1 T.C. GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu Sonuç Raporu Proje No:2011/16 Kısa Mahmut Otunun ( Teucrium chamaedrys L. Subsp. chamaedrys) Antioksidan Aktivitesinin Belirlenmesi ve Etkili Bileşiklerin İzolasyonu ve Karekterizasyonu Proje Yöneticisi Doç. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen-Ed. Fakültesi Kimya Bölümü Araştırmacılar ve Birimleri Uzm. Nusret GENÇ Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen-Ed. Fakültesi Kimya Bölümü Uzm. Hüseyin AKŞİT Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen-Ed. Fakültesi Kimya Bölümü (Ağustos / 20l2)
i ÖZET* Kısa Mahmut Otunun (Teucrium chamaedrys L. Subsp. chamaedrys) Antioksidan Aktivitesinin Belirlenmesi ve Etkili Bileşiklerin İzolasyonu ve Karakterizasyonu* Bu çalışmada; Kısamahmut otunun antioksidan aktivitesinin belirlenmesi ve aktif bileşiklerin izolasyonu ve karakterizasyonu amaçlanmıştır. Bu amaçla bitki örneği sırası ile hekzan:diklormetan (1:1), etil asetat:diklormetan ve son olarak da metanol:diklor metan ile ekstrakte edilmiştir. Elde edilen ekstraktlara antioksidan aktivite (serbest radikal giderme aktivitesi, indirgeme gücü aktivitesi) ve toplam fenolik madde içeriği testleri uygulanmıştır. Metanol:diklormetan ekstraktının diğer ekstralara göre daha yüksek fazla fenolik madde içerdiği ve daha yüksek antioksidan aktiviteye sahip olduğu tespit edilmiştir. Bu yüzden; bu ekstrakta kolon kromatografi uygulanmış ve iki madde (verbaskosid ve teukrosid) saflaştırılıp yapıları NMR ve HRMS gibi spektroskopik yöntemlerle yapıları aydınlatılmıştır. İzole edilen bileşiklerin antioksidan aktivitelerinin belirlenmesi için serbest radikal giderme aktivitesi ve indirgeme aktivite testleri uygulanmıştır. Sonuçlar izole edilen moleküllerin sentetik antioksidanlara (BHA, BHT ve Troloks) göre daha yüksek aktiviteye sahip olduğunu göstermiştir. Hekzan:diklormetan ekstraktından ise üç triterpen türevi izole edilmiş ve yapıları spektroskopik metotlarla belirlenmiştir. Fakat bu moleküllerin antioksidan testleri, moleküller fenolik gruplara sahip olmadığından değerlendirilmemiştir. Sonuç olarak; kısamahmut otundan antioksidan aktiviteye sahip moleküller saflaştırılıp yapıları aydınlatılmıştır. Anahtar Kelimeler: Antioksidan aktivite, kısamahmut otu *Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu tarafından desteklenmiştir. (Proje No:2011/16).
ii ABSTRACT* Determination of antioxidant activity of Teucrium chamaedrys L. Subsp. chamaedrys and isolation of active compounds. In this study; we aimed to determine of antioxidant capacity of Teucrium chamaedrys L. Subsp. chamaedrys and isolation of active compounds. For this aim plant material was extracted hexane-dichloromethane (1:1), ethyl acetate:dichloromethane (1:1) and finally methanol:dichloromethane respectively. Obtained extracts subjected to antioxidant activity tests (free radical scavenging activity and reducing power) and total phenolic content tests. Methanol:dichloromethane extract was the most active extract and consisted phenolic substances more than other extract. So that, the methanol:dichloromethane extract subjected column chromatography which resulted isolation of two molecules (verbascoside and teucroside). The chemical structures of molecules were determined by spectroscopic techniques including NMR and HRMS. In order to determination of antioxidant activity of isolated molecules, the free radical scavenging activity test and reducing power test were applied. The results showed that isolated molecules has a higher antioxidant activity than synthetic antioxidants (BHA, BHT and Trolox) From hexane:dichloromethane extract, three diterpene derivatives were isolated and characterized but not determined antioxidant activity due to these molecules has no phenolic moiety. As a result, the molecules have antioxidant activity were isolated from Teucrium chamaedrys L. Subsp. chamaedrys and characterized successfully. Keywords: Antioxidant activity, Teucrium chamaedrys L. Subsp. chamaedrys *The Project was supported by Scintific Research Projects Commission of Gaziosmanpasa University (Project No:2011/16)
iii İÇİNDEKİLER DİZİNİ Sayfa ÖZET... i ABSTRACT... ii İÇİNDEKİLER DİZİNİ... iii SİMGE ve KISALTMALAR... iv ŞEKİLLER DİZİNİ... v ÇİZELGELER DİZİNİ... vi 1. GİRİŞ... 1 2. KAYNAK ÖZETLERİ... 3 3. MATERYAL ve YÖNTEM... 5 3.1. Bitkilerin Toplanması ve ekstraksiyon işlemi... 5 3.2. Antioksidan Kapasitenin Belirlenmesi... 5 3.2.1. Serbest Radikal Giderme Aktivitesi... 6 3.2.2. İndirgeme Gücü Aktivitesi... 6 3.2.3. Toplam Fenolik Madde İçeriği... 7 3.4. Etkili Bileşiklerin Saflaştırılması ve Karakterizasyonu... 8 4. BULGULAR ve TARTIŞMA... 9 4.1. Ham Ekstrelerin Antioksidan Kapasitesinin Belirlenmesi... 9 4.1.1. Serbest Radikal giderme aktivitesi... 9 4.1.3. Toplam Fenolik Madde Miktarı... 11 4.2. Antioksidan Aktif Moleküllerin Saflaştırılması... 12 4.2. 1. Verbaskosid in Saflaştırılması ve Karakterizasyonu... 12 4.2.2. Teukrosid in Saflaştırılması ve Karakterizasyonu... 19 4.3. Saflaştırılan Moleküllerin Antioksidan Aktivitelerinin Değerlendirilmesi... 23 4.3.1. İzole Edilen Moleküllerin Serbest Radikal Giderme Aktiviteleri... 23 4.3.2. İzole Edilen Moleküllerin İndirgeme Gücü Aktiviteleri... 25 4.4. Hekzan:Diklormetan Fazından İzole Edilen Moleküller... 26 4.4.1. Teukrin G nin Yapı Tayini ( KOLON III-Fraksiyon 14)... 26 4.4.2. Dihidroteguin Molekülün Yapı Tayini (KOLON III-Fraksiyon 24-25)... 28 4.4.3. Fraksiyon 36 Molekülün Yapı Tayini (KOLON III-Fraksiyon 36)... 30 5. SONUÇ... 32 KAYNAKLAR... 34
iv SİMGE ve KISALTMALAR Simge Açıklama δ J Kimyasal Kayma Etkileşme sabiti Kısaltma Açıklama BHA BHT DPPH NMR MS TOF LC TLC nm Abs ppm DMSO d dd s HMBC COSY HETCOR APT Bütillenmiş hidroksi anisol Bütillenmiş hidroksi toluen 2,2-difenil-1-pikril hidrazil Nükleer manyetik spektroskopi Kütle spektroskopisi Uçuş zamanlı kütle spektroskopisi sıvı kromatografi İnce tabaka kromatografisi Nanometre Absorbans NMR sa sinyallerin TMS sinyaline olan uzaklığı Dimetilsülfoksit Dublet Dubletin dubleti Singlet Hetoronuclear multiple bond correlation Correlation Spectroscopy Hetoronuclear correlation Attached proton test
v ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 2. 1. Fiorendino ve ark., tarafından izole edilen chamedroside A, B ve C molekülleri... 3 Şekil 3. 1. Gallik asidin kalibrasyon grafiği... 7 Şekil 3. 2. Aktif moleküllerin izolasyon şeması... 8 Şekil 4. 1. Teucrium chamaedrys L. subs. chamaedrys bitki ekstraktlarının serbest radikal giderme aktivitesi sonuçları... 9 Şekil 4. 2. Teucrium chamaedrys L. subs. chamaedrys bitki ekstraktlarının indirgeme aktivitesi sonuçları... 10 Şekil 4. 3. Ekstraktların fenolik madde içerikleri (%)... 11 Şekil 4. 4. Ayırma ve saflaştırmada kullanılan kolon (KOLON I)... 12 Şekil 4. 5. 101-116 fraksiyon aralığının proton NMR Spektrumu... 13 Şekil 4. 6. Çalışmada kullanılan kolon (KOLON II)... 14 Şekil 4. 7. KOLON II den izole edilen molekülün proton NMR spektrumu (aromatik) 15 Şekil 4. 8. KOLON II den izole edilen molekülün proton NMR spektrumu (alifatik).. 16 Şekil 4. 9. KOLON II den izole edilen molekülün karbon NMR spektrumu... 17 Şekil 4. 10. KOLON II den izole edilen molekülün LC-TOF spektrumu... 18 Şekil 4. 11. KOLON II den izole edilen molekülün kimyasal yapısı... 18 Şekil 4. 12. KOLON I den saflaştırılan molekülün proton NMR spektrumu (Aromatik)... 19 Şekil 4. 13. KOLON I den saflaştırılan molekülün proton NMR spektrumu (Alifatik) 20 Şekil 4. 14. KOLON I den saflaştırılan molekülün karbon NMR spektrumu... 21 Şekil 4. 15. KOLON I den saflaştırılan molekülün LC-TOF spektrumu... 21 Şekil 4. 16. KOLON I den saflaştırılan molekülün kimyasal yapısı... 22 Şekil 4. 17. İzole edilen moleküllerin ve standartların serbest radikal giderme aktivitesi... 23 Şekil 4. 18. İzole edilen moleküllerin ve standartların IC50 değerleri... 24 Şekil 4. 19. İzole edilen moleküllerin ve standartların serbest radikal giderme aktivitesi... 25 Şekil 4. 20. Teukrin G molekülünün kimyasal yapısı... 26 Şekil 4. 21. Teukrin G molekülü proton NMR spektrumu... 27 Şekil 4. 22. Teukrin G molekülü karbon NMR spektrumu... 27 Şekil 4. 23. Dihidroteguin molekülün yapısı ve NMR değereleri... 28 Şekil 4. 24. Dihidroteguin molekülünün proton NMR spektrumu... 29 Şekil 4. 25. Dihidroteguin molekülünün karbon NMR spektrumu... 29 Şekil 4. 26. Fraksiyon 36'nın kimyasal yapısı... 30 Şekil 4. 27. Fraksiyon 36'nın proton NMR spektrumu... 30 Şekil 4. 28. Fraksiyon 36'nın karbon NMR spektrumu... 31
vi ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 4. 1. KOLON II den izole edilen molekülün NMR verileri... 18 Çizelge 4. 2. KOLON I den saflaştırılan molekülün NMR verileri... 22
1 1. GİRİŞ Bitkilerin ilaç, yiyecek ve kozmetik amaçlı kullanımı insanın varlığıyla başlamış günümüze kadar süregelmiştir. Olağan olan hastalıkların varlığı ve bunların tedavi edilmesi amacıyla bu geçen zaman içerisinde bitkilerin kullanımı ve her birisine ait spesifik özellikleri insanlar tarafından keşfedilmiş ve pozitif yada negatif denemelerle de geliştirilmiştir (Baytop, 1999). Günümüzde 20000 den fazla bitki alternatif tedavi amaçlı olarak kullanılmaktadır. Bu gelişmeler ve hastalıklara karşı ilaç veya etken madde keşfi için tıbbi bitkiler ve bu bitkilerden çeşitli maddelerin izole edilerek insanlığın hizmetine sunma çalışmaları da son derece önem kazanmıştır (Moffat ve ark., 1986). Günümüzde, bitkisel kaynaklara dayanan doğal ürünlerin üretim teknolojisinin geliştirilmesi ve üretilen ürünlerin çeşitli endüstriyel alanlarda kullanımı, insan sağlığı ve çevrenin koruması açısından önemli teknoloji araştırmalarının merkezinde yer almaktadır (Baytop ve ark., 1999; Amakura ve ark., 2002). Bugün Avrupa da çevre kirliliğinin önlenmesi ve insan sağlığının korunması açısından çeşitli endüstriyel alanlarda doğal bitkisel katkı maddelerinin kullanımı fevkalade önem taşıyan bir konu durumundadır (Amakura ve ark., 2002). Fakat Avrupa nın bitki örtüsü bu problemin çözümü için yetersiz kaldığından bu konuda yapılan çalışmalar Güneydoğu Asya (Çin, Hindistan) ve Güney Amerika ülkelerine kaymıştır. Bu ülkelerde bitkisel ürünler konusunda araştırma geliştirme etkinliklerinin hızla gelişmesi sonucunda üretilen bitkisel ürünler dünya pazarlarını işgal etmiş durumdadır (Moffat ve ark., 1986). Türkiye ise zengin bitki örtüsüyle Güneydoğu Asya ve Güney Amerika ülkelerinden geri kalmamaktadır. Buna rağmen söz konusu alanlarda yeterli bilimsel çalışmalar yapılmamıştır (Baytop, 1999). Bu nedenle, bitkisel ürünler yönünden Türkiye dünya pazarında hak ettiği yere ulaşamamıştır. Canlıların yaşamlarını devam ettirebilmeleri için gerekli olan enerjiyi karşılayabilmeleri, alınan besinlerin metabolizmaya girişi ile mümkün olmaktadır. Vücut tarafından alınan besinlerin enerjiye dönüştürülmesi için oksijen mutlaka gereklidir. Katabolizma sırasında harcanan oksijenin bir dezavantajı reaktivitesi çok
2 yüksek olan reaktif oksijen ara ürünleri (ROS) olarak bilinen zararlı bazı radikallerin meydana gelmesidir. Bu radikallerin üretimi stres durumlarında artış gösterir ve vücutta birçok hastalığın da sebebidir. Bu nedenle strese dayalı hastalıklar başta olmak üzere bir hastalık tedavisinde preperatif antioksidan maddelerin kullanılması hekimler tarafından tavsiye edilmektedir. Günümüzde kanserle serbest radikaller arasındaki ilişki yapılan deneylerle ispat edilmiştir. Bilindiği gibi serbest radikaller yani süper oksit ve hidroksil radikali gibi maddeler canlı organizmalarda ve dokularda diğer madde ve gruplarla reaksiyona girerek hücre içerisinde istenmeyen toksik maddeler oluşturabilirler. Bu ürünler vücuda zararlı olup çeşitli mekanizmalarla hücre harabiyetini tetikleyerek hücre ölümüne yol açarlar (Gordon ve ark., 1996). Memeli hayvan hücrelerinde bu maddeler yaşlanmayı da hızlandırır. Serbest radikaller; lipit, protein ve DNA gibi büyük biyomoleküllerle etkileşerek, onları dejenere eder ve mutasyonların oluşumuna yol açarlar (Davies ve ark., 1995). Metabolizma ile bu maddelerin toksik özellikleri yok edilerek hücre dışına atılır (Safer ve ark., 1999). Bu reaksiyonlarda antioksidan maddeler ve antioksidan enzim sistemleri oldukça önemli rol oynar ve bu maddeler bu yüzden oldukça önemlidirler (Fukomoto ve ark., 2000). Sentetik antioksidanların kanserojen etkileri göz önüne alındığında doğal kaynaklı antioksidanların önemi daha da anlaşılmaktadır. Doğal antioksidanların en ucuz kaynağı bitkilerdir. Bitkilerden izole edilip yapıları ve aktiviteleri ortaya konan moleküllerin sentetik antioksidanların yerini alması için yapılan araştırmalar son yıllarda araştırmacıların odağı haline gelmiştir. Bu bağlamda; Türkiye ye endemik bir tür olan kısamahmut otunun anitoksidan aktivitesinin belirlenmesi ve bu aktiviteye sahip moleküllerin bitkiden saflaştırılması bitkinin ticari olarak değerlendirilmesini, ülke ekonomisine katkı sağlaması düşünülmektedir.
3 2. KAYNAK ÖZETLERİ Teucrium chamaedrys L. bitkisi halk arasında birçok hastalığın tedavisinde kullanılmaktadır. Bu hastalıklardan bazıları: baş ağrısı, kulak ağrısı, mide ağrısı, basur, hemoroid, diyabet iştahsızlık, kansızlık ve hazımsızlıktır (anonim 1). Atatürk Üniversitesi nde yapılan bir çalışmada yedi adet bitkiye antioksidan aktivite testi yapılmış, içlerinden en yüksek aktivitenin Tecrium chamaedrys L. e ait olduğu görülmüştür (Özgen ve ark., 2005). Tecrium chamaedrys L. ile yapılan başka bir çalışmada, üç adet yeni diterpenoid izole edilerek yapıları aydınlatılmıştır (Fiorendino ve ark., 2009). Şekil 2. 1. Fiorendino ve ark., tarafından izole edilen chamedroside A, B ve C molekülleri Tepe ve ark., (2012) Teucrium polium ve Teucrium chamdrys bitkilerinin metanol ekstraktlarının anti amoebisidal (Tropozitlerin neden olduğu kistler) aktivite gösterdiğini rapor etmişledir. Teucrium chamaedrys L. bitki türünde antioksidan ve izolasyon çalışmalarına rastlanırken, bir alt türü olan Teucrium chamaedrys L. sups. Chamaedrys de bu tür çalışmalara rastlanmamıştır.
4 Bu çalışmada; değişik biyolojik aktivitelere sahip kısamahmut otu bitkisinin antioksidan aktivitesi belirlenmesi ve antioksidan aktif bileşenlerin izolasyonu ve karakterizasyonu amaçlanmıştır.
5 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1. Bitkilerin Toplanması ve ekstraksiyon işlemi Kısamahmut otunun ekstrelerinin hazırlanması şu şekilde yapılacaktır: 1000 gram kısamahmut otu küçük parçalar haline getirildikten sonra 2500 ml hekzan- kloroform karışımı (1:1) içinde 24 saat süre ile mekanik karıştırıcı ile karıştırıldı. Sıvı faz adi süzgeç kâğıdı ile süzülerek bir kaba alındı. Bitki posasına kısma tekrar çözücü ilave edildi ve yukarıdaki işlemler sıvı fazın rengi berraklaşıncaya kadar devam edildi. Süzüntüler birleştirilerek çözücüsü uzaklaştırılarak EKSTRE I (12 g) elde edildi. Kalan bitki posasına sırası ile etil asetat-kloroform (1:1) ve metanol-kloroform (1:1) karışımları ilave edildi ve yukarıdaki işlemler tekrarlanarak özütleme yapıldı. Bu işlemler sonumda sırası ile ESKTRE II (8 g) ve EKSTRE III (112 g) elde edildi. Bu şekilde kısamahmut otunun içindeki doğal bileşikler % 13.2 verimle apolardan polara doğru değişik içerikli üç farklı kısma ayrılmış oldu. 3.2. Antioksidan Kapasitenin Belirlenmesi Bitki türevli yenilebilir/yenilemez ürünler büyük oranda antioksidan özelliğe sahip fenolik bileşikler (örneğin; fenolik asitler, flavanoidler, antosiyaninler, taninler, lignanlar ve kateşinler) içerir. Bu fenolikler, kalp hastalıkları, bazı kanser türleri ve oksidatif strese bağlı diğer hastalıklara yakalanma riskini arttırdığı bilinen zararlı serbest radikalleri engeller. Bu bileşiklerin antioksidan özellikleri temelde onların hidrojen atomu vericisi veya indirgeme ajanı olarak davranmalarından dolayı indirgeyebilme yeteneklerinden kaynaklanır. Bu doğal antioksidanlar; serbest radikal toplayıcısı, zincir kırıcı, proantioksidant metal iyonlarını kompleksleştiricisi olarak davranır. Meyvelerin, sebzelerin ve diğer bitki türevli ürünlerin antioksidan aktivitesini bir tek testle kesin olarak tespit etmek zordur. Doğal kaynaklı ürünlerin antioksidan aktivitesini
6 değerlendirmek/tahmin etmek için birçok test önerilmiştir. Doğal ürünlerin antioksidan aktivitesinin belirlenmesi için en azından iki test uygulanmalıdır. Elde edilen ekstrelerden ve bileşiklerden 1 mg/ml şeklinde stok çözeltiler hazırlandı. Daha sonra elde edilen her bir ekstraktin serbest radikal (DPPH ) giderme aktivitesi (Blois, 1958), indirgeme gücü aktivitesi (Elmastaş ve ark., 2006), in vitro olarak ölçüldü ve total fenolik bileşik tayini spektroskopik olarak (Slinkard ve Singleton, 1977) yapıldı. Bu aktivitelerin her biri α-tokoferol (vitamin E), bütillenmiş hidroksi toluen (BHT), bütillenmiş hidroksi anisol (BHA) gibi antioksidan maddelerin antioksidan aktiviteleri ile karşılaştırıldı. 3.2.1. Serbest Radikal Giderme Aktivitesi Serbest radikal (DPPH ) giderme aktivitesi Liyana-Pathirana nın özetlediği metotta bazı modifikasyonlar yapılarak değerlendirildi (Liyana-Pathirana ve Shaihidi, 2005). DPPH (2,2-difenil-1-pikril hidrazil) 0,135 mm lik etanol çözeltisin 1 ml si üzerine değişik konsantrasyonlarda (5-10-20-40-80 g/ml) numune çözeltisi ilave edildi. Son hacim etanol ile 4 ml ye tamamlandı. Karışım şiddetli şekilde vortekslenerek oda sıcaklığında ve karanlıkta inkübe edildi. Spektrofotometrik ölçüm (Jasco V-530, Japan Servo Co. Ltd., Japan) oda şartlarında, 517 nm de yapıldı. Denemeler üç tekrarlı olarak yapıldı. Numunelerin % serbest radikal giderme aktivitesi aşağıdaki formülle hesaplandı % SRG = [ (Abs kontrol -Abs numune )/Abs kontrol ]x100. Sonuçlar, % serbest radikal giderme olarak hesaplandı. 3.2.2. İndirgeme Gücü Aktivitesi Ham ekstre ve izole edilen moleküllerin indirgeme gücü Oyaizu metoduna göre değerlendirildi (Oyaizu, 1986). Standart ve numunelerin etanol içindeki farklı derişimlerine (40, 80 ve 120 mg/ml) fosfat tamponu (2.5 ml, 0.2 M, ph 6.6) ve potasyum ferrik siyanür [K 3 Fe(CN) 6 ] (2.5 ml, %1) ilave edildi. Bu karışım 50 C de 20 dakika inkübe edildi. İnkübasyondan sonra, bu karışıma TCA (2,5 ml, % 10) ilave
Absorbans (760nm) 7 edildikten sonra 10 dakika 3000 rpm de santrifüjlendi. Karışımdan 2.5 ml alınarak destile su (2.5 ml) ve FeCl 3 (0.5 ml, % 0.1) ilave edildi. Elde edilen son karışımın absorbansları 700 nm de kaydedildi. Yüksek absorbans yüksek indirgeme olarak değerlendirildi. Ölçümler üç tekrar olarak yapılmış, sonuçlar 700 nm deki absorbanslar olarak verilmiştir. 3.2.3. Toplam Fenolik Madde İçeriği Elde edilen ekstraktların total fenolik bileşik tayini Folin-Ciocalteu reaktifi ile yapıldı. Bitki ekstraktları (0.5 ml, 1 mg/ml) üzerine 10 kat seyreltilmiş Folin-Ciocalteu reaktifi (2.5 ml) ve Na 2 CO 3 (2 ml, 75 g/l) ilave edildi. Bu karışım vortekslendikten sonra 50 C de 5 dakika inkübe edildi. Numuneler oda sıcaklığına getirildikten sonra 760 nm deki absorbansları spektrofotometrede kaydedildi. Kör olarak su kullanıldı. Standart olarak kullanılan gallik asitin değişik derişimleri ile elde edilen kalibrasyon eğrisi (Şekil 3.1) oluşturuldu. Sonuçlar % fenolik madde olarak verildi. 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Gallik Asitin Kalibrasyon Grafiği y = 1,0188x - 0,0017 R² = 0,9992 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 konsantrasyon (mg/ml) Şekil 3. 1. Gallik asidin kalibrasyon grafiği
8 3.4. Etkili Bileşiklerin Saflaştırılması ve Karakterizasyonu Saflaştırma işleminin ön basamağı olan ekstraksiyon işlemi Şema 1. de özetlenmiştir. Şemada verilen tekniklerle elde edilen ekstre I, II ve III antioksidan testlere tabi tutularak hangi ekstrenin daha yüksek antioksidan özelliğe sahip olduğu belirlendikten sonra; ayırma işlemi kolon kromatografisi, flash kromatografi ve ince tabaka kromatografisi yöntemleri kullanılarak saflaştırıldı. Saf bileşikler uygun çözücü sistemleriyle kristallendirilmeye çalışılarak, bileşiklerin yapıları NMR, ve kütle spektroskopisi yardımı ile yapı tayinleri yapıldı. ( Teucrium chamaedrys L. Subsp. chamaedrys) Ekstraksiyon (hekzan-kloroform) Evaporasyon (Evapotörde) Ekstre I Süzüntü Süzüntü Bitki posası Ekstraksiyon (etilasetat-kloroform) Bitki posası Evaporasyon (Evapotörde) Ekstre II Süzüntü Ekstraksiyon(metanol-kloroform) Bitki posası Evaporasyon (Evapotörde) Ekstre III Kolon Kromatografisi, Flash Kromatografisi, NMR, MS Şekil 3. 2. Aktif moleküllerin izolasyon şeması
9 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Bölüm 3.1 de özetlenen şekilde yapılan özütleme işlemlerinden elde edilen ekstrelenin antioksidan kapasitesinin belirlemek yapılacak izolasyon çalışmalarına rehberlik edecek testlerin sonuçları aşağıda verilmiştir. 4.1. Ham Ekstrelerin Antioksidan Kapasitesinin Belirlenmesi 4.1.1. Serbest Radikal giderme aktivitesi Şekil 4.1 incelendiğinde; polar olmayan çözücü sisteminden polar olana doğru gittikçe serbest radikal giderme aktivitesinde bir artış gözlenmiştir. Metanol ekstresi 20 µg/ml derişimde bile % 90 ın üzerinde aktiviteye sahiptir. Tüm derişimlerde aktivite sıralaması Metanol>etil asetat> hekzan ekstreleri şeklindedir. Serbest radikal giderme aktivitesine göre en aktif olan ekstre diklormetan:metanol özütüdür (ESKTRE III). Şekil 4. 1. Teucrium chamaedrys L. subs. chamaedrys bitki ekstraktlarının serbest radikal giderme aktivitesi sonuçları
10 4.1.2. İndirgeme Gücü Aktivitesi Şekil 4.2 incelendiğinde; serbest radikal giderme aktivitesinde olduğu gibi indirgeme gücü aktivitesinde hekzan:diklormetan özütü (EKSTRE I) en düşük aktiviteye sahipken metanol:dikormetan özütü (EKSTRE III) ise en yüksek aktiveteye sahiptir. Etilasetat:diklormetan özütü (EKSTRE II) ise ılıman bir aktiviteye sahiptir. Bütün ekstraktlarda derişimin artması ile aktivitede de artış gözlenmiştir. 160 µg/ml derişiminde ise; aktivite sıralaması şu şekildedir; BHA > BHT > Metanol > Trolox > etilasetat > hekzan. Şekil 4. 2. Teucrium chamaedrys L. subs. chamaedrys bitki ekstraktlarının indirgeme aktivitesi sonuçları
11 4.1.3. Toplam Fenolik Madde Miktarı Şekil 4. 3. Ekstraktların fenolik madde içerikleri (%) Şekil 4.3 incelendiğinde; metanol:diklormetan (ESKTRE III) özütünün diğer özütlere göre daha yüksek miktarda fenolik madde içerdiği tespit edilmiştir. Bu da hem serbest radikal giderme hem de indirgeme gücü aktivitelerinin yüksek olmasını açıklamaktadır. Antioksidan aktiviteye sahip moleküllerin izole edilmesi için yapılmış çalışmada; yapılacak kolon işleminden önce; apolar çözücü sistemleri ile yapılan özütleme işlemi, antioksidan aktiviteye sahip olmayan diğer moleküllerin uzaklaştırılması ve fenolik maddelerim konsantrasyonunun arttırılması açısından önemlidir. Bitkiden biyolojik olarak aktif moleküllerin izole edilebilmesi için; hem fenolik maddece zengin hem de antioksidan aktiviteye sahip metanol:diklormetan ekstraktı seçilmiştir.
12 4.2. Antioksidan Aktif Moleküllerin Saflaştırılması 4.2. 1. Verbaskosid in Saflaştırılması ve Karakterizasyonu Yaklaşık 100 g Metanol:diklormetan özütü (EKSTRE III) 200 gr silika jel ile karıştırılarak tamamen kuruyana kadar azot gazı atmosferinde çözücüsü uzaklaştırıldı. Kromatografi işlemi; 50 cm X 120 cm boyutlarında özel imalat kolon kullanıldı. Sabit faz olarak 4 kg silika jel kullanıldı. Kolon şartlandırma işlemi 8 L hekzan sürekli kolondan geçirilerek yapıldı. Uygulanan bu işlem KOLON I olarak adlandırıldı. Şekil 4. 4. Ayırma ve saflaştırmada kullanılan kolon (KOLON I) Elüsyona; % 100 hekzan ile başlanarak, polarite etil asetat ile arttırılarak öncelikle % 100 etil asetata sonra da metanol ile arttırılarak %20 metanol: etil asetata kadar çıkıldı. Elüsyon işlemine polarite adım adım %10 luk artışlarla % 100 metanol kadar devam edildi. Fraksiyonlar 250 ml hacimlerde toplandı. Fraksiyonların çözücüsü evaporatörde uzaklaştırıldıktan sonra uygun çözücü ile çözülerek deney tüplerine aktarılarak saklandı.
13 Fraksiyonlar 25 lik seriler halinde TLC ye uygulandı. Benzer fraksiyonlar birleştirilerek saklandı. Toplanan fraksiyonlardan [101-116] ve [135-148] aralığı TLC kontrolü birleştirildi. Çözücüler evaporatörde uzaklaştırıldıktan sonra DMSO-d 6 ile çözülerek 1D-NMR spektrumları kaydedildi. Spektrumlar aşağıda verilmiştir. Şekil 4. 5. 101-116 fraksiyon aralığının proton NMR Spektrumu 101-116 fraksiyon aralığının proton NMR spektrumu incelendiğinde fraksiyonun küçük safsızlıklar içerdiği görülmektedir. Aromatik ve alifatik sinyaller içeren molekülün yapısının aydınlatılması için daha ileri saflaştırma işlemi gerektiğine karar verilerek bu aralığa tekrar kolon uygulaması (KOLON II) yapıldı.
14 Şekil 4. 6. Çalışmada kullanılan kolon (KOLON II) KOLON II de madde miktarı az olduğundan küçük bir kolon tercih edildi (2.5x80 cm). Dolgu maddesi olarak 120 g silika jel, hareketli fazın polaritesi: etil asetat: metanol karışımı 0:100 den 60:40 a kadar her 500 ml de %10 luk artışlar şeklinde ayarlandı. Yine fraksiyonlar 250 ml lik hacimlerde toplandı. TLC kontrolü ile fraksiyon 20-23 aralığının tek spot içerdiği ve oldukça saf olduğu gözlendi. Birleştirilen fraksiyonların çözücüsü uzaklaştırıldıktan sonra az miktarda metanol ile çözülerek damla damla etil asetat ilavesi ile çöktürme yapıldı. Çözücü dekante edildikten sonra kalan katı kısmın çözücüsü evaporatör ile uzaklaştırılarak açık sarı renkte amorf elde edildi. Bu katının yapısının tayin edilmesi için DMSO-d6 da çözülerek değişik 1D (proton, karbon, DEPT ve APT spektrumları) ve 2D (HETCOR, COSY, HMBC) spektrumları kaydedildi. Elde edilen maddenin proton (Şekil 4.7 ve 4.8) ve karbon (Şekil 4.9) NMR spektrumları verilmiştir. 1D ve 2D NMR spektrumlarından elde edilen verilerden molekülün yapısı
15 aydınlatılmıştır. Moleküle ait proton ve karbon sinyallerinin kimyasal kayma değerleri (δ, ppm olarak), Tablo 4.1 de verilmiştir. Şekil 4. 7. KOLON II den izole edilen molekülün proton NMR spektrumu (aromatik) Şekil 4.7 de saflaştırılan molekülün NMR spektrumu, kimyasal kayma ve yarılma şekilleri ile birlikte verilmiştir. Spektrumda 6-8 ppm aralığında 6 adet aromatik protonlar ile α-β doymamış sistemin sinyalleri gözlenmektedir. Büyük etkileşme sabitine sahip α ve β protonları sırası ile 7.46 ve 6.30 ppm de dublet olarak (J=15.80 Hz) yarılmışlardır. Kafeik asit ve fenilpropanoid halkalarındaki protonların farklı kimyasal kaymalarla aynı yarılma şekilleri ile sinyal vermeleri her iki aromatik halkanın da 3-4 disübstitüe olduklarının göstergesidir. Ayrıca anomerik H-1ˈ protonunun J=7.9 Hz lik bir etkileşme sabiti ile dublet şeklinde glikozun α-konfigürasyonunda olduğunu yine H1ˈˈ protonlarının 2.8 Hz lik bir etkileşme sabiti ile dublet şeklinde yarılması ramnoz grubunun β-konfigürasyonunda olduğunu gösterir.
16 Şekil 4. 8. KOLON II den izole edilen molekülün proton NMR spektrumu (alifatik) Saflaştırılan molekülün proton NMR spektrumunun 0-4 ppm aralığı Şekil 4.8 de verilmiştir. Spektrumda H-2ˈˈ protonları ramnoz grubunun metil sinyalleri J=6.25 Hz etkileşme sabiti ile dublet şeklinde rezonans olmuştur. Fenilpropanoid halkasının α ve β protonları ise sırasıyla 2.68 ve 3.85 ppm de rezonans olmuşlardır. Yarılma şekilleri spektrumda gözlenememiştir. İzole edilen molekülün karbon NMR spektrumu Şekil 4.9 da verilmiştir. Spektrum incelendiğinde toplamda 29 karbon gözlenmektedir. Bu sinyallerden δ C =18,62 ramnoz grubunun metil grubuna δ C =35.48 β karbonuna δ C =72.03 α karbonuna aittir. Glikoz ve ramnoz gruplarının anomerik karbon sinyalleri sırası ile 102.76 ve 102.50 ppm de gözlenmiştir.
17 Şekil 4. 9. KOLON II den izole edilen molekülün karbon NMR spektrumu δ C =166.13 ppm de gözlenen sinyal karbonil grubuna, sırasıyla 114.33 ve 146.01 ppm de αˈ ve βˈ karbonlarına aittir. Spektrumda 144-150 ppm aralığındaki diğer dört sinyal aromatik halkaya OH gruplarının bağlı olduğu quarterner karbon sinyalleridir. Şeker gruplarına ait 10 karbon sinyali 60-80 ppm aralığında gözlenmiştir. Moleküldeki şeker grupları, kafeik asit ve fenilpropanoid grubunun birbirine bağlandığı pozisyonlar HMBC spektrumundan elde edilen korelasyonlarla belirlenmiştir (Bkz. Şekil 4. 10, kırmızı ile vurgulanan oklar; H dan C ye). Molekülün kütle spektrumunda gözlenen 624.2042 sinyali (Bkz Şekil 4.10) molekülün tam molekül ağırlığını vermektedir (hesaplanan C 29 H 36 O 11 : 624.2054). Bu bilgiler ışığında KOLON II den izole edilen ve yapsın NMR ve kütle spektrometresi ile aydınlatılan molekülün kimyasal yapısı Şekil 4.11 de verilmiştir.
18 Şekil 4. 10. KOLON II den izole edilen molekülün LC-TOF spektrumu Şekil 4. 11. KOLON II den izole edilen molekülün kimyasal yapısı Çizelge 4. 1. KOLON II den izole edilen molekülün NMR verileri Pozisyon MOLEKÜL I (KOLON II 20-23 fraksiyon aralığı ) C H DEPT/APT δ (ppm) δ (ppm) 1 C 129.90-2 CH 117.01 6.63 (d, J=2,0 Hz) 3 C 145.51-4 C 114.20-5 CH 116.10 6.62 (d, J=8.01 Hz) 6 CH 120.10 649 (dd, J=8.01, J=2.0 Hz) α CH 2 72.03 3.85 (t, J=6.76 Hz) β CH 2 35.79 2.68 (t, J=6.76 Hz) 1' CH 102,50 4.37 (d, J=7.9 Hz) 2' CH 74.96 3,73 (m) 3' CH 70.75 3,33 (m) 4' CH 69.19 4,70 (m) 5' CH 72.43 3,09 (m) 6' CH 2 61.15 3,28 (m) 1'' CH 102.76 4.78 (d, J=2.8 Hz) 2'' CH 80.02 3,68 (J=7,81 Hz) 3'' CH 74.88 3,48 (m) 4'' CH 74.77 3,20 (m) 5'' CH 69.25 3,35 (m) 6'' CH 3 18.69 0.96 (d, J=6,25 Hz) 1'''' C 126.02-2'''' CH 115.32 7.03 (d, J=2.01 Hz) 3'''' C 146.45-4'''' C 149.59-5'''' CH 116.12 6.75 (d, J=8.31 Hz) 6'''' CH 122.14 6.98 (dd, J=8.3, J=2.01 Hz) α' CH 114.02 6.20 (d, J=15.8 Hz) β' CH 146.51 7.45 (d, J=15.8 Hz) C=O C 167.03 -
19 4.2.2. Teukrosid in Saflaştırılması ve Karakterizasyonu Metanol:diklormetan özütüne uygulanan KOLON I den toplanan 135-148 fraksiyon aralığının; yapılan TLC kontrolünde tek spot içerdiği ve 101-116 fr aralığından farklı bir madde olduğu tespit edilmiştir. Birleştirilen fraksiyonların parlak sarı renkte amorf katı olduğu gözlenmiş ve NMR spektrumları kaydediştir. Proton NMR spektrumları (alifatik ve aromatik kısım olarak) Şekil 4.12 ve 4.13 de verilmiştir. Şekil 4. 12. KOLON I den saflaştırılan molekülün proton NMR spektrumu (Aromatik) Proton NMR spektrumu incelendiğinde molekülün tekrar saflaştırma işlemine gerek duyulmayacak saflıkta olduğu gözlenmiştir. Spektrumdan; molekülün verbaskosit in aromatik kısmı ile benzerlik gösterdiği anlaşılmaktadır. Buradan da bu iki molekülün aynı aromatik iskelete sahip olduğu kanısına varılmıştır. Proton NMR spektrumunda, verbaskosit molekülünden farklı olarak δ H =5.16 ppm de geniş singlet şeklinde gözlenen sinyal, yapıda glikoz ve ramnoza ilave bir şeker grubunun bağlı olduğunu gösterir.
20 Şekil 4. 13. KOLON I den saflaştırılan molekülün proton NMR spektrumu (Alifatik) Molekülün alifatik kısmı da verbaskosit molekülü ile uyumludur. Ancak molekülün sahip olduğu diğer şeker protonları çözücü pikleri ile çakıştığından proton NMR spektrumundan moleküller arasındaki fark ortaya konamamıştır. Tablo 2 de verilen proton kimyasal kayma değerli HETCOR spektrumundan elde edilen veriler ile oluşturulmuştur. Şekil 4.14 de verilen karbon NMR spektrumundaki aromatik bütün sinyaller verbaskosit ile uyum içindedir. Alifatik kısımdaki α ve β karbonlarının kimyasal kayma değerleri de aynı iskelete sahip verbaskosit ile benzerdir. Anomerik karbonların kimyasal kayma değerleri; bağlı bulunduğu elektronegatif oksijen atomlarının kaydırma etkisinden dolayı diğer şeker karbonlarına nazaran daha aşağı alanda rezonans olduklarından 100 ppm civarındadır. Molekülün karbon NMR spektrumundaki δ C =100.57 ppm deki karbon sinyali de molekülün fazladan bir şeker grubu içerdiğini doğrulamaktadır. Nitekim şeker gruplarının karbon sinyallerinin bulunduğu 60-80 ppm aralığında toplam 14 sinyalin varlığı ve bu sinyallerden δ C =61.13 ppm de gözlenen ve APT spektrumunda negatif olarak sinyal veren CH 2 karbonunun varlığı şeker
21 grubunda bir CH 2 sinyalinin varlığını gösterir. Şeker halkası içerisinde CH 2 içeren şeker ksilozdur. Proton NMR spektrumunda ksiloza ait anomerik protonun geniş singlet şekilde rezonans olması da ksiloz grubunun β-konformasyona sahip olduğunu gösterir. Şekil 4. 14. KOLON I den saflaştırılan molekülün karbon NMR spektrumu Molekülün LC-TOF Spektrumunda gözlenen (Bkz Şekil 4.15) 756.2445 (hesaplanan: 756.2477) sinyal molekülün, molekül formülünün C 34 H 44 O 19 olduğunun göstergesidir. Şekil 4. 15. KOLON I den saflaştırılan molekülün LC-TOF spektrumu
22 Bu spektral bilgiler ışığında aydınlatılan molekülün kimyasal yapısı ve NMR değerleri sırası ile Şekil 4.16 ve Tablo 22 de verilmiştir. Şekil 4. 16. KOLON I den saflaştırılan molekülün kimyasal yapısı Çizelge 4. 2. KOLON I den saflaştırılan molekülün NMR verileri 1 (Beşir KOLON 135-148 FR) C. No C H DEPT/APT δ (ppm) δ (ppm) 1 C 129.60-2 CH 116.75 6.63 (d, J=2.58 Hz) 3 C 145.43-4 C 143.99-5 CH 115.92 6,63 (brs) 6 CH 120.01 6,49 (brs) α CH 2 70.75 3.78 (t, J=6.76 Hz) β CH 2 35.47 2.60 (t, J=6.76 Hz) 1' CH 100.58 5.16 (brs) 2' CH 77.68 3.79 (m) 3' CH 70.75 3.38 (m) 4' CH 69.45 4.73 (m) 5' CH 72.42 3.12 (m) 6' CH 2 61.13 3.34 (m) 1'' CH 102.76 4.36 (d, J=7.80 Hz) 2'' CH 80.01 3.69 (t, J=9.28 Hz) 3'' CH 74.91 3.48 (m) 4'' CH 74.83 3.20 (m) 5'' CH 69.20 3.36 (m) 6'' CH 3 18.64 0.94 (d, J=6.76 Hz) 1''' CH 102.49 4.81 (d,j=2.52 Hz) 2''' CH 70.34 3.60 (m) 3''' CH 71.35 3.44 (m) 4''' CH 67.39 3.55 (m) 5''' CH 2 64.02 3.30 (m) 3.46 (m) 1'''' C 125.91-2'''' CH 115.14 7.03 (d, J=2.8 Hz) 3'''' C 146.02-4'''' C 148.94-5'''' CH 116.24 6.76 (d, J=8.04 Hz) 6'''' CH 121.91 6.99 (d, J=8.04 Hz) α' CH 113.97 6.21(d, J=15.8 Hz) β' CH 146.08 7.46 (d, J=15.8 Hz) C=O C 166.15 -
23 4.3. Saflaştırılan Moleküllerin Antioksidan Aktivitelerinin Değerlendirilmesi Antioksidan aktivite gösteren özütten izole edilen iki molekülün antioksidan aktiviteleri serbest radikal giderme ve indirgeme gücü aktiviteleri ile değerlendirildi. Saflaştırılan moleküllerin 1 mg/ml derişimdeki stok çözeltileri hazırlanarak testler bu stok çözeltiler üzerinden yapıldı. 4.3.1. İzole Edilen Moleküllerin Serbest Radikal Giderme Aktiviteleri İzole edilen moleküllerin serbest radikal giderme aktiviteleri Bölüm 3.2.1 de özetlendiği gibi yapıldı. Moleküllerin aktiviteleri eşit derişimlerde hazırlanan standart çözeltilerin aktiviteleri ile karşılaştırıldı. Şekil 4. 17. İzole edilen moleküllerin ve standartların serbest radikal giderme aktivitesi Şekil 4.17 incelendiğinde izole edilen moleküllerin EKSTRE 3 den daha aktif olduğu gözlenir. Sentetik antioksidanlar ile karşılaştırıldığında ise; izole edilen moleküllerin BHA ve BHT den daha aktif iken Troloks dan daha az aktif olduğu gözlenmiştir.
24 Moleküllerin IC 50 değerleri (Şekil 4.18) incelendiğinde; izole edilen moleküllerin ve standartların aktivite farkları daha açık şekilde görülmektedir. Teukrosid, aynı aromatik iskelete sahip olmasına rağmen verbaskosid den daha düşük aktiviteye sahiptir. Çünkü moleküllere bağlı olan şeker gruplarının serbest radikal giderme aktivitesine bir etkisi yoktur. Serbest radikallerin sönümlenmesi aromatik kısımda gerçekleşen bir olaydır. Teukrosid de ise fazladan bir şeker grubunun bağlı olması mol başına düşen aromatik bölgeyi düşürmektedir. Bu da serbest radikal giderme aktivitesindeki düşüşü açıklamaktadır. Şekil 4. 18. İzole edilen moleküllerin ve standartların IC50 değerleri IC 50 değerleri incelendiğinde izole edilen moleküllerin, karışım halinde bulundukları EKSTRE III den daha yüksek aktiviteye sahip oldukları görülmektedir. Yapılan çalışmada izole edilen moleküller; doğal kaynaklı, yüksek antioksidan aktiviteye sahip, kanserojen olduklarından şüphe edilen sentetik antioksidanların yerini alabilecek doğal antioksidanlardır.
25 4.3.2. İzole Edilen Moleküllerin İndirgeme Gücü Aktiviteleri İzole edilen moleküllerin indirgeme gücü aktivitesinin standart olarak kullanılan sentetik antioksidanların aktiviteleri ile karşılaştırılması Bölüm 3.2.2 de özetlendiği şekilde yapıldı. 20, 40, 80 ve 160 µg/ml derişimlerde değerlendirilen aktivite sonuçları Şekil 4.19 da verilmiştir. Şekil 4. 19. İzole edilen moleküllerin ve standartların serbest radikal giderme aktivitesi Tablo incelendiğinde değerlendirilen bütün derişimlerde izole edilen moleküllerin ESKTRE III den daha aktif olduğu gözlenmektedir. Verbaskosid ise teukrsosid dan daha aktiftir. Verbaskosid in indirgeme gücü aktivitesi ise test edilen standartlardan daha yüksektir. Teukrosid ise aktivite bakımından standartlarla benzerlik göstermektedir.
26 4.4. Hekzan:Diklormetan Fazından İzole Edilen Moleküller Antioksidan aktivitesi düşük olmasına rağmen hekzan:diklormetan ekstresinde bazı kristallenmeler gözlendi ve bu özütteki (EKSTRE I) moleküllerin ayrılması için ekstre sıcak su ile çözülerek kollodial haldeki klorofil ve yağ süzgeç kağıdı ile uzaklaştırıldı.sarı renkteki sulu faz önce hekzan ile sıvı-sıvı ortamda ayırma hunisinde ekstrakte edilerek az miktarda suya geçmiş yağ ve klorofil uzaklaştırıldı. Kalan su fazı etil asetat kullanılarak yine ayırma hunisinde ekstrakte edilerek etil asetat fazları toplandı ve evaporatörde çözücüsü kuruluğa kadar uzaklaştırıldı. Elde edilen kalıntının miktarı 6 g olarak tartıldı. Etil asetat fazının içerdiği metabolitlerin ayrılması için kolon kromatografisine (KOLON III) tabi tutuldu. Kolon olarak 5X40 cm uzunluğunda cam kolon, hareketli faz olarak hekzan:aseton karışımı (asetonun artan miktarı ile %100 asetona kadar) ve sabit faz olarak da 70 gr slika jel kullanıldı. 250 ml hacimlerde toplanan fraksiyonlar TLC ye uygulandı. Fraksiyonlardan 14, 24-25 ve 36 fraksiyonların tek madde oldukları tespit edildi bu fraksiyonların NMR spektrumları ve TOF dataları kaydedildi. 4.4.1. Teukrin G nin Yapı Tayini ( KOLON III-Fraksiyon 14) Şekil 4. 20. Teukrin G molekülünün kimyasal yapısı
27 Şekil 4. 21. Teukrin G molekülü proton NMR spektrumu Şekil 4. 22. Teukrin G molekülü karbon NMR spektrumu
28 4.4.2. Dihidroteguin Molekülün Yapı Tayini (KOLON III-Fraksiyon 24-25) Şekil 4. 23. Dihidroteguin molekülün yapısı ve NMR değereleri
29 Şekil 4. 24. Dihidroteguin molekülünün proton NMR spektrumu Şekil 4. 25. Dihidroteguin molekülünün karbon NMR spektrumu
30 4.4.3. Fraksiyon 36 Molekülün Yapı Tayini (KOLON III-Fraksiyon 36) Şekil 4. 26. Fraksiyon 36'nın kimyasal yapısı Şekil 4. 27. Fraksiyon 36'nın proton NMR spektrumu
31 Şekil 4. 28. Fraksiyon 36'nın karbon NMR spektrumu
32 5. SONUÇ Kısamahmut otundan antioksidanca aktif moleküllerin saflaştırılması ve karakterizasyonu amacıyla yapılan çalışmada; üç farklı çözücü sistemi ile (hekzan:diklormetan, etil asetat:diklormetan ve metanol:diklormetan) aşamalı olarak ekstrakte edilmiştir. Elde edilen ekstrakt miktarları sırası ile 12 g, 8 g ve 112 g şeklindedir. Toplam ekstraksiyon verimi ise %13.2 olarak hesaplanmıştır. Bitki esktraktlarının toplam fenolik madde içeriği (ekstredeki % fenolik madde olarak) ise % 1.2, %4.8 ve % 18.2 olarak bulunmuştur. Bitki ekstraktlarının serbest radikal giderme ve indirgeme gücü aktiviteleri ise toplam fenolik madde içeriği ile paralel olarak apolar çözücü sisteminden polar çözücü sistemine doğru bir artış göstermektedir. Toplam fenolik madde içeriğinde de olduğu gibi en yüksek aktivite yine metanol diklormetan ekstraktında gözlenmiştir. Antioksidan aktif moleküllerin izolasyonu için; fenolik maddece zengin ve yüksek aktiviteye sahip metanol:diklormetan ekstraktı seçilmiştir. Bu ekstrakt kolon kromatografisine tabi tutulmuş ve toplana 101-116 fraksiyon aralığı ve 135-158 fraksiyon aralığı TLC kontrolü ile birleştirilmiştir. 135-148 fraksiyon aralığının tek madde içerdiği NMR spektrumundan anlaşılmış ve herhangi bir ek saflaştırma işlemine gerek kalmadan yapısı teukrosid olarak aydınlatılmıştır. 101-116 fraksiyon aralığı ise tekrar kolon kromatografisine tabi tutulmuş ve toplanan fraksiyonlardan 20-23. fraksiyonların saf olduğu TLC kontrolü ile belirlenmiş ve NMR ve TOF kullanılarak verbaskosid olarak aydınlatılmıştır. İzole edilen bu moleküllerin serbest radikal giderme aktivitesi standart olarak kullanılan sentetik antioksidanlardan BHA ve BHT den yüksek olduğu ve troloks dan ise düşük olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca verbaskosid in teukrosid e nazaran daha yüksek aktiviteye sahip olduğu belirlenmiştir. Serbest radikal giderme aktivitesinde ham ekstraktın IC 50 değeri 9.83 µg/ml iken verbaskosid ve teukrosid in IC 50 değerleri sırasıyla 4.28 ve 5.76 µg/ml olarak bulunmuştur. İndirgeme gücü aktivitesinde ise serbest radikal giderme aktivitesindeki benzer korelasyon söz konusudur.
33 Sonuç olarak; bu çalışmada, kısamahmut otundan antioksidan aktivitesi yüksek moleküller kromatografik yöntemlerle saflaştırılıp yapıları spektroskopik olarak tayin edilmiştir. Ayrıca bitkinin hekzan diklormetan ekstraktından üç adet diterpen izole edilerek yapıları aydınlatılmıştır.
34 KAYNAKLAR Amakura, Y., Umino, Y., Tsuji, S., Ito, H., Hatano, T., Yoshida, T., Tonogia, Y., 2002. Constituents and their antioxidative effect in eucalyptus leaf extract used as a natural food additive. Food Chemistry. 77, 47-56. Anonim, 2011. dalak-otu-teucrium-chamaedrys.www.sifaliotlar.org (20.01.2011). Baytop, T., 1999. Therapy with medicinal plants in Turkey (Past and Present). Nobel Tıp Kitapevleri, Istanbul, 152-153. Blois, M. S., 1958. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature, 26, 1199 1200. Davies, K,J,A., Rice, E., Halliwell, C. B., Lunt, G. G., 1995. Free radicals and oxidative stres. 1 31. Portland Press London U.K. Elmastas, M., Demirtas, I., Isildak, O., Aboul-Enein, H.Y., 2006. Antioxidant Activity of S- Carvone Isolated from Spearmint (Mentha Spicata L.). Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 29, 1465 1475. Fiorendino A., Ricci A., Pacifico B., Picolella S., and Monacco P., 2009. Structure determination of chamaedryosides A C, three novel nor-neo-clerodane glucosides from Teucrium chamaedrys, bynmr spectroscopy. Magnetic Resononse in Chemstry. 47,1007-1012 Fukumoto, L. R., Mazzo, G., 2000 Assessing antioxidant and prooxidant activities of phenolic compounds. J. Agric. Food Chem. 48. 3597 3604. Gordon, M.H., 1996. Dietary antioxcidants in disease prevention. 13, 265 273. Moffat, A. C., Jackson, J. V., Moss M. S., and Widdop, B., 1986. Clarke s isolation and identification of drugs, The Pharceutical Press, Londra U.K. Özgen U., Mavi A., Yıldırım A., Hougton P. J., 2006. Antioxidant Properties of Some Medicinal Lamiaceae (Labiatae) Species. Pharmaceutical Biology. 44, 107 112 Prakasam, A., Sethupathy, S., Pugalendi K.V., 2005. Antiperoxidative and antioxidant effects of Casearia Esculante root extract in Streptozotocin-Induced Diabetic Rats. Yale J Biol Med, 78(1), 15-23 Safer, A. M., Nughamich, A., 1999. Hepatotoxicity induced by the antioxidatant food additive butylated hydroxy toluene (BHT) in rats. An electron microscopical study. Hist. Histopathol.14, 391 406. Slinkard, K., Singleton, V.L., 1977. Total phenol analyses: Automation and comparison with manual methods. American Journal of Enology and Viticulture, 28, 49 55.