karışımı içeren PCR da farklı floresan renkli ddntp ile sonlanmış farklı uzunluktaki PCR ürünleri otomatize dizi analizi cihazlarında analiz edilmektedir. Non-radyoaktif, tek tüpte gerçekleşen, hızlı, kesin ve güvenilir bir yöntem olarak belirtilmektedir (54). 2.5.1.3. Real-time PCR Son yılllarda PCR reaksiyonlarında sıcaklık döngüleri sağlamak için kullanılan cihazların (thermocycler) hassaslaşması ve floresan ışıma tekniklerinin de gelişimi ile kinetik revers transkriptaz-pcr (RT-PCR) geliştirilmiştir. Bu sayede, gen kopya ürünlerinin düzeylerini sayısal değerlerle ölçmek, devam eden PCR reaksiyonunu ekranda izleyerek Real Time (eşzamanlı) olarak reaksiyonun gidişine müdahale etmek ve PCR döngülerinin sayısıyla oynayabilmek mümkündür. Birçok adlandırmayla anılan bu teknolojiye floresan okuma yapması nedeniyle literatürde Floresan Kantitatif RT-PCR, Kantitatif-kinetik PCR gibi çeşitli adlar altında rastlamak mümkündür. Gerçek zamanlı PCR reaksiyonu, bir reaksiyonda polimorfik DNA bölgelerinin kantifikasyonunun ve tek nükleotid polimorfizm genotiplendirilmelerinin yapılabildiği bir yöntem olarak özetlenebilir (55). Başlıca gen ekspresyonunun kantitasyonu, viral kantitasyon, patojenlerin tespiti, mikrosatellit instabilitesi 26

tespiti, metilasyon analizi, kemik iliği transplantasyonu sonrası kimerizm analizi, anne kanından izole edilen tek hücrede prenatal tanı, hemoglobinopatilerin prenatal tanısı gibi alanlarda kullanılmaktadır (52, 56-62). LightCycler (LC) (Roche) cihazı ile genotipleme çalışmaları için ilgili gen bölgesine özgün primerlerin yanında testin özgüllüğünü arttırmak amacıyla esas hedefe yönelik floresan boyalarla işaretlenen diziye özgü oligonükleotid hibridizasyon probları kullanılmaktadır. Bu problar DNA zincirine baş ve kuyruk pozisyonunda hibridize olacak şekilde dizayn edilmiştirler ve DNA zincirindeki polimorfik bölgeyi örten sensor hibridizasyon probu ile bu proba yakın bir bölgeye bağlanan anchor problardan oluşmaktadır (Şekil 7-A). Denatürasyon aşamasında, hibridizasyon probları solüsyon içerisinde birbirinden bağımsız olarak durmaktadırlar. Bu problar, amplifikasyon süresi boyunca ise hedef DNA bölgesi üzerinde birbirine 1-5 nükleotid uzaklıktaki mesafede bağlanırlar. Floresan boya ile işaretlenmiş olan uçlar yan yana gelmektedir. LC cihazının ışık kaynağından yayılan 470 nm deki mavi ışık, fluorescein ile işaretlenmiş olan sensor probunu uyararak daha uzun dalga boyundaki (530 nm) yeşil floresan ışığın yayılmasına neden olmaktadır. İki floresan boya ile işaretlenmiş olan probların yan yana gelmesiyle açığa çıkan enerji, ikinci prob üzerindeki alıcı boyayı etkileyerek floresans oluşumuna yol açmakta ve yeşil ışığın enerjisi LC Red 640 boyası içinde farklı bir dalga boyundaki (640 nm) kırmızı floresan ışığın yayılmasına neden olmaktadır. İki prob arasında meydana gelen bu enerji transferi, Fluoresance Resonance Energy Transfer (FRET) olarak adlandırılmaktadır. Bu enerji transferi sonucunda oluşan floresans miktarı, ortamdaki hibridizasyonun derecesine diğer bir ifadeyle PCR siklusu süresince oluşan amplikonların miktarına bağlı olarak artmaktadır. LC cihazının optikle 27

ilgili birimi olan F2 kanalı, 640 nm deki kırmızı ışığın yoğunluğunu ölçmektedir. Ölçüm, ışımanın maksimum olduğu bağlanma (annealing) fazı sonunda yapılabilmektedir (Şekil 7-B). Annealing fazından sonra, sıcaklık artar ve hibridizasyon probları başlayan uzama (elongation) aşaması sırasında amplikondan ayrılırlar (Şekil 7-C). Uzama aşamasından sonra oluşan amplikonlar çift iplikli olduklarından hibridizasyon probları ile hibridize olamazlar. Bu durumda, iki prob birbirlerinden uzakta ve serbest halde oldukları için FRET gerçekleşemez (Şekil 7-D) (63). Şekil 7. Light cycler çalışma prensibi 2.6. Beta Talasemide Prenatal Tanı Hemoglobinopatilerden ilk kez prenatal tanı, fetal fibroblastlardan elde edilen DNA ile alfa talasemide yapılmıştır (64). Gebelik haftasına göre amniyosentez, kordosentez veya koryonik villüs materyalinden elde edilecek fetusa ait DNA ile talasemi açısından yukarıda bahsedilen yöntemlerin biri kullanılarak moleküler analiz yapılabilmektedir. Mutasyon analizi sırasında elde edilen DNA nın anneye değil fetusa ait olduğu mutlaka doğrulanmalıdır. 28

a) Amniyosentez Gebeliğin 16-20. haftalarında ultrasonografi eşliğinde transabdominal olarak, amniyotik sıvıdan örnek alma işlemidir. Erken amniyosentezde daha çok ekstraembriyonik doku hücreleri bulunurken, 17-18. haftadan sonra fetal epidermis, gastrointestinal sistem ve üriner sisteme ait hücreler ile fetal membranlara ait hücreler baskındır. Gebeliğin 15-18. haftaları arasında yaklaşık 250-350 ml amniyotik sıvı bulunmaktadır ve buradan elde edilecek 1 ml gibi az bir miktardan DNA izolasyonu yapılıp uygun moleküler analiz yöntemleri kullanılabilmeketedir. İşleme bağlı olarak oluşabilecek gebelik kayıp oranı % 0,5-1 arasında bildirilmektedir (65). b) Koryon Villus Örneklemesi (CVS) Gebeliğin 9-12. haftalarında ultrasonografi eşliğinde transservikal veya transabdominal kateter aracılığıyla koryon villuslardan parça alınarak yapılan işlemdir. CVS sonrası fetal kayıp riskinin amniyosenteze oranla daha yüksek olduğu bildirilse de 11-13. haftalar arasında spontan fetal kayıp riskinin amniyosentez haftalarındakine göre daha yüksek olduğu göz önüne alındığında arada anlamlı bir fark gözlenmemektedir (66). CVS den elde edilen materyalde, en dış kısımda hormonal olarak aktif sinsityotrofoblast, ortada sitotrofoblast ve merkezde fetal kaynaklı kapiller dokular olmak üzere 3 doku bulunmaktadır. Prenatal tanıda kullanılanlar, merkezde bulunan fetal mezenkimal dokulardır. CVS ile alınan örnekler mikroskop altında fetal ve maternal hücreler birbirlerinden ayrılır, DNA izolasyonu sonrasında mutasyon analiz yöntemlerinden uygun olanları kullanılmaktadır. 29

c) Kordosentez Gebeliğin 18-20. haftaları arasında ultrasonografi eşliğinde fetustan kord kanı alma işlemidir. Alınan fetal kan örneğinin anne kanı ile kontamine olup olmadığının anlaşılması için kan sayımı ve Kleihauer Betke testi ile kanın fetal kan olduğu gösterilmelidir. Mutasyon analizi için kolon kromatografisi, in vitro hemoglobin sentezi gibi yöntemler kullanılabilmekle beraber fetal DNA kullanılarak uygulanan moleküler genetik testler hem yöntem kolaylığı hem de doğruluk bakımından tercih edilmektedir (66). d) Maternal Kanda Fetal DNA Fetal DNA nın maternal plazmadan veya serumdan elde etme yöntemidir (67). Noninvaziv bir yöntem olarak bilinen bu teknik henüz çalışma aşamasındadır ve rutin tanı amaçlı kullanılmamaktadır. İleriki yıllar için büyük umut taşıyan bu yöntemde, PCR sırasında maternal kontaminasyon ve diğer DNA amplifikasyonunlarını önlemek amacıyla sınırlı sayıda PCR siklusu önerilmektedir (68). 2.7. Preimplantasyon Genetik Tanı Günümüzde aileler, birçok kromozomal ve tek gen hastalıklarında gebelik döneminde prenatal tanı ile saptanan etkilenmiş bir fetusun sonlandırılacağı gebelik yerine gebelik oluşmadan tanı imkanı veren PGT yöntemini tercih edebilmektedirler (52). Esas amacı genetik olarak bir hastalık açısından etkilenmemiş embriyonun tespiti ve uterusa transferi olan PGT, in vitro fertilizasyon (IVF) veya intrasitoplazmik sperm injeksiyonu (ICSI) sonrası 30

oluşmuş embriyonun 3. gününde alınan blastomerinden veya oositin mayozdaki ilerlemesi sonucu oluşan birinci ve/veya ikinci polar cisimden veya blastokistinin trofoektoderm hücrelerinden yapılan PCR veya FISH (Flouresance in situ hybridization) temelli genetik analize dayanmaktadır (69). Hastaya ve hastalığa göre bu yöntemlerden biri veya birkaçı uygulanabilmektedir. Baba kaynaklı anomaliler polar body analizi ile gözden kaçabilirken ovumdaki mayotik hatalardan kaynaklanan mozaisizmler ve/veya uniparental dizomiler embriyo biyopsisi ile gözden kaçabilmektedir. Bu nedenle tek, çift veya bazen üçlü biyopsi kesin tanı için gerekli olabilmektedir (70). 2.7.1 Preimplantasyon Genetik Tanı Uygulamaları PCR ın tek hücrede kullanılabileceğin ilk olarak gösterilmesinden sonra, preklinik ve klinik PGT testleri uygulanmaya başlandı (71). İlk olarak PCR temelli PGT, X e bağlı hastalık tanısında kullanılmıştır ancak daha sonraları birçok tek gen hastalığının tespitinde uygulanmıştır (72, 73). Cinsiyet tayini embriyodan tek bir blastomer alınıp Y kromozomuna spesifik primerler kullanılarak yapılan PCR amplifikasyonu ile gerçekleştirilmiştir. Ancak amplifikasyon başarısızlığını XX cinsiyet olarak değerlendirip yanlış tanı verildiğinde tek primer seti ile PCR yönteminin güvenilirliği tartışma konusu olmuştur (74). Daha birçok çalışmada benzer sorunlarla karşılaşılmasının ardından çözüm olarak bağlı polimorfik markırlar kullanılarak yapılan multipleks PCR geliştirilmiştir. Günümüzde PGT işlemleri tek hücre düzeyinde gerek kromozomal gerekse de gen düzeyinde başarılı olarak uygulanmaktadır. Prenatal tanıya 31

alternatif olarak değerlendirilmektedir (75). PGT endikasyonları arasında ileri anne yaşı, tek gen hastalığı, yapısal kromozomal anomali taşıyıcılığı, tekrarlayan yardımcı üreme tekniklerinde başarısızlık, tekrarlayan düşük öyküsü, non obstrüktif azospermi, dengeli translokasyon taşıyıcılığı sayılmaktadır. PGT nin amaçları arasında spontan abortusların azaltılması, implantasyon oranlarının arttırılması, çoklu gebeliklerin ve dondurulmuş embriyoların azaltılması sayılabilir. Sorunlar 2.7.2. Preimplantasyon Genetik Tanıda (Tek Hücre PCR ında) Karşılaşılan 2.7.2.1. DNA nın stabilitesi ve PCR amplifikasyonu Tek hücre ile tanıya ulaşılması ve bu tanının embriyonunun canlılığını kaybetmeden konması gerektiğinden her aşamada birçok sorunla karşılaşılabilmektedir. Başarılı bir tek hücre PCR ı için ilk koşul, hücrenin DNA kalıbının PCR a uygun olması ve DNA zincirinin primer bağlanma ve primerler arası bölgelerinden kırılmamış olması gerekmektedir. Tek hücre PCR ı için yapılan embriyo biyopsisi de DNA amplifikasyon başarısı açısından önemlidir. En önemli noktalardan bir tanesi, biyopsi sırasında hücrenin parçalanmasını (lizis) engellemektir. Hücre parçalanmış olup nukleus görünür halde bile tüpe alınmasına rağmen amplifikasyon başarısında ciddi sorunlar yaşandığı belirtilmiştir. Hücrenin alındıktan sonra kullanılan lizis protoklünün de amplifikasyonu etkilediği gösterilmiştir (76, 77). İyi bir morfolojye sahip ve görünür halde nukleusu olan bir emriyodan alınan blastomerdeki amplifikasyon başarısı %90 ın üzerindedir. Ancak arrested, fragmante, nukleusu tam 32

seçilemeyen bir embriyodan alınan blastomerin amplifikasyon başarısı daha düşük olacaktır (78, 79). 2.7.2.2. Kontaminasyon Tek bir hücrenin DNA konsantrasyonunun çok düşük olması (~ 5 pg) PCR daki temel sorunlardan birisidir. Bu nedenle başarılı bir PCR işlemi için fazla amplifikasyon siklusuna ihtiyaç duyulmaktadır. Siklus sayısı arttıkça Taq polimeraz daha fazla yere bağlanmaya başlayıp nonspesifik bağlanmalar oluşturmakta ve kontaminasyon riskini arttırmaktadır. Kontaminasyon, oositi çevreleyen kümülüs hücrelerinden anne kaynaklı veya fertilizasyonu takiben zona pellusidada gömülü kalmış spermden ötürü baba kaynaklı olabileceğinden oositler kümülüs hücrelerinden tamamen temizlenmeli ve oosit fertilizasyonu için IVF yerine ICSI önerilmektedir (80-82). Parental kaynak dışında laboratuvar ortamı da bir diğer kontaminasyon kaynağıdır. Özellikle önceden amplifiye olmuş DNA fragmanlarının ortamda bulunması büyük tehlike teşkil etmektedir. Bu nedenle biyopsi ve PCR işlemlerinin yapıldığı yerler izole, steril ve kendine özgü ekipmaları olan laboratuvar bölgeleri olmalıdır ve o bölgede kullanılan malzemeler kesinlikle oda dışına çıkartılmamalıdır. Filtrasyon, UV ışık dekontaminasyona yardımcı olmakla beraber kesinlikle ilk basamak çözümler olarak değerlendirilmemelidir. Ayrıca, tüm PCR ajanlarının klinik vaka öncesi test edilmesi hem işlemin başarısını test etmek hem de kontaminasyonu gözlemlemek açısından önemlidir. PCR ın özgüllüğünü arttıran ve kontaminasyon riskini azaltan bir strateji, nested PCR olarak bilinmektedir (83). İlk turda dış primerler ile yapılan bir amplifikasyon, ikinci turda ise ilk turda elde 33

edilen ürün kalıp olarak kullanılarak iç primerler ile yeniden PCR uygulama işlemidir. İkinci amplifikasyonda daha dar bir bölge, daha yüksek kopya sayısında çoğaltılmaktadır. İlk siklusta bir kontaminasyon olmuş olsa dahi ikinci reaksiyonda, bu bölge yeni iç primerler nedeniyle çoğaltılamamaktadır. Kontaminasyonu aşmanın bir diğer yolu da ek hipervariabl DNA fragmanlarının amplifikasyonudur (84). Gen dışı bağlı olmayan (unlinked) veya bağlı (linked) mikrosatellit markırların kullanılması kontaminasyonun ekarte edilmesi amacıyla önemlidir. 2.7.2.3. Allel dropout (ADO) PCR temelli PGT de karşılaşılan bir başka sorun, tek hücrede parental allelerden sadece birinin amplifiye olması diğerinin olamaması allel dropout (ADO) olarak adlandırılmaktadır (85). Heterozigot bir hücrede, her 2 allel de eşit oranda etkilenebilir ve bunun önceden bilinmesi olanaksızdır. Yanlış tanıya yol açacağından, PCR başarısızlığı gibi sorunlara göre daha tehlikelidir. Özellikle normal olarak sonuçlandırılan dominant hastalıklarda ve taşıyıcı olarak sonuçlanan bileşik heterozigotluk durumlarında yanlış tanı açısından çok önemlidir. ADO, tek hücre reksiyonlarının %30 undan fazlasını etkilediğne dair yayınlar bulunsa da genel olarak insidansı %10-20 olarak verilmektedir (80, 86-88). Yüksek ADO oranı nedeniyle bazı gruplar aynı embriyodan 2 hücrenin analizini yapmaktadırlar. ADO nun tam olarak nedeni aydınlatılamamış olmasına rağmen, hücre lizis metodu ve tam başarılamayan lizis, uygunsuz PCR koşulları, hedef DNA dizisi, PCR ürününün boyutu gibi PCR etkinliğini düzenleyen birçok faktör suçlanmıştır (89-91). Bir çalışmada, denatürasyon 34

ısısının 90 0 C den 96 0 C ye çıkartılmasıyla ADO oranında kistik fibrozis lokusunda 4 kat, beta globin lokusunda 11 kat azalma tespit edilmiş (91). Alkali bir lizis tamponu veya proteinaz-k içeren bir lizis solüsyonunun da ADO yu azaltmada etkili oldukları belirtilmiştir (91, 92). Dejenere olmaya başlayan hücrelerdeki ADO oranlarının artması, DNA nın degradasyonu ile ilişkili olabileceğini ortaya koymuştur. Ayrıca ADO oranları hücre tipine göre de değişiklik göstermektedir. Bazı çalışmalarda, blastomerlerdeki ADO oranlarının diğer tek hücrelere göre çok daha fazla olduğu bildirilmiştir (87). ADO eradikasyonunda kullanılan yöntemlerin başında multipleks PCR olarak adlandırılan hastalığa neden olan gen civarında bulunan bir veya daha fazla bağlı (linked) polimorfik markırın aynı anda amplifikasyonudur. Multipleks PCR ilk kez denendiğinde 4 lokus tek bir PCR ile çoğaltılımıştı. Bir markır mutasyon için 4 markır ise bağlı veya bağlı olmayan markırlardan oluşmaktaydı. Mutasyon için kullanılan markıra ek olarak bir bağlı markır kullanıldığında ADO ya bağlı yanlış tanı riskinin en azından yarı yarıya azaldığını hesaplamışlar. Aynı araştırmacılar CFTR geninin ekzon 10 u için ADO oranını %33,3 intron 6 da bağlı bir markırın ise %20,4 olarak bulmuşlardır. İkisi birlikte çalışılarak hesaplandığında ise %13,9 olarak bulmuşlardır (87). ADO, aynı reaksiyonda gerçekleşen her bir amplifikasyonda aynı anda gerçekleşemeyeceğinden dolayı multipleks PCR güvenli bir yöntem olarak belirtilmektedir (93). Son yıllarda hem ADO yu hem PCR başarısızlığını hem de kontaminasyonu önlemek ve tespit etmek amacıyla multipleks PCR ile birlikte floresan PCR ın kullanıldığı platformlarda analizler gerçekleştirilmektedir (94). 35

2.7.3. Preimplantasyon Genetik Tanıda (Tek Hücre PCR ında) Kullanılan Multipleks PCR ve Mikrosatellit Tekrar Dizileri Birbiriyle ilişkili olmayan primer setleri kullanılarak tek bir PCR reaksiyonunda birçok bölgeyi çoğaltma işlemine multipleks PCR adı verilmektedir (95). PCR koşulları iyi optimize edilirse 15 kadar lokusun aynı anda çoğaltılabileceği gösterilmiştir (96). Tek bir hücre için de, uygun koşullar sağlandığı takdirde benzer amplifikasyon sayılarına ulaşabilmek mümkün olabilir. PCR sonrası yakın büyüklükteki ürünlerin ayrımı önceden problem iken günümüzde floresan PCR ile çözüme kavuşmuş oldu. Primerler, farklı renklerdeki floresan boyalarla işaretlenebilmekte ve aynı büyüklükteki PCR ürünleri bile kolayca ayırt edilebilmektedir. Tek hücre PCR ında yanlış tanıya neden olan allel dropout ve kontaminasyonu ekarte etmek amacıyla kısa tekrar dizileri (STR) içeren markırlar kullanılarak multipleks floresan PCR uygulanmaya başlanmıştır. Bu amaçla, bağlı veya bağlı olmayan markırlar kullanılmaktadır (97, 98). Anne ve babanın o lokus için 4 farklı allele sahip olması, incelenen hücrenin de aynı lokus için 2 farklı allele sahip olması istenir. İncelenen hücrede başka, ek bir allelin olması kontaminasyonu işaret edecektir (99). İkiden fazla parental allel varlığında ise kontaminasyon dışında anöploidi veya uniparental dizomi de akla gelmelidir (100). Kümülüs hücresi tarafından oluşan kontaminasyonda, maternal alleller dışında bir de paternal allel gözlenecektir. ADO tespitinde ise bağlı markırların kullanılması gerekmektedir. Bu, ayrıca kontaminasyonu tespit etmek için de kullanılabilir. Bağlı markırın allelleri mutasyonla beraber kalıtılacaktır, böylece ADO, elde edilen sonuçlara göre 36

değerlendirilmektedir. Bazı markırları çoğaltmak zordur ve elektroforez sonrasında stutter adı verilen istenmeyen ek DNA fragmanları oluşturabilmektedirler. Trinükleotid veya tetranükleotid tekrar dizilerinin kullanılması, standardize edilmiş hazır PCR ajanlarının kullanılması bu sorunları azaltacaktır. 2.7.4. Preimplantasyon Genetik Tanıda (Tek Hücre PCR ında) Kullanılan Bağlantı (Linkaj Analizi) Mutasyon analizi ve bağlı markır analizlerini birleştirip bir PCR protokolü oluşturmak, özellikle çok sayıda mutasyon bulunan hastalıklarda zor olabilmektedir. Böyle durumlarda mutasyonu doğrudan tespit etmek yerine polimorfik markırlar kullanarak mutasyonla beraber kalıtılan haplotipi tespit etmek bazı gruplar tarafından benimsenmiştir. Hastalık lokusu ile yakın ilişkide olan herhangi bir informatif polimorfizmin varlığı, mutasyonun olup olmadığının tespitinde kullanılabilmektedir. Gen içi veya gene çok yakın durumdaki markırlar bu amaçla seçilmektedir. Bu markırların, mayoz sırasında rekombinasyonla mutasyondan ayrılma olasılığı bulunmamaktadır. Bu işlemin dezavantajı ise hangi polimorfik varyantın mutasyonla birlikte kalıtıldığının gösterilebildiği bir aile çalışması gerektirmesidir. Bağlantı analizi, otozomal dominant hastalıklar arasından ilk kez Marfan sendromu için uygulanmıştır. Bu çalışmada, fibrillin geni ile bağlı dinükleotid polimorfizminin kaltımı incelenmiştir (101). Daha sonra birçok hastalık için bu yöntem başarıyla uygulanmıştır. 37

BÖLÜM II GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. Olguların Seçimi Mikrosatellit markırların heterozigotluk oranlarını hesaplamak için 2009 yılında Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik Anabilim Dalı na başvuran olgulardan, akraba olmadığı bilinen rastgele 100 olgu (50 erkek, 50 kadın) seçildi. Bu olguların cinsiyetleri, doğum yerleri ve yaşları kaydedildi. Tek hücre çalışmaları kapsamında olgular, 2007 2009 yılları arasında, önceden fetusta beta talasemi riski için prenatal tanı amacıyla Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik Anabilim Dalı na başvurmuş olan çiftler arasından seçildi. Tek hücre çalışmasına, bir çocuklarında talasemi taşıyıcılığı olan 7 çift, bir çocuklarında talasemi taşıyıcılığı ve diğer çocuklarında talasemi hastalığı olan 2 çift ve bir çocuklarında talasemi hastalığı bileşik heterozigot şeklinde gözlenen 1 çift olmak üzere çocuklarla beraber toplam 32 birey dahil edildi. Çalışma protokolü, Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Araştırma Etik Kurulu tarafından 04.05.2009 tarihli ve 09-2.1/4 sayılı karar ile onaylanmıştır. Çalışmaya katılanlar Gönüllü Olur Formunu nu imzalayarak çalışmaya katılmayı kabul etmişlerdir. Çalışmanın ekonomik desteği Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu tarafından sağlanmıştır. 38

2.2. Çalışmada Kullanılan Kimyasal Malzeme, Tamponlar ve Aletler 2.2.1. Periferik Kandan DNA İzolasyonu 1. İnvisorb spin blood kit (INVITEK) Filtreli tüpler Receiver tüpler Eppendorf tüpleri Proteinaz K Lysis buffer A Binding buffer B6 Wash buffer I ve II Elution buffer D 2. Etanol (%95 99) 3. Otomatik pipetler (1 10 µl ve 10 100 µl, Eppendorf) 4. Steril sarı ve beyaz pipet uçları (Brand) 5. 1,5 ml lik Eppendorf tüpleri (Axygen) 6. Eppendorf tüp taşıyıcıları 7. Vorteks (Heidolph Reaks Top) 8. Santrifüj (Sigma 1 15) 9. Thermomikser (Eppendorf AG) 10. Eldiven 2.2.2. Periferik Kandan Tek Hücre (lenfosit) Ayrıştırması ve DNA İzolasyonu 1. Laminar flow (Heraus) 39

2. Alev kaynağı 3. Steril cam pastör pipetler 4. Ağız pipeti 5. Inverted Mikroskop (Olympus CK 40) 6. PCR Grade distile su (Roche) 7. Steril petri kapları (Greiner bio-one) 8. Steril 15 ml lik falkon tüpler (Greiner bio-one) 9. Histopaque 1083 (Sigma) 10. Proteinaz K, rekombinant, PCR Grade (Roche) 11. -20 C derin dondurucu 12. Steril NaCl 13. 0,2-0,5-1,5 ml lik Eppendorf tüpleri (Axygen) 14. FastStart High Fidelity PCR System, dntpack (Roche) Enzim miks MgCl 2 içeren 10x konsantrasyonlu reaksiyon miksi DMSO Nükleotid miks 15. Otomatik pipetler (1 10 µl ve 10 100 µl, Eppendorf) 16. UV lambalı, PCR kabini (Thermo Holten) 17. Steril sarı ve beyaz pipet uçları (Brand) 18. Vorteks (Heidolph Reaks Top) 19. Santrifüj (Sigma 1 15) 20. Thermomikser (Eppendorf AG) 21. Thermal Cycler (Techne) 22. Beta globin geni ve mikrosatellit markırlar için primerler (TIB MOLBIOL) 40

23. Pudrasız eldiven 2.2.3. Nested, Real-time PCR 1. Light Cycler (Roche) 2. Light Cycler kapillerleri (Roche) 3. Light Cycler Faststart DNA Master HybProbe (Roche) Enzim miks MgCl 2 PCR Grade distile su 4. Mutasyona özgü nested primerler ve light cycler probları (TIB MOLBIOL) 5. Otomatik pipetler (1 10 µl ve 10 100 µl, Eppendorf) 6. 0,2-0,5-1,5 ml lik Eppendorf tüpleri (Axygen) 7. UV lambalı, PCR kabini (Thermo Holten) 8. Steril sarı ve beyaz pipet uçları (Brand) 9. Vorteks (Heidolph Reaks Top) 10. Santrifüj (Sigma 1 15) 11. Pudrasız eldiven 2.2.4. Mikrosatellit Markır Analizi 2.2.4.1 Heterozigotluk Araştırması İçin Mikrosatellit Markır Analizi 1. Taq polimeraz (Fermentas) 2. 10x Buffer (Fermentas) 3. MgCl 2 (Fermentas) 41

4. dntp set (Fermentas) 5. Steril distile su 6. Primerler (TIB MOLBIOL) 7. Otomatik pipetler (1 10 µl ve 10 100 µl, Eppendorf) 8. 0,2-0,5-1,5 ml lik Eppendorf tüpleri (Axygen) 9. Steril sarı ve beyaz pipet uçları (Brand) 10. Thermal cycler (Techne) 11. ABI 3100 sekans cihazı (Applied Biosystems) 12. ROX size standard (Applied Biosystems) 13. POP-4 (Applied Biosystems) 14. Formamid 2.2.4.2 Tek Hücre Çalışmasında Kullanılan Mikrosatellit Markır Analizi 1. ABI 3100 sekans cihazı (Applied Biosystems) 2. ROX size standard (Applied Biosystems) 3. POP-4 (Applied Biosystems) 4. Formamid 5. Otomatik pipetler (1 10 µl ve 10 100 µl, Eppendorf) 6. 0,2-0,5-1,5 ml lik Eppendorf tüpleri (Axygen) 7. Steril sarı ve beyaz pipet uçları (Brand) 42

2.3. Heterozigotluk Araştırması Amaçlı Mikrosatellit Markır Analizi Çalışma Protokolü Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik Anabilim Dalı na 2009 yılında herhangi bir nedenle başvuran olgulardan, akraba olmadığı bilinen rastgele 50 erkek, 50 kadın toplam 100 olgu seçildi. Tüm olgular için demografik veriler, aile bilgilerini içeren olgu formları dolduruldu. Her olgudan 2 şer ml EDTA lı periferik kan örneği alındı. 2.3.1. Periferik Kandan DNA İzolasyonu DNA izolasyonları, Invisorb spin blood kit (Invitek) ile gerçekleştirildi. 1. EDTA'lı tüplerden 200 µl kan eppendorf tüplere aktarıldı. Üzerine 20 µl proteinaz K ve 200 µl Lysis buffer A eklenerek 10-15 saniye vortekslendi ve 56 0 C thermomikser de 10 dakika inkübe edildi. 2. Aynı zamanda Elution buffer D örnek başına 200 µl olacak kadar ependorf tübe alınıp 56 0 C Thermomikser e ısınması için bırakıldı. 3. Spin filtreler, Recevier tüplerine yerleştirildi. 4. Örneklerin üzerine 400 µl Binding buffer B6 eklendi, 5 saniye vortekslendi ve filtreli tüplere aktarıldı. 5. Filtreli tüpler içerisinde oda sıcaklığında 1 dakika inkubasyon uygulandı. 6. Bu filtreli tüplere 1 dakika sonra 12000 rpm de 2 dakika santrifüj işlemi gerçekleştirildi. 43

7. Santrifüj işlemi bitiminde filtreler Recevier tüplerinden çıkarıldı ve Recevier tüpleri boşaltıldı. Filtreler tekrar Recevier tüplerine yerleştirildi ve filtrelerin üzerine 500 µl Wash buffer I eklenerek tekrar santrifüje yerleştirildi. 12000 rmp de 1 dakika santrifüj işlemi uygulandı ve tekrar Recevier tüpleri boşaltıldı. 8. Filtrelerin üzerine Wash buffer II solüsyonu eklendi ve 12000 rpm de 1 dakika santrifüj işlemi uygulandı. Santrifüj işlemi bitiminde Recevier tüpleri boşaltılarak 13500 (en yüksek) rpm de 4 dakika kuru santrifüj işlemi uygulandı ve filtreler Eppendorf tüplerine alındı. 9. Bu işlem sonrasında, daha önce 56 0 C Thermomikser de bekletilmiş olan Elution buffer D her örnek için 200 µl olmak üzere filtrelerin üzerine konuldu, 3 dakika oda sıcaklığında inkubasyona bırakıldı. 10. İnkubasyon bittikten sonra 10000 rpm de 1 dakika santrifüj yapılarak DNA izolasyon aşaması bitirildi. 11. DNA -20 0 C de saklandı. 12. DNA izolasyon başarısı %1 lik agaroz jelde kontrol edildi. 2.3.2. Mikrosatellit Markır Analizi İçin PCR İşlemi Bu çalışmada, tek hücre PCR ında kullanılmak üzere seçilen, beta globin gen bölgesine bağlı (linked) D11S4891 ve D11S2362, bağlı olmayan (unlinked) D13S314 ve GABRB3 toplam 4 adet mikrosatellit markır kullanıldı. D11S4891 ve D11S2362 11. kromozom üzerinde beta globin (HBB) geni ile bağlı, 44

D13S314 13. kromozom üzerinde Wilson hastalığı geni (ATP7B) ile bağlı ve 15. kromozom üzerinde GABRB3, Prader Willi / Angelman gen bölgesinde GABA A reseptörü b3 lokusunda yer almaktadır (102-105, 137). D11S4891, D13S314 ve GABRB dinükleotid, D11S2362 trinükleotid tekrar dizilerinden oluşmaktaydı. Kullanılan markırlara ait primerler, PCR ürün büyüklükleri, tekrar dizileri Tablo 4 de verilmiştir. Tablo 4. Mikrosatellit markır analizinde kullanılan markırların primer dizileri, PCR ürün büyüklükleri ve tekrar dizileri. * olan primerler FAM ile işaretli olarak sentez edilmiştir. (F: Forward, R: Reverse) Markır Primer Dizileri PCR Ürün Büyüklüğü (bp) Tekrar Dizisi D11S4891 D11S2362 D13S314 GABRB3 F:*5 GGAAATGGACCTCTGTCTC 3 85-111 TG R: 5 CTTTTATTCCAGCCCCAC 3 F:*5 TGGACTATAGGACCCCCTTC 3 209-230 TAA R:5 GAGAACAGCCTGTCACACCT 3 F:*5 GAGTGGAGGAGGAGAAAAGA 3 137-155 CA R:5 GTGTGACTGGATGGATGTGA 3 F:5 CTCTTGTTCCTGTTGCTTTCAATACAC 3 181-201 CA R:*5 CACTGTGCTAGTAGATTCAGCTC 3 Her bir örnek için hazırlanan total PCR reaksiyon karışımı 25 µl 'dir. Distile H 2 O, 10X buffer, MgCl 2 (25mM), dntp (4x25 µ mol), primerler ve Taq polimerazdan oluşan karışım 0,2 ml lik her bir reaksiyon tüpüne dağıtıldı ve en son DNA örnekleri eklendi. (Tablo 5). 45

Tablo 5. PCR işleminde kullanılan malzemeler ve miktarları Kullanılan Malzeme Miktar (µl) Distile H 2 O 9.5 10x Buffer 2.5 MgCl 2 2.5 dntp 1 D11S4891, D11S2362, D13S314, GABRB3 F ve R primerleri 0.5 er (Toplam 4) Taq polimeraz 0.5 DNA 5 TOPLAM 25 Hazırlanan tüpler, thermal cycler a yerleştirildi ve ilgili PCR koşulları ile polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirildi (Tablo 6). Amplifikasyon ürünleri PCR programı bittikten sonra +4 0 C'de ışık almayan bir yerde saklandı. 46

Tablo 6. Heterozigotluk araştırması amaçlı mikrosatellit markır analizinde kullanılan PCR basamakları İşlem Sıcaklık Süre Döngü sayısı Denatürasyon 95 0 C 3 dakika 1 Denatürasyon 95 0 C 30 saniye Bağlanma 55,5 0 C 30 saniye 34 Uzama 72 0 C 45 saniye Final uzama 72 0 C 9 dakika 1 2.3.3. Mikrosatellit Markır Analizi Sonuçlarının Görüntülenmesi Her bir PCR ürünü için 10 µl formamid ve 0.5 µl ROX karışımı hazırlandı ve üzerine 2.5 µl PCR ürünü eklendi. Her bir PCR ürününe, ABI 3100 cihazında mikrosatellit analizi programında kapiller elektroforez uygulandı. ROX size standart a göre FAM florasan boyasıyla işaretli pikler elde edildi ve büyüklükleri baz çifti (bp) olarak kaydedildi. 2.3.4. Allel Frekansı ve Heterozigotluk Oranının Hesaplanması Türk toplumundan rastgele seçilen 100 bireyden toplam 200 allelde bu markırlar incelendi. Her bir mikrosatellit markır için bulunan allellerin büyüklükleri baz çifti (bp) cinsinden tek tek yazıldı. Görülme sıklıklarına göre 47

alleller sıralandı ve her bir allelin frekansı hesaplandı. Frekans hesaplaması, her bir lokusta saptanmış olan her bir allelin görülme sayısı toplam allel sayısı olan 200 e bölünerek hesaplandı. Her bir lokus için allel frekansları hesaplandığı için, beklenen (expected) heterozigotluk oranı formülüne göre hesaplandı (Pi: i allelinin frekansı). Gözlenen (observed) heterozigotluk oranı, çalışma grubumuzdaki heterozigotların sayısının toplam gönüllü sayısı olan 100 e bölünmesiyle elde edildi. Çalışmada kullandığımız toplam 4 lokus için ortak heterozigotluk oranı ise, 4 lokusa ait gözlenen heterozigotluk oranlarının aritmetik ortalaması alınarak hesaplandı. Heterozigotluk oranları MSTools programı kullanılarak doğrulandı (http://animalgenomics.ucd.ie/sdepark/ms-toolkit). 2.4. Periferik Kandan Tek Hücre (Lenfosit) Ayrıştırması ve DNA İzolasyonu Çalışma Protokolü Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik Anabilim Dalı na, beta talasemi prenatal tanısı için başvurmuş olan olgulardan, heterozigot veya bileşik heterozigot mutasyon taşıyıcısı çocukları olan çiftler dosya taraması ile tespit edildi. Heterozigot veya bileşik heterozigot mutasyon taşıması, her iki allelin de PCR sonucunda çoğalıp çoğalmadığını test etmek amacıyla önemliydi. Ebeveyn ve çocukların beta talasemi mutasyonları, daha önceden yapılan testler sonucunda bilinmekteydi. Toplam 32 birey (10 çift, birer çocukları, 2 hasta çocuk) çalışmaya dahil edilmiştir. Çalışmaya dahil edilen tüm bireylerin beta talasemi mutasyon analizleri, çalışma öncesinde sekans analiziyle konfirme edilmiştir. Ebeveynlerden 2 şer ml, çocuklarından 5 er ml EDTA lı 48

periferik kan örnekleri alındı. Ebeveynlerin ve hasta olan 2 çocuğun periferik kandan DNA izolasyonları bölüm 2.3.1 de belirtilen şekilde yapıldı. Toplam 10 çocuktan alınan periferik kan örneklerine ise en geç 2 saat içerisinde taze olarak lenfosit ayrıştırması işlemi uygulandı. 2.4.1. Periferik Kandan Tek Hücre (Lenfosit) Ayrıştırması Beta talasemi mutasyonunu heterezigot veya bileşik heterozigot olarak taşıdığı bilinen toplam 10 çocuktan alınan periferik kandan lenfosit ayrıştırması Histopaque 1083 (Sigma) kullanılarak yapıldı. Polisukroz (64 g/l) ve sodyum diatrizoat (100 g/l) içeren karışım, periferik kandan canlı mononükleer hücrelerin elde edilmesine kullanılmaktadır (106). Tüm kullanılan malzemelerin steril olması, laminar flow altında çalışılması ve kontaminasyona azami dikkat edilmesi gerekmektedir. Çalışma öncesinde steril cam pipetlerden alev kaynağı kullanılarak yaklaşık 6 ųl iç çaplı mikro pipetler yapıldı. İşlem basamakları olarak aşağıdaki yöntem uygulanmıştır (107). karıştırıldı. 1. Falkon tüpe 2,5 ml EDTA lı kan ve 2,5 ml steril NaCl eklendi ve 2. Ayrı bir falkona 8,5 ml Histopaque 1083 kondu ve üzerine yavaş bir şekilde ilk falkon tüpteki kan ve NaCl den oluşan karışım eklendi. 3. Yirmibeş dakika, 2000 rpm de 13,5 ml lik yeni karışım santrifüj edildi. 4. Santrifüj sonrası mononükleer hücrelerin bulunduğu faz (halka) gözükmektedir (Şekil 8). 49

5. Yeni bir falkon tüpe, lenfosit fazı cam pipet yardımıyla alındı ve steril distile su ile 5 ml ye tamamlandı. 6. Karışım petri kabına kondu ve gerektiği takdirde distile su ile daha da dilue edildi. Ağız pipeti ve mikro pipet yardımıyla, faz-kontrast mikroskop altında lenfositler tek tek yakalandı ve içerisinde 10 µl distile su bulunan 0,2 ml lik ependorf tüplere kondu. 7. Her bir olgu için 10 adet tek lenfosit ayrıştırıldı (Toplamda 100 adet tek hücre). 1 tane tüp ise içerisinde sadece 10 µl distile su (negatif kontrol) olacak şekilde bırakıldı. Şekil 8. Mononükleer hücre elde etmek için kullanılan yöntemin şematik görünümü 50

2.4.2 Tek Hücrede (Lenfosit) PCR işlemi Bu basamaktan sonra lizis PCR a kadar aşağıdaki yöntemle devam edildi (108). Tek hücre PCR işleminde ise FastStart High Fidelity PCR System, dntpack (Roche) kiti kullanıldı. 1. Tek lenfosit ayrıştırma işleminden sonra, her bir olgu için toplam 11 adet olan 0,2 lik ependorf tüpler -20 0 C de minimum 30 dakika bekletildi. 2. Daha sonra oda sıcaklığına getirilen tüpler, içindeki su eridikten sonra, su kontrol hariç diğer tüm tüplere 5 er µl proteinaz K eklendi. Bir tane 0,2 lik tüp proteinaz K negatif kontrol olarak çalışmaya eklendi. (Liofilize olarak gelen 25 mg proteinaz K 1,25 ml disitle suda çözündü ve -20 0 C de stok olarak saklandı). 3. Toplam 12 örnek için lizis PCR işlemi uygulandı. Enzim aktivasyonu 37 0 C de 45 dakika ve 65 0 C de 10 dakika enkübe edilerek; enzim deaktivasyonu ise 97 0 C de 5 dakika enkübe edilerek sağlandı (Tablo 7). Bu işlem yaklaşık olarak 1 saat 12 dakika sürmektedir. Tablo 7. Lizis PCR basamakları Sıcaklık Süre Döngü sayısı 37 0 C 45 dakika 1 65 0 C 10 dakika 1 97 0 C 5 dakika 1 10 0 C 10 dakika 1 51

4. FastStart High Fidelity PCR System, dntpack (Roche) kiti kullanılarak tek hücrede PCR işlemi uygulandı. Beta 1 ve beta 2 primerleri ile beta globin gen bölgesinin ilk yarısı (mutasyonların büyük çoğunluğunu kapsayan gen bölgesi) çoğaltıldı (109-112) (Şekil 9). IVSII-1 mutasyonu, bu çoğaltılan bölgenin dışında kalmaktaydı. Sadece IVSII-1 mutasyonu için IVSII-1 EXT ve Nested 4 primerleri kullanıldı. Mikrosatellit markırlar (D11S4891, D11S2362, D13S314, GABRB3) kontaminasyon, allel dropout gibi istenmeyen durumları test etmek için kullanıldı. Beta 1, beta 2, IVSII-1 EXT ve nested 4 primer dizileri Tablo 8 de verilmiştir. Kullanılan malzemeler ve miktarları Tablo 9 da verilmiştir. Şekil 9. Beta globin (HBB) geni şematik görünümü. Kırmızı kutular ekzonları, beyaz kutular intronları göstermektedir. Gen üzerinde en sık gözlenen mutasyonlar aşağı yönde ok ile işaretlenmiştir. IVSII-1 mutasyonu gen üzerinde kesikli ok işaretiyle gösterilmiştir. Beta 1 - beta 2 ve nested 4 IVSII-1 EXT primerlerinin kapsadığı gen bölgeleri karşılıklı iki koyu ok ile gösterilmiştir. 52

Tablo 8. HBB geninin belirli bölgesini çoğaltmak için kullanılan primerlerin dizileri, PCR ürün büyüklükleri PRİMER PRİMER DİZİLERİ PCR ÜRÜN BÜYÜKLÜĞÜ (bp) Beta 1 (F) 5 GAAGTCCAACTCCTAAGCCA 3 Beta 2 (R) 5 CATCAAGCGTCCCATAGACTC 3 Nested 4 (F) 5 CAACTGTGTTCACTAGCAAC 3 IVSII-1 EXT (R) 5 -TAAAAGAAACTAAAACGATCC-3 689 637 Tablo 9. Tek hücre PCR işleminde kullanılan malzemeler ve miktarları Kullanılan Malzeme Miktar (µl) Distile H 2 O 24,9 MgCl 2 İçeren 10x Reaksiyon Miksi 5 DMSO 1 Nükleotid miks 1 Beta 1 ve Beta 2 primerleri (IVS II-1 için IVSII-1 EXT ve Nested 4) 0,5 er (Toplam 1) D11S4891, D11S2362, D13S314, GABRB3 Forward (F) ve reverse (R) primerleri 0,2 şer (Toplam 1,6) Enzim miks 0,5 TOPLAM 35 53

5. PCR kabini içerisinde, kontaminasyona azami dikkat ederek her olgu için 10 lenfosit, 1 su negatif, 1 proteinaz k negatif, anne, baba ve PCR negatif olmak üzere toplam 15 reaksiyonluk PCR miks hazırlandı. 6. İçerisinde tek lenfosit bulunan toplam 10 tüpe, 1 su negatif, 1 proteinaz k negatif ve PCR negatife 35 er µl PCR miksten konuldu. Anne ve baba için ayrı 2 tüp hazırlandı ve içerisine 13 er µl distile su ve üzerine 35 er µl PCR miksten konuldu. Son olarak anne ve baba genomik DNA ları 2 şer µl ilgili tüplere eklendi. Böylece tüm tüplerde 50 µl final hacime ulaşılmış oldu. 7. PCR aşağıda belirtilen şekilde uygulandı (Tablo 10). Bu işlem yaklaşık olarak 2 saat 33 dakika sürmektedir. Tablo 10. Tek hücre PCR işlemi PCR basamakları İşlem Sıcaklık Süre Döngü sayısı Denatürasyon 95 0 C 15 dakika 1 Denatürasyon 95 0 C 45 saniye Bağlanma 60 0 C 1 dakika 36 Uzama 72 0 C 1 dakika Final uzama 72 0 C 15 dakika 1 Soğutma 4 0 C 1 54

2.5. Nested, Real-time PCR Real-time PCR işlemi Light Cycler (Roche) cihazı ve Light Cycler Faststart DNA Master HybProbe (Roche) kiti kullanılarak uygulandı. Nested PCR olarak dizayn edilen bu işlemde, mutasyon saptaması erime eğrisi analizi yöntemiyle yapıldı. Kullanılan tüm problar, çalışma öncesinde genomik DNA ve 1/1000 oranında dilue edilmiş genomik DNA ile çalışılarak test edildi. 1. Tek hücre PCR ından alınan örneklerin her birisi için, içerisinde 1 ml distile su bulunan 1,5 luk ependorf tüpler hazırlandı. Her birinin içerisine ilgili PCR ürününden 1 er µl alınıp karıştırıldı. 2. Light Cycler Faststart DNA Master HybProbe (Roche) kiti kullanılarak nested PCR miksi hazırlandı (Tablo 11). Nested 1 ve nested 2 primerleri HBB genindeki çoğu mutasyonu kapsamaktadır. Sadece IVSII-1 mutasyonunu için nested 3 ve nested 4 primerleri kullanılmıştır (Tablo 12). Kullanılan tüm problar Tablo 13 de ve Şekil 10 da verilmiştir. 55

Tablo 11. Nested PCR miksi hazırlanırken kullanılan malzemeler ve miktarları. Prob X ve Y olguya göre değişmektedir. Kullanılan Malzeme Miktar (µl) Distile H 2 O 6,4 MgCl 2, 25 mm 1,6 Nested 1 (IVSII-1 için Nested 4) 2 Nested 2 (IVSII-1 için Nested 3) 2 Prob X 2 Prob Y 2 Enzim miks 2 TOPLAM 18 Tablo 12. Nested PCR da kullanılan primerlerin dizileri, PCR ürün büyüklüğü Primer Primer Dizileri PCR Ürün Büyüklüğü (bp) Nested 1 (F) 5 GCTGTCATCACTTAGACCTCA 3 Nested 2 (R) 5 CACAGTGCAGCTCACTCA 3 Nested 4 (F) 5 CAACTGTGTTCACTAGCAAC 3 Nested 3 (R) 5 AAACGATCCTGAGACTTCCA 3 587 625 56

Tablo 13. Light Cycler da kullanılan problar, tarayabildikleri örnek mutasyonlar, prob dizileri, erime ısıları (Tm) ve mutasyon saptamada kullandıkları diziler Prob Set Mutasyon Hibridizasyon Prob Dizileri Tm ( 0 C) Mutasyon Saptama A IVSII-745 (C>G) (CAP+20 C>T) Acceptor: 5 LCRed705-CCTCAAA CAGACACCATGGTGCACCTG-P3 Donör: 5 -TTCTGACACAACTGTGT TCACTAGCA-FITC-3 69,3 59 Normal dizi B C Cd5 (-CT) Cd6 (-A) Cd8 (-AA) Cd8/9 (+G) HbS Cd6 (A>T) Acceptor: 5 LCRed640-GACTCCT GAGGAGAAGTCTGC-P-3 Donör: 5 -CCTCAAACAGACACCA TGGTGCACC-FITC-3 Acceptor: 5 -CTCCTGTGGAGAA GTCTGC- LCRed640-3 Donör: 5 -FITC-GTTACTGCCCTGT GGGGCAAGGTGAACGTGGATGA-3 55,8 66,7 52,5 79 Normal dizi Mutant dizi IVSI-1 (G>A, G>T) D E IVSI-2 (T>G, T>C, T>A) IVSI-5 (G>A, G>C, G>T) IVSI-6 (T>C) IVSI-110 (G>A) IVSI-116 (T>G) Acceptor: 5 LCRed705-TGTAACC TTGATACCAACCTGCCCA-P-3 Donör: 5 -TGCCCAGTTTCTATTGG TCTCCTTAAACCTGTC-FITC-3 Acceptor: 5 LCRed640-CCCTTAG GCTGCTGGTGGTCTAC-P-3 Donör: 5 -TCTGCCTATTGGTCTATT TTCCC-FITC-3 63,7 68,2 62,8 56,5 Normal dizi Normal dizi F Cd39 (C>T) Cd37 (TGG>TGA) Cd41/42 (-TTCT) Acceptor: 5 LCRed705-ACCCTTG GACCCAGAGGTTCTT-P-3 Donör: 5 -CCCTTAGGCTGCTGG TGGTC-FITC-3 60,3 61,3 Normal dizi G IVSII-1 (G>A) Acceptor: 5 LCRed640-TCTCAGG ATCCACGTGCAGCTTG-P-3 Donör: 5 -GTCCCATAGACTCACCCT GAAG-FITC-3 64,7 56,1 Normal dizi 57

Şekil 10. Light Cycler da kullanılan hibridizasyon probları, kapsadıkları örnek mutasyonlar. Şekil HBB genini temsil etmektedir. Mutasyonlar bulundukları yerlerinde ok işaretleriyle belirtilmiş ve altında kapsadıkları ilgili Light Cycler prob setleri gösterilmiştir 3. Kullanılan Light Cycler problarından sadece HbS ye özgü prob, mutant diziyi saptaycak şekilde dizayn edilmiş olup diğer tüm problar normal diziyi tanıyacak şekilde sentezlettirilmiştir. IVSII-745 mutasyonu amplifiye edilen 58

bölgenin dışında kalmaktadır. Ancak bu mutasyonun HBB geninin 5 translasyona uğramayan bölgesindeki (5 UTR) polimorfik baz değişimi (+20C>T) ile cis durumda olduğu; dolayısıyla IVSII-745 ile +20C>T polimorfizminin birlikte gözlendiği belirtilmiştir (111). Şekil 10 da gösterilen A probu, bu polimorfizmi içine alan ancak normal diziyi tanıyacak şekilde sentezlenmiştir. Çalışmada her olgu için ilgili mutasyonu kapsayan prob setleri kullanılmıştır. 4. Nested PCR için miks, olgu başına 16 reaksiyonluk hazırlandı (Lenfosit 1-10, anne, baba, su negatif, proteinaz k negatif, 1. PCR negatif, LC negatif). Soğuk blok üzerine dizilen 20 µl lik LC kapillerlerine (Roche) 18 er µl miks dağıtıldı. 5. Lenfosit 1-10, anne, baba, su negatif, proteinaz k negatif, 1. PCR negatif için sulandırılmış ilk PCR ürünlerinden ilgili kapillerlere 2 şer µl eklendi ve kapillerlerin üst kapakları kapatıldı. LC negatif için 2 µl reaksiyonda kullanılan su konuldu ve kapatıldı. 6. Tüm kapillerler en fazla 2000 rpm de 10 saniye kadar santrifüj edildi, reaksiyon karışımının her bir kapiller tüpün dibine çöktüğü kontrol edildi ve LC cihazına yüklendi. Cihazda ilk olarak nested PCR yapılıp daha sonra erime eğrisi analizi ile mutasyon tespiti ve genotiplendirme yapılmıştır. İşlemde kullanılan parametreler Tablo 14 de verilmiştir. 59

Tablo 14. LC cihazında kullanılan nested PCR ve mutasyon saptama program koşulları İşlem Hedef Derece ( 0 C) İnkübasyon Süresi (sn) Isı Geçiş Oranı ( 0 C/sn) Denatürasyon 95 30 20 1 95 5 20 Amplifikasyon 55 10 20 40 72 25 20 95 0 20 Erime Eğrisi Analizi 40 120 20 85 0 0,3 1 Soğutma 40 30 20 1 Döngü Sayısı 7. İşlem sonrasında ilgili mutasyona özgü F2 (LC Red 640) veya F3 (LC Red 705) kanalından erime eğrisi (melting curve) analizi işaretlenerek mutasyonlar incelenip kaydedildi. Mutasyonlar bilindiğinden dolayı amplifikasyon başarısızlığı, allel dropout, kontaminasyon durumları kolaylıkla incelenebildi. 2.6. Tek Hücre Çalışmasında Kullanılan Mikrosatellit Markır Analizi Sonuçlarının Görüntülenmesi 1. Light Cycler işlemi devam ederken, ilk PCR ürünlerinden mikrosatellit markır analizi yapıldı. İlk PCR multipleks olarak dizayn edilmiş olup hem HBB geninin belirli bir bölgesini, hem de mikrosatellit markırları çoğaltmaktadır. 2. Her bir PCR ürünü için 10 µl formamid ve 0,5 µl ROX karışımı hazırlandı ve üzerine 2,5 µl PCR ürünü eklendi. Her bir PCR ürününe, ABI 3100 60

cihazında mikrosatellit analizi programında kapiller elektroforez uygulandı. ROX size standart a göre FAM florasan boyasıyla işaretli pikler elde edildi ve boyutları baz çifti (bp) olarak kaydedildi. Anne, baba ve çocuklarına ait tek lenfositlerin pikleri karşılaştırıldı. Allel dropout, kontaminasyon durumları incelendi. 61

2.7. Tek Hücre Analizinde Uygulanan Tüm İşlem Basamaklarının Özeti Çalışma boyunca kullanılan işlem basamakları Şekil 11 de özetlenmiştir. Şekil 11. Tek hücre analizinde uygulanan tüm işlem basamaklarının özeti. Tek hücre izolasyonu, hücenin lizis aşamaları, lizis PCR, anne ve baba genomik DNA larının ve mikrosatellit markırların eklenmesiyle gerçekleştirilen multipleks PCR, Light Cycler cihazında yapılan nested PCR ve mutasyon tespiti analizleri ve yaklaşık zamanları 62

BÖLÜM III BULGULAR 3.1 Heterozigotluk Araştırması Amacıyla Yapılan Mikrosatellit Markır Analizi Bulguları 3.1.1 Çalışma Grubunun Genel Özelliklerinin Karşılaştırılması Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik Anabilim Dalı na 2009 yılında başvuran olgulardan rastgele, akraba olmadığı bilinen 50 erkek, 50 kadın olmak üzere toplam 100 olgu seçildi. Bu olguların cinsiyetleri, yaşları ve doğum yerleri kaydedildi. Ortalama yaş 28,85 ± 19,48 olarak saptandı. En düşük yaş 1 iken en yüksek yaş 65 olarak saptandı. Olguların 44 ü (%44) İzmir doğumlu olarak kaydedildi. Sırasıyla 13 kişi (%13) Manisa, 10 kişi Muğla (%10), 9 kişi Aydın (%9), 5 kişi Uşak (%5), 4 kişi Afyon (%4) ve 15 kişi (%15) diğer il doğumlu olarak saptandı (Şekil 12). 63

2% 2% 3% 4% 5% 9% 10% 13% 44% İzmir Manisa Muğla Aydın Uşak Afyon Kütahya Çanakkale Balıkesir Antalya Ardahan Adana Diyarbakır Ağrı Bursa Konya Malatya Şekil 12. Mikrosatellit markırların heterozigotluk çalışması amacıyla seçilen 100 olgunun doğum yerleri. Antalya, Ardahan, Adana, Diyarbakır, Ağrı, Bursa, Konya grafikte % 1 ile temsil edilmektedir 3.1.2 Mikrosatellit Markır Analizi Sonuçları Rastgele seçilen 100 bireyden toplam 200 allelde bu markırlar incelendi. Her olgu için her lokusta heterozigot ya da homozigot olma durumlarına göre genotiplendirme yapıldı ve ürün büyüklükleri baz çitfi olarak kaydedildi (Ek 1). 3.1.3 Mikrosatellit Markır Analizi İstatistik Sonuçları Her lokus için, görülme sıklıklarına göre saptanan tüm alleller sıralandı ve 200 allel içerisinde kaç kez görüldükleri kaydedildi. Allel frekansları, bölüm 2.3.4 de bahsedilen şekilde hesaplandı. (Tablo 15, Şekil 13). 64

Şekil 13. Bir olguya ait mikrosatellit markır analizi sonucu. D11S4891, D13S314, GABRB3 ve D11S2362 markırları ve üzerlerinde baz çifti (bp) olarak bulunan değerleri verilmiştir. Tablo 15. D11S4891, D13S314, GABRB, D11S2362 mikrosatellit markırları için saptanan alleller, boyutları (s), allel sayıları (n) ve allel frekansları (f) D11S4891 D13S314 GABRB3 D11S2362 S (bp) n f S (bp) n f S (bp) n f S (bp) n f 97 7 0,035 133 5 0,025 181 85 0,425 209 4 0,02 101 51 0,255 135 7 0,035 183 10 0,05 212 8 0,04 103 53 0,265 137 39 0,195 185 30 0,15 215 24 0,12 105 74 0,37 139 31 0,155 187 17 0,085 218 59 0,295 107 7 0,035 141 22 0,11 189 5 0,025 221 20 0,1 111 8 0,04 143 15 0,075 191 11 0,055 224 38 0,19 145 16 0,08 193 15 0,075 227 37 0,185 147 29 0,145 195 7 0,035 230 10 0,05 149 5 0,025 197 15 0,075 151 31 0,155 199 1 0,005 201 4 0,02 TOPLAM 200 1 200 1 200 1 200 1 65

Beklenen (expected) ve gözlenen (observed) heterozigotluk oranları Tablo 16 da verilmiştir. Çalışmada kullanılan toplam 4 lokus için ortak gözlenen heterozigotluk oranı ise %80 olarak hesaplandı. Tablo 16. D11S4891, D13S314, GABRB3, D11S2362 mikrosatellit markırları için saptanan allel sayısı, beklenen ve gözlenen heterozigotluk oranları Mikrosatellit Bulunan Allel Beklenen Gözlenen Markır Sayısı Heterozigosite Heterozigosite D11S4891 6 %73 %85 D13S314 10 %87 %79 GABRB3 11 %77 %74 D11S2362 8 %82 %81 3.2 Periferik Kandan Tek Hücre (Lenfosit) Ayrıştırması, DNA İzolasyonu ve Tek Hücre PCR Sonuçları 3.2.1 Çalışma Grubunun Genel Özelliklerinin Karşılaştırılması Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik Anabilim Dalı na, 2007-2009 yılları arasında beta talasemi prenatal tanısı için başvurmuş olan 10 çift, 9 heterozigot ve 1 bileşik heterozigot mutasyona sahip birer çocukları ile birlikte toplam 30 bireyin bilgileri Tablo 17 de verilmiştir. Toplam 10 probandın 8 i kız, 2 si erkekti. Probandların yaşları 4 ay 26 yaş aralığında bulunmaktaydı. Ebeveynler arasında akrabalık, 1 aile dışında belirtilmedi. Farklı probları denemek amacıyla farklı mutasyonlara sahip olgular seçilmeye özen gösterildi. 66

Tablo 17. Toplam 10 çocuğa ait yaş, mutasyon, ebeveyn mutasyon ve ebeveynlerin akrabalık durumları bilgileri (K: Kadın, E: Erkek, HET: Heterozigot) Olgu Yaş Cinsiyet Mutasyon Anne Baba Akrabalık No Mutasyonu Mutasyonu 1 4 ay K IVSI.1 HET IVSI.1 HET IVSI.1 HET Yok 2 1 yaş K CD39 HET IVSI.110 HET CD39 HET Yok 3 7 ay K HbS HET HbS HET HbS HET Yok 4 26 yaş K CD39 HET CD39 HET CD39 HET Yok 5 11 yaş K IVSI.110 HET IVSI.110 HET IVSI.110 HET Yok 6 11 yaş K IVSI.110 HET IVSI.110 HET IVSI.110 HET Yok 7 14 yaş E IVSI.6 HET IVSI.6 HET IVSI.6 HET Yok 8 4 ay E CD8 HET CD8 HET CD8 HET Yok 9 7 yaş K IVSI.110/IVSII- IVSI.110 HET IVSII-745 Yok 745 HET 10 6 ay K IVSII-1 HET IVSII-1 HET IVSII-1 HET Var 3.2.2 Tek hücre PCR ve Mikrosatellit Markır Analizi Sonuçları Tüm olgular için toplam 10 adet tek lenfositten, ebeveynlerin ve varsa hasta çocukların genomik DNA sından PCR işemi uygulandı. Nested PCR sonucu elde edilen mutasyon sonuçları ve ilk PCR dan elde edilen mikrosatellit markır analizleri her olgu için aşağıda verilmiştir. 67

a) Olgu 1: IVSI.1 heterozigot mutasyon taşıdığı bilinen 4 aylık kız olgu. Anne ve babası da aynı mutasyonu taşımaktaydı ve akrabalık belirtmediler. Başka çocukları yok ve aile öyküsünde ek bir bulgu saptanmadı. Tüm lenfositler, anne ve baba IVSI.1 heterozigot olarak saptandı (Şekil 14). Şekil 14. Olgu 1 için D prob seti kullanılarak elde edilen anne, baba ve tek lenfosite ait LC erime eğrisi analizi. Mavi çizgi ile işaretlenen pik (~61 0 C) normal alleli, kırmızı ile işaretlenen pik (~52 0 C) mutant alleli (IVSI-1) göstermektedir. Mutasyon taşımayan olguya ait patern Normal olarak gösterilmiştir. Negatiflere ait patern aşağıda görülmektedir. 68

Anne, baba ve lenfositlere (olgu) ait mikrosatellit markır analizleri aşağıda verilmiştir (Tablo 18, Şekil 15). Şekil 15. Sırasıyla tek lenfositlerden birine ait, anne ve babanın mikrosatellit markır analizi sonuç görüntüsü Tablo 18. Olgu 1, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları Olgu D11S4891 (TG) D13S314 (CA) GABRB (CA) D11S2362 (TAA) (85-111 bp) (137-155 bp) (181-201 bp) (209-230 bp) Olgu 1 101 105 139 143 181 187 221 224 Anne 101 103 139 145 181 187 224 224 Baba 103 105 135 143 181 189 215 221 69

b) Olgu 2: CD39 heterozigot mutasyon taşıdığı bilinen 1 yaşında kız olgu. Annesi IVSI-110 heterozigot ve babası CD39 heterozigot mutasyonu taşımaktaydı ve akrabalık belirtmediler. Aile öyküsünde ek bir bulgu saptanmadı. Tüm lenfositler CD39 heterozigot, anne IVSI-110 heterozigot ve baba CD39 heterozigot olarak saptandı (Şekil 16-17). Şekil 16. Olgu 2 için E prob seti kullanılarak IVSI-110 için yapılan LC erime eğrisi analizi. Mavi çizgi ile işaretlenen pik (~61 0 C) normal alleli, kırmızı ile işaretlenen pik (~56 0 C) mutant alleli (IVSI-110) göstermektedir. Negatife ait patern aşağıda görülmektedir. Bu analizde, annenin IVSI-110 için heterozigot, baba ve lenfositin normal olduğu gözlenmektedir (Babanın IVSI-110 allelini taşımadığı biliniyor). 70

Şekil 17. Olgu 2 için F prob seti kullanılarak CD39 için yapılan LC erime eğrisi analizi. Mavi çizgi ile işaretlenen pik (~66 0 C) normal alleli, kırmızı ile işaretlenen pik (~58 0 C) mutant alleli (CD39) göstermektedir. Negatife ait patern aşağıda görülmektedir. Bu analizde, baba ve lenfositin CD39 için heterozigot, annenin ise normal olduğu gözlenmektedir (Annenin CD39 allelini taşımadığı biliniyor). 71

Anne, baba ve lenfositlere ait mikrosatellit markır analizleri aşağıda verilmiştir (Tablo 19). Tablo 19. Olgu 2, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları Olgu D11S4891 (TG) D13S314 (CA) GABRB (CA) D11S2362 (TAA) (85-111 bp) (137-155 bp) (181-201 bp) (209-230 bp) Olgu 2 103 103 135 139 181 183 212 215 Anne 103 103 135 137 181 181 212 215 Baba 101 103 139 141 181 183 215 215 72

c) Olgu 3: HbS heterozigot mutasyon taşıdığı bilinen 7 aylık kız olgu. Anne ve babası da aynı mutasyonu taşımaktaydı ve akrabalık belirtmediler. Çiftin HbS taşıyıcısı olan başka bir kız çocuğu var. Aile öyküsünde ek bir bulgu saptanmadı. Tüm lenfositler, anne ve baba HbS heterozigot olarak saptandı (Şekil 18). Şekilde Lenfosit 2 olarak adlandırılan lenfositte ADO gözlendi. Sadece mutant allelin amplifikasyonu çok belirginken, normal allelin amplifiye olamadığı düşünüldü. D11S4891 ve D11S2362 markırlarında heterozigot durum gözlendiğinden dolayı, ADO nun sadece beta globin genini ilgilendirdiği şeklinde yorumlandı. Şekil 18. Olgu 3 için C prob seti kullanılarak HbS için yapılan LC erime eğrisi analizi. Mavi çizgi ile işaretlenen pik (~63 0 C) mutant alleli, kırmızı ile işaretlenen pik (~54 0 C) normal alleli göstermektedir. Lenfosit 2 de allel dropout olduğu düşünüldü. HbS için normal olan bir olgunun paterni de şekilde gösterilmiştir 73

Anne, baba ve lenfositlere ait mikrosatellit markır analizleri aşağıda verilmiştir (Tablo 20). Tablo 20. Olgu 3, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları Olgu D11S4891 (TG) D13S314 (CA) GABRB (CA) D11S2362 (TAA) (85-111 bp) (137-155 bp) (181-201 bp) (209-230 bp) Olgu 3 103 105 139 141 181 183 212 215 Anne 103 105 139 141 181 181 212 215 Baba 103 105 141 143 181 183 212 227 74

d)olgu 4: CD39 heterozigot mutasyon taşıdığı bilinen 26 yaşında kız olgu. Anne ve babası da aynı mutasyonu taşımaktaydı ve akrabalık belirtmediler. Çiftin 1 tane 2,5 aylık abortus öyküleri mevcut. Bir lenfositte amplifikasyon sağlanamadı; diğer lenfositler, anne ve baba CD39 heterozigot olarak saptandı (Şekil 19). Şekil 19. Olgu 4 için F prob seti kullanılarak CD39 için yapılan LC erime eğrisi analizi. Mavi çizgi ile işaretlenen pik (~66 0 C) normal alleli, kırmızı ile işaretlenen pik (~58 0 C) mutant alleli göstermektedir. Bu analizde anne, baba ve lenfositin CD39 için heterozigot olduğu gözlenmektedir. Ayrıca CD39 alleli taşımayan normal bir olguya ait patern de gösterilmiştir. 75

Anne, baba ve lenfositlere ait mikrosatellit markır analizleri aşağıda verilmiştir (Tablo 21). Tablo 21. Olgu 4, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları Olgu D11S4891 (TG) D13S314 (CA) GABRB (CA) D11S2362 (TAA) (85-111 bp) (137-155 bp) (181-201 bp) (209-230 bp) Olgu 4 103 103 137 147 181 181 212 224 Anne 103 105 137 147 181 183 212 224 Baba 103 105 137 137 181 183 212 224 76

e) Olgu 5: IVSI-110 heterozigot mutasyon taşıdığı bilinen 11 yaşında kız olgu. Anne ve babası da aynı mutasyonu taşımaktaydı ve akrabalık belirtmediler. Çiftin IVSI-110 homozigot hasta kız çocukları var. Tüm lenfositler, anne ve baba IVSI-110 heterozigot olarak saptandı (Şekil 20). Şekil 20. Olgu 5 için E prob seti kullanılarak IVSI-110 için yapılan LC erime eğrisi analizi. Mavi çizgi ile işaretlenen pik (~61 0 C) normal alleli, kırmızı ile işaretlenen pik (~56 0 C) mutant alleli göstermektedir. Bu analizde, anne, baba ve lenfositin IVSI-110 için heterozigot olduğu gözlenmektedir 77

Anne, baba ve lenfositlere ait mikrosatellit markır analizleri aşağıda verilmiştir (Tablo 22). Tablo 22. Olgu 5, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları Olgu D11S4891 (TG) D13S314 (CA) GABRB (CA) D11S2362 (TAA) (85-111 bp) (137-155 bp) (181-201 bp) (209-230 bp) Olgu 5 103 103 137 139 181 195 221 224 Anne 103 103 137 139 181 193 215 224 Baba 103 103 137 147 191 195 221 224 78

f) Olgu 6: IVSI-110 heterozigot mutasyon taşıdığı bilinen 11 yaşında kız olgu. Anne ve babası da aynı mutasyonu taşımaktaydı ve akrabalık belirtmediler. Çiftin 1 tane IVSI-110 homozigot hasta kız ve 1 tane normal erkek çocukları var. Tüm lenfositler, anne ve baba IVSI-110 heterozigot olarak saptandı (Şekil 21). Şekil 21. Olgu 6 için E prob seti kullanılarak IVSI-110 için yapılan LC erime eğrisi analizi. Mavi çizgi ile işaretlenen pik (~61 0 C) normal alleli, kırmızı ile işaretlenen pik (~56 0 C) mutant alleli göstermektedir. Bu analizde, anne, baba ve lenfositin IVSI-110 için heterozigot olduğu gözlenmektedir 79

Anne, baba ve lenfositlere ait mikrosatellit markır analizleri aşağıda verilmiştir (Tablo 23). sonuçları Tablo 23. Olgu 6, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi Olgu D11S4891 (TG) D13S314 (CA) GABRB (CA) D11S2362 (TAA) (85-111 bp) (137-155 bp) (181-201 bp) (209-230 bp) Olgu 6 103 105 137 151 181 187 212 224 Anne 103 105 137 137 183 187 212 224 Baba 103 105 147 151 181 185 212 224 80

g) Olgu 7: IVSI-6 heterozigot mutasyon taşıdığı bilinen 14 yaşında erkek olgu. Anne ve babası da aynı mutasyonu taşımaktaydı ve akrabalık belirtmediler. Çiftin 1 tane IVSI-6 homozigot hasta erkek çocuğu 15 yaşındayken ex olmuş ve yaşayan 1 tane IVSI-6 homozigot hasta erkek çocukları var. Hasta çocuğa ulaşılamadığından dolayı çalışmaya alınamamıştır. Tüm lenfositler, anne ve baba IVSI-6 heterozigot olarak saptandı (Şekil 22). Şekil 22. Olgu 7 için D prob seti kullanılarak IVSI-6 için yapılan LC erime eğrisi analizi. Mavi çizgi ile işaretlenen pik (~67 0 C) normal alleli, kırmızı ile işaretlenen pik (~53 0 C) mutant alleli göstermektedir. 81

Anne, baba ve lenfositlere ait mikrosatellit markır analizleri aşağıda verilmiştir (Tablo 24). Tablo 24. Olgu 7, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları Olgu D11S4891 (TG) D13S314 (CA) GABRB (CA) D11S2362 (TAA) (85-111 bp) (137-155 bp) (181-201 bp) (209-230 bp) Olgu 7 101 103 137 147 191 195 221 224 Anne 101 103 139 147 191 195 215 224 Baba 101 103 137 145 181 195 221 224 82

h) Olgu 8: CD8 heterozigot mutasyon taşıdığı bilinen 4 aylık erkek olgu. Anne ve babası da aynı mutasyonu taşımaktaydı ve akrabalık belirtmediler. Çiftin 1 tane CD8 homozigot hasta kız çocukları var. Bu çalışmada, olguya ek olarak hasta olan bireyden de periferik kan alınıp genomik DNA elde edildi. Bu olgunun da PCR ı anne ve babayla beraber çalışıldı. Tek hücre (lenfositler), anne ve baba IVSI-6 heterozigot olarak saptandı. Homozigot hasta olan çocukları ise IVSI-6 homozigot olarak saptandı. (Şekil 23). Şekil 23. Olgu 8 için B prob seti kullanılarak CD8 için yapılan LC erime eğrisi analizi. Mavi çizgi ile işaretlenen pik (~67 0 C) normal alleli, kırmızı ile işaretlenen pik (~57 0 C) mutant alleli göstermektedir. CD8 alleli taşımayan bir olguya ait patern Normal olarak gösterilmiştir 83

Anne, baba, hasta çocuk ve lenfositlere ait mikrosatellit markır analizleri aşağıda verilmiştir (Tablo 25). Mutant alleler, hasta çocuğun allellerine göre, D11S4891 ve D11S2362 bağlı markırlar baz alınarak belirlenmiştir. Tablo 25. Olgu 8, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları. * ile işaretli alleller mutant allelleri göstermektedir Olgu D11S4891 (TG) D13S314 (CA) GABRB (CA) D11S2362 (TAA) (85-111 bp) (137-155 bp) (181-201 bp) (209-230 bp) Olgu 8 101 103 137 147 187 195 214 226 Hasta Çocuk 103 103 137 152 178 195 211 214 Anne 101 *103 137 152 187 195 *211 226 Baba 101 *103 147 152 178 187 *214 226 84

i) Olgu 9: IVSI-110 / IVSII-745 bileşik heterozigot mutasyon taşıdığı bilinen 7 yaşında beta talasemi hastası kız olgu. Annede IVSI-110 heterozigot, babada IVSII-745 heterozigot mutasyon bulunmaktaydı. Akrabalık belirtmediler. Tüm bireylere ait mutasyonlar doğru olarak saptandı (Şekil 24-25) Şekil 24. Olgu 9 için E prob seti kullanılarak IVSI-110 için yapılan LC erime eğrisi analizi. Mavi çizgi ile işaretlenen pik (~61 0 C) normal alleli, kırmızı ile işaretlenen pik (~56 0 C) mutant alleli göstermektedir. Bu analizde, annenin ve lenfositin IVSI-110 için heterozigot, babanın normal olduğu gözlenmektedir (Babanın IVSI-110 allelini taşımadığı biliniyor). 85

Şekil 25. Olgu 9 için A prob seti kullanılarak IVSII-745 için yapılan LC erime eğrisi analizi. Mavi çizgi ile işaretlenen pik (~67 0 C) normal alleli, kırmızı ile işaretlenen pik (~60 0 C) mutant alleli göstermektedir. Bu analizde, babanın ve lenfositin IVSII-745 için heterozigot, annenin normal olduğu gözlenmektedir (Annenin IVSII-745 allelini taşımadığı biliniyor). Anne, baba ve lenfositlere ait mikrosatellit markır analizleri aşağıda verilmiştir (Tablo 26). Tablo 26. Olgu 9, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları Olgu D11S4891 (TG) D13S314 (CA) GABRB (CA) D11S2362 (TAA) (85-111 bp) (137-155 bp) (181-201 bp) (209-230 bp) Olgu 9 103 103 137 151 181 181 221 224 Anne 101 103 147 151 181 181 221 224 Baba 101 103 137 151 181 181 221 224 86

j) Olgu 10: IVSII-1 heterozigot mutasyon taşıdığı bilinen 6 aylık kız olgu. Anne ve babası da aynı mutasyonu taşımaktaydı ve çiftler arasında birinci derece kuzen evliliği bulunmaktaydı. Çiftin 1 tane IVSII-1 homozigot hasta erkek çocukları var. Bu çalışmada, olguya ek olarak hasta olan bireyden de periferik kan alınıp genomik DNA elde edildi. Bu olgunun da PCR ı anne ve babayla beraber çalışıldı. Bir lenfositte amplifikasyon sağlanamadı; diğer lenfositler, anne ve baba IVSII-1 heterozigot olarak saptandı. Homozigot hasta olan çocukları ise IVSII-1 homozigot olarak saptandı. (Şekil 26). Şekil 26. Olgu 10 için G prob seti kullanılarak IVSII-1 için yapılan LC erime eğrisi analizi. Mavi çizgi ile işaretlenen pik (~65 0 C) normal alleli, kırmızı ile işaretlenen pik (~58 0 C) mutant alleli göstermektedir. Bu analizde, anne, baba ve lenfositlerin IVSII-1 için heterozigot oldukları gözlenmektedir. Hasta çocuk IVSII-1 homozigot olarak saptanmıştır. IVSII-1 için normal patern şekilde belirtilmiştir 87

Anne, baba, hasta çocuk ve lenfositlere ait mikrosatellit markır analizleri aşağıda verilmiştir (Tablo 27). Mutant alleler, hasta çocuğun allellerine göre, D11S4891 ve D11S2362 bağlı markırlar baz alınarak belirlenmiştir. Tablo 27. Olgu 10, hasta çocuk, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları. * ile işaretli alleller mutant allelleri göstermektedir Olgu D11S4891 (TG) D13S314 (CA) GABRB (CA) D11S2362 (TAA) (85-111 bp) (137-155 bp) (181-201 bp) (209-230 bp) Olgu 10 101 103 137 137 181 183 212 224 Hasta Çocuk 101 101 137 147 183 183 224 227 Anne *101 103 137 147 181 183 221 *224 Baba *101 103 137 147 181 183 212 *227 88

3.2.3 Tek hücre PCR ve Mikrosatellit Markır Analizi Sonuçlarının Değerlendirilmesi Toplam 10 olgudan 100 lenfositte tek hücre PCR ı uygulandı. Hiçbir PCR da kontaminasyon saptanmadı (%0). Olgu 4 te 1 ve olgu 10 da 1 olmak üzere toplam 2 tek lenfositte PCR amplifikasyon başarısızlığı oldu (%2). Allel dropout ise sadece olgu 3 te 1 lenfositte gözlendi (%1). Bu olguda HbS alleli amplifiye oldu ancak normal allel amplifikasyonu gözlenemedi. Genomik DNA ile uygulanan PCR larda ise herhangi bir sorunla karşılaşılmadı. Mikrosatellit markır analizlerinde herhangi bir sorunla karşılaşılmadı. Çalışmaya alınan 6 aile İzmir den, 2 aile Aydın dan, 1 aile Muğla dan ve 1 aile Balıkesir den geldi. Çalışmaya alınan toplam 32 birey (64 allel) için mikrosatellit markırlar incelendiğinde, D11S4891 için en sık saptanan alleller 103 bp (allel frekansı: 0,59) ve 101 bp (allel frekansı: 0,25) olarak belirlendi; heterozigotluk oranı %72 olarak hesaplandı. D13S314 için en sık saptanan alleller 137 bp (allel frekansı: 0,35) ve 147 bp (allel frekansı: 0,18) olarak belirlendi; heterozigotluk oranı %90 olarak hesaplandı. GABRB3 markırı için en sık saptanan alleller 181 bp (allel frekansı: 0,45) ve 183 bp (allel frekansı: 0,18) olarak belirlendi; heterozigotluk oranı %78 olarak hesaplandı. D11S2362 için en sık saptanan alleller 224 bp (allel frekansı: 0,32) ve 212 bp (allel frekansı: 0,20) olarak belirlendi; heterozigotluk oranı %93 olarak hesaplandı. Dört lokus için ortak gözlenen heterozigotluk oranı ise %83 olarak bulundu. Olgu 8 ile beraber çalışmaya alınan CD8 homozigot olgu ile 10. ailede çalışmaya katılan IVSII-1 homozigot olgu, D11S4891 ve D11S2362 markırları sonucunda, o ailelerdeki mutant allellerin belirlenmesinde yardımcı oldu. 89

BÖLÜM IV TARTIŞMA Dünya Sağlık Örgütü nün Afrika, Amerika, Avrupa, Orta Doğu, Güney Doğu Asya ve Batı Pasifik bölgesi olmak üzere toplam 6 bölgeden elde ettiği verilere göre hemoglobin bozukluklarının dünya genelinde %5 sıklıkta gözlendiği belirtilmiştir. Afrika da HbS + HbC + beta talasemi sıklığı %15, Uzak Doğu da HbE + alfa talasemi %6,5, Orta Doğu da HbS + beta talasemi %5,5, Batı Pasifik bölgesinde alfa talasemi + beta talasemi + HbE %3, Amerika da HbS + beta talasemi %3 ve Avrupa da beta-talasemi %1,5 sıklıkta gözlendiği yayınlanmıştır (113). Dünya da toplam 269 milyon taşıyıcı olduğunu saptamışlar. Uzakdoğu da 90 milyon, Afrika da 88 milyon, Batı Pasifik te 48 milyon, Orta Doğu da 20 milyon, Amerika da 15 milyon ve Avrupa da 8 milyon taşıyıcı bulunmaktadır. Dünyada yıllık 9,2 milyon gebe taşıyıcının 4 milyonu Afrika da, 2,7 milyonu Uzak Doğu da, 1,2 milyonu Batı Pasifik te, 700 bini Orta Doğu da, 400 bini Amerika da ve 200 bini Avrupa dadır. Bunlar arasında yıllık 1,47 milyon riskli gebenin 900 bini Afrika da, 280 bini Uzak Doğu da, 140 bini Batı Pasifik te, 90 bini Orta Doğu da, 40 bini Amerika da, 20 bini Avrupa da olarak hesaplanmıştır. Dünyada yıllık hasta doğan çocuk sayısını ise 365.000 olarak verilmektedir. Her yıl Afrika da 220.000, Uzak doğu da 70.000, Batı Pasifik te 40.000, Orta Doğu da 20.000, Amerika da 10.000 ve Avrupa da 5000 bebek hasta doğmaktadır (113). Dünyada bu kadar sık gözlenen beta talaseminin ülkelerdeki dağılımına bakacak olursak özellikle Akdeniz kuşağı ülkelerinde yüksek taşıyıcılık oranları görülmektedir. Örneğin İtalya da taşıyıcılık oranı bazı bölgelerde %30 lara kadar 90

çıkmaktadır (114). Yunanistan da %6-19 olan bu oran, Yunan adalarında %25 seviyelerindedir (115). Akdeniz kuşağında yer alan ülkemizde beta talasemi taşıyıcılığı genel oranı %2 olmakla beraber, bu sayı Türkiye nin bazı yörelerinde %10 a kadar çıkmaktadır. Yapılan çalışmalarda gebeliklerin %22 sinde risk belirlemeye ihtiyaç olacağı hesaplanmıştır (46). Taşıyıcılığın ve gebelik oranının yüksek olduğu ülkemizde talasemi ile mücadeleye çok önem verilmesi gerekir. Ülkemizde, hemoglobinopatiler ile ilgili yapılan ilk çalışmalar 1950 li yıllara dayanmaktadır. İlk moleküler çalışmalar ise 1987 yılında başlamıştır. Bu yıllardan sonra moleküler genetik çalışmalar büyük bir hız kazanmış ve Hb İstanbul, Hb Ankara, Hb Çapa gibi ilk kez ülkemizde tanımlanan nadir hemoglobin varyantları da saptanmıştır. Türkiye de, 1993 yılında, 3960 sayılı Kalıtsal Kan Hastalıkları ile Mücadele Kanunu çıkartılmış ve beraberinde, Sağlık Bakanlığı tarafından Akdeniz kıyı illerimizde talasemi merkezleri kurulmuştur. Bu merkezlerde hemoglobinopatilerin tedavisi ile birlikte talasemi tarama çalışmaları da başlatılmıştır. Özellikle evlenecek çiftlerde talasemi taraması yapılması önerilmiş, İl Hıfzıssıha Kurul kararı ile İzmir, Muğla, Antalya, Mersin ve Hatay da evlenecek çiftlere talasemi ve hemoglobinopati taraması zorunlu hale getirilmiştir. Akraba evliliklerinin sık oluşu ve doğum hızının yüksekliği, Türkiye de beklenenin de üzerinde β talasemili çocuk doğmasının nedeni olarak gösterilmektedir. Türk toplumunda 30 u aşkın mutasyon tanımlanmıştır ve bu geniş moleküler çeşitlilik, hastalığa önlem alma stratejilerini zorlaştırmaktadır (48). Türkiye de en sık rastlanılan mutasyon, IVSI- 110 un Türkiye genelinde %40 olan sıklığı, Orta Anadolu da %50 yi aşmakta, buna karşılık Doğu ve Güney Doğu Anadolu da %25 lere düşmektedir. Türkiye nin coğrafi bölgeleri, mutasyon sıklığı ve mutasyon çeşitliliği açısından 91

kıyaslandığında Batı ve Akdeniz bölgelerinin Türkiye genelindeki dağılımla uyumlu olduğu ancak Kuzey, Güney ve Doğu Anadolu bölgelerinin daha az heterojen ve mutasyonlar bakımından farklı olduğu gösterilmiştir (48). Ülkemizde, 1980 li yılların sonlarından itibaren hemoglobinopatilerin moleküler tanısı çeşitli yöntemlerle yapılmaktadır. Günümüze kadar, talasemi sendromları moleküler düzeyde tanımlanmış, tanıda kullanılan yöntemler gelişmiş ve otomatize sistemler devreye girmiştir. İlk kullanılan yöntemler dot-blot hibridizasyonu, ARMS ve restriksiyon enzimi analizleridir. Bu üç yöntem son derece güvenilir olmakla beraber özellikle doğum öncesi tanıda Türk toplumu gibi, mutasyon çeşitliliği çok olan toplumlarda uygulamak hızlı ve kolay değildir. Mutasyon saptamasında, genel olarak en sık gözlenen mutasyondan başlanarak, daha az görülen mutasyonlara doğru bir araştırma başlatılır ve ailelerin geldikleri bölgedeki mutasyon dağılımı da göz önünde bulundurulur. Beta globin Strip Assay (Vienna Lab) kiti Türkiye de talasemi tanısını büyük oranda kolaylaştırmıştır (116,117). Floresan işaretleme yöntemleri kullanılmaya başlandıktan sonra, mutasyon tanımlanmasında DNA dizi analizi geliştirilmiştir (118). Hem prenatal hem de postnatal örneklerde strip assay ve dizi analizi yöntemleri rahatlıkla kullanılabilmektedir. Klinik bir laboratuvar açısından hızlı, doğru ve güvenilir bir genotiplendirme yapmak büyük önem taşımaktadır. Bu amaçla geliştirilen real time PCR yöntemi, talasemi mutasyonlarının tanımlanmasında da kullanılmaktadır (111). Aynı anda birçok mutasyonu tarayabilmesi, kolay, güvenli, mutasyon saptama probları konusunda esnek olması nedeniyle tercih edilmektedir (111). Tüpler açılmadan tanıya gidildiğinden dolayı kontaminasyon riski oldukça düşüktür. Ayrıca elektroforeze 92

gerek kalmadan amplifikasyon esnasında sonucu almak ve gerekirse siklus sayısına müdahale edebilmek sistemin avantajlarındandır (55). Ülkemizde, özellikle prenatal tanı açısından büyük öneme sahip olan beta talasemi hastalığı için yeni yöntemlerin uygulanması kaçınılmazdır. Preimplantasyon genetik tanı yöntemiyle, 100 den fazla tek gen hastalığı için blastomer düzeyinde tanı imkanı bulunmaktadır (119). Diğer prenatal tanı yöntemlerinden ayrılan en belirgin özelliği, günümüzde en erken uygulanabilen tanı yöntemi olmasıdır. Kalıtsal bir hastalığa neden olan genetik bozukluğun embriyoda tanımlanması için hastalığa neden olan genin yapısının belirlenmiş olması gerekmektedir. PGT için başvuran çiftler, çoğunlukla ailelerinde kalıtsal bir hastalığın olduğunu ve bir sonraki çocuklarında da riskin bulunduğunu bilmektedirler. Bu çiftler değerlendirildiğinde, prenatal tanı, gamet donasyonu, çocuk edinme veya çocuk yapmama seçenekleri söz konusu olabilmektedir (120). Prenatal tanıdaki problem, gebeliğin başlamış ve devam ediyor olmasıdır. Olası bir gebelik sonlandırması birçok çift için travmatik olmaktadır. Psikolojik nedenlerin yanında dini sebeplerden de gebelik terminasyonunu istemeyen çiftler vardır. Preimplantasyon genetik tanı bu çiftler için uygun bir seçenek olarak gösterilmektedir (121). Beta talasemi hastalığı için de PGT yöntemi başarıyla uygulanmaktadır (112, 122-124). Beta talasemi için PGT protokolü, embriyodan alınacak olan tek bir hücrede (blastomer) PCR analizine dayanmaktadır. Farklı merkezlerin, tek hücre PCR ı için oluşturduğu birçok farklı yöntem mevcuttur (90, 97, 125, 126). Real time PCR yöntemi ile tek hücre PCR ı ve beta talasemi mutasyonlarının tanımlanması güvenli olarak yapılabilir (112). Tek hücre düzeyinde, real time PCR ile BRCA1 geninde tek baz değişikliğinin gösterildiği bir çalışma bulunmaktadır (127). Bu çalışmada nested 93

PCR uygulanmamış, FastStart DNA Master Hybridization Probes kiti kullanılarak, floresan işaretli hibridizasyon probları kullanılmış ve tek lenfositle yapılan çalışmada heterozigot ve mutant alleller saptanmıştır (127). Beta talasemi gibi sık ve heterojen gözlenen bir monogenik hastalık için, olguya spesifik yöntemlerin yerine, geniş mutasyonları tarayabilen tek bir PGT stratejisinin olması önem taşımaktadır (108). Hemoglobinopatiler için birçok PGT metodu uygulanmaktadır (50, 128, 129). Ancak bunlardan birkaçı geniş uygulamalara olanak vermektedir (51, 97). Genotiplendirmenin yanında uygulanacak olan protokol, tek hücre PCR ında karşılaşılabilecek olan amplifikasyon başarısızlığı, kontaminasyon ve ADO gibi istenmeyen durumları en az seviyede tutabilecek; doğru ve güvenilir bir yöntem olmalıdır (130). Tüm tek hücre metod ve protokolleri, klinikte tanı amaçlı kullanılmadan önce, genotipi önceden bilinen tek hücrelerle çalışılması önerilmektedir (108). Bizim çalışmamızda, beta globin gen bölgesindeki en sık rastlanan mutasyonları, tek hücre (lenfosit) düzeyinde, multipleks PCR ı takiben nested PCR - real time PCR ile tespit edebilen, HBB geni ile bağlı ve bağlı olmayan markırlar kullanarak ADO ve kontaminasyonu gözleyen ve HBB geni ile bağlı markırlar yardımıyla mutant alleli saptayabilen bir yöntem uygulanmıştır. Bakılan mutasyonlar, Türkiye deki talasemi olgularının yaklaşık olarak %90 ını kapsamaktadır (53). En sık mutasyonların bulunduğu ekzon 1, 1. intron ve ekzon 2 bölgeleri bu çalışmanın kapsamı içindedir. IVSII-745 mutasyonu amplifiye edilen bölgenin dışında bulunmaktadır. Ancak bu mutasyonun HBB geninin 5 UTR bölgesindeki polimorfik baz değişimi (+20C>T) ile cis durumda olduğu; dolayısıyla IVSII-745 ile +20C>T polimorfizminin birlikte gözlendiği belirtilmiştir (111). Çalışmamızda belirtilen A probu ile bu mutasyon da 94

tanımlanabilmiştir. Taranan mutasyonlara bakacak olursak sadece Türk toplumu değil, tüm Akdeniz toplumlarındaki mutasyonları ve IVSI-1G>T, IVSI- 5G>C, CD41/42-TCTT gibi Asya da sık gözlenen mutasyonları da tarayabiliyor olması protokolün avantajları arasındadır. Çalışmamızda, beta globin geni ile beraber mikrosatellit markırları da içeren multipleks PCR ı takiben nested PCR uygulanmıştır. İki aşamalı amplifikasyon yöntemi olarak bilinen nested PCR da ilk aşamada dış primerlerle hedef bölgedeki uzunca bir yerin amplifikasyonu sağlanır. Daha sonra bu amplifikasyon ürününden alınan örnekteki DNA nın daha kısa bir bölümü iç primerlerle çoğaltılmaktadır. Böylece ortamda tek bir hedef DNA bulunsa bile, bu yöntemle çok sayıda DNA elde edilebilir (131). İlk PCR da kontaminasyon olmuş olsa bile, ikinci PCR da farklı primerler kullanıldığından dolayı ilk bölge çoğaltılmamaktadır. Birçok litertürde, kontaminasyonu önlemek amacıyla bu yöntem tercih edilmektedir (132). Bizim çalışmamıza, toplam 10 çift, 9 heterozigot, 1 bileşik heterozigot mutasyon taşıyan çocukları alındı. Seçilen 2 ailede, homozigot hasta olan 2 kardeş daha çalışmaya eklendi. Hasta bireylerin çalışmaya dahil edilmesinin avantajı, HBB geni ile bağlı mikrosatellit markırlarda elde edilen değerlerin anne ve babadan kalıtılan mutant allelleri ortaya çıkarmasını sağlamaktır. Tek hücre çalışmasında, farklı her 2 allelin beraber amplifiye olup olmadığını test etmek amacıyla heterozigotluk (mutant/normal veya mutant/mutant) gereklidir. Her olgudan 10 lenfosit izole edildi ve toplam 100 lenfosit üzerinden amplifikasyon, kontaminasyon ve ADO durumları incelendi. Lenfosit izolasyonunda kullanılan Histopaque 1083, mononükleer hücre izolasyonunda sık ve sorunsuz olarak kullanılan bir ajandır (106). Bizim çalışmamızda da hücrelerin elde edilmesi sırasında herhangi bir problem yaşanmadı. FastStart High Fidelity PCR System, 95

dntpack (Roche) kiti ise zor koşulları olan PCR larda önerilmektedir (133). Çalışmamızda, Materyal-Metod bölümünde uygulanan protokol ile PCR ile başarılı sonuçlar alınmıştır. Çiftler arasında sadece birinde akrabalık tarif edildi. Beta talasemi gibi otozomal resesif kalıtım gösteren hastalıklarda akrabalık önem taşımaktadır ve bu kişilerde bakılan mikrosatellit markırların aynı olma olasılığı daha fazladır ki bu, kontaminasyon ve ADO analizini zorlaştırabileceği gibi, tek hücrede mutant alleli tanımlamada da zorluk yaratabilir. Bizim çalışmamızda 10 numaralı çiftte akrabalık belirtilmiş ve D11S2362 dışındaki tüm markırlarda anne ve baba allelleri aynı değer olarak saptanmış ancak mutant allel bu ailede gösterilebilmiştir. Lenfositle yapılan çeşitli çalışmalarda, amplifikasyon başarısı %87-99 ve ADO oranı %0-12 olarak bildirilmektedir (97, 112, 125, 134, 135). Bu çalışmada, tek hücre PCR ı uygulanan 100 lenfositte amplifikasyon başarısızlığı oranı %2 ve ADO oranı %1 olarak saptandı. Amplifikasyon başarısızlığının nedeni olarak hücrenin tüpe aktarılmasında sorun olabileceği veya hücre aktarılırken parçalanıp PCR için uygun olmayabileceği düşünüldü. ADO nun tam olarak nedeni açıklanamamış olsa da hücre lizis metodu ve tam başarılamayan lizis, uygunsuz PCR koşulları gibi PCR etkinliğini düzenleyen birçok faktör suçlanmıştır (89). Bizim çalışmamızda ADO nedeni olarak, seçilen tek lenfositin genetik yapısının uygunsuzluğu veya liziste oluşan bir sorun olduğu düşünüldü. Çalışılan 100 lenfositte kontaminasyon saptanmadı. Bu oranlar, literatürle uyumlu olmakla birlikte PGT uygulayan merkezlerin bildirdiği sınırlar çerçevesindedir (80). Özellikle kontaminasyon, en önemli ve belli ölçülerde önüne geçilebilir problemlerden birisidir. IVF kaynaklı parental kontaminasyon olabileceği gibi laboratuvar kaynaklı kontaminasyon da olabilmektedir. Bu 96

çalışmada laboratuvar ortamları açısından kontaminasyona azami dikkat edilmiş, uygun materyaller ve UV ışık gibi önlemler alınmıştır. Nested PCR uygulaması ve mikrosatellit markırların kullanılması da bu oranlara katkı sağladığı kanısındayız. Tek hücre çalışmasının real-time PCR sonuçlarını karşılaştıracak olursak, tüm lenfositlerin anne, baba ve hasta çocukların genotiplendirmeleri yapılmıştır. Her nested PCR için PCR negatif, proteinaz K negatif, su negatif, ilk PCR negatif eklendi, ancak Sonuçlar bölümünde her şekilde bunlar gösterilmedi. Erime eğrisi analizi sonucunda HbS probu dışındaki tüm problarda yüksek dercede gözlenen pik normal allel olarak not edilmiştir. Bu problar, normal diziyi tanıyacak şekilde dizayn edildiğinden dolayı, mutant allele bağlanan prob, baz değişikliğinden dolayı tam olarak bağlanamayacak ve ısı yükselirken düşük sıcaklıkta diziden ayrılacak ancak normal allele bağlanan prob, daha yüksek derecelerde diziden ayrılacaktır. Ayrıca bazı ailelerde, bulunabildiği takdirde o mutasyon için normal ve homozigot kontrol örnekleri de eklendi. Böylece, bulunan mutant veya normal eğrilerini bu örneklerle kanıtlamak mümkün olacaktır. Ancak bu problar, daha öncesinde genomik DNA lar ile test edildiğinden eğri paternleri bilinmekteydi. Bu çalışmamızın diğer bir parçası olan, mikrosatellit markır analizi için çalışmaya alınan bireyler rastgele olarak seçilmişlerdir. Aynı allelden fazla sayıda elde edip frekansını arttırabileceğinden dolayı, bireyler arasında akrabalık olmamasına dikkat edildi. Olgu seçiminde yaş sınırı belirlenmedi. Bu çalışmamızın amaçlarından ilki, Türk populasyonunda heterozigotluk oranı yüksek mikrosatellit markırların tespit edilmesi olarak belirlenmişti. Çalışmada 97

kullandığımız markırlar ile ilgili Türk literatüründe yapılmış herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Heterozigotluk oranları belirlendikten sonra ileride planlanacak olan talasemi ve talasemi dışı çalışmalarda bu markırların kullanılabilirliği açısından bir kaynak teşkil etmesi ve literatüre katkıda bulunulması da amaçlarımız arasındaydı. Olguların büyük bir kısmının (%44) İzmir doğumlu olması ve tüm olguların %85 i Ege Bölgesi doğumlu olmasının nedeni olarak, üniversite hastanemizin çoğunlukla İzmir ve yakın illerinden hasta potansiyeline sahip olması kanısına varıldı. Mikrosatellitler genom içinde dağılmış, daha çok kodlanmayan DNA bölgelerinde bulunan, yüksek derecede polimorfik, tekrar eden kısa DNA baz segmentleridir. Tekrar dizilerine göre dinükleotid, trinüklotid, tetranükleotid markırlar olarak bilinirler (100). Mikrosatellit markırların çalışmalarda kullanılabilmesi için ilgili populasyonlardaki allel dağılımlarının belirlenmesi ve bundan yararlanarak söz konusu lokusların istatistik parametrelerinin hesaplanması gerekmektedir. Gen sıklıkları ve allel frekansları populasyonlar arasında farklılık gösteriyorsa mutlaka kişinin ait olduğu populasyonun gen sıklığı ele alınmalı ve uygun olan markırlar seçilmelidir. Ayrıca popülasyonların DNA verileri oluşturulduğu zaman DNA profilinin değişim derecesinin saptanmasında ve popülasyonların orijini ve yapısı hakkında bilgi verecektir (136). Bu çalışmada, D11S4891, D13S314, GABRB3 ve D11S2362 olmak üzere toplam 4 mikrosatellit markır çalışıldı. Dinükleotid tekrar polimorfizmi olan D11S4891, beta globin geni ile bağlıdır. Akciğer kanserinde 11p15.5 bölgesinde heterozigotluk kaybı çalışmasında bu markır kullanılmıştır (137). Maksimum 98

heterozigosite oranı 0,72 olarak verilmiştir. Allel büyüklükleri ve frekansları, 85 bp (0,007), 97 bp (0,013), 101 bp (0,020), 103 bp (0,138), 105 bp (0,329), 107 bp (0,441), 109 bp (0,046), 111 bp (0,007) olarak verilmiştir (137). En sık gözlenen allel, 107 bp iken 2. sıklıkta 105 bp olarak verilmiştir. Bizim çalışmamızda en sık gözlenen allel 105 bp (0,37) ve 2. sıklıkta 103 bp (0,265) olarak saptandı. İki allel (85 bp ve 109 bp) bizim çalışmamızda gösterilemedi. Özellikle 85 bp allelinin çok nadir görüldüğü gözlenmektedir. Dinükleotid polimorfizmi olduğundan dolayı pikler birbiri üzerine binebilmekte, Taq polimerazın aktivitesine bağlı olarak beklemediğimiz ekstra pikler ortaya çıkabilmekte ve böylece 100 bp den küçük olan allelleri belirlemede analizi zorlaştırmaktadır (138). Bizim çalışmamızda D11S4891 markırı için heterozigotluk oranı, bu çalışmadan (%72) ve beklenenden (%73) daha yüksek olarak (%85) saptanmıştır. Çalışmada elde edilen en yüksek heterozigotluk oranı D11S4891 markırında saptandı. Diğer allellerdeki frekans farklılıkları toplumlar arası polimorfik bölgelerin değişken olabileceğini göstermektedir. Gastrin/kolesistokinin beyin reseptör geni (CCKBR) civarındaki tekrar polimorfizmlerini araştıran başka bir çalışmada da D11S4891 markırı kullanılmıştır (139). Diğer dinükleotid polimorfizmi olan D13S314, Wilson hastalığından sorumlu olan ATP7B geni ile bağlı bir markırdır. Wilson hastalarında haplotip analizi yapılan bir çalışmada bu markır kullanılmıştır (138). Bu çalışmada, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145 ve 147 bp allelleri bulunmuştur (138). Bizim çalışmamızda bunlara ek olarak 149 ve 151 bp allelleri saptanmıştır. Hindistan da yapılan başka bir çalışmada ise en sık alleller sırasıyla 151, 147, 99

141 ve 139 bp olarak belirtilmiş (140). Bizim çalışmamızda D13S314 markırı için sıklık sırasına göre allel frekansları en yüksek olan alleller 137, 151, 139, 147 bp olarak saptandı. Heterozigotluk oranı %79 olarak belirlendi. Ayrıca bu markır, Wilson hastalığı moleküler tanısında, linkaj çalışmalarında ve Wilson hastalığı analizinde ADO saptamada kullanılmıştır (141-143). Talasemi sendromlarında tek hücre genotiplendirme çalışmasında kontaminasyonu gözlemek için başka gruplar tarafından da bu markır kullanılmıştır (112) Prader-Willi / Angelman Sendromu bölgesinde yer alan GABAA reseptör beta 3 alt ünitesi (GABRB3) geni polimorfik bölgesi, Mutirangura ve ark. tarafından çalışılmıştır (144). Çalışmada, bizim çalışmamızla aynı alleller bulunmuş ve en sık alleller sırasıyla 181, 197, 195 ve 193 olarak belirtilmiş. Bizim çalışmamızda en sık alleller 181, 185, 187 ve 193 olarak hesaplanmış. Talasemi sendromları için tek hücre genotiplendirme çalışmasında kontaminasyonu gözlemek açısından bu markır da daha önce kullanılmıştır (112). Arjantin de yapılan başka bir çalışmada, nondelesyonlu Prader-Willi Sendromu olgularında etiyolojiyi saptamak için GABRB3 kullanılmıştır. Çalışmada saptanan alleller, Mutirangura ve ark. tarafından bulunan allelerden farklıdır (145). Bu farklılık, kullanılan primerler ve standardize edilen yöntemle ilişkli olabileceği düşünüldü. Bu çalışmada heterozigotluk oranı %83 olarak hesaplanmıştır. Bizim çalışmamızda, heterozigotluk oranı en düşük markır (%74) olarak saptandı. Ayrıca bu markır, Prader-Willi sendromu analizinde ve nonsendromik orofasiyel yarıklanmalarla ilişki kuran çalışmalarda kullanılmıştır (146). Bizim çalışmamızda kullanılan tek trinükleotid polimorfizmi olan D11S2362, beta globin geni ile bağlı ve heterozigotluk oranı beyaz ırkta 0,81 100

olarak bildirilmiştir (147). En sık alleller 218, 221, 227 ve 224 bp olarak verilmiştir. Bizim çalışmamızda heterozigotluk oranı, verilen literatürle uyumlu, %81 olarak bulundu. En sık gözlenen alleller ise 218, 224, 227 ve 215 bp olarak hesaplandı. Literatürde bu markır, adenokortikal tümör oluşumunda heterozigotluk kaybı çalışmasında ve obsesif kompulsif hastalık aile linkaj çalışmasında kullanılmıştır (148, 149). Genel olarak markır çalışması değerlendirildiğinde, tüm markırların heterozigotluk oranlarının ve anlamlılık düzeylerinin yüksek olduğu ve ileriki dönem çalışmalarda kullanılabilir olduğu gösterildi. Çalışmamızda kullanılan toplam 4 lokus için ortak gözlenen heterozigotluk oranı %80 olarak hesaplandı ve bu çalışma için seçilen markırların uygun oldukları belirlendi. Tek hücre çalışmasında, az sayıda bireyle elde edilen verilere göre, gözlenen heterozigotluk oranları, 200 allelde bulunan değerlere yakın değerler olarak bulundu ve 4 lokus için ortak heterozigotluk oranı ise önceki veriye (%80) yakın, %83 olarak hesaplandı. Türk toplumunun heterojen bir yapısı olduğu göz önüne alındığında farklı bölgelerde farklı allel dağılımları olabileceği göz önünde bulunduruldu ve bulunan değerlerin büyük oranda Batı Türkiye toplumunu yansıttığı düşünüldü. Heterozigotluk oranları, HBB geni ile bağlı olan markırlardan daha düşük olan GABRB3 ve D13S314 markırları yerine HBB geni ile bağlı ek markırların kullanılması daha akıllıca olacağı düşünüldü. Böylece ADO ve kontaminasyonu gözlemek dışında mutant alleli saptamada da yardımcı olacakları düşünüldü. PGT ile beraber insan lökosit antijeni (HLA) uygun embriyo seçimi, mevcut hasta çocukları olan aileler için bir seçenek olarak karşımıza çıkmaktadır. Beta talasemi, Fankoni anemisi gibi hastalıklarda doğum sonrası alınan kord kanı 101

hematopoetik kök hücre (HSC) ile hasta çocuğun tedavisi sağlanabilmektedir (150). HLA bölgesi 6. kromozomda bulunmakta ve insan genomundaki en polimorfik bölgelerden biri olarak kabul edilmektedir. Bu amaçla başvuran her PGT ailesi için informatif HLA allel lokuslarının belirlenebilmesi zor ancak gereklidir. Bu amaçla gen içi farklı bölgelerde 29 STR markırı PGD öncesi anne, baba ve hasta çocuk üzerinde deneyip, bilgi verici olanları kullanmak gerekliliği bildirilmiştir (150). Seçilen markırların incelenmesi sırasında yakın büyüklükte olanların üst üste gelmesi nedeniyle analiz zor olabilmektedir. Bu amaçla aile için önceden markırların belirlenip gerekirse farklı floresan boya ile işaretlenmiş primerlerin kullanılması gerekebilmektedir (150). STR markırları kullanılarak yapılan başka bir HLA çalışmasında, HLA lokusunun farklı bölgelerinden seçilmiş 7 adet markırın hazır bulundurulduğu ve en az 4 informatif markırın gerekliliği bildirilmiştir (151). Bu markırlar anne, baba ve hasta çocuktan alınmış, tek lenfositlerde denenmiş ve tek hücre PCR ına uygun, heterozigozitesi yüksek ve aile için informatif olan markırlar seçilmiştir (151). Tüm genom amplifikasyonu sonrasında HLA tiplendirmesi yapan başka bir çalışmada HLA lokusu farklı bölgelerinden seçilen 4 mikrosatellit markır ile genotiplendirme yapılmış (152). Bu çalışmada özellikle az sayıda allel ile HLA tiplendirmesinde yanlış sonuçlar elde edilebileceği, heterozigot olmayan markırlarla çalışılmaması gerektiği ve daha çok markırın eklenmesi gerektiği bildirilmiştir (152). Bizim çalışmamızda HLA markırları kullanılmamıştır ancak ileriki dönem tek hücre PCR çalışmalarında HBB geni ile bağlı olmayan markırların yerine uygun HLA markırları kullanılarak HLA uygunluğu aile içinde araştırılabilir. 102

Tek hücre çalışmamızda kullanılan mikrosatellit markırlar, multipleks olan ilk PCR da kullanılmışlardır. Allel dropout ve kontaminasyonu ekarte etmek amacıyla seçilen bağlı ve bağlı olmayan kısa tekrar dizileri içeren markırlar, belirlenen lokus için anne ve babanın farklı 2 şer allele ve tek hücrenin de 2 farklı allele sahip olması istenmektedir (98). İncelenen hücrede başka, ek bir allelin olması kontaminasyonu işaret edecektir (99). İkiden fazla parental allel varlığında ise kontaminasyon dışında anöploidi veya uniparental dizomi akla gelmelidir (100). Çalışmada kullanılan 4 markırdan 3 tanesi dinükleotid polimorfizmidir. Bu dizilerin, elektroforez sonrasında stutter adı verilen istenmeyen ek DNA fragmanları oluşturmaları ve tekrar sayıları nedeniyle üst üste pik vermeleri nedeniyle analizleri zorlaştırmaktadır. Trinükleotid veya tetranükleotid tekrar dizilerinin kullanılması, bu sorunu azaltacağı bildirilmiştir (144). D11S2362, trinükleotid polimorfizmidir ve analizinin diğer markırlara göre daha sorunsuz olduğu gözlenmiştir. İleriki çalışmalarda uygun olduğu takdirde tri veya tetranükleotid tekrar dizilerinin çalışılması planlanmıştır. Avrupa İnsan Üreme ve Embriyoloji Birliği (ESHRE) tarafından PGT uygulaması sırasında, öncesinde ve sonrasında dikkat edilmesi gereken durumlar bildirilmiştir (153). Özellikle ADO nedeniyle yanlış sonuç vermenin amplifikasyon başarısızlığından daha ciddi bir durum olduğu belirtilmiş. En az 50 heterozigot tek hücrenin çalışılıp, en az %90 amplifikasyon başarısı, <%5 kontaminasyon (mümkünse %0) ve mümkünse %10 un altında ADO oranı önerilmektedir. PCR protokolleri olarak nested PCR, floresan PCR ve multipleks PCR önerilmektedir (153). Bizim çalışmamaızda da bu öneriler dikkate alınmış ve uygun değerler elde edilmiştir. 103

Preimplantasyon genetik tanınıda tüm genom amplifikasyonu, array CGH gibi ileri teknik ve yöntemler de denenmektedir (154). Bu gibi yöntemlerde en büyük sorun, tek bir hücrenin varlığıdır. Primer uzama-preamplifikasyon (PEP)- PCR yöntemiyle talasemi mutasyonları tanımlanmış. Ayrıca kit kullanarak tüm genom amplifikasyonu yapılmış ve HLA tiplendirmesi başarılmıştır (154). Array- CGH in tek hücrede rutine girmesiyle beraber monogenik hastalıklar için tanı konulan embriyoların anöploidi veya diğer kromozomal hastalıklar için taranması da mümkün olabilecektir (152). 104

BÖLÜM V SONUÇLAR ve ÖNERİLER Multipleks PCR ve nested PCR (real-time PCR) kullanılarak tek hücrede (lenfosit) beta talasemi genotiplendirmesi başarıyla yapılmıştır. Multipleks PCR da kullanılan D11S2362, GABRB3, D13S2362 ve D11S4891 mikrosatellit markırlarını kullanarak ADO ve kontaminasyon izlenmiştir. Bu markırların, tek hücre çalışmasından önce Türk toplumunda heterozigotluk oranları araştırılmış ve tüm markırlar %74 ün üzerinde heterozigot olarak saptanmıştır. Bu 4 markır için ortak heterozigotluk oranı %80 olarak bulundu ve markırlar çalışma için uygun oldukları belirlendi. Heterozigotluk oranı en düşük olan, HBB geni ile bağlı olmayan GABRB3 ve D13S314 markırları yerine HBB geni ile bağlı markırlar kullanılabilir. Böylece ADO ve kontaminasyon dışında mutant alleller de saptanabilir. Ayrıca uygun PCR koşullarında HLA markırları eklenerek HLA tiplendirmesi de yapılabilir. Tek hücre çalışmasında, beta talasemi mutasyonunu heterozigot / bileşik heterozigot taşıyan probandlardan elde edilen tek lenfositler çalışıldı. Toplam 100 lenfositte amplifikasyon başarı oranı %98, ADO oranı %1 olarak saptandı. Örneklerin hiçbirisinde kontaminasyon saptanmadı. Bu çalışma, belirtilen markırlarla, ülkemizde yapılmış olan ilk heterozigotluk çalışması ve real time PCR ile tek hücrede beta talasemi genotiplendirmesi yapılan ilk çalışma olarak dikkat çekmektedir. Bu çalışmanın tecrübe ve deneyimleri sonrasında, ileride blastomer ve diğer tek hücrelerde talasemi ve diğer tek gen hastalıklarında bu yöntem uygulanabilecektir. 105

BÖLÜM VI ÖZET / ABSTRACT TEK HÜCREDE REAL TIME PCR İLE BETA TALASEMİ MUTASYONLARININ TANIMLANMASI Dr. Burak DURMAZ Doktora Tezi, Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Ferda ÖZKINAY Ekim 2009, 139 sayfa Ülkemizde beta talasemi mutasyonu taşıyan yaklaşık 1,5 milyon kişi bulunmaktadır. Taşıyıcı ve hasta bireylerin hasta çocuğa sahip olmamaları için bir seçenek preimplantasyon genetik tanı (PGT) dır. PGT, embriyoların anne rahmine yerleştirilmeden önce genetik tanısı yapılarak sağlıklı embriyoların seçilmesi işlemidir. Blastomer ile çalışmadan önce diğer tek hücre kaynakları ile protokol test edilmelidir. Bu çalışmada, beta talasemi mutasyonu heterozigot olarak belirlenmiş 9 bireyden ve bileşik heterozigot olarak belirlenmiş 1 bireyden elde edilen periferik kandan, mikromanipülasyonla tek lenfositler elde edilmiş ve bu kişilerin anne, babaları ve 2 ailede 2 homozigot hasta bireyle beraber genotiplendirilmiştir. Beta globin gen bölgesi ile 3 adet gen içi ve 2 adet gen dışı polimorfik markırların multipleks PCR ı uygulanmıştır. Bu markırlar, öncesinde 100 kişiden oluşan Türk populasyonu üzerinde incelenerek heterozigotluk oranları hesaplanmıştır. İkinci PCR, nested PCR olarak dizayn edilmiş olup, her mutasyona özgün farklı sentez ettirilmiş olan Light Cycler probları kullanılmıştır. Ayrıca ilk PCR dan elde edilen ürünler sekans cihazında incelenerek kontaminasyon ve allel dropout incelenmiştir. D11S4891, D13S314, GABRB ve D11S2362 markırları için heterozigotluk oranları %74 ün üzerinde bulundu. Seçilen 10 birey için uygulanan tek hücre PCR ında tüm hibridizasyon probları denendi; %98 amplifikasyon başarısı ve %1 ADO saptandı. Kontaminasyon gözlenmedi. Çalışmaya alınan tüm bireylerin genotiplendirmesi başarıyla yapıldı. Bu çalışmayla elde edilen bilgi ve deneyimler, ileriki dönem tek hücre çalışmalarına ışık tutacaktır. Anahtar sözcükler: Beta talasemi, tek hücre, mutasyon, gerçek zamanlı PCR e-mail: burak.durmaz@ege.edu.tr 106

ABSTRACT DETECTION OF BETA-THALASSEMIA MUTATIONS IN SINGLE CELLS BY USING REAL TIME PCR Dr. Burak DURMAZ PhD Thesis, Department of Pediatrics Supervisor: Prof. Dr. Ferda ÖZKINAY October 2009, 139 pages In our country, the number of the beta-thalassemia carriers has been estimated as 1,5 million. Preimplantation genetic diagnosis (PGD) is one of the options for the carriers and beta thalassemia patients to have a healthy child. PGD is defined as the selection of the healthy embrios by genetic testing prior to implantation. The protocol has to be tested with other sources of single cells before working with blastomeres. In this study, blood obtained from heterozygotes / compound heterozygotes for beta thalassemia are used to isolate a single lymphocyte by micromanipulation. In this study, blood samples obtained from 9 patients with known heterozygote mutation and 1 with known compound heterozygote mutation were used to isolate single lymphocytes. The lympocytes, the parents of the probands and 2 children with homozygous mutation in 2 families were genotyped. Multiplex PCR including the beta globin gene region, 3 linked and 2 unlinked polymorphic markers was done. These markers were tested on 100 people from Turkish population for the calculation of heterozygosity rates. Second PCR was designed as nested PCR and seperate Light Cycler hybridization probes were used for each set of mutations. Besides, first PCR products were analyzed in the sequencer for contamination and allele dropout. The heterozygosity rates of D11S4891, D13S314, GABRB and D11S2362 markers ranged between 74% and 85%. All the hybridization probe sets were used in the selected 10 probands. An amplification efficiency rate and ADO rate were 98% and 1% respectively. No contamination was observed. The genotyping was successful for all the volunteers enrolled in the study. The knowledge and experince gathered from this study will light on further studies including PGD. Key words: Beta thalassemia, single cell, mutation, real-time PCR e-mail: burak.durmaz@ege.edu.tr 107

BÖLÜM VII YARARLANILAN KAYNAKLAR 1. Marengo-Rowe, A.J. (2006). Structure-function relations of human hemoglobins, Proc, 19(3):239-245 2. Hedlund, B. (1980). Hemoglobins of human embryos, fetuses, and neonates. In: Fairbanks V.F., ed. Hemoglobinopathies and thalassemias. New York: Brian C. Decker, p:14 17 3. Weatherall, D.J., Clegg, J.B., Higgs, D.R., Wood, W.G. (2001). The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease (ed. Scriver, C. R.) McGraw Hill, New York, p:4571 4636 4. Stamatoyannopoulos, G., Grosveld, F. (2001). The Molecular Basis of Blood Disease (eds Stamatoyannopoulos, G., Majerus, P. W., Perimutter, R. M. & Varmus, H.), Saunders, New York, p:135 182 5. Weatherall, D.J. (1997). ABC of clinical haematology. The hereditary anaemias, BMJ, 314:492 496 6. Marengo-Rowe, A.J. (1971). Haemoglobinopathies, Br J Hosp Med, 6:617 630 7. Weatherall, D.J. (2001). Phentotype-genotype relationships in monogenic disease: Lessons from the Thalassaemias, Nat Rev Genet, 2(4):245-255 8. Rodwel, V.W., Murray, R.K., Granner, D.K., Mayes, P.A. (1988). Harper s Biochemistry, Appleton & Lange 21.edition, p:41-49 108

9. Angastiniotis, M., Modell, B. (1998). Global epidemiology of hemoglobin disorders, Ann N Y Acad Sci, 850:251-269 10. Kutlar, A. (2007). Sickle cell disease: a multigenic perspective of a single gene disorder, Hemoglobin, 31(2):209-224 11. Trompeter, S., Roberts, I. (2009). Haemoglobin F modulation in childhood sickle cell disease, Br J Haematol, 144(3):308-316 12. William F. Kern. (2002). The inherited hemolytic anemias: Hemoglobinopathies, thalassemias, enzyme deficiencies, and membran defects. PDQ Hematolology, BC Dexter Inc Ed., p:91-92 13. Vichinsky, E. (2007). Hemoglobine syndromes, Hematology Am Soc Hematol Educ Program, p:79-83. 14. Fucharoen, S., Winichagoon, P. (2000). Clinical and hematologic aspects of hemoglobin E beta-thalassemia, Curr Opin Hematol, 7:106-112 15. Jacsch, R. (1890). Uber Diagnose und Therapie der Erkrankungen des Blutes. Prager Med Wochenschr, 15(389):403 414 16. Cooley, T.B., Lee, P. (1927). A series of cases of splenomegaly in children and peculiar changes in bones; report of cases. Am J Dis Child, 34:347 363 17. Whipple, G.H., Bradford, W.L. (1936). Mediterranean disease thalassemia (erythroblastic anemia of Cooley); associated pigment abnormalities simulating hemochromatosis, J Pediatr, 9:279 311 18. Weatherall, D.J. (1980). In Wintrobe MM, ed. Blood, Pure and Eloquent: A Story of Discovery, of People, and of Ideas. New York: McGraw-Hill, p:378 19. Weatherall, D.J, Clegg, J.B. (2001). The Thalassaemia Syndromes (ed 4th). Oxford: Blackwell Science, p:287-291 109

20. Marengo-Rowe, A.J. (2007). The thalassemias and related disorders. Proc, 20(1):27-31 21. Thein, S.L. (2005). Pathophysiology of {beta} Thalassemia--A Guide to Molecular Therapies. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, p:31 22. Weatherall, D. J. (1998). Pathophysiology of thalassaemia. Clin. Haematol, 11: 127 146 23. Hillman, R., Ault, K. (2002). Hematology in Clinical Practice. 3rd ed. New York: McGraw-Hill, p:65-80 24. Cao, A., Rosatelli, M., Monni, G., Galanello, R. (2002). Screening for thalassemia: a model for success, Obstet Gynecol Clin North Am, 29:305 328 25. Cunningham, M.J., Macklin, E.A., Neufeld, E.J., Cohen, A.R. (2004). Thalassemia Clinical Research Network. Complications of beta-thalassemia major in North America, Blood, 104(1):34 39 26. Rund, D., Rachmilewitz, E. (2005). Beta-thalassemia, N Engl J Med, 353(11):1135 1146 27. Fucharoen, S., Winichagoon, P. (1997). Hemoglobinopathies in Southeast Asia: molecular biology and clinical medicine, Hemoglobin, 21:299 319 28. Birgens, H., Ljung, R. (2007). The thalassaemia syndromes, Scan J Clin Lab Invest, 67(1):11-26 29. Forget, B.G. (2001). Molecular Genetics of the Human Globin Genes. In: Steinberg, M.H., Forget, B.G., Higgs, D.R., Nagel, R.L., editors. Disorders of Hemoglobin: Genetics, Pathophysiology, and Clinical Management. Cambridge, UK: Cambridge University Press, p:117-130 110

30. Stamatoyannopoulos, G., Woodson, R., Papayannopoulou, T., et al. (1974). Inclusion-body beta thalassemia trait. A form of beta thalassemia producing clinical manifestations in simple heterozygotes, N. Engl. J. Med, 290:939 943 31. Huisman, T.H.J., Carver, M.F.H., Baysal, E.A. (1977). Syllabus of Thalassemia Mutations 1st ed, p:1 309 32. Bianco, I., Cappabianca, M.P., Foglietta, E., et al. (1997). Silent thalassemias: genotypes and phenotypes, Haematologica, 82: 269 280 33. Tamagnini, G.P., Lopes, M.C., Castanheira, M.E., et al. (1983). Beta + thalassaemia Portuguese type: clinical, haematological and molecular studies of a newly defined form of beta thalassaemiaü, Br J Haematol, 54(2):189 200 34. Weatherall, D.J. Clegg, J.B., Wood, W.G., et al. (1980). The clinical and molecular heterogeneity of the thalassaemia syndromes, Ann NY Acad Sci, 344:83 100 35. Kan, Y.W., Nathan, D.G. (1970). Mild thalassemia: the result of interactions of α and β thalassemia genes, J Clin Invest, 49:635 642 36. Galanello, R.E., Dessi, M.A., Melis, M., et al. (1989). Molecular analysis of β o - thalassemia intermedia in Sardinia, Blood, 74:823 827 37. Kanavakis, E., Metaxatou-Mavromati, A., Kattamis, C., et al. (1983). The triplicated α gene locus and β thalassaemia, Br J Haematol, 54:201 207 38. Sampietro, M., Lupica, L., Perrero, L., et al. (1997). The expression of uridine diphosphate glucuronosyltransferase gene is a major determinant of bilirubin level in heterozygous β-thalassaemia and in glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency, Br J Haematol, 99:437 439 111

39. Piperno, A., Mariani, R., Arosio, C., et al. (2000). Haemochromatosis in patients with β-thalassaemia trait, Br J Haematol, 111:908 914 40. Voskaridou, E., Terpos, E. (2004). New insights into the pathophysiology and management of osteoporosis in patients with beta thalassaemia, Br J Haematol, 127(2):127-139 41. Wonke, B. (1998). Annotation: bone disease in β-thalassaemia major, Br J Haematol, 103:897 901 42. Perrota, S., Cappellini, M.D., Bertoldo, F., et al. (2000). Osteoporosis in β thalassaemia major patients: analysis of the genetic background, Br J Haematol, 111:461 466 43. World Health Organization. (1994). Guidelines for the control of haemoglobin disorders. Report of the VIth Annual Meeting of the WHO Working Group on Haemoglobinopathies, Cagliari, Sardinia 44. Arcasoy, A., Canatan, D.,Köse, M., Üstündağ, M. (2002). Hemoglobinopati ve Talasemi, Önlem-Tanı-Tedavi.Antalya: SiyahGrafik Maatbacılık Ltd, p:13-17 45. DNA ve Hemoglobinler, Tanı ve Tedavi: T.C. Sağlık Bakanlığı AÇSAP Genel Müdürlüğü (2007). Talasemi ve hemoglobinopatiler. Hemoglobinopati kontrol programı, p:29 46. Modell, B., Darlison, M., Birgens, H., et al. (2007). Epidemiology of haemoglobin disorders in Europe: an overview, Scand J Clin Lab Invest, 67: 39 70 47. Altay, C. (2002). The Frequency and Distribution Pattern of ß-Thalassemia Mutations in Turkey, Turk J Haematol, 19(2):309-315 112

48. Ghazi, O., Tadmouri, A., Basak, N. (2001). Β-thalassemia in Turkey; A review of the clinical epidemiological molecular and evolutionary aspects, Hemoglobin 25(2):227-239 49. Old, J.M. (2007). Screening and genetic diagnosis of haemoglobinopathies, Scand J Clin Lab Invest, 67:71-86 50. Kuliev, A., Rechitsky, S., Verlinsky, O., et al. (1998). Preimplantation diagnosis of thalassaemias, J Assist Reprod Genet, 15:219 225 51. El-Hashemite, N., Wells, D., Delhanty, J.D. (1997). Single cell detection of beta-thalassaemia mutations using silver stained SSCP analysis: an application for preimplantation diagnosis, Mol Hum Reprod, 3:693 698 52. Kanavakis, E., Traeger-Synodinos, J., Vrettou, C., et al. (1997). Prenatal diagnosis of the thalassaemia syndromes by rapid DNA analytical methods, Mol Hum Reprod, 3:523 528 53. Tadmouri, G.O., Tüzmen, S., Ozçelik, H., et al.(1998). Molecular and population genetic analyses of beta-thalassemia in Turkey, Am J Hematol, 57(3):215-220 54. Kotler, L., Sobolev, I., Ulanovsky, L. (1994). DNA sequencing: modular primers for automated walking, Biotechniques, 17(3):554-559 55. Reuter, M., Küpper, Y., Schmitz, A., et al. (2005). Detection of new single nucleotide polymorphisms by means of real time PCR, Journal of Genetics, 84(3): 341-345 56. Mengelle, C., Pasquier, C., Rostaing, L., et al. (2003). Quantitation of human cytomegalovirus in recipients of solid organ transplants by real-time quantitative PCR and pp65 antigenemia, J Med Virol, 69(2):225-231 113

57. Perandin, F., Manca, N., Calderaro, A., et al. (2004). Development of a realtime PCR assay for detection of Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, and Plasmodium ovale for routine clinical diagnosis, J Clin Microbiol, 42(3):1214-1219 58. Dietmaier, W., Hofstädter, F. (2001). Detection of microsatellite instability by real time PCR and hybridization probe melting point analysis, Lab Invest, 81(10):1453-1456 59. Cottrell, S.E., Distler, J., Goodman, N.S., et al. (2004). A real-time PCR assay for DNA-methylation using methylation-specific blockers, Nucleic Acids Res, 32(1):e10 60. Thiede, C. (2004). Diagnostic chimerism analysis after allogeneic stem cell transplantation: new methods and markers, Am J Pharmacogenomics, 4(3):177-187 61. Gupta, M., Song, P., Yates, C.R., et al. (2004). PCR-based genotyping assay for CXCR2 polymorphisms, Clin Chim Acta, 341(1-2):93-100 62. Bischoff, F.Z., Sinacori, M.K., Dang, D.D., et al. (2002). Cell-free fetal DNA and intact fetal cells in maternal blood circulation: implications for first and second trimester non-invasive prenatal diagnosis, Hum Reprod Update, 8(6):493-500 63. Lyon, E., Wittwer, C.T. (2009). LightCycler technology in molecular diagnostics, J Mol Diagn, 11(2):93-101 64. Kan, Y.W., Golbus, M.S., Dozy, A.M. (1976). Prenatal diagnosis of alphathalassemia. Clinical application of molecular hybridization, N Engl J Med, 295:1165-1167 114

65. Eisenberg, B., Wapner, R.J. (2002). Clinical proceduress in prenatal diagnosis, Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol, 16:611-627 66. Evans, M.I., Wapner, R.J. (2005). Invasive prenatal diagnostic procedures, Semin Perinatol, 29:215-218 67. Lo, Y.M., Corbetta, N., Chamberlain, P.F., et al. (1997). Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum, Lancet, 350:485-487 68. Clark, B.E., Thein, S.L. (2004). Molecular diagnosis of haemoglobin disorders, Clin Lab Haematol, 26:159-176 69. Wells, D., Delhanty, J.D. (2001). Preimplantation genetic diagnosis: applications for molecular medicine, Trends Mol Med, 7:23 30 70. Cieslak, J., Tur-Kaspa, I., Ilkevitch, Y., et al. (2006). Multipl micromanipulations for preimplantation genetic diagnosis do not affect embryo development to the blastocyst stage, Fertility and Sterility, 85:1826-1829 71. Coutelle, C., Williams, C., Handyside, A., et al. (1989). Genetic analysis of DNA from single human oocytes: a model for preimplantation daignosis of cytstic fibrosis, Br Med J, 299:2-24. 72. Handyside, A.H., Pattinson, J.K., Penketh, R.J., et al. (1989). Biopsy of human preimplantation embryos and sexing by DNA amplification, Lancet, 1:347-349. 73. Handyside, A.H., Kontogianni, E.H., Hardy, K., et al. (1990). Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification, Nature, 344:769-770 74. Harper, J.C., Handyside, A.H. (1994). The current status of preimplantation diagnosis, Curr Obstet Gynaecol, 4:143-149 115

75. Delhanty, J.D., Harper, J.C. (2000). Pre-implantation genetic diagnosis, Baillieres Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol, 14:691 708 76. Sermon, K., Lissens, W., Nagy, Z.P., et al. (1995). Simultaneous amplification of the two most frequent mutations of infantile Tay-Sachs disease in single blastomeres, Hum Reprod, 10:2214-2217 77. Kontogianni, E.H., Griffin, D.K., Handyside, A.H. (1996). Identifying the sex of human preimplantation embryos in X-linked disease: amplification efficiency of a Y-specific alphoid repeat from single blastomeres with two lysis protocols, J Assist Reprod Genet, 13(2):125-132 78. Cui, K.H., Matthews, C.D. (1996). Nuclear structural conditions and PCR amplification in human preimplantation diagnosis, Mol Hum Reprod, 2(1):63-71 79. Ray, P.F., Ao, A., Taylor, D.M., et al. (1998). Assessment of the reliability of single blastomere analysis for preimplantation diagnosis of the delta F508 deletion causing cystic fibrosis in clinical practice, Prenat Diagn, 18(13):1402-1412 80. ESHRE PGD Consortium Steering Committee. ESHRE Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD) Consortium: data collection III. (2002). Hum Reprod,17:233-246 81. Handyside, A.H. (1998). Clinical evaluation of preimplantation genetic diagnosis. Prenat Diagn, 18:1345-1348 82. Van Steirteghem, A.C., Nagy, Z., Joris, H., et al. (1993). High fertilization and implantation rates after intracytoplasmic sperm injection, Hum Reprod, 8:1061-1066 116

83. Holding, C., Monk, M. (1989). Diagnosis of beta-thalassaemia by DNA amplification in single blastomeres from mouse preimplantation embryos, Lancet, 2:532-535 84. Katz, M.G., Trounson, A.O., Cram, D.S. (2002). DNA fingerprinting of sister blastomeres from human IVF embryos, Hum Reprod, 17:752 759 85. Handyside, A.H., Delhanty, J.D. (1997). Preimplantation genetic diagnosis: strategies and surprises, Trends Genet, 13:270 275 86. Findlay, I., Ray, P., Quirke, P., et al. (1995). Allelic dropout and preferential amplification in single cells and human blastomeres:implications for preimplantation diagnosis of sex and cystic fibrosis, Hum Reprod, 10:1609 1618 87. Rechitsky, S., Strom, C., Verlinsky, O., et al. (1998). Allele dropout in polar bodies and blastomeres, J Assist Reprod Genet, 15(5):253 257 88. Piyamongkol, W., Bermudez, M.G., Harper, J.C., et al. (2003). Detailed investigation of factors influencing amplification efficiency and allele drop-out in single cell PCR: implications for preimplantation genetic diagnosis, Mol Hum Reprod, 9(7):411 420 89. Thornhill, A.R., McGrath, J.A., Eady, R.A.J, et al. (2001). A comparison of different lysis buffers to assess allele dropout from single cells for preimplantation genetic diagnosis, Prenat Diagn, 21: 490-497 90. Vrettou, C., Palmer, G., Kanavakis, E., et al. (1999). A widely applicable strategy for single cell genotyping of b-thalassaemia mutations using DGGE analysis: application to preimplantation genetic diagnosis, Prenat Diagn, 19:1209-1216 117

91. Ray, P.F., Handyside, A.H. (1996). Increasing the denaturation temperature during the first cycles of amplification reduces allele drop out from single cells for preimplantation diagnosis, Mol Hum Reprod, 2:213-218 92. El-Hashemite, N., Delhanty, J.D. (1997). A technique for eliminating allele specific amplification failure during DNA amplification of heterozygous cells for preimplantation diagnosis, Mol Hum Reprod, 3(11):975-978 93. Findlay, I., Matthews, P., Quirke, P. (1998). Multiple genetic diagnosis from single cells using multiplex PCR: reliability and allele drop-out, Prenat Diagn, 18:1413-1421 94. Piyamongkol, W., Harper, J.C., Sherlock, J.K., et al. (2001). A successful strategy for preimplantation genetic diagnosis of myotonic dystrophy using multiplex fluorescent PCR, Prenat Diagn, 21:223-232 95. Sherlock, J., Cirigliano, V., Petrou, M., et al. (1998). Assessment of diagnostic quantitative fluorescent multiplex polymerase chain reaction assays performed on single cells, Ann Hum Genet, 62:9-23 96. Eggerding, F.A., Iovannisci, D.M., Brinson, E., et al. (1995). Fluorescencebased oligonucleotide ligation assay for analysis of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene mutations, Hum Mutat, 5(2):153-165 97. Piyamongkol, W., Harper, J.C., Delhanty, J.D., et al. (2001). Preimplantation genetic diagnostic protocols for alpha- and beta-thalassaemias using multiplex fluorescent PCR, Prenat Diagn, 21(9):753-759 98. Harper, J.C., Wells, D., Piyamongkol, W., et al. (2002). Preimplantation genetic diagnosis for single gene disorders: experience with five single gene disorders, Prenat Diagn, 22(6):525-533 118

99. Holding, C., Bentley, D., Roberts, R., et al. (1993). Development and validation of laboratory procedures for preimplantation diagnosis of Duchenne muscular dystrophy, J Med Genet, 30(11):903-909 100. Sermon, K. (2002). Current concepts in preimplantation genetic diagnosis (PGD): a molecular biologist's view, Hum Reprod Update, 8(1):11-20 101. Harton, G.L., Tsipouras, P., Sisson, M.E., et al. (1996). Preimplantation genetic testing for Marfan syndrome, Mol Hum Reprod, 2(9):713-715 102. Jiang Y., Slager S.L., Huang J. (2001). Genome scan for linkage to asthma using a linkage disequilibrium-lod score test., Genet Epidemiol, 21 Suppl 1:S303-7 103. Bernard, M.H., Sidhu, S., Berger, N., et al. (2003). A Case Report in Favor of a Multistep Adrenocortical Tumorigenesis. J Clin Endocrinol Metab, 88:998 1001 104. Mutirangura, A., Ledbetter, S.A., Kuwano, A., et al. (1992). Dinucleotide repeat polymorphism at the GABAA receptor b3 (GABRB3) locus in the Angelman/Prader- Willi region (AS/PWS) of chromosome 15, Hum Mol Genet, 1:67 105. Thomas, G.R., Bull, P.C., Roberts, E.A., et al. (1994). Haplotype studies in Wilson disease, Am J Hum Genet, 54:71 78 106. Boyum, A. (1968). Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of mononuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g, Scand J Clin Lab Invest, 21:77-89 107. Feldman, D.L., Mogelesky, T.C. (1987). Use of Histopaque for isolating mononuclear cells from rabbit blood, J Immunol Methods, 102:243-249 119

108. Traeger-Synodinos, J., Vrettou, C., Palmer, G., et al. (2003). An evaluation of PGD in clinical genetic services through 3 years application for prevention of beta-thalassaemia major and sickle cell thalassaemia, Mol Hum Reprod, 5:301 307 109. Cao, A., Rosatelli, M.C., Eckman, J.R. (2001). Prenatal diagnosis and screening for thalassemia and sickle cell disease. In: Steinberg, M.H., Forget, B.G., Higgs, D.R., Nagel, R.L., editors. Disorders of hemoglobin: genetics, pathophysiology and clinical management. Cambridge: Cambridge University Press. p:958 978 110. Old, J.M. (2001). DNA based diagnosis of the hemoglobin disorders. In: Steinberg, M.H., Forget, B.G., Higgs, D.R., Nagel, R.L., editors. Disorders of hemoglobin: genetics, pathophysiology and clinical management. Cambridge: Cambridge University Press. p:941 957 111. Vrettou, C., Traeger-Synodinos, J., Tzetis, M., et al. (2003). Rapid screening of multiple b-globin gene mutations by real time PCR (LightCyclerTM): application to carrier screening and prenatal diagnosis for thalassemia syndromes, Clin Chem, 49:769 776 112. Vrettou, C., Traeger-Synodinos, J., Tzetis, M., et al. (2004).Real-Time PCR for Single-Cell Genotyping in Sickle Cell and Thalassemia Syndromes as a Rapid, Accurate, Reliable, and Widely Applicable Protocol for Preimplantation Genetic Diagnosis, Hum Mutat, 23:513-521 113. Canatan D. (2006) Dünyada ve Türkiye de anormal hemoglobinler. Talasemi ve hemoglobinopatiler, p:11-19 114. Cao, A., Rosatelli, C., Galenello, R., et al. (1989). The Prevention of Thalassemia in Sardinia, Clin Genet, 36: 277-285 120

115. Kollia, P., Karababa, P.H., Sinopoulou, K., et al. (1992). Beta-thalassaemia mutations and the underlying beta gene cluster haplotypes in the Greek population, Gene Geogr, 6(1-2):59-70 116. Bilenoğlu, O. (1996). Molecular Analysis of β-thalassemia and Hemoglobins by the βglobin Strip Assay: A novel diagnostic approach,yüksek Lisans Tezi, Boğaziçi Üniversitesi 117. Latif, A. (2006). Molecular Analysıs of Hemoglobinopathies and Construction of a Database; Identification of a Novel IVS-II-2 (T-A) Mutation, Yüksek Lisans, Boğaziçi Üniversitesi 118. Kotler, L., Sobolev, I., Ulanovsky, L. (1994). DNA sequencing: modular primers for automated walking, Biotechniques, 17(3):554-559 119. Bick, D.P., Lau, E.C. (2006). Preimplantation genetic diagnosis, Pediatr Clin North Am, 53(4):559-577 120. Ogilvie, C.M., Braude, P.R., Scriven, P.N. (2005). Preimplantation genetic diagnosis--an overview, J Histochem Cytochem, 53(3):255-260 121. Grace, J., El Toukhy, T., Braude, P. (2004). Pre-implantation genetic testing, BJOG, 111(11):1165-1173 122. Kuliev, A., Rechitsky, S., Verlinsky, O., et al. (1999). Birth of healthy children after preimplantation diagnosis of thalassemias, J Assist Reprod Genet, 16(4):207-211. 123. Jiao, Z., Zhou, C., Li, J., et al. (2003). Birth of healthy children after preimplantation diagnosis of beta-thalassemia by whole-genome amplification, Prenat Diagn, 23(8):646-651. 121

124. Kokkali, G., Vrettou, C., Traeger-Synodinos, J., et al. (2005). Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major, Hum Reprod, 20(7):1855-1859 125. Hussey, N.D., Davis, T., Hall, J.R., et al. (2002). Preimplantation genetic diagnosis for beta-thalassaemia using sequencing of single cell PCR products to detect mutations and polymorphic loci, Mol Hum Reprod, 8(12):1136-1143 126. Fiorentino, F., Magli, M.C., Podini, D., et al. (2003). The minisequencing method: an alternative strategy for preimplantation genetic diagnosis of single gene disorders, Mol Hum Reprod, 9(7):399-410 127. Pals, G., Young, C., Mao, H.S., Worsham, M.J. (2001). Detection of a single base substitution in a single cell using the LightCycler, J Biochem Biophys Methods, 47(1-2):121-129. 128. De Rycke, M., Van de Velde, H., Sermon, K., et al. (2001). Preimplantation genetic diagnosis for sickle-cell anemia and for beta-thalassemia, Prenat Diagn, 21(3):214-222 129. Ray, P.F., Kaeda, J.S., Bingham, J., et al. (1996) Preimplantation genetic diagnosis of beta-thalassaemia major, Lancet, 347:1696 130. Wells, D. and Sherlock, J.K. (1998). Strategies for preimplantation genetic diagnosis of single gene disorders by DNA amplification, Prenat Diagn, 18: 1389-1401. 131. Messmer, T.O., Skelton, S.K., Moroney, J.F., et al. (1997). Application of a nested, multiplex PCR to psittacosis outbreaks, J Clin Microbiol, 35(8):2043-2046 122

132. Lewis, C.M., Pinel, T., Whittaker, J.C. and Handysie, A.H. (2001). Controlling misdiagnosis errors in preimplantation genetic diagnosis: a comprehensive model encompassing extrinsic and intrinsic sources of error, Hum Reprod, 16, 43-50 133. Birch, D.E. (1996). Simplified hot start PCR, Nature, 381(6581):445-446 134. Monk, M., Holding, C. (1990). Amplification of a beta-haemoglobin sequence in individual human oocytes and polar bodies, Lancet, 335:985 988 135. Kuliev, A., Rechitsky, S., Verlinsky, O., et al. (1998). Chromosomal mosaicism in cleavage-stage human embryos and the accuracy of single-cell genetic analysis, J Assist Reprod Genet, 15:276 280 136. Filoğlu, G. (1999). 7 Tetramerik STR lokusunun kriminal identifikasyonundaki önemi (Doktora Tezi). İstanbul Üniversitesi Adli Tıp Enstitüsü, Fen Bilimleri Anabilim Dalı 137. O'Briant, K.C., Bepler, G. (1997). Delineation of the centromeric and telomeric chromosome segment 11p15.5 lung cancer suppressor regions LOH11A and LOH11B, Genes Chromosomes Cancer, 18(2):111-114 138. Bobba, A., Marra, E., Fathallah, D.M., Giannattasio, S. (2003). Nonradioactive detection of five common microsatellite markers for ATP7B gene in Wilson disease patients, Mol Cell Probes, 17(6):271-274 139. O'Briant, K.C., Ali, S.Y., Weier, H.U., Bepler, G. (1998). An 84-kilobase physical map and repeat polymorphisms of the gastrin/cholecystokinin brain receptor region at the junction of chromosome segments 11p15.4 and 15.5, Chromosome Res, 6(5):415-418 123

140. Gupta, A., Aikath, D., Neogi, R., et al. (2005). Molecular pathogenesis of Wilson disease: haplotype analysis, detection of prevalent mutations and genotype-phenotype correlation in Indian patients, Hum Genet, 118(1):49-57 141. Gupta, A., Maulik, M., Nasipuri, P., et al. (2007). Molecular diagnosis of Wilson disease using prevalent mutations and informative single-nucleotide polymorphism markers, Clin Chem, 53(9):1601-1608 142. Gupta, A., Neogi, R., Mukherjea, M., et al. (2003). DNA linkage based diagnosis of Wilson disease in asymptomatic siblings, Indian J Med Res, 118:208-214 143. Gupta, A., Nasipuri, P., Das, S.K., Ray, K. (2006). Simple and effective strategies for detection of allele dropout in PCR-based diagnosis of Wilson disease, Clin Chem, 52(8):1611-1612 144. Mutirangura, A., Kuwano, A., Ledbetter, S.A., et al. (1992). Dinucleotide repeat polymorphism at the D15S11 locus in the Angelman/Prader-Willi region (AS/PWS) of chromosome 15, Hum Mol Genet, 1(2):139 145. Aráoz, H.V., Torrado, M., Barreiro, C., Chertkoff, L. (2006). A combination of five short tandem repeats of chromosome 15 significantly improves the identification of Prader-Willi syndrome etiology in the Argentinean population. Genet Mol Res, 5(2):390-398 146. Lee, M.J., Nishio, H., Nagai, T., et al. (1998). Molecular genetic analysis of the Prader-Willi syndrome by using fluorescent multiplex PCR of the dinucleotide repeats on chromosome 15q11-q13, Clin Chim Acta, 271(1):89-96 147. Taiwan Polymorphic Marker Database (TPMD): http://tpmd.nhri.org.tw/phpbin/index_en.php 124

148. Bernard, M.H., Sidhu, S., Berger, N. et al. (2003). A case report in favor of a multistep adrenocortical tumorigenesis, J Clin Endocrinol Metab, 88(3):998-1001 149. Wang, Y., Samuels, J.F., Chang, Y.C., et al. (2009). Gender differences in genetic linkage and association on 11p15 in obsessive-compulsive disorder families, Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet, 150B(1):33-40 150. Fiorentino, F., Biricik, A., Karadayi, H., et al. (2004). Development and clinical application of a strategy for preimplantation genetic diagnosis of single gene disorders combined with HLA matching, Mol Hum Reprod, 10(6):445-460 151. Van de Velde, H., Georgiou, I., De Rycke, M., et al. (2004). Novel universal approach for preimplantation genetic diagnosis of beta-thalassaemia in combination with HLA matching of embryos, Hum Reprod, 19(3):700-708 152. Chen, S.U., Su, Y.N., Fang, M.Y., et al. (2008). PGD of beta-thalassaemia and HLA haplotypes using OmniPlex whole genome amplification, Reprod Biomed Online, 17(5):699-705 153. Thornhill, A.R., dedie-smulders, C.E., Geraedts, J.P., et al. (2005). ESHRE PGD Consortium. ESHRE PGD Consortium 'Best practice guidelines for clinical preimplantation genetic diagnosis (PGD) and preimplantation genetic screening (PGS), Hum Reprod, 20(1):35-48 154. Renwick, P., Ogilvie, C.M. (2007). Preimplantation genetic diagnosis for monogenic diseases: overview and emerging issues, Expert Rev Mol Diagn, 7(1):33-43 125

EKLER Ek 1. Toplam 100 olgu, 4 lokus için mikrosatellit markır sonuçları. Tekrar dizileri ve PCR ürün büyüklükleri verilmiştir. (bp: baz çifti) Olgu D11S4891 (TG) D13S314 (CA) GABRB3 (CA) D11S2362 (TAA) No (85-111 bp) (137-155 bp) (181-201 bp) (209-230 bp) 1 101 103 139 141 181 181 221 224 2 105 105 137 147 181 185 221 227 3 101 101 137 147 181 185 218 221 4 103 105 139 147 181 183 218 221 5 103 105 139 145 187 193 218 227 6 105 107 137 137 181 185 227 227 7 101 103 141 141 181 187 218 218 8 103 111 133 137 181 181 218 218 9 103 105 137 137 181 183 224 230 10 105 111 151 151 181 181 212 227 11 105 111 141 141 181 181 215 218 12 105 111 137 137 181 185 218 227 13 105 105 139 147 181 185 212 215 14 105 111 139 149 181 183 221 227 15 103 105 141 143 185 197 218 224 16 97 105 141 149 183 183 215 218 17 101 105 143 145 181 181 218 221 18 105 105 139 149 181 193 218 227 19 103 105 139 151 181 185 221 227 20 105 105 139 151 181 181 215 221 126

21 101 103 141 151 181 185 212 227 22 101 101 143 143 181 181 224 227 23 101 103 137 151 197 199 215 221 24 103 105 141 145 181 181 218 218 25 101 103 139 147 185 197 218 230 26 101 105 151 151 181 181 218 221 27 97 103 135 147 181 185 218 221 28 103 105 133 139 181 197 218 227 29 101 105 141 149 181 181 218 218 30 105 105 139 151 187 193 218 224 31 103 105 139 151 181 193 221 227 32 101 105 139 145 195 195 218 227 33 105 105 139 151 181 191 215 227 34 103 105 135 137 197 201 215 215 35 101 103 139 147 181 185 218 224 36 101 105 137 141 191 193 218 221 37 101 103 143 145 181 201 218 224 38 103 111 137 151 183 187 218 227 39 103 103 143 151 181 191 218 224 40 97 103 137 137 193 195 221 227 41 101 105 137 151 181 181 215 218 42 103 105 137 145 181 185 215 221 43 103 105 139 151 181 193 218 227 44 97 105 137 143 195 197 221 230 45 103 105 139 145 181 187 218 230 46 103 105 137 139 181 189 218 224 47 101 103 141 145 197 201 209 227 127

48 101 105 143 151 181 181 215 227 49 101 107 139 145 185 197 224 227 50 101 105 137 137 181 185 215 215 51 103 105 147 147 181 197 227 230 52 101 105 147 151 181 187 224 224 53 103 103 139 151 181 181 221 224 54 101 103 139 141 181 191 218 230 55 101 103 139 143 185 187 209 227 56 101 105 139 139 181 185 215 221 57 101 103 139 147 185 185 218 227 58 101 107 141 141 181 187 218 218 59 101 105 137 141 189 193 215 218 60 101 103 137 147 181 183 218 218 61 103 105 141 147 183 197 224 227 62 101 105 141 147 181 193 218 227 63 105 107 147 147 183 185 212 224 64 103 105 137 141 181 181 218 230 65 103 105 139 151 185 197 224 227 66 101 103 137 151 181 185 218 227 67 103 105 137 145 193 193 209 218 68 101 105 141 147 181 185 218 230 69 101 107 147 151 181 187 218 224 70 103 105 133 137 185 185 218 218 71 101 111 147 151 181 187 215 224 72 101 111 135 141 181 191 209 224 73 105 105 133 137 187 189 215 218 74 101 103 147 147 187 193 215 224 128

75 101 105 137 137 181 185 224 224 76 103 105 143 151 181 185 218 227 77 101 105 135 137 181 187 218 224 78 97 101 151 151 181 187 218 224 79 103 105 137 151 181 181 218 227 80 101 105 139 143 181 181 218 224 81 103 103 137 147 195 197 227 227 82 101 101 143 145 181 187 227 227 83 103 105 139 151 181 187 218 218 84 103 105 145 145 181 185 218 224 85 101 105 151 151 181 193 215 215 86 101 105 135 147 191 197 215 227 87 101 103 147 147 185 191 212 224 88 105 107 137 137 185 185 212 215 89 105 105 137 145 181 191 212 224 90 97 103 139 145 181 189 212 224 91 103 105 137 147 195 195 224 224 92 103 105 143 145 181 181 221 227 93 101 103 133 151 181 201 215 224 94 101 107 135 139 181 197 218 227 95 101 105 141 147 187 193 224 230 96 105 105 137 151 183 189 224 224 97 101 103 143 147 193 197 224 230 98 101 105 135 143 181 181 221 224 99 101 105 137 149 181 191 215 224 100 97 105 139 147 191 191 218 218 129

ÖZGEÇMİŞ Ad-Soyad : M. Burak DURMAZ Doğum Tarihi : 08.09.1979 Medeni hali : Evli Adres İş : EÜTF. Tıbbi Genetik AD. Bornova 35100 İzmir Ev : 101/2 Sok. No:35 Bornova 35050 İzmir Telefon İş : 2323903961-2323904917 Ev : 2323750795 Cep : 5324417571 Fax : 2323903971 E-mail : burak.durmaz@ege.edu.tr burakdurmaz@hotmail.com Eğitim İlkokul : Gazi İlkokulu, İzmir, 1991 Ortakul : İzmir Özel Türk Anadolu Lisesi, İzmir, 1994 Lise : İzmir Özel Türk Fen Lisesi, İzmir, 1997 Lisans : Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, İzmir, 2004 Doktora : EÜTF. Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları AD. Genetik BD. - Genetik Doktora Programı Yabancı Dil : İngilizce - 2006, Mart ÜDS = 86.250 2004, Mayıs KPDS = 81 (B) Almanca - Orta seviye İspanyolca - Başlangıç seviyesi 130

Üye Olduğu Mesleki Kuruluşlar: 1. Türkiye Tıbbi Genetik Derneği 2. Ege Perinataloji Derneği 3. American Society of Human Genetics (ASHG) Projelerde Aldığı Görevler : 1. Henoch-Schonlein Purpura nefriti geçirmiş olgularda MBL gen polimorfizminin araştırılması, Ege Üniversitesi Bilimsel Araştırma Uygulama Merkezi (EBİLTEM), Yardımcı Araştırmacı, 2005/GHUM/005, 2005 2. Nadir görülen genetik sendromda (Pachyonychia congenita) sorumlu genin araştırılması, Ege Üniversitesi Araştırma Fon Saymanlığı, Yardımcı Araştırmacı, 2005/TIP/016, 2005 3. Alzheimer Hastalığına yatkınlık genlerinin araştırılması, Ege Üniversitesi Bilimsel Araştırma Uygulama Merkezi (EBİLTEM), Yardımcı Araştırmacı, 2006/GHUM/001, 2006 4. Çocuklarda IFNγ +874 ve IFNGR1 CA n Tekrar Polimorfizmlerinin Tüberküloza Yatkınlıktaki Rolünün Araştırılması, Ege Üniversitesi Bilimsel Araştırma Uygulama Merkezi (EBİLTEM), Yardımcı Araştırmacı, 2007/GHUM/006, 2007 5. İdiyopatik Mental Retardasyonlu Olguların Array-CGH ile Değerlendirilmesi, Ege Üniversitesi Araştırma Fon Saymanlığı, Yardımcı Araştırmacı, 2007/TIP/029, 2007 6. Hemofili hastalarında eklem içi radioizotop uygulamasının güvenirlik açısından değerlendirilmesi: Erken genotoksik etkilerin prospektif olarak araştırılması, Türkiye Hemofili Derneği, Yardımcı Araştırmacı, 2009 7. Postmenapozal kadınlarda RANK geni C421T ve C575T polimorfizmlerinin kemik mineral yoğunluğu ile ilişkisinin araştırılması, Türkiye Osteoporoz Derneği, Yardımcı Araştırmacı, 2009 8. Deneysel Nekrotizan Enterokolit Modelinde İnsulin Benzeri Büyüme Faktörü-1 ve Rekombine Eritropoetinin Apopitoz ve Telomeraz Aktivitesi Üzerine Etkileri, TÜBİTAK, Yardımcı Araştırmacı, SBAG-107S397, 2008 131

9. Çocukluk çağı Wilson Hastalığı nda ATP7B geni mutasyonlarının taranması, Ege Üniversitesi Araştırma Fon Saymanlığı, Yardımcı Araştırmacı, 2008/TIP/008, 2008 10. Çocukluk Çağı Lösemilerinde micro RNA Ekspresyonunun lösemi tipi, tedaviye yanıt ve prognoz ile ilişkisinin değerlendirilmesi, TÜBİTAK, Yardımcı Araştırmacı, SBAG-109S076, 2009 11. Tek Hücrede Real Time PCR ile Beta Talasemi Mutasyonlarının Tanımlanması ve Beta Talesemi Preimplantasyon Genetik Tanısı, Ege Üniversitesi Araştırma Fon Saymanlığı, Yardımcı Araştırmacı, 2009/TIP/002, 2009 12. ALL ve AML de yaygın prognostik faktör olarak kullanılan kromozomal değişikliklerin gösterilmesi, Ege Üniversitesi Araştırma Fon Saymanlığı, Yardımcı Araştırmacı, 2009/TIP/066, 2009 Ödüller: 1. Poster İkincilik Ödülü, VIII. Ulusal Tıbbi Genetik Kongresi, Hastalıkların Biyokimyasal ve Moleküler Temeli Dalında, Çanakkale, 2008 2. En İyi Araştırma Proje Ödülü, 3.Ulusal Osteoporoz Kongresi, Antalya, 2008 Eserler: A. Uluslararası hakemli dergilerde yayınlanan makaleler: 1. Cogulu O, Durmaz B, Ozkinay C, Ozkinay F. A case of epicanthus, telecanthus, high palate, transitional vertebra associated with vesicoureteral reflux. Acta Paediatr, 96:147-148 (2007). 2. Karabagli H, Karabagli P, Alpman A, Durmaz B. Congenital supratentorial cystic hemangioblastoma. Case report and review of the literature. J Neurosurg, 107(6 Suppl):515-518 (2007). 3. Durmaz B, Karaca E, Vural F, Cogulu O, Alpman A, Tombuloglu M, Ozkinay F. Chronic myelogenous leukemia exhibiting trisomy 14 due to a Robertsonian translocation with philadelphia chromosome. Acta Oncol 47:1604-1606 (2008). 132

4. Alpman A, Cogulu O, Akgul M, Ataman Arıkan E, Durmaz B, Karaca E, Sağol S, Ozkinay C, Ozkinay F. Prenatally Diagnosed Turner Syndrome and Cystic Hygroma: Incidence and Reasons for Referrals. Fetal Diagn Ther 25:58-61 (2008). 5. Durmaz B, Wollnik B, Cogulu O, Li Y, Tekgul H, Hazan F, Ozkinay F. Pontocerebellar hypoplasia type III (CLAM): extended phenotype and novel molecular findings. J Neurol 256:416-419 (2009). 6. Durmaz B, Alpman A, Pariltay E, Akgul M, Ataman E, Kirbiyik O, Cogulu O, Ozkinay F. The evaluation of the referral reasons of patients at a tertiary pediatric genetic center in Izmir, Turkey. Genet Test Mol Biomarkers 13:163-166 (2009). 7. Cogulu O, Durmaz B, Pehlivan S, Alpman A, Ozkinay F. Evaluation of the SMN and NAIP genes in a family: homozygous deletion of the SMN2 gene in the fetus and outcome of the pregnancy. Genet Test Mol Biomarkers 13:287-288 (2009). 8. Kirbiyik O, Durmaz B, Cogulu O, Akin H, Avci CB, Gunduz C, Ercal D, Ozkinay F. Intracardiac echogenic focus and cytogenetic abnormalities. Genet Couns 20:73-75 (2009). 9. Durmaz AA, Akin H, Ekmekci AY, Onay H, Durmaz B, Cogulu O, Aydinok Y, Ozkinay F. A severe alpha thalassemia case compound heterozygous for Hb Adana in alpha1 gene and 20.5 kb double gene deletion. J Pediatr Hematol Oncol 31:592-594 (2009). B. Uluslararası bilimsel toplantılarda sunulan ve bildiri kitabında (Proceedings) basılan bildiriler: 1. Burak Durmaz, Tufan Cankaya, Emin Karaca, Cumhur Gunduz, Cihangir Ozkinay, Ferda Ozkinay. The evaluation of preimplantation genetic diagnosis cases referred to a regional genetic center in Izmir, Turkey. 19th Course In Medical Genetics, Book of Abstarct, 80, Bertinoro, 2006. 2. Burak Durmaz, Ozgur Cogulu, Asude Alpman, Cihangir Ozkinay, Ferda Ozkinay. A Case of Short Stature with Motor Mental Retardation, Congenital Cardiac Anomalies, Agenesis of Uterus and Ovaries and Unusual Craniofacial 133

Dysmorphology. European Human Genetics Conference, Book of Abstarct, P0258, 156, Amsterdam, 2006. 3. Haluk Akin, Asude Alpman, Ferda Ozkinay, Derya Ercal, Ozgur Cogulu, Huseyin Kirayoglu, Burak Durmaz, Cumhur Gunduz, Sermet Sagol, Cihangir Ozkinay. The evaluation of chromosomal abnormalities diagnosed prenatally in Izmir. European Human Genetics Conference, Book of Abstract, P0467, 200, Amsterdam, 2006. 4. Burak Durmaz, Ozgur Cogulu, Tugrul Dereli, Cihangir Ozkinay, Ferda Ozkinay. A Case Of Kindler Syndrome With Primary Infertility. 7th Balkan Meeting on Human Genetics, Book of Abstract, 78, Skopje, 2006. 5. Ayca Aykut, Aybuke Akaslan, Burak Durmaz, Funda Tuzun, Ozgur Cogulu, Ferda Ozkinay. A new clinical picture with hypopigmented hair, microcephaly, motor-mental retardation and renal anomalies. European Human Genetics Conference, Book of Abstract, P0144, 67, Nice, 2007. 6. Haluk Akin, Cigir Biray Avci, Burak Durmaz, Cumhur Gunduz, Ozgur Cogulu, Derya Ercal, Ferda Ozkinay, Cihangir Ozkinay. Intracardiac echogenic focus and cytogenetic abnormalities. European Human Genetics Conference, Book of Abstract, P0455, 135, Nice, 2007. 7. Emin Karaca, Cumhur Gunduz, Gunseli Altin, Tufan Cankaya, Burak Durmaz, Ege Tavmergen Goker, Haluk Akin, Ozgur Cogulu, Ferda Ozkinay. A one year experience on PGD at Ege University in Izmir/Turkey. European Human Genetics Conference, Book of Abstract, P0472, 139, Nice, 2007. 8. Mehmet Akgul, Esra Ataman, Burak Durmaz, Asude Alpman, Emin Karaca, Ozgur Cogulu, Haluk Akin, Cumhur Gunduz, Cihangir Ozkinay, Ferda Ozkinay. The incidence of prenatally diagnosed Turner syndrome and their referral indications. European Human Genetics Conference, Book of Abstract, P0489, 142, Nice, 2007. 9. Ozgur Cogulu, Asude Alpman, Burak Durmaz, Erhan Pariltay, Mehmet Akgul, Ozgur Kirbiyik, Esra Ataman, Haluk Akin, Ferda Ozkinay, Cihangir Ozkinay. The evaluation of referral reasons for genetic counseling and prenatal diagnosis at a tertiary genetic center: a Turkish experience. European Human Genetics Conference, Book of Abstract, P1335, 330, Nice, 2007. 134

10. Asude Alpman, Tufan Cankaya, Burak Durmaz, Ali Vahabi, Cumhur Gunduz, Ozgur Cogulu, Ferda Ozkinay. Psychological effects of parenting stress on parents of Down Syndrome children. European Human Genetics Conference, Book of Abstract, P1368, 337, Nice, 2007. 11. Burak Durmaz, Erhan Pariltay, Mehmet Akgul, Asude Alpman, Esra Ataman, Ozgur Kirbiyik, Ozgur Cogulu, Ferda Ozkinay. Retrospective evaluation of the referral reasons of patients at a tertiary genetic center in Izmir, Turkey. European Human Genetics Conference, Book of Abstract, P1371, 338, Nice, 2007. 12. Durmaz Burak, Xin Hong, Selander Åsa, Nordenskjöld Magnus, Bui The- Hung, Ozkinay Ferda, Schoumans Jacqueline. Genetic analysis of fetuses with malformations and apparently normal karyotypes. 1st MC-GARD Worksop on Array techniques to identify copy number variations, Book of Abstract, 4-5, Helsinki, 2007. 13. E. Pariltay, A. Alpman, E. Karaca, B. Durmaz, O. Cogulu, F. Ozkinay. Cytogenetic analysis of 135 myelodysplastic syndrome patients. American Society of Human Genetics Conference, Book of Abstract, 340/W, 100, San Diego, 2007. 14. M.Akgul, O. Cogulu, S. Aksoylar, A. Alpman, B. Durmaz, C. Gunduz, G. Koturoglu, N. Cetingul, F. Ozkinay. The relationship between congenital malformations and pediatric malignancies. American Society of Human Genetics Conference, Book of Abstract, 563/F, 138, San Diego, 2007. 15. B. Durmaz, F. Ozkinay, M. Bak, A. Aykut, E. Serdaroglu, H. Onay, C. Ozkinay. Mannose binding Lectin Codon 54 Polymorphism Is Associated With Predisposition To Henoch-Schonlein Purpura In Childhood. American Society of Human Genetics Conference, Book of Abstract, 677/W, 157, San Diego, 2007. 16. H. Onay, A.Y. Ekmekci, B. Durmaz, E. Sayin, H. Cosar, N. Bayram, D. Can, H. Akin, C. Ozkinay. Interferon-γ gene and interferon-γ receptor-1 gene polymorphisms in tuberculosis children from Turkey. American Society of Human Genetics Conference, Book of Abstract, 2381/W, 450, San Diego, 2007. 135

17. B. Durmaz, H. Onay, G. Itırlı, H. Akin, O. Cogulu, F. Ozkinay. A retrospective analysis of patients tested for cystic fibrosis mutations in a reference Genetics center in Izmir, Turkey. European Human Genetics Conference, Book of Abstract, P01.040, 46, Barcelona, 2008. 18. S. Unlubay, O. Cogulu, B. Durmaz, A. Alpman, F. Ozkinay. A novel case of partial trisomy 2p in a 2-year old girl. European Human Genetics Conference, Book of Abstract, P01.305, 105, Barcelona, 2008. 19. A. Aykut, F. Ozkinay, M. Bak, B. Durmaz, D. Trak, H. Onay, C. Ozkinay. Is Mannose Binding Lectin Codon 54 Polymorphism Associated With Predisposition to Acute Poststreptococcal Glomerulonephritis in Childhood? European Human Genetics Conference, Book of Abstract, P06.167, 326, Barcelona, 2008. 20. Sukran Darcan, Sema Tanriverdi, Samim Ozen, Damla Goksen, Burak Durmaz, Ferda Ozkinay. Precocious puberty in a patient with X linked adrenal hypoplasia congenita due to DAX 1 mutation. 47th Annual Meeting of the European Society for Paediatric Endocrinology (ESPE), Book of Abstarct, R52, 237-238, Istanbul, 2008. 21. O. Kirbiyik, O. Cogulu, B. Durmaz, F. Ozkinay. An unusual case with camptodatyly, thenar, hypothenar muscle atrophy, spasmotic pains, excessive sweating and minor facial anomalies. European Human Genetics Conference, Book of Abstract, P02.016, 57, Vienna, 2009. 22. A. Aykut, O. Cogulu, B. Durmaz, F. Ozkinay. A new entity: Report on two siblings with mental retardation. European Human Genetics Conference, Book of Abstract, P02.069, 326, Vienna, 2009. 23. S. Unlubay, O. Cogulu, B. Durmaz, A. Alpman, F. Ozkinay. A novel case of partial trisomy 2p in a 2-year old girl. European Human Genetics Conference, Book of Abstract, P03.036, 57, Vienna, 2009. C. Ulusal hakemli dergilerde yayınlanan makaleler: 1. Sacide Pehlivan, Burak Durmaz, Ayça Aykut, Ferda Özkınay. Küçük RNA ların Etki Mekanizmaları ve Önemi. Arşiv, 2006, 15(3): 320-328. 136

2. Özgür Çoğulu, Burak Durmaz, Ferda Özkınay. Genetik hastalıklara temel yaklaşım. Ege Pediatri Bülteni 2006, 13(1): 57-66. 3. Özgür Çoğulu, Asude Alpman, Burak Durmaz, Ferda Özkınay. Mitoz ve Mayozun Moleküler Temelleri. Turkiye Klinikleri J Med Sci 2007, 27: 725-737. 4. Haluk Akın, Aslıhan Yılmaz Ekmekçi,Asude Alpman Durmaz, Burak Durmaz, Hüseyin Onay, Yeşim Aydınok, Ferda Özkınay. Hemoglobin G- Coushatta ile β (IVSI-110) veya S Bileşik Heterozigot Riskli Fetus İçin Prenatal Genetik Danışmanlık. Türk Çocuk Hematoloji Dergisi 2008, 2(3): 40-44. D. Ulusal bilimsel toplantılarda sunulan ve bildiri kitabında basılan bildiriler: 1. Akın H., Alpman A., Özkınay F., Erçal D., Çoğulu Ö., Kirayoglu H., Durmaz B., Gunduz C., Sagol S., Özkinay C. 1998-2005 yılları arasında kromozomal anomali saptanan 157 gebede prenatal tanı endikasyonlarının değerlendirilmesi. VII. Ulusal Prenatal Tanı ve Tıbbi Genetik Kongresi, P112, 137, Kayseri, 2006. 2. Çankaya T., Karaca E., Durmaz B., Gündüz C., Özkınay C., Özkınay F. Preimplantasyon genetik tanı (PGT) uygulanan olgular ve sonuçları. VII. Ulusal Prenatal Tanı ve Tıbbi Genetik Kongresi, P125, 143, Kayseri, 2006. 3. Alpman A., Çogulu Ö., Gündüz C., Durmaz B., Vahabi A., Çankaya T., Özkınay F. Down sendromlu çocukların ailelerinin psikososyal değerlendirilmesi. VII. Ulusal Prenatal Tanı ve Tıbbi Genetik Kongresi, P171, 163, Kayseri, 2006. 4. Durmaz B., Çoğulu Ö., Hazan F., Özkınay C., Özkınay F. Korpus Kallosum Hipoplazisi, serbral ve serebellar atrofiye eşlik eden büyüme geriliği, hipertonisite, büyük kulaklar ve mikrosefalisi olan bir olgu: Yeni bir sendrom? VII. Ulusal Prenatal Tanı ve Tıbbi Genetik Kongresi, P178, 167, Kayseri, 2006. 5. Burak Durmaz, Ozgur Cogulu, Filiz Hazan, Cihangir Ozkinay, Ferda Ozkinay. Korpus kallosum hipoplazisi, serebral ve serebellar atrofiye eşlik eden büyüme geriliği, hipertonisite, büyük kulaklar ve mikrosefalisi olan bir olgu: Yeni bir sendrom? (2006, Poster, Ulusal Tıbbi Genetik Kongresi, Kayseri, Türkiye) 137

6. Çankaya T., Kırbıyık Ö., Durmaz B., Çoğulu Ö., Alpman A., Özkınay C. Kabuki make-up sendromlu bir olgu. VII. Ulusal Prenatal Tanı ve Tıbbi Genetik Kongresi, P180, 168, Kayseri, 2006. 7. Ferda Özkınay, Nazan Çetingül, Güldane Koturoğlu, Cumhur Gündüz, Burak Durmaz, Asude Alpman, Serap Aksoylar, Özgür Çoğulu. Kanser Tanısı Almış Pediatrik Olgularda Konjenital Malformasyonlar. 43. Türk Pediatri Kongresi, S015 Sözlü Bildiri, 226, Bodrum, 2007. 8. Burak Durmaz, Bernd Wollnik, Özgür Çoğulu, Hasan Tekgül, Filiz Hazan, Ferda Özkınay. Progresif Mikrosefaliye Eşlik EdenSerebellar Atrofi (CLAM): Klinik Bulgular ve Aday Gen Bölgesinin Daraltılması İle İlgili Moleküler Çalışmalar. VIII. Ulusal Tıbbi Genetik Kongresi, PS-069, 203, Çanakkale, 2008. 9. Kaan Kavaklı, Özgür Çoğulu, Hayal Özkılıç, Semih Aydoğdu, Ferda Özkınay, Burak Durmaz, Özgür Kırbıyık, Can Balkan, Deniz Karapınar, Güray Saydam. Hemofili Hastalarında Radyoizotop Sinovektomi Uygulaması Sonrası Kromozomal Kırık Gelişme Oranlarının Araştırılması: Ege Üniversitesi Deneyimi. XXXIV. Ulusal Hematoloji Kongresi, S026 Sözlü Bildiri, 54, İzmir, 2008. 10. Haluk Akın, Aslıhan Ekmekçi, Asude Alpman, Burak Durmaz, Hüseyin Onay, Yeşim Aydınok, Ferda Özkınay. Annede HB G-Coushatta Taşıyıcılığı Babada Beta/S Bileşik Heterozigotluğu Olan Bir Ailede Prenatal Genetik Danışmanlık. XXXIV. Ulusal Hematoloji Kongresi, P0120, 122, İzmir, 2008. E. Atıflar 2 ayrı yayından 2 atıf (01.10.2009) F. Diğer faaliyetler, Kurslar Kongreler 1. Ege Üniversitesi Bilgisayar Uygulamalı Biyoistatistik Kursu, 2005, İzmir 2. 1. Ulusal Moleküler Tıp Kongresi, 2005, İstanbul 3. 1. Ulusal Moleküler Tıp Kongresi Moleküler Tıpta Temel Kavramlar kursu, 2005, İstanbul 138

4. 3. Ulusal Tıbbi Genetik Sempozyumu Kardiyovasküler Sistem Hastalıklarında Genetik, 2005, Bursa 5. Kök Hücre Biyolojisinde Güncel Kavramlar ve Klinik Uygulamalar Sempozyumu, 2005, İstanbul 6. Ege Perinatoloji Derneği Olgu Sunumları toplantısı, 2005, İzmir 7. 1.Ege Genetik Sempozyumu, 2005, İzmir 8. Ege Perinatoloji Derneği Olgu Sunumları toplantısı, 2005, İzmir 9. EBİLTEM, AB 6. Çerçeve Pogramı Proje Destekleri Yararlanma Yöntemleri ve AB 6. Çerçeve Programı Proje Yazımı eğitimi, 2006, İzmir 10. Ege Perinatoloji Derneği Fetal Ekokardiyografi toplantısı, 2006, İzmir 11. European School of Genetic Medicine, 19th Course in Medical Genetics, 2006, Bertinoro di Romagna 12. European Human Genetics Conferece ESHG 2006, Amsterdam 13. VII. Ulusal Prenatal Tanı ve Tıbbi Genetik Kongresi, 2006, Kayseri 14. 7th Balkan Meeting of Human Genetics, 2006, Üsküp 15. QF-PCR Workshop, 2006, İzmir 16. 2. Ege Genetik Sempozyumu, 2006, Afyonkarahisar 17. European Human Genetics Conferece ESHG 2007, Nice 18. MC-GARD 1st Workshop, Array techniques to identify copy number variations, 2007, Helsinki 19. American Society Of Human Genetics ASHG 2007, San Diego 20. 3. Ege Genetik Sempozyumu, 2007, Denizli 21. II. QF-PCR Workshop, 2008, İzmir 22. 13th Annual Preimplantation Genetic Diagnosis Workshop, 2008, Londra 23. PGD Eğitim Programı Nisan 2008, 1 ay Atina Üniversitesi, Atina 24. VIII. Ulusal Tıbbi Genetik Kongresi, 2008, Çanakkale 25. European Human Genetics Conferece ESHG 2008, Barselona 26. I. Moleküler Biyoloji ve Genetik Öğrenci Kongresi 2008 Bilim Kurulu 27. 4. Ege Genetik Sempozyumu, 2007, Aydın 28. I. Tıpta Tez Yönetimi Kursu, 2008, İzmir 29. MediMedGen 2009, Ankara 30. 3. Moleküler Biyoloji ve Genetik Araştırma ve Uygulama Platformu, Yardımcı Kurul 139