EGE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ (YÜKSEK LİSANS TEZİ) ENDEMİK BİTKİLERİMİZDEN OLAN CHRONANTHUS ORİENTALİS (Lois) Heywood&Frodin (Fabaceae) İLE FİTOKİMYASAL ÇALIŞMALAR Merve GÜNER Tez Danışmanı: Doç.Dr. Hatice DEMİRAY Biyoloji Anabilim Dalı Bilim Dalı Kodu: 401.03.00 Sunuş Tarihi: 10.02.2011 Bornova-İZMİR 2011
ii
iv
v ÖZET ENDEMİK BİTKİLERİMİZDEN OLAN CHRONANTHUS ORİENTALİS (Lois) Heywood&Frodin (Fabaceae) İLE FİTOKİMYASAL ÇALIŞMALAR GÜNER, Merve Yüksek Lisans Tezi, Biyoloji A.B.D. Tez Danışmanı: Doç. Dr. Hatice DEMİRAY Şubat 2011, 66 sayfa Bu çalışmada Chronanthus orientalis bitkisi taşıdığı kinolizidin alkaloidleri tipi yönünden incelenmiştir. Açık havada ve gölgede kurutulmuş C.orientalis in toprak üstü kısımları etanol ile ekstre edilmiştir. Etanol ekstresi üzerinden total alkaloidler tuzları şeklinde elde edildikten sonra ince tabaka ve kolon kromatografik çalışmalar sonunda spartein, lidocaine, oxospartein, lupanin, n-oktilftalat izole edilmiştir. Bileşiklerin analizi gaz kromatografisi kütle spektrometrisi yöntemleriyle belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Chronanthus orientalis, alkaloid, Cytisus, kinolizidin
vi
vii ABSTRACT PHYTOCHEMICAL STUDIES OF CHRONANHTUS ORİENTALİS (Lois) Heywood&Frodin (Fabaceae) ONE OF OUR ENDEMİC PLANTS GÜNER, Merve MSC, Biology Department Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Hatice DEMİRAY February 2011, 66 pages İn this work, type of quinolizidine alkaloids of Chronanthus orientalis were investigated. Aerial parts of C.orientalis were extracted with ethanol after dried in shade places. Sparteine, lidocaine, oxosparteine, lupanine, n- octylphthalate alkaloids were isolated after the thin layer and column chromatographic investigations of the total alkaloids which were obtained from dried ethanol extract. Gas chromatographic and mass spectrometric analysis were performed in analysing the compounds. Key Words: Chronanthus orientalis, alkaloid, Cytisus, quinolizidine
viii
ix TEŞEKKÜR Bu çalışmanın her aşamasında benden desteğini esirgemeyen, her sorunuma maddi manevi çözüm bulan, bu tezi yapmam konusunda beni yüreklendiren çok değerli hocam Doç. Dr. Hatice DEMİRAY a teşekkürü bir borç bilirim. Laboratuar çalışmalarım sırasında deneyimini ve bilgisini benden esirgemeyen Dr. Z. Işın YAZICI ya, bitkimi Bozdağ dan toplamada emeği ona ait olan Dr. Serdar ŞENOL a, TLC uygulamalarında bana yardımcı olan Fatih KARABEY e çok teşekkür ederim. Lisans hayatımda olduğu kadar yüksek lisans eğitimimde de desteğini esirgemeyen annem Nesrin GÜNER, babam Nevzat GÜNER, kardeşim Cem GÜNER e sonsuz teşekkürlerimi bildiririm. Ayrıca manevi desteğiyle her zaman yanımda olan hayat arkadaşım Mustafa SIRKINTI ya teşekkürlerimi sunarım.
x
xi İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET... v ABSTRACT... vii TEŞEKKÜR... ix ŞEKİLLER DİZİNİ... xv SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... xvii 1. GİRİŞ... 1 2. LİTERATÜR ÖZETİ... 2 2.1 Botanik Bilgileri... 2 2.1.1 Leguminosae (Fabaceae) Familyası... 2 2.1.1.1 Sistematikteki Yeri... 2 2.1.1.2 Genel Takson Bilgileri... 3 2.1.2 Chronanthus (DC.) Koch Cinsi... 4 2.1.3 Chronanthus orientalis... 5 3. LUPİNAN GRUP... 7 3.1 Papilionaceae Alkaloidleri... 7 3.1.1 Papilionaceae... 8
xii İÇİNDEKİLER (devam) Sayfa 3.1.2 Lupinan Alkaloidlerinin Farmakolojik Etkileri... 11 3.1.3 Alkaloid İçeren Bitkilerin Halisünojen Etkileri... 13 4. ALKALOİDLERİN İNCE TABAKA KROMATOGRAFİSİ... 15 4.1 İnce Tabaka Kromatografisi... 15 4.1.1 Prolidin, Priolizidin, Pridin, Piperidin ve Kinolizidin Alkaloidleri... 15 4.1.2 Solvent Sistem... 15 4.1.3 Tespit... 16 4.1.4 Kantitatif Analiz... 17 5. MATERYAL VE YÖNTEMLER... 19 5.1 Materyaller... 19 5.1.1 Ekstraksiyon ve Yoğunlaştırma... 19 5.1.2 Ekstraksiyon ve İzolasyon Sırasında Kullanılan Materyal ve Yöntemler... 20 5.2 Kullanılan Teknik Aletler ve Kimyasal Maddeler... 23
xiii İÇİNDEKİLER (devam) Sayfa 6. SONUÇLAR... 24 6.1 Bulunan Maddelerin Özellikleri... 37 7. TARTIŞMA... 40 9. KAYNAKLAR DİZİNİ... 44 ÖZGEÇMİŞ... 47
xiv
xv ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil Sayfa 2.1 Chronanthus orientalis bitkisitürkiye de illere göre dağılışı... 3 2.2 Chronanthus orientalis bitkisi Gridlere göre dağılışı:b1,b2... 3 2.3 Chronanthus biflorus... 6 2.4 Cytisus fontanesii... 6 5.1 Chronanthus orientalis drog maddesinin etanol ile ekstraksiyonu... 19 5.2 Açık kolon kromatografisi... 21 5.3 A maddesinin TLC yöntemiyle gösterdiği belirgin bantlar... 22 6.1 2-(diethylamino)- N-(2,6-dimethylphenyl)acetamide... 37 6.2 Molecküler Formül: C15H26N2... 38 6.3 Lupanin moleküler dizini... 38
xvi
xvii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama CHCl3 Fr. OH Kloroform Fraksiyon Hidroksil Kısaltmalar İTK MeOH Hex MS GS THC DnOP İnce Tabaka Kromatografisi Metanol Hekzan Kütle Spektroskopisi Gaz Kromatografisi Tetra Hidro kannobinol n-octylphtalate
xviii
1 1. GİRİŞ Türkiye yaklaşık 10.750 civarında vasküler bitki taksonuna sahiptir ve bulunduğu coğrafyada bu yönüyle ön plana çıkmaktadır. Bu floristik zenginliğin yaklaşık 3.500 kadarı endemiktir. Bu sayı, toplam floranın % 32 sini oluşturmaktadır. Türkiye florasında en çok takson içeren familyalar, Compositae (1.215 takson) ve Leguminosae (Fabacea) (1.071 takson) dir ve ülkemiz florasının yaklaşık beşte birini oluştururlar. Türkiye florasında Leguminosae familyası içerdiği 400 civarındaki endemik takson ile ikinci sırada yer almaktadır. Bu çalışmanın temel materyalini oluşturacak olan Chronanthus orientalis (Lois.) Heywood& Frodin de Leguminosae familyasına dahildir. Chronanthus cinsi dünya genelinde sadece 2 tür içermektedir. Bunlardan biri olan Chronanthus biflorus (Desf.) Koch, Doğu-Güney İspanya, Balarik Adaları ve Kuzeybatı Afrika da yayılışa sahiptir. Diğer tür ise Flora of Turkey (Davis, 1965-82) e göre tek lokalitede (İzmir Bozdağ) yetiştiği bilinen ve Türkiye Bitkileri Kırmızı Kitabı (Ekim & ark. 2000) na göre VU (zarar görebilir) kategorisinde yer alan Chronanthus orientalis (Lois.) Heywood&Frodin dir. Chronanthus orientalis ismi bitkiye, Cytisus genusu üzerindeki son morfolojik ve moleküler araştırmalar ile sistematiğe kazandırılan yeni veriler sonucunda, nükleer ve plastid DNA karakterleri göz önünde bulundurularak verilmiştir (Cristofolini ve Troia, 2006). Bu yeni isimlendirmeye göre sinonimi Cytisus oritentalis L. Desf.( Greuter,1989; Davis,1970 ) olan bitkimiz Chronanthus orientalis (lois). Heywood&Frodin olarak isimlendirilmiştir. Cytisus genusu üzerinde bugüne kadar yapılan fitokimyasal çalışmaların sonucunda: Kinolizidin alkaloidleri, (spartein, lupanin ), fenetilaminler, isaflavonlar (genistein: Viscardi&Reynaud&Reynaud, 1984), flavonoidler, uçucu yağ, kafeik asit, p-kumarik asitler, tannin ve pigmentler bulunmuştur. Kuru ve taze olarak kullanıldıklarında; kardiyotonik, katartik, antioksidant, diüretik, emetik, purgatif etkilerine sahiptirler (Dang, 2007; Van Beek and Breteler,1993). Endemik olması dolayısıyla bitkimizde bulunması kuvvetle muhtemel olan yeni bileşiklerin fitokimyasal olarak araştırılması ile literatüre yeni katkılar sağlanacaktır.
2 2. LİTERATÜR ÖZETİ 2.1. Botanik Bilgileri 2.1.1 Leguminosae (Fabaceae) Familyası Otsu veya ağaç, yapraklar alternat, genelde stipulalı, bipinnat, basit pinnat, digitat, trifoliat ya da basit, genellikle tek yapraklı, yapraklar bazen körelmiş. Çiçek aktinomorf veya zigomorf, hipogin, bazen perigin, genelde hermafrodit ve çiçek rasem spika, umbella şeklinde veya tekli. Sepal nadiren 4, genelde 5 li. İlave sepaller önde. Korolla (1-) 5 petalli, tomurcukta valvat veya imbrikat, serbest ve nadiren tabanda birleşik. Androkeum 4- veya 4 ten fazla stamenli, genelde 10, hepsi birleşik tüp şeklinde (diadelphous). Üstteki stamen serbest, diğer 9 u birleşik ya da hepsi serbest. Ovaryum 1 karpelli, üst durumlu, plasentasyon uçta. Meyva legümen (bir karpelden oluşmuş, olgunlukta açık) veya lomentum tip. Tohumlar 1- veya 1 den fazla sayıda (Davis 1970). 2.1.1.1 Sistematikteki Yeri Kingdom : Plantae Subkingdom : Tracheobionta Division : Magnoliophyta Cronquist, Takht. & Zimmerm. Ex Reveal Class : Magnoliopsida Brongn. Subclass : Rosidae Takht Order : Fabales Bromhead Family : Fabaceae Lindl Genus : Chronanthus (DC.) KOCH Taxon : Chronanthus orientalis (LOIS.) HEYWOOD ET FRODIN (Chamberlain D.F, Phil D, Matthews A.C, 1970)
3 Şekil 2.1 Chronanthus orientalis bitkisi Türkiye de illere göre dağılışı: İZMİR( ) Şekil 2.2 Chronanthus orientalis bitkisi Gridlere göre dağılışı:b1,b2 2.1.1.2 Genel Takson Bilgileri Ömür : Çok yıllık Yapı : Çalı Hayat formu : FANEROFİT Çiçeklenme : 6-6 Habitat : Tepe eteklerindeki meşe çalılarında Yükseklik : 0-1000 m Endemik : Endemik Element : D.Akdeniz Türkiye dağılımı : B.Anadolu Genel dağılımı : Türkiye Tribus: Genistae (Cytiseae & Laburneae) dahildir. Dallanmamış ve dikenli çalılardır. Nadiren odunsu temele sahip fakat çalımsı olarak yükselen,
4 otlar. Yaprakları 1-3 yapraksı olup, nadiren küçük dikensi fillotlar şekline indirgenmiş, stipüller terminal küçük veya yok. İnflorasens rasemoz, fasikülat veya subkapitat, terminal veya bazen lateral. Stamenler monodelfus. Anterler dimorfik. Meyve legümen ve kendiliğinden açılmıyor. Tohumlar karunkulalı veya karunkulasızdır. Buna dahil türler Cytisus, dikensiz çalılar Chamaecytisus Link Chronanthus Koch Gonocytisus Spach Teline medicus Ulex L. Genista L. Spartium L. Podocytisus Bois & Heldr Calicotome Link. Adenocarpus D.C Lotononis Eckl & Zeyh Argyrolobium Eckl & Zeyh Lupinus L. Robina L 2.1.2 Chronanthus (DC.) Koch Cinsi Leguminosae familyasında Grup C de yer alır. Tam olarak odun yapısının eksik olduğu otsu türlere girer. Dikensiz, yaprakları 3-yaprakçık olup; stipül bulundurmaz. Çiçekler terminal başta bulunur. Kaliks belirgin bir alt ve üst dudakla birlikte tubular dır. Üst dudak derin bir şekilde ikiye ayrılmış olup, alt dudak belirgin bir şekilde üç dişlidir. Korolla sarı ve devamlı olup, tohumu çevreler. Stamenler monodelfustur. Meyve eşkenar dörtgene benzeyecek derecede oblong olup 1-3 tohumludur. Tohumda küçük bir strophiole bulunur (Heywood,
5 V.H. & Frodin, D. 1968). Avrupa türlerinin sinopsisini Cytisus ve akraba türleri oluşturur ( Feddes Rep. 79: 21, 1968). 2.1.3 Chronanthus orientalis Dik çalıları 50 cm e kadar yükselir, dalları güçlü çizgili ya da açılı olup yoğun villusludur. Yaprakları 3-yaprakçıklı, petiol 2-4 mm. Yaprakçıklar 10-30 3-5 mm, eliptik, oblensolat, bol tüylüdür. Çiçekler braktesiz, terminal başlar (reprodiktüf tomurcuk) 2-4 tanedir. Pedisel 3 mm, brakteoller 12 mm ve linear. Kaliks 9 mm ve bol tüylü, süt dişler alt dudağın ¾ ü kadar, alt dişler hemen hemen dudağa eşit. Standartı 20 mm, oblong-ovat ve tüysüz. Kanat ve karina standarta hemen hemen eşittir. Tohum 15 mm ve tüysüz. Quercus ların aralarında 1000m nin altındaki yamaçlarda gözlenirler. Asya da daha az olarak tanımlanmıştır. Batı Anadolu. B1 İzmir: Tire dolayları,700-800 m, Bornm. 1906:9249. B2 İzmir: Bozdağ ın güney yamaçlarında teraslarda yayılış gösterir Endemiktir. Doğu Akdeniz elementidir. Chronanthus un diğer türü ise sadece C.biflorus (Desf.) Koch (Cytisus fontanesii Spach) olup, Doğu ve Batı İspanya, Balerik Adaları ve Kuzey ve Güney Afrika da yayılış gösterir.
6 Şekil 2.3 Chronanthus biflorus Şekil 2.4 Cytisus fontanesii
7 3. LUPİNAN GRUP 3.1 Papilionaceae Alkaloidleri Bu grubun asıl üyelerine lupin alkaloidleri demek gelenek olmuştur. Fakat görünümde bunların Papilionaceae deki geniş yayılımından ötürü, leguminous sub-familyanın karakteristik alkaloidleri olduğu bilindiğinden beri yukarıdaki terimin kullanılması önerilmiştir. Leguminosae içinde tek bir tip alkaloid yoktur; diğer tipler de görülür, ör. Acacia, Crotalaria, Erythrina, Mimosa ve Pentaclethra. Alkaloidlerin bitkilerdeki dağılımının incelenmesi araştırıcıların dikkatini oldukça çekmiştir. Plugge cytisine için birçok sayıda Cytisus türünü inceledi. Klein ve Farkeass bitki dokularında bulunan cytisine için mikrokimyasal testler bulmuş ve bu alkaloidin Genista, Ulex, Sophora, Baptisia, Euchresta, Anagyris ve Thermopsis te yayılışını araştırmıştır. Jaretzky ve Axer 115 papilionaceous türünü incelemiş ve bundan yirmi üç tanesinde spartein bulmuşlardır. Hepsi de Lupinus, Genista ya da Cytisus a aittir. En geniş yüzdeler G.aetnensis (2.4-2.5) G.purgans (1.96-2.1),C.albus (2.1-2.2), C.pareocox (2.4-2.5) ve C.scoparius (broom) (2.7) türlerine ait sürgün ve yapraklarda bulunmuştur. Cytisus scoparius daki miktar Mart ayında 2.3 den Mayıs ayında 3.0 a çıkıyor; Haziran da 1.25 e düşüp, Kasım da yavaşça 2.8 e kadar yükseliyor daha sonra Şubat a kadar sabit kalıyor. E.P nin bulunduğu Yeni Zelanda da çok daha kapsamlı bir araştırma yapılmaktadır. White 200 ün üzerinde leguminous türünün alkaloidal içeriğini incelemiştir. Çeşitli organlardaki yüzdelerini ve doğal bulunuşunu ortaya çıkarmış ve izlenebilir bir süre içinde bu şartlardaki değişimleri, lokalite ve büyüme şartlarını not etmiştir. Diğer familyalara ait bitkilerde üç alkaloid grubu bulunmuştur: l-spartein, metilcytisin ve lupinin. İlki Chelidonium majus (Papaveraceae) de, ikincisi Caulophyllum thalictroides (Berberiadeceae) de ve üçüncüsü Anabasis aphylla (Chenopodiaceae) de bulunmuş olup, aynı zamanda aphylline, aphyllidine de bu gruplara aittir. Aşağıda bu bitkilerdeki önemli alkaloidler verilmiştir.
8 3.1.1 Papilionaceae (1) Ammodendron Conollyi Bge. d-spartein, ammondendrin. (1a) Ammothannus lehymanni Bge. d-saprtein, sophocarpin ve AMMOTHAMNINE (2) Anagyris foetida L. Anagrin, d-spartein, cytisine (3) Baptisia australis, B. tinctoria R. Br. ve diğer türler. Cytisine. Baptisia australis (L) R. Br. nin bir Kanada tipi olup N-metilcytsisine, d-spartein, cytisine (Marion ve Quellet). (4) Calycotome spinosa L. (Link). Tohumlarında dl-form belirtisi ile birlikte d-calycotomine ve bir ikinci baz, calycotamine (5) Cytisus ve Genista spp. White bu iki cinsi, esas alkaloidleri bulundurmalarına göre altı gruba ayırmıştır: (a) spartein, ör. C. scoparius; (b) bazı sparteinlerle birlikte ya da birlikte olmayan lupanin, ör: d-lupanin ve l-spartein içeren C. ratisbonensis ve d-lupanin,d-spartein ve bir üçüncü baz içeren C. ratisbonensis ; (c) cytisine ya da benzer bazlar, genelde sparteinsiz halde, örneğin, bitkinin üst kısımlarında anagrin ve tohumlarında cytisine bulunduran C. linifolius ; (d) cytisine ya da benzer bazlarla birlikte bulunan spartein, ör. bitkinin üst kısımlarında spartein, fakat tohumlarında cytisine içeren G. aetnensis ; (e) calycotomine ana alkaloidlerin bulunduğu yer olan C.nigricans var. elongatus Willd. da ya da bitkinin üst kısımlarında dl-spartein ve tohumlarında dlcalycotomine içeren C. proliferus ; (f) alkaloid bulundurmayanlar. C. canariensis ve C. stenopetalus grup (c) ye ait olup, ikinci türün bazı modellerinde anagrin ile birlikte çoğunlukla bulunan cytisine ve metilcytisine alkaloid oranı yüzde 0.4 e kadar çıkmaktadır. C. monspessulans türü de grup (c) ye ait olup, çoğunlukla bazı cytisine lerle birlikte bulunan metilcytisine ve muhtemelen lupanin grubuna ait yeni bir alkaloid olan monspessulanine içeriği yüzde 0.9 a ulaşmaktadır. (6) Cytisus scoparius L. l-spartein ve izomeritleri, sarothamnine, genistein; 3: 4-dihidroksifeniletilamin (7) Cytisus laburnum L. (Laburnum vulgare Presl.) ve Euchresta horsfieldii. Cytisine
9 (8) Genista aetnensi tohumları cytisine içerir; bitkide retamine, bir miktar cytisine ve cytisine benzeri bazların izine rastlanır; kaydedilmiş tek alkaloid spartein dir. (8a) G.tinctoria. Cytisine, metilcytisine, anagrin ve bir dördüncü baz (9) Lupinus albus. d ve dl-lupanin; hidroksilupanin (10) L. Andersonii. Wats. Nonalupin (11) L. angustifolius. L. d-lupanin, hidroksilupanin (12) L. barbiger S. Wats. Spartein, dilupin, trilupin (13) L. caudatus Kel. Monolupin (14) L. corymbosis Heller. Hakzalupin (14a) L. hilarianus. Hidroksilupanin (15) L. kingii Wats. d-lupanin (16) L. laxiflorus var. silvicola C.P. Smith. Anagrin (17) L. laxus Rydb. Spartein, d-lupanin, trilupin ve bir dördüncü baz (18) L. luteus ve L. niger. Lupinin ve l-spartein (18a) L. macounii Rydb. Rhombinine, hidroksirhombinine (19) L.palmeri Wats. Lupinin, tetralupin ve pentalupin (20) L.perennis. d-lupanin ve hidroksilupanin (21) L. polyphyllus Lindl. d-lupanin, hidroksilupanin (22) L. sericeus Pursh. Spathulatine ve nonalupin (23) L. sericeus var. flexuosus. C.P. Smith. Octalupin (24) L. spathulatus. Rydb. Spathulatine (25) L. termis. dl-lupanin (25a) Piptanthus nepalensis Sweet. Tohumlarında Cytisine (25b) Podalyria spp. Lupanin; P. buxifolia da d- ve dl-formları; P. calyptrata da l-formu; P. sericea da d- ve dl- formu (26) Retama sphoerocarpa. Retamine ve spartein. (26a) Sesbania tripeti Hort. Lupanin benzeri alkaloidler (27) Sophora angustifolia var. flavescens. S. ve Z.Matrine, sophoridine, sophoramine, owymatrine (28) S. alopecuroides. Martine, sophocarpine, sophoridine, sophoramine, aloperine (29) S. chrysophylla. Anagrin, cytisine, sophochrysine
10 (30) S. microphylla. Cytisine, metilcytisine, martine, sophochrysine ve bir beşinci baz (31) S. pachycarpa. Pachycarpine (d-spartein), sophocarpine, sophocarpidine (martine) (32) S. secundiflora, S. speciosa. Cytisine (33) S.tetraptera. Matrine, metilcytisine, sophochrysine (34) S.tomentosa. Cytisine (35) Spartium junceum. Spartein ; sadece Yeni Zellanda daki bitkilerde cytisine (36) Thermopsis alpina (Pall.). Led. T. alternifolia. Rgb. ve Schm. açıkça belirtilmemiş alkaloidler (37) T. lanceolata. d-spartein, thermopsine, homothermopsine, anagrin, metilcytisine, cytisine (38) T. rhombifolia (Watt), Rhichards. Cytisine, metilcytisine, thermopsine, rhombifoline, rhombinine, 3-metoksipridin (39) Ulex europoeus. Anagrin ve bir ikinci alkaloid, Yeni Zellanda da çiçeklerde ve çimlenen tohumlarda cytisine (39a) Virgilia capensis Lam. Virgiline, virgilidine, d- ve dl-lupanin, ve tanımlanamayan bazların şurubu andıran bir karışımı Anagrin: C 15 H 20 ON 2 Ulex europaeus dan elde edilen Gerrad ın alkaloidi ulexine, birçok araştırıcı tarafından cytisine olarak belirlenmiş, fakat Klein ve Farkass bunu tayine edememiş ve Clemo ve Raper Ulex europaeus dan elde edilen anagrinin bazen ikinci bir alkaloidle birlikte bulunduğunu göstermiştir. Anagrin, Partheil ve Spasski tarafından Anagyris foetida nın tohumlarından izole edilmiş çok iyi bilinen bir bileşiktir. Preperasyonu Ing tarafından şu şekilde tanımlanmıştır; perkloratla izole edildiğinde renk vermeyen ve bazları ışıkta bırakıldığında mat sarı camsı bir form alır. Birleşimi: Ferrik kloridle kırmızı renk vermesi ve aktif olmayan bir oksijen atomu bulundurmasıyla anagrine benzer. Hidrojenleme ile ayırt etme yöntemi sonucunda anagrin ile cytisine nin yakın akraba olduğu anlaşılır. Anagrinin formülü, cytisine nin son C 4 H 9 yapısına yeni bir piperidin bileşiğinin ya da metilpirolidin halkası eklenmesiyle oluşmuş olabilir. En önemli bu beş alkaloid grubundaki benzerlik araştırıcılar tarafından netleştirilmiştir.
11 Cytisine: (Ulexine, Baptitoxine, Sophprine), C 11 H 14 ON 2 Alkaloidlerin preperasyonu Ing tarafından tanımlanmıştır. Suda alkol ya da kloroformda çözünebilir fakat eter ya da benzende çözünemez. Kuvvetli bir alkalini baz olup iyi kristallenebilen sulangan tuz formlarındadır: hidroklorid, B. HCL. H 2 O, renksiz prizmalar. Cytisine nitratlanabilir ve aminocytisine dönüşme yoluyla diazotize olabilir. Bu ve dibromocytisine nin karakteristik özellikleri aromatik bir çekirdek bulundurmlarıyla belirtilir. 3.1.2 Lupinan Alkaloidlerinin Farmakolojik Etkileri İlaç olarak spartein sülfat verusya da Thermopsis lanceolata nın galenikal preperasyonları solunum ve dolaşım stimülantı olarak kullanılmaktadır. Ölümcül zehir etkisine sahip birçok bitki bilinmektedir. Bunlardan özellikle Cytisus Laburnum a dikkat çekmek için Freise cocobolo demiştir. Apuleia molaris Benth. den türevlenmiş kabuktaki cytisine küçük oranlarda bile kronik bir zehirdir. Bu bağlamda Wagenaar tarafından yayımlanan bir kaynakçada cytisine nin özel bir ilgiyle mikrokimyasal tespiti belirtilmiştir. Belge büyükbaş hayvanların besin maddesi olarak kullanılan lupin tohumlarının acılık-giderme si olarak hazırlanmış ve bu amaçla Makaro ve Kondratyeva lupin alkaloidi bulunan unların preperasyonu için bir tasarı geliştirmişler ve ortaya çıkarılan alkaloidler insektisit olarak kullanılmaya başlanmış. Bu grup alkaloidler Rusya da dikkatleri üzerine çekmiş ve bu amaçla Ammothamnus lehmanni den elde edilen sophocarpine, böcek gruplarını çökertmek için denenmiştir. Georgadze a göre üç sophora alkaloidi, sophocarpine (a), sophocarpidine (b) ve sophoridine (c) sadece farklı derecelerde ve farklı farmakolojikal aktivitelerinin karakterlerinde; dolasıyla her birinin damar içi enjeksiyonları yüksek ve daha sonra düşük kan basıncına neden olur ve onların bu yöndeki aktiviteleri diğerlerini (a),(c), (b) arttırır. Az miktardaki dozlarda stimulat, yüksek dozlarda azaltıcı etkisi, hem soğuk hem sıcakkanlı hayvanların kalbinden izole edilmiş ve aktivitesi azalan türler ise şunlar olarak belirlenmiş; (c), (b), (a). Son yıllarda anagrin in doğal yayılımı ve kimyası ilgi görmesine rağmen çok az kişi tarafından çalışılmıştır. Bunlardan biri de Smith ve Wilson olup; Tournade ve Raymond-Hamet tarafından araştırılan anagrinin vazokonstriktif etkisine dikkat çekmişlerdir.
12 Olası terapötik etkiye sahip umut vadeden geliştirilen maddeler içinde lupinan grubu modifikasyonlarda temel materyal olarak kimyacıların ilgisi çekmemiştir. Liberalli kuş sıtmalarında inaktif lupanin bulmuş ve Clemo ve Swan bunun bir aminolupinan olduğunu tespit etmiştir. Lupinin p-aminobenzoat Rusya da araştırılmış ve işaretli lokal anestezik etkilere sahip olduğu gösterilmiştir. Spartein: Bu alkaloid konin etkisine oldukça benzemekte olup daha az toksiktir. Raymon-Hamet e göre kobay fareleri için sülfatın letal dozu bu methot için geliştirilimiş teset sonuçlarına göre 63 ya da 74 mgm. per kilo dur. Spartein in merkei sinir sistemi üzerinde az bir etkiye sahip olduğu görülür fakat motor sinir uçlarını ve sempatik sinir düğümlerine etki ederek çalışmasını aksatır. Kalp aktivasyonlarında koninden daha fazla bir depresyon etkisine neden olur ve kan dolaşımı üzerinde yatıştırıcı bir etkiye sahiptir. Spartein sülfatın deneysel anafilaksi üzerindeki engelleyici etkisi Bertoni tarafından, metrazole olan antagonizmi Schnittspahn tarafından, otonomik sinir sistemi üzerindeki etkisi Koppanyi ve Linegar tarafından incelenmiştir. Ligon izole edilmiş tavşan uteruslarında hareketlilik üzerindeki stimulant etkide 5 te 1 oranında lupinin baz bulmuş ve spartein disülfat kadar etkili olan 1/15 oranında lupanin-dihidroklorid ve trilupin bazı bulmuştur. Kobay farelerine uygulanan intraperitoneal enjeksiyonlardaki letal doz ( mgm. per kilo): lupanin dihidroklorid 25-29, lupinin baz 28-30, spartein sülfat 42-55, trilupin baz 200-25. Zipf ve Triller toksik izospartein ve sparteinin yarısı kadar toksik didehidrosaprtein bulmuştur; ikisi de izole edilmiş kurbağa kalpleri üzerinde spartein benzeri etkilere sahip olup, kurbağa ve fare kasları üzerinde periferal kurar benzeri etkilere neden olur. Jack e göre kurbağa kalbi üzerinde fibrillatory-aksine bir etki olmadığı bununla birlikte benzil-lupanol bu konuda sparteinle aynı etkiye sahip olup fenildehidrospartein sparteine göre 10-20 kat daha etkilidir. Delourme-Houde kuartener türevlerin spartein kapasitesini yoğunlaştırmasını bulmuş ve yükselmiş adrenalinin hipertansif aksiyonunu uzatabilmiştir. Pratesi ve Aitieri piperidin türevlerinin spartein benzeri aktivitesini araştırmıştır. C 5 H 10 N. CH 2. CH 2 X X olan yere; NH 2, NMe 2, NEt 2, NMePh ya da ikinci bir piperidil çökeltisi. Mercier ve Mercier dietilaminoetanolun ilaçlarda yüksek dozlarının spartein benzeri etkiler ürettiğini bulmuşlardır.
13 Cytisine: Bu baz nikotin gibi aynı farmakolojik sınıfa aittir. Bulantı sarsılma ve solunum respirasyonundan dolayı ölüme neden olan güçlü bir zehirdir. N-metilcytisinde nikotin benzeri aksiyonlar belirtilmiş daha sonra cytisin aksiyonlarını detaylı bir şekilde çalışan Scott ve Chen e göre cytisine aksiyonu daha güçsüz ve nikotinin 1/40 ı kadar bir toksitiseye sahiptir (Henry, T.A, 1949). 3.1.3 Alkaloid İçeren Bitkilerin Halisünojen Etkileri 3.1.3.1 Halisülojenlerin Tıbbi Kullanımı Halüsinojenler ruhsal hastalıklar, alkolizm ve bağımlılık gibi hastalıklarda kullanılan Opium dan türetilmiş ilaçlarda olduğu gibi, tedavi edici olası yararları araştırılmak üzere çalışılmaktadırlar. Tabii ki bu ilaçlar ölmek üzere olan hastalara verilmektedir. Bununla birlikte bu alışkanların çoğu bırakılmıştır. Hint kenevirinin aktif kimyasal bir sentetiği olan Tetra Hidro kannobinol (THC), kemoterapi tedavisi sonrasında acı bulantı ve kusma gibi rahatsızlardan mustarip olan kanser hastalarına reçete ile verilmesi onaylanmış bir ilaçtır. THC aynı zamanda glokom hastalığının sebep olduğu acı veren göz tansiyonunu azaltmak için de kullanılır. PCP ise veterinerler tarafından ara sıra hayvanlarda anestezik ve sedatif etkileri için kullanılır. Halüsinojenik bitkiler dünyada gelişmekte olan kültürlerde önemli bir rol oynamaktadır. Bunlar entheogenler olarak ve dini törenlerde rekreasyonal faydalar içermesinden dolayı tedavide kullanılmaktadırlar. Bütün halüsinojenlerin kullanımının onaylanmaması son yıllarda meydana gelen bir gelişmedir. Çok büyük miktarda kaynak yaygın psikoaktif maddelerin (Marijuana, LSD, PCP gibi) kontrolü için yatırım yapmaktadır. Böylece bu bitkilere karşı araştırıcıların ilgisi yeniden çekilebilir ve diğer düzensiz maddeler aşırı bir aracı haline gelir. Birçok farklı halüsinojenik bitki türü vardır. Birçoğunun bilgisine ulaşılabilinir ama bazıları diğerlerine göre daha az çalışılmıştır. Birkaç halüsinojen bitkiye kısa bir bakış: Atropa belladonna, Areca catechu, Brooms (misc. sp.), Calliandra anomala, Acorus calamus, Eschscholzia californica, Nepeta cataria, Argemone mexicana, Coleus sp., Erythrina flabelliformis, Turnera diffusa, Datura sp., Coryphantha macromeris, Foeniculum vulgare, Argyreia nervosa, Merremia
14 tuberosa, Valeriana officinalis, Hyoscyamus niger, Humulus lupulus, Hydrangea paniculata,iochroma sp., Piper methysticum,catha edulis, Leonotis leonurus, Lobelia inflata, Catharanthus rosea, Mandragora officinarum, Kaempferia galanga, Ilex paraguayensis, Sophora secundiflora, Ephedra nevadensis, Ipomea sp., Myristica fragrans, Rivea corymbosa, Passiflora incarnata, Salvia divinorum, Psilocybe mantarlar(misc. sp.), Rhynchosia phaseoloides, Trichocereus pachanoi, Sassafrans albidum, Coriaria thymifolia, Actinidia polygama, Heimia sp., Mirabilis multiflora, Peganum harmala, Nicotiana tobaccum, Lactuca virosa, Artemisia absinthium. Brooms (Leguminosae): Broom un üç türünün psikotropik etkilerine göre hangisinin daha etkili olduğuna dair bazı karışıklıklar vardır. Bu bitkilerin etkilerinin keşiflerindeki ilk rapora göre, Kanarya Adalarındaki çiçekli broomlar üçü içinde en hoş ve en etkili olandır. Bu tür aynı zamanda Yaqui şamanları tarafından da kullanılmıştır. Kanarya Adaları Broom un yayılışı; Kanarya Adaları olup, İskoç Broom un yayılışı; merkez ve güney Avrupa ve İspanyol Broom un yayılışı Akdeniz dir. Bileşenleri: Kinolizidin alkaloidleri (özellikle spartein ve lupanin), feniletilaminler, isoflavonlar, flavonoidler, bir uçucu yağ, kafeik asit, p-koumarik asitler, taninler ve pigmentler. Tıbbi kullanımları: Taze ya da kuru olarak kardiotonik, kathartik, diüretik, emetik ve purgatif olarak kullanılırlar. ESC1 (T) ve ESC5 olarak adlandırılan iki suş İspanya topraklarında yetişen Cytisus scopairus dan izole edilmiştir. 16S rrna geninin filogenetik analizleri, bu suşların Ochrobactrum genusuna ait olduğunu göstermiştir. En yakın akrabaları Ochrobactrum anthropi ve Ochrobactrum lupini olup sırayla bu suşlara %100 ve %99.9 oranında benzerlik gösterirler. Cytisus scoparius un Wistar albino fareler üzerinde CCL 4 oksidatf stres tedavisinde antioksidant aktivitesinin araştırılması hedeflenmiştir. Cytisus scoparius ekstratının farelerde karaciğeri, CCL 4 ile endüklenen oksidatif stresten koruduğu gözlemlenmiş ve böylece bu bitki üzerindeki geleneksel savın değerlendirilmesine yardımcı olmuştur.(dang, R., 2007)
15 4. ALKALOİDLERİN İNCE TABAKA KROMATOGRAFİSİ 4.1 İnce Tabaka Kromatografisi 4.1.1 Prolidin, Priolizidin, Pridin, Piperidin ve Kinolizidin Alkaloidleri Alkalodilerin hızlı uçucu olan bu heterojen grupları gaz kromatografisi için çok uygundur. GC ve TLC kombinasyonuyla bu alkaloidlerin ayırt edilmesinde birçok tabaka ile çalışılmıştır. 4.1.2 Solvent Sistem Ramaut Leguminosae alkaloidlerini solvent S1 ile analiz etmiştir. Daha birçok solvent sistemi de denenmiştir. Paris ve Paris, bazı Leguminosae alkaloidlerini de içeren alkaloid gruplarını ayırmada kullanılan 3 solvent sistemini rapor etmiştir. Gill ve Gill ve Steinegger, Cytisus ve Genista türlerinden kinolizidin alkaloidlerini ayırt etmek için silika jel tabakada değişik oranlarda siklohegzandietilamin solventlerini kullanmışlardır. Bununla birlikte kloroform-metanol (8:2) solventini de kullanmışlardır. Lupine alkaloidinin tanımlanması TLC ve GS-MS yöntemleri kullanılarak, Cho ve Martin tarafından yapılmıştır. Solvent S8, Sharma et al. tarafından pirolizidin alkaloidlerini ayırmak için tanımlanmış olup, Lupine alkaloidleri için de uygun olacağı bulunmuştur. S9 solventinin, farklı bağlayıcı hareketlilikte olan markerlarla işaretlenmiş bazı alkaloidlerin kimlik benzerliklerini kontrol etmede kullanışlı olduğu bulunmuştur. Solvent S10 sistemi, kağıt kramatografisinde daha önceden bilinen bir yöntemdir. Genest TLC yöntemini, zehirli Arbrus tohumlarını, Ormosia tohumlarından ayırmak için kullanmıştır. Ormosia türü kinolizidin tip alkaloid içermektedir. Faugeras ve Paris Leguminosae alkaloidlerinin densitometrik analiz yöntemiyle, birkaç solvent sisteminin arasındaki bağı çalışmıştır. Solvent S6 bütün kinolizidin alkaloid tiplerini ayırmak için kullanılmıştır. Alkaloid esterleri için silika jel tabakalarda siklohekzan-diklorometan-dietilamin (4:4:2) solvent sistemi çalışılmıştır. Basit kinolizidin alkaloid tipleri için silika jel tabakalarda
16 toluen-aseton-etanol-amonyak (60:40:6:2) solvent sistemi çalışılmıştır. İsobütanol-hidroklorik asit-su (7:1:2) solventi, selüloz tabakalarda diğerleri kadar iyi sonuç vermiştir. Dipiperidin alkaloidleri selüloz tabakalarda metanol-aseton-su-amonyak (35:20:40:5)solventinde kolayca elde edilebilmiştir. Gafurov et al. leguminosae alkaloidlerini ayırmada kaolini sabit bir faz olarak kullanmışlardır. Wysocka bazı kinolizidin alkaloidlerinden epimerik alkollerin ayrımını tanımlamıştır. Karlsson ve Peter lupine alkaloidlerinin kantitatif analizleri için silika jel tabakalarda benzen-diklorometan-dietileterdietilamin(5:5:5:2) solvent sistemini kullanmışlardır. 4.1.3 Tespit Dtagendorff reaktifi ve iodoplatinate alkaloidlerin bu grubunun tespitinde geniş bir şekilde kullanılmaktadır. Dragendorff reaktifi Leguminosae alkaloidlerinin kantitatif analizlerinde kullanılmıştır. Ramaut birkaç Leguminosae alkaloidlerinden Dragendorff rekatifi ile elde edilen renkleri rapor etmiştir. Chalmers et al. prilozidin alkaloidlerinin analizi için iodin buharı kullanmışlardır. Meissner et al. birkaç kinolizidin alkaloidinde hassas bir tespit yapmak için Dragendorff reaktifi kullanmış ve bunun sonucunda 1 M sülfirik asit içinde %1 oranında seryum bulmuşlardır. Karllson ve Peter 17 saat 130 ºC de tutulan plakaların floresansını ölçerek lupin alkaloidlerini nicel olarak saptamışlardır. Floresans rengi birkaç hafta boyunca sabit kalmıştır. Mattocks TLC plakalarda priloizidin alkaloidleri için özel bir metot geliştirmiştir. Alkaloidler, hidrojen peroksit ve sonradan ısıtılma yoluyla N-oksitlere dönüştürülmüştür. N-oksitler, asetik anhidrid ile etkileştiklerinde Ehrlich reaktifiyle mavi ya da leylak rengi noktalar veren pirolleri verir. Sadece bazik kısmında doymamaış bir halka bulunduran alkaloidler bir renk reaksiyonu verir. Bu yöntemin, iodoplatinate reaktifi ile tespit yöntemi, iodin ve Dragendorff rekatifinden daha hassas olduğu bulunmuştur. N-oksitlerin asetik anhidrid ile etkileşimlerinden sonra alkaloidler UV ışık altında kahverengi noktalar halindeki floresansı gözlemlenebilir. Ehrlich reaktifi ile rekasiyon metodu daha hassas hale getirir. Moll Conium alkaloidlerini, etanolde %0.5 1-kloro-2,4-dinitrobenzen ve
17 etanolde %0.05 bromothylmol mavisi ile püskürtmede sarı zemin üzerinde mavi noktalar verdiğini tespit ederek tanımlamıştır. Kaniewska ve Borkowski metilenoksit içeren alkaloidlerin tespiti için Labat ve Gaebel reaktiflerini kullanmışlardır. Başka diğer alkaloidler de pozitif reaksiyon vermişlerdir ör; arecoline, cytisine, lupinin ve spartein. Menn ve McBain kolinesteraz inhibitörleri için bir tespit yöntemi tanımlamışlardır. Diğerleri arasında da alkaloid lobelin de tespit edilmiştir.(svendsen,a.b and Verpoorte, R., 1983) 4.1.4 Kantitatif Analiz Massa et al. kantitaif analizi, alkaloidlerin Dragendorff rekatifi ile tespitinden sonra densitometri ile açıklamışlardır. Diğerlerinin içinden spartein, 400 nm deki refleksiyon modu ölçülerek analiz edilmiştir. Faugeras ve Paris birçok Leguminosae alkaloidinin kantitaif analizini densitometri ile açıklamışlardır. Spesifik analiz ayrımları için birçok solvent belirlenmiştir. Alkaloidler 490 nm dalga boyunda, transmisyon ve refleksiyon modunun her ikisinde de Dragendorff reaktifi püskürtülerek belirlenir. Transmisyon refleksiyon modundan 2-3 kez daha fazla hassas olduğu ve belirgin olduğu bulunmuştur. Karlsson ve Peter Lupinus türlerinin alkaloidlerini belirlemek için florodensitometri yöntemini kullanmışlardır. Plakaların 17 saat 130 ºC de banyo edilmesinden sonra, hangi alkaloidlerin mavi floresan noktalar verdiği gözlendikten sonra, renk birkaç hafta boyunca sabit kalır. Alkaloidler, 360 nm dalga boyu ile uyarılmasıyla, 400 nm de emisyon yapması ile tanımlanmışlardır. Jollffe ve Shellard Cytisus scoparius (Broom tops ), Lobelia infilata, Piper nigrum, Punica granatum ve Areca catechu içeren birçok ham drogta TAS tekniğini uygulamışlardır. Broom tops ve Piper nigrum da sırasıyla spartein ve piperine benzeyen sadece bir alkaloid gözlenmiştir. Lobelia ile ilgili çalışmaların sonucu değişken olup bu yüzden tanımlamada kullanılamamıştır. Deneysel koşullarda 90 saniye 275 ºC sıcaklıkta, numune(10-20 mg) 10 mg kalsiyum hidroksit ile karıştırılmıştır. Uygun nem doygunluğundaki silika jel itici bir güç olarak kullanılmıştır. Stahl ve Schmitt Conii fructus tan elde edilen ham droglardan coniine alkaloidi, N- metilconiine ve x-coneceine tespit edimesinde ve Arecae semen den elde edilen
18 ham droglardan arekolin tespit edilmesinde TAS tekniğini kullanmışlardır. İkinci droğun toz hali 120 saniye 150 ºC de, meyvenin tamamı ise 220 ºC de kullanılmıştır. Bu sıcaklık Arcea tohumlarının toz hali için de kullanılmıştır. Yürütücü olarak örneklerde %20 su içeren 50 mg moleküler elek 4A kullanılmıştır. Lobelia alkaloidlerinin kromatografi tepkimelerini Kaess ve Mathis rapor etmiştir. Lobeline, lobelanidin, lobelanin alkaloidlerinin eldesi için şu reaksiyonlar kullanılmıştır: sodyum asetatta, semikarbazid hidrkloridle keton bileşiklerinin karbazonlarının belirdiği, asetil klorid ya da asetik anhidri ile reaksyonunda, asitlenmiş hidroksil içeren alkaloid türevlerinin belirdiği, kormik asit ile oksidasyonunda hidroksil içeren alkaloidlerden diketon alkaloidlerinin belirdiği, sodyum borhidrür ile indirgenmesinde keton alkaloidlerden dihidroksi alkaloidlerinin belirdiği gözlenmiştir.(svendsen A.B and Verpoorte, R., 1983)
19 5. MATERYAL VE YÖNTEMLER 5.1 Materyaller 5.1.1 Ekstraksiyon ve Yoğunlaştırma Doğal yayılış ortamı olan Ödemiş Bozdağ dan toplanan Chronanthus orientalis in toprak üstü kısımları açık havada gölgede kurutularak drog materyal haline getirildi ve değirmenden geçirilerek öğütüldü. Perkolatör cihazında kurutulmuş ve öğütülmüş yaklaşık 150 gr drog materyali üzerine 4gün boyunca(musluk 1dakikada 36 damla şeklinde ayarlanmıştır.) toplamda 7lt etonol ilave edip ekstraksiyona maruz bırakıldı. Elde edilen ekstre ile 40 ºC de rotavaporda yoğunlaştırma işlemi gerçekleştirilmiştir. 150 gr drogla yola çıktığımız bu işlemin sonunda elde ettiğimiz kuru madde ağırlığı 14,96 gr olarak ölçülmüştür. Şekil 5.1 Chronanthus orientalis drog maddesinin etanol ile ekstraksiyonu
20 5.1.2 Ekstraksiyon ve İzolasyon Sırasında Kullanılan Materyal ve Yöntemler 5.1.2.1 Kullanılan Kromatografik Yöntemler Total Alkaloid Eldesi: Kuru maddenin olduğu balona 200ml %1 lik HCL eklendikten sonra 60 ºC su banyosunda kuru maddenin çözülmesi sağlandı. Filtre kağıdı yerleştirilmiş huni üzerine%1 lik HCL tatbik edildikten sonra kuru madde ve %1 lik HCL karışımı huniden geçirildi. Filtre kağıdında kalan posa kurumaya bırakıldıktan sonra elde edilen süzüntü üzerine 200 ml petrol eteri eklendi. Çalkalanıp ayırma hunisine konulduğunda 2 faz belirgin bir şekilde gözlendi. Alttaki asitli olan faz ayrılıp üzerine 25ml %25 lik amonyak eklendikten sonra çözelti bazik hale getirilmiş oldu.13ml amonyak ile Ph=10-11 e getirilip, üzerine 250 ml kloroform eklendikten sonra tekrar ayırma hunisine konuldu. Drogtaki alkaloidler alt fazda toplandı. Alt faz sürekli olarak toplanarak işlem 250 ve 400 ml kloroformla tekrarlanıp total alkaloidlerin bulunduğu çözeltinin eldesi sağlandı. Kloroformlu ekstre, filtre kağıdına önceden konulan sodyumsülfat tan geçirilerek kuruluğa getirildi. Böylece drogtan total alkaloid(260,28 mg) elde edildi. Açık Kolon Kromatografisi: Çalışmamızda normal faz silika jel ile doldurulmuş klasik açık kolon kromatografierinden yararlanılmıştır. Fraksiyonlar, 5-15 ml toplanmış ve kontrolleri İ.T.K. ile yapılmıştır. Dolgu Materyali: Silika jel (Kieselgel 60, 70-230 mesh, Merck) Silika Jel Kolonun Hazırlanması: 300 gr silikajel üzerine 300 ml metanol, 570 ml kloroform ilave edilip süspanse hale getirilmiş karışım, alt ucuna pamuk yerleştirilmiş cam kolona aktarılmıştır.(95:5)kloroform-metanol çözgeni tek seferde kolona eklenip, silikajel sabit hale getirilmiştir. Çözgen apolardan polara geçiş olacak şekilde belli oranlarda hazırlanır. Kolon sabit hale geldikten sonra, daha önceden kuru halde olan total alkaloid (95:5) kloroform metanol ile çözülüp, kolonun cidarından pipet yardımıyla tatbik edilmiştir. Musluk 1dk da 36 damla verecek şekilde açıkken, kolonun üzerine bir parça yerleştirilir. Pamuk, daha sonra ilave edilecek olan solventlerin total alkaloide direkt olarak zarar vermesini engelleyecektir. Kolonun yaklaşık olarak orta hizasında bant belirgin hale
21 geldiğinde, daha öncede numaralandırılmış olan tüplere örnek toplanmaya başlandı. İkinci çözgen olarak (90:10) kloroform-metanol, üçüncü çözgen olarak (80:20) kloroform-metanol, dördüncü çözgen olarak (70:30:3)kloroform-metanolsu, kolondan geçirilerek, örneğin tüplere toplanma işlemine devam edildi. Son olarak kolondan 300ml metanol geçirilerek işlem sonlandırıldı. Şekil 5.2: açık kolon kromatografisi İnce Tabaka Kromatografisi (İ.T.K.): Çalışmamızın tüm kontrollerinde normal faz silika kaplı hazır plaklar kullanılmıştır. Kromatografi tankı : Camag 22x23x8 cm Adsorban : Silika Jel (Alüminyum folyo, hazır plak, Kiesegel 60 F254, 0.2 mm, Merck, Art.5554) Çözgeni sistemleri : CHCl 3 :MeOH (95:5) (90:10) Solvan sistemleri : (100:20:15)etilasetat-metanol-su (20:75:15) benzen-kloroform-dietilamin Lekelerin Belirlenmesi : Sülfürik asidin sudaki %30 luk çözeltisi püskürtülmüş, ardından plaklar 5-10 dakika 105-110 0 C de ısıtılarak lekeler belirlenmiştir (80:20)kloroform-metanol,
22 (70:30:3) kloroform-metanol-su, metanol solventlerinden elde edilen tüp aralıklarından oranlara uygun örnekler seçilerek standart ile birlikte, TLC yöntemi uygulandı. Bu TLC de (20:75:15)(benzen-kloroform-dietilamin) den 11ml sistemde yürütücü olarak kullanıldı. A maddesi:82-98arası numaralı tüpleri, bu aralıkta saf madde olma olasılığına karşın birleştirilip kuruluğa getirildi. Kuru madde ağırlığı: 53,7 mg olarak hassas terazide ölçüldü. B maddesi: 30-80 arası numaralı tüpler birleştirilip kuruluğa getirildi. Kuru madde ağırlığı 69,3 mg olarak hassas terazide ölçüldü. C maddesi: 81-170 arası numaralı tüpler birleştirilip kuruluğa getirildi. Kuru madde ağırlığı 40,3 mg olarak hassas terazide ölçüldü. D maddesi:20-28 tüpler birleştirilip kuruluğa getirildi. E maddesi: 8-18 tüpler birleştirilip kuruluğa getirildi. A maddesi: (100:20:15) etilasetat-metanol-su solvent sistemiyle TLC üzerinde yürütülüp, lekelerini belirledikten sonra 2 bant belirgin bir şekilde gözlendi. Şekil 5.3 : A maddesinin TLC yöntemiyle gösterdiği belirgin bantlar
23 5.2 Kullanılan Teknik Aletler ve Kimyasal Maddeler 1 )Liyofilizatör 12) Hexan 5 lt 2) UV/Görünür bölge Spek. 13) Etilasetat 5 lt 3) Ultrasonik Banyo 14) Sulfuric asit 4) Hassas terazi 15) Balon yuvarlak altlı 50 ml 5)Cam RP-C-18 dolgu materyali 16)Balon yuvarlak altlı 250 ml 6) Mikser 17)Balon yuvarlak altlı 500ml 7) Silika-jel dolgu materyali 18) Ayırma hunisi 8) Sephadex dolgu materyali 19) Kolon 1,5 cm*100 cm 9) Metanol 20lt 20) Kolon 3 cm*50 cm 10)Etanol 5lt 21)Kolon 6 cm*100 cm 11) Kloroform 20lt 22) Perkolatör
24 6. SONUÇ CO kodlu bitki ekstresinin Gaz Kromatograsi Kütle Spektrometrisi ile analizi: Analiz Şartları: Gaz Kromatografisi Kütle Spektrometrisi (GS/MS) Şartları: Sistem : Shimadzu GCMS QP 5050A System Kolon: HP-1 fused silica capillary column ( 25m, 0.32 mm i.d., 0,17 m film thicknes % dimethylpolysiloxane ) Enjeksiyon sıcaklığı: 250 İnterface sıcaklığı: 280 İyonlaştırma modu: EI Elektron enerjisi: 70ev Kütle aralığı: 40-500 m/z Sıcaklık programı: 80 o C 1 dak, 10 o C/dak. 220 o C 1 dak., 5 o C/dak. 250 o C 10 dak. Taşıyıcı gaz : Helyum Gaz akış hızı: 1.2 ml/dak Değerlendirmeler: Wiley GC/MS Kütüphanesi Ekstre (9:1) kloroform:metanol de çözülerek analiz edildi. Chronanthus orientalis bitki ekstresinin Gaz Kromatorgrafisi Kütle Spektrometrisi ile analizi sonrası elde edilen kromatogram, ana bileşenlerin relatif yüzdeleri, bu bileşenlerin kütle spektrumları, parçalanma ürünlerinin relatif bollukları sonuçları aşağıdadır
25 CO kodlu ekstrenin GC/MS kromatogramı: 17.5e6 TIC 15.0e6 12.5e6 10.0e6 7500e3 5000e3 2500e3 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 17.5e6 TIC 15.0e6 10.773 12.5e6 10.0e6 7500e3 5000e3 2500e3 11.022 11.227 11.357 11.559 11.842 12.845 14.039 14.875 17.959 18.351 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 Alıkonma zamanı Relatif Yüzde Wiley GC/MS Kütüphanesi Karşılaştırma* Wiley GC/MS Kütüphanesi Benzerlik Yüzdesi * 10.773 61.43 Sparteine 91 11.002 7.70 - - 11.227 1.54 - - 11.357 5.54 - - 11.559 1.88 - - 11.842 5.32 Lidocaine 96 12.845 1.26 - - 14.039 4.65 Oxosparteine 88 14.875 0.72 Lupanine 90 17.959 2.83 - - 18.351 1.33 n-octylphtalate 94 *Kütüphane taramasında benzerlik yüzdesi yüksek olan bileşenler belirtilmiştir.
26 Kromatogramdaki geliş zamanlarına karşılık gelen piklerin kütle spektrumları ve parçalanma ürünlerinin relatif bollukları: Rt:10.773 1750e3 1500e3 98 137 1250e3 1000e3 750e3 500e3 250e3 0e3 41 193 55 84 110 122 234 150 67 176 177 205 219 50 75 100 125 150 175 200 225 [MS Spectrum] Raw Spectrum 10.775 (scan : 451) Background 10.650(scan : 439) Base Peak m/z 98.15 (Inten : 1,251,627) m/z Relative Intensity 41.05 41.89 42.05 20.70 55.10 26.50 84.15 22.06 97.15 38.78 98.15 100.00 110.20 22.74 136.30 43.48 137.25 92.70 193.10 31.01
27 Rt. 11.025 225000 200000 98 134 175000 150000 125000 100000 41 232 75000 50000 25000 0 148 175 55 67 84 122 189 231 110 217 281 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 [MS Spectrum] Raw Spectrum 11.025 (scan : 484) Background 10.975 (scan : 478) Base Peak m/z 98.15 (Inten : 213,229) m/z Relative Intensity 41.05 48.75 42.05 26.99 55.10 25.63 97.15 56.79 98.15 100.00 122.25 20.88 134.25 96.29 135.25 41.88 175.15 27.66 232.20 54.14
28 Rt.11.227 35000 30000 98 134 25000 20000 41 232 15000 10000 5000 0 122 148 189 55 191 68 110 175 231 80 50 75 100 125 150 175 200 225 [MS Spectrum] Raw Spectrum 11.225 (scan : 508) Background 11.183 (scan : 503) Base Peak m/z 98.20 (Inten : 32,887) 217 m/z Relative Intensity 41.05 56.25 42.10 28.20 97.15 34.59 98.20 100.00 122.25 32.01 134.25 94.56 135.30 41.21 148.25 31.23 189.10 31.13 232.20 5.24
29 Rt:11.358 200000 134 175000 97 150000 125000 100000 41 75000 50000 25000 0 54 67 148 175 80 122 110 231 189 217 50 75 100 125 150 175 200 225 232 [MS Spectrum] Raw Spectrum 11.358 (scan : 524) Background 11.308 (scan : 518) Base Peak m/z 134.15 (Inten : 207,520) m/z Relative Intensity 41.05 47.81 54.05 21.36 96.15 39.83 97.15 82.85 98.20 35.28 134.15 100.00 135.25 32.95 148.25 20.53 232.20 32.50
30 Rt: 11.558 55000 98 50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 41 84 134 55 68 177 122 108 174 148 191 203 229 50 75 100 125 150 175 200 225 [MS Spectrum] Raw Spectrum 11.558 (scan : 548) Background 11.508 (scan : 542) Base Peak m/z 98.20 (Inten : 54,318) 232 m/z Relative Intensity 41.05 42.25 55.10 22.09 84.15 31.91 96.15 29.51 97.20 25.46 98.20 100.00 134.25 43.43 135.25 24.53 231.20 22.13 232.15 39.08
31 Rt: 11.842 1500e3 86 1250e3 1000e3 750e3 500e3 250e3 0e3 42 58 72 105 120 134 148 163 176 191 219 234 50 75 100 125 150 175 200 225 [MS Spectrum] Raw Spectrum 11.842 (scan : 582) Background 11.800 (scan : 577) Base Peak m/z 86.15 (Inten : 1,455,652) m/z Relative Intensity 42.05 3.93 43.10 1.63 56.10 3.02 58.10 9.70 72.15 4.57 77.05 1.89 86.15 100.00 87.15 5.82 91.10 1.68 120.20 1.55
32 Rt:12.845 70e3 98 60e3 50e3 40e3 30e3 20e3 10e3 0e3 41 134 232 207 55 84 68 175 122 150 114 164 189 217 250 50 75 100 125 150 175 200 225 250 [MS Spectrum] Raw Spectrum 12.845 (scan : 702) Background 12.792 (scan : 696) Base Peak m/z 98.20 (Inten : 67,318) m/z Relative Intensity 41.05 33.45 42.05 15.07 96.15 18.17 97.15 30.72 98.20 100.00 134.25 31.79 135.25 24.24 136.25 15.99 207.10 18.36 232.15 20.29
33 Rt:14.042 97 125000 100000 110 75000 41 55 50000 25000 69 84 123 136 150 191 220 248 0 164 177 205 245 281 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 [MS Spectrum] Raw Spectrum 14.042 (scan : 846) Background 13.925 (scan : 832) Base Peak m/z 97.20 (Inten : 137,618) m/z Relative Intensity 41.05 47.65 55.10 46.99 84.10 29.38 96.15 33.22 97.20 100.00 98.20 88.54 110.20 73.25 123.25 32.29 136.25 41.70 248.15 38.40
34 Rt:14.875 30000 136 25000 20000 15000 10000 5000 0 55 41 150 248 98 110 82 70 122 162 219 176 191 208 231 281 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 [MS Spectrum] Raw Spectrum 14.875 (scan : 946) Background 14.792 (scan : 936) Base Peak m/z 136.25 (Inten : 28,469) m/z Relative Intensity 41.05 46.27 55.10 48.66 97.20 25.92 98.20 34.69 110.20 28.44 136.25 100.00 148.25 27.41 149.25 43.93 150.20 45.65 248.15 37.12
35 Rt: 17.958 400e3 350e3 176 300e3 250e3 200e3 150e3 100e3 50e3 0e3 56 91 105 233 42 58 77 120 132 148 160 191 209 267 281 355 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 [MS Spectrum] Raw Spectrum 17.958 (scan : 1316) Background 17.883 (scan : 1307) Base Peak m/z 176.15 (Inten : 354,494) m/z Relative Intensity 42.10 3.63 56.10 8.46 77.10 4.18 91.15 8.22 103.20 4.23 105.20 6.78 148.25 3.73 176.15 100.00 177.15 13.80 233.10 6.27
36 Rt: 18.351 80e3 149 70e3 60e3 50e3 40e3 57 30e3 20e3 43 71 167 10e3 0e3 113 104 279 93 177 209 221 281 341 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 [MS Spectrum] Raw Spectrum 18.351 (scan : 1363) Background 18.292 (scan : 1356) Base Peak m/z 149.15 (Inten : 81,763) m/z Relative Intensity 41.05 33.57 43.10 36.95 55.05 19.02 57.10 46.79 70.15 27.40 71.15 28.77 11330 10.34 149.15 100.00 150.15 12.34 167.10 34.27
37 6.1 Bulunan Maddelerin Özellikleri Lidocaine: Lidocaine genel olarak antiritmik drog ve lokal anestezik olarak bilinir. Kaşıntı, yanma, iltihaplanma sağaltımında kullanılır. Diş anestezisinde ya da küçük cerrahi operasyonlarda lokal anestezide enjeksiyon olarak tatbik edilir. Farmakodinamikleri Anestezi: Lidocaine sinir hücresi membranında Na voltaj jkanalını hızlı bir şekilde bloke ederek sinyal iletimini değiştirir. Postsinaptik nöron membranı yeterli blokajıyla depolarize olmaz ve bu potansiyel bir aksiyon oluşumunu engeller. Böylece anestezik etki sadece beyinden gelen acı sinyallerini engelleyerek değil kaynağındaki ilk oluşumu sonlandırarak olur. Şekil 6.1 2-(diethylamino)- N-(2,6-dimethylphenyl)acetamide Spartein: Fabaceae familyasından Lupinus,Spartium ve Cytisus un içeridiği kinolizidin tipi bir alkaloidtir. Spartein; Na kanallarını engeleyen birinci sınıf antiaritmik bir ajan olup oksitoksik etkisi de bulunmaktadır. Antiaritmik bir ajan olarak kalp aritmisini engellemek için kullanılır. Drog uterus kas tabakasını uyarır. Bu doğum sırasında, doğum sancısına neden olur. Yüksek riskli doğumlarda fetal durumları tayin eder. Tek başına ya da diğer droglarla beraber kullanıldığında düşüğe sebebiyet verir.
38 Şekil 6.2:Molecküler Formül: C 15 H 26 N 2 Oxospartein: 17-oxospartein lupanin biyosentezinde anahtar görevinde bulunarak ara ürün olarak yer alır ve lupanine dönüşür. Lupanin: Kinolizidin alkaloidi olan lupanin tek dallı bir moleküler yapıya sahip olduğundan birçok Lupinus türünde bulunur. Lupaninler bis-kinolizidin alt grubuna aittir. Lupanin bir asetilkolin reseptörü agonistidir. Merkezi sinir sistemini etkiler Şekil 6.3 : lupaninin moleküler dizimi Lupanin ve spartein bis-izokinolizidin alkaloidlerindendir. Spartein; başağrılı zehirlenme, baş dönmesi, uyku, gözlerde kırpışma, kalp çarpıntısı, kardiyal ağrı, bacaklarda güç kaybına sebep olur. Güçlü toksik alımında ise
39 striknin-tip felçe, çizgili kasların istem dışı şiddetli kasılmasına ve ölüme neden olur. 13-a-OH lupanine ve 17-oxo-lupanine insülin salgılatıcı bir madde salgılayarak yüksek şeker konsantrasyonunu etkliler ve tip2 diyabetin sağaltımında kullanılabilir. OH lupanine ve 17-oxo-lupanine sadece yüksek glikoz konsantrasyonlarında insülini stimüle ederek hipoglisemi riskini azaltır. n-octylphtalate: Potansiyel toksik etkisi bakımından risk faktörü taşıdığı yapılan çalışamalarda kanıtlanmıştır. Bireysel olarak birikerek artan ftalatın yarattığı bir risk sözkonusudur. DnOP plastik üretiminde plastikleştirici olarak kullanılır. Plastiklere esneklik, mekanik özellik gibi pek çok özellik kazandırır. Ayrıca endüstride, taşıma bantı, şişe kapağı yapmı, boya yapımı, katalizör, ya da plastisol üretiminde ara bir kimyasal olarak rol oynar. DnOP ayrıca elektrikli kondansatörde bir akışkan olarak görev alır.