Araştırma Makalesi / Research Article. Duygu GEZEN-AK, Erdinç DURSUN, Selma YILMAZER

Araştırma Makalesi / Research Article Doi: 10.4274/npa.y7076 (Nöropsikiyatri Arflivi 2014; 51: 157-162) (Archives of Neuropsychiatry 2014; 51: 157-162) 157 Hippokampal Nöronlardaki Sinir Büyüme Faktörü (NGF) Salınımı Üzerine Vitamin D nin Etkisi The Effect of Vitamin D Treatment On Nerve Growth Factor (NGF) Release From Hippocampal Neurons Duygu GEZEN-AK, Erdinç DURSUN, Selma YILMAZER 1İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı, İstanbul, Türkiye ÖZET Giriş: Yapılan son çalışmalar, uzun yıllardır esas fonksiyonunun kalsiyum ve fosfat dengesini düzenlemek ve kemik yapısını korumak olduğu düşünülen vitamin D nin, beyinde de önemli rollerinin olduğunu göstermiştir. Çalışmalarımızda kortikal nöronlarda vitamin D nin, beta amiloid ile indüklenen ve kalsiyum artışı ile sinir büyüme faktörü (NGF) üretimini hedef alan toksisiteyi ortadan kaldırmada etkili olduğu; beta amiloidin vitamin D reseptörü anlatımını engellediği ve vitamin D-VDR yolağının bloke edilmesinin nörodejenerasyon benzeri değişikliklere sebep olduğu gösterilmiştir. Ayrıca vitamin D reseptörüne (VDR) ait belirli bir haplotipin Alzheimer Hastalığı riskini arttırdığı ilk kez grubumuz tarafından bildirilmiştir. Bu çalışmada kortikal nöronların NGF salınımını düzenleyen vitamin D nin hippokampal nöronlarda da NGF salınımı üzerine etkisinin olup olmadığını saptamayı amaçladık. Yöntem : Sprague Dawley cinsi sıçanların 18 günlük embriyolarından alınan hippokampus bölgelerinden hazırlanan primer hippokampal nöron kültürlerine, 48 saat süresince vitamin D uygulandı. NGF salınımındaki değişimler, ELISA yöntemi ile belirlendi. Tüm gruplara, sitotoksisite testi uygulandı. Bulgular: Vitamin D uygulanan primer hippokampal nöronların NGF miktarlarının hiçbir uygulama yapılmayan kontrol grubuna göre anlamlı derecede arttığı saptandı. Ayrıca vitamin D nin nöronları sitotoksisiteye karşı koruduğu belirlendi. Sonuç: Sonuçlarımız kortikal nöronlarda olduğu gibi Alzheimer hastalığında büyük önem taşıyan hippokampal nöronlarda da vitamin D nin nöron sağ kalımı için önemli bir molekül olan NGF salınımını etkilediğini göstermektedir. (Nöropsikiyatri Ar fli vi 2014; 51: 157-162) Anahtar kelimeler: Alzheimer hastalığı, vitamin D, sinir büyüme faktörü, primer hippokampal nöron kültürü ABSTRACT Introduction: Vitamin D, the main function of which is thought to be the maintenance of calcium and phosphate homeostasis and bone structure, has been shown in recent studies to have important roles in brain development as well. A certain vitamin D receptor (VDR) gene haplotype was reported, for the first time by our group, to increase the risk of developing Alzheimer s disease. Our studies also showed that vitamin D prevents beta amyloid-induced calcium elevation and toxicity that target nerve growth factor (NGF) release in cortical neurons; beta amyloid suppresses VDR expression and the disruption of vitamin D-VDR pathway mimics beta amyloid-induced neurodegeneration. In this study, our aim was to investigate the effects of vitamin D on the NGF release from hippocampal neurons. Method: Primary hippocampal neuron cultures that were prepared from 18-day-old Sprague-Dawley rat embryos were treated with vitamin D for 48 hours. The alteration in the NGF release was determined with ELISA. Cytotoxicity tests were also performed for all groups. Results: The NGF release in vitamin D-treated group was significantly higher than in untreated control group. The protective effect of vitamin D against cytotoxicity was also observed. Conclusion: Our results indicated that vitamin D regulates the release of NGF, a very important molecule for neuronal survival of hippocampal neurons as well as cortical neurons. (Archives of Neuropsychiatry 2014; 51: 157-162) Key words: Alzheimer s disease, vitamin D, nerve growth factor, primary hippocampal neuron culture Conflict of interest: The authors reported no conflict of interest related to this article. Çıkar çatışması: Yazarlar bu makale ile ilgili olarak herhangi bir çıkar çatışması bildirmemişlerdir. Yaz flma Adresi/ Correspondence Address Dr. Selma Yılmazer, İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı, İstanbul, Türkiye Gsm: +90 532 274 07 15 E-mail: drselmayilmazer@gmail.com Geliş tarihi/received: 14.02.2013 Kabul tarihi/accepted: 07.03.2013 Nöropsikiyatri Arşivi Dergisi, Galenos Yayınevi taraf ndan bas lm flt r. / Archives of Neuropsychiatry, published by Galenos Publishing.

158 Gezen-Ak ve ark. Giriş Uzun yıllardır esas fonksiyonunun kalsiyum ve fosfat dengesini düzenlemek ve kemik yapısını korumak olduğu düşünülen vitamin D (1,25 dihidroksivitamin D, 1,25 dihidroksikolekalsiferol) nin, yapılan son çalışmalarla birlikte immün sistemin ve reninanjiotensin sisteminin düzenlenmesinde, kardivasküler hastalıkların oluşmasında ve beyinde önemli rollerinin olduğu gösterilmiştir. Bir kolesterol omurgası taşıyan ve tüm vücutta steroid benzeri etkileri olan vitamin D, nükleer bir steroid reseptörü olan vitamin D reseptörü (VDR) aracılığı ile 1.000 in üzerinde genin anlatımını düzenler. Beyinde vitamin D biyosentez ve yıkımının gerçekleştiği ve vitamin D nin etkisini gösterebilmesi için gerekli olan VDR nin beynin çeşitli bölgelerinde bulunduğu saptanmıştır. Ayrıca bir çok çalışmada vitamin D nin sinir sistemi üzerinde koruyucu etkilerinin olduğu gösterilmiştir (1,2,3,4,5,6). Vitamin D nin sinir sistemi üzerindeki etkileri ile ilgili bulgular 4 başlık altında toplanabilir (1,3,7,8,9): Oksidatif stresin önlenmesi: Vitamin D, γ glutamil transpeptidaz aktivitesini düzenleyerek beyinde detoksifikasyon işlemini kontrol eden bir antioksidandır. Nörotrofik faktörlerin düzenlenmesi: Vitamin D nöron kaderinin belirlenmesinde rol oynayan sinir büyüme faktörü (NGF), nörotrofin-3 (NT-3), nörotrofin-4 (NT-4) ve glial hücre kökenli nörotrofik faktörlerin (GDNF) anlatımını düzenler. Ca+2 dengesi: Vitamin D hücre içi kalsiyum dengesinin sağlanmasında önemli rol oynayan L-tipi voltaj duyarlı kalsiyum kanallarının ve kalsiyum bağlayan proteinlerin anlatımını düzenler. İmmun sistemin düzenlenmesi: Vitamin D otoimmün ve hücresel immün cevapta rol oynar. Vücuttaki vitamin D miktarları ve vitamin D alınması ile ilgili problemler, nörotrofik faktör üretimini, hücre içi kalsiyum dengesini, oksidatif stres mekanizmalarını ve immün sistemi etkileyeceğinden nörodejeneratif hastalıklardaki nöron hasarı ile ilişkilendirilebilir. Bunlara ek olarak daha önce yapmış olduğumuz çalışmalarda vitamin D reseptör geni polimorfizmleri ve TaubF haplotipi ile geç başlangıçlı Alzheimer hastalığı arasında ilişki bulunduğu literatürde ilk kez olarak ortaya konulmuştur (3,10). Son çalışmalar gelişmiş ülkelerde yaşayan bireylerde, vitamin D eksikliğinin gençler de dahil olmak üzere oldukça yaygın olduğunu göstermektedir. Yaşlılarda ise vitamin D eksikliği görülme oranı % 87 ye kadar ulaşmaktadır. Yakın zamanlara kadar sadece basit bir vitamin olarak görünmesi, bu biyoaktif maddenin aslında çok hedefli sekosteroid bir hormon olduğu ve eksikliğinin yaşlılarda ciddi problemlerin ortaya çıkmasına sebep olabileceği gerçeğini saklamış olabilir. Beyindeki ilk bulgular 25 yıl öncesine uzanmasına rağmen elde edilen bilgiler halen oldukça yetersizdir. Bu kısıtlı bilgiler bile vitamin D nin beyin gelişiminden, immün sistemin düzenlenmesine kadar bir çok yolakta rol oynadığına dair veriler sunmaktadır. Vitamin D nin sinir sistemi üzerindeki etkisine katılan intraselüler yolaklar göz önüne alındığında, vitamin D eksikliğinin nörodejeneratif hastalıkların oluşumunda rol oynayabileceği düşünülebilir ve böylece nörodejenerasyonun moleküler mekanizmalarının açıklanmasına yeni bir bakış açısı getirebilir. Daha önceki çalışmalarımızda vitamin D nin kortikal nöronlarda beta amiloid ile indüklenen ve kalsiyum artışı ile NGF üretimini hedef alan toksisiteyi ortadan kaldırmada etkili olduğu; beta amiloidin vitamin D reseptörü anlatımını ortadan kaldırdığı ve vitamin D-VDR yolağının bloke edilmesinin nörodejenerasyon benzeri değişikliklere sebep olduğu gösterilmiştir (8,9,11). Son zamanların diğer ilgi çekici çalışmaları vitamin D nin Alzheimer hastalarının makrofajlarını fagositoz yapmak üzere güçlü bir şekilde uyardığını ve böylece beta amiloidin temizlenmesini sağlayarak nöronları apoptoza karşı koruduğunu göstermiştir (12,13). Annweiler and Beauchet 2011 yılında Alzheimer hastalığının tedavisinde kullanılan bir ilaç olan memantin i vitamin D ile kombine ederek Alzheimer hastalığı için yeni bir tedavi protokolü (AD-IDEA) yayınlamışlardır (14). Ancak halen vitamin D nin nöronlar ve nörodejenerasyon üzerine etkisi hakkında yeterli sayıda çalışma bulunmamaktadır. NGF ile vitamin D ilişkisi üzerindeki bilgiler ise glia hücreleri, nöroblastoma hücre soyları ve serum içeren medyumda kültürü yapılmış olan hippokampal nöronlarda (6,15,16,17) ve kortikal nöronlar üzerinde gerçekleştirilen çalışmalar (8,9) ile sınırlıdır. Serum içeren medyumların özellikle nörotrofik faktör ve vitamin çalışmalarına uygun olmadığı bildirilmiştir (18). Buna göre hippokampal nöronların serum içermeyen medyum ile oluşturulan kültürlerinde vitamin D uygulaması ile NGF salınımının nasıl etkilediğine dair herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Mevcut biyolojik veriler ve daha önceki çalışmalarımızdan elde ettiğimiz genetik ve hücresel sonuçlar ışığında bu çalışmada vitamin D nin hippokampal nöronlar üzerindeki etkisini özellikle NGF salınımı açısından araştırmayı planladık. Bu amaçla sıçan primer hippokampal nöron kültürüne vitamin D uygulayarak nöron sağ kalımında önemli görevlere sahip olan NGF proteinindeki değişiklikleri saptamayı ve vitamin D nin Alzheimer hastalığı için önem taşıyan hippokampustaki NGF salınımı üzerine etkisini araştırmayı amaçladık. Yöntem Primer Hippokampal Nöron Kültürünün Hazırlanması Hippokampal nöronların elde edilmesi için Sprague-Dawley cinsi 18 günlük embriyolar kullanıldı. Goslin ve Banker ın yöntemiyle (19) 18 günlük embriyolardan sağ ve sol hemisfere ait hippokampuslar meningial membrandan arındırılarak çıkarıldı ve hücrelere ayrılarak ekimi yapıldı (8, 9, 11). Nöron kültürü 35 mm çapında 6 kuyulu plakalar (Corning 3506. Corning Inc. New York, USA) kullanılarak gerçekleştirildi. Ekim yapılacak petriler 1:50 oranında poly-l-ornithine (Sigma P-4957. Sigma-Alderich Chemie GmbH, Steinheim, GE) ile kaplanarak hazırlandı. Nöronlar bir gün boyunca içerisinde 0,1 mg/ml conalbumin (Sigma C-7786. Sigma-Alderich Chemie GmbH, Steinheim, GE); %7,5 Sodyum bikarbonat (GibcoBRL 25080-094. Invitrogen Inc., New York, USA); 0,1 mm Putrescine (Sigma P-7505. Sigma-Alderich Chemie GmbH, Steinheim, GE); 10 ng/ml Insülin (GibcoBRL 12585. Invitrogen Inc., New York, USA); 30 nm Sodyum selenit (Sigma S-5261. Sigma-Alderich Chemie GmbH, Steinheim, GE); 20 nm Progesteron (Sigma P-6149. Sigma-Alderich Chemie GmbH, Steinheim, GE); 20 mm Glukoz (Sigma G-7021. Sigma-Alderich Chemie GmbH, Steinheim, GE) ve PenStrep (Sigma P-4333 Sigma- Alderich Chemie GmbH, Steinheim, GE) içeren Leibovitz 15 + (L- 15+; GibcoBRL 11415-064. Invitrogen Inc., New York, USA) kültür

Gezen-Ak ve ark. 159 medyumunun içerisinde bekletildi. Takip eden gün içerisinde L-15+ medyumu, serum içermeyen 1:50 B27, %9 sodyum klorür ve PenStrep içeren Nöron Bazal Medyumu (Neurobasal medium- NBM) ile değiştirildi. Primer hippokampal nöron kültüründeki hücreler ekimden sonraki 7 gün içerisinde akson ve dendritlerini uzatarak olgun nöronlar haline geldi (Şekil 1). Çalışmamızda Laboratuvar Hayvanlarının Kullanılması ve Bakımı Kılavuzunda belirtilen hükümlere uyulmuştur. Çalışma İ.Ü. Deney Hayvanları Birimi Etik Komitesi (onay no: 23797/20.09.2006) tarafından onaylanmıştır. Kültürdeki Hücrelerin Nöron/Glia Ayrımının Yapılması Kültürdeki hücreler nöron ve glia hücrelerine özgü antikorlar kullanılarak immünfloresan yöntemi ile işaretlendi. Nöronların ayırımı bir nöron belirteci olan Pan Neuronal Marker primer antikoru ve FITC işaretli sekonder antikorlar kullanılarak, glia hücreleri ise bir glia hücresi belirteci olan glial fibriler asidik protein (GFAP) primer antikoru ve Texas Red (TR) işaretli sekonder antikorlar kullanılarak yapıldı. Primer antikorların uygulanmadığı sadece sekonder antikorların uygulandığı kültür hücreleri negatif kontrol olarak kullanıldı. Pozitif kontrol olarak ise 14 gün boyunca herhangi bir uygulama yapılmadan yaşatılan ve böylece glia hücrelerinin üremesine izin verilen primer hippokampal nöron kültürü kullanıldı (Şekil 2a). Kültürdeki hücreler %3,7 lik paraformaldehit (Sigma 15,812-7. Sigma-Alderich Chemie GmbH, Steinheim, GE) içerisinde fikse edildi. Hücreler %30 luk normal keçi serumunda (Chemicon S26. Millipore Corp. California, USA) oda sıcaklığında 1 saat bekletildi ve %30 keçi serumu ile 1:50 oranında sulandırılan primer antikor Milli-Mark Pan Neuronal Marker (Millipore MAB2300. Millipore Corp. California, USA), gece boyu + 4 C de bekletildi. Takiben %1,5 keçi serumu içerisinde 1:50 oranında sulandırılan keçi anti-fare IgG, FITC (fluorescein isothiocyanate) (Millipore AP181F. Millipore Corp. California, USA) sekonder antikoru ile 1 saat oda sıcaklığında inkübe edildi. Ardından %10 luk normal keçi serumunda oda sıcaklığında 30 dk bekletildi. Hücreler 1:750 oranında primer antikor GFAP (Invitrogen AB5804. Invitrogen Inc., New York, USA) ile 2 saat oda sıcaklığında bekletildi. Son olarak 1:100 oranında sulandırılan keçi anti tavşan IgG TR (Texas Red) (Santa Cruz sc-2780. SantaCruz Inc. California, USA) sekonder antikoru ile 1 saat oda sıcaklığında inkübe edildi. 1:48.000 oranında DAPI (4,6-Diamidino-2-Phenylindole) solusyonu içinde 5 dk bekletildi. Hücreler invert floresan mikroskobunda (Leica DMIL, Leica Microsystems Ltd., Heerbrugg, GE) incelendi ve TR, I3 ve A3 filtreleri kullanılarak floresan kamera sistemi (Leica DFC 300 FX, Leica Microsystems Ltd., Heerbrugg, GE) ile fotoğrafları çekildi. Farklı filtrelerle çekilen aynı alana ait fotoğraflar özel bir yazılım (The Leica Application Suite Image Overlay Software, Leica Microsystems Ltd., Heerbrugg, GE) kullanılarak çakıştırıldı. Her bir petrinin rastgele alanlarından çekilen 10 ar adet fotoğraf üstüste çakıştırıldı ve nöron ve glia hücrelerinin sayımı yapıldı. Şekil 1. 7 günlük primer hippokampal nöronların faz-kontrast mikroskobu ile görünüşü. Büyütme 20x. Şekil 2. Kültür hücrelerinde nöron/glia oranının belirlenmesi A)14 günlük primer hippokampal nöron kültürü görülmektedir. Yaşlanmasına ve glia üremesine izin verilen 14 günlük primer hippokampal nöron kültürü nöron/glia oranını saptamak üzere pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Glia oranı %50 olarak belirlenmiştir. B) 7 günlük primer hippokampal nöron kültürü görülmektedir. Glia oranı %20 olarak belirlenmiştir. FITC işaretli Pan Neuronal Marker, TR işaretli GFAP antikorları ve DAPI ile üçlü boyama. Nöron: Yeşil (FITC), (ok); glia hücreleri: kırmızı (TR), > (ok ucu); nukleus: mavi (DAPI), * (yıldız). Büyütme 40x.

160 Gezen-Ak ve ark. Gruplar Kültürün 7. gününde olgunlaşan nöronlar 3 gruba bölündü: 1. Grup: Vitamin D uygulanan grup 7. gün, 48 saat süreyle 10-8 M 1,25 dihidroksivitamin D3 uygulanan deney grubu. 2. Grup: Etanol uygulanan grup 7. gün, 48 saat süreyle 10-8 M etanol uygulanan deney grubu. 3. Grup: Kontrol grubu 7. gün, vitamin D ve vitamin D nin içinde çözündürüldüğü etanol uygulanan gruplarla aynı zamanda sadece medyumu değiştirildi. Tüm gruplar 6 şar ayrı petride uygulandı ve deneyler 3 kere tekrarlandı. Vitamin D uygulaması 1,25 α-dihidroksivitamin D3 (Sigma C-9756. Sigma-Alderich Chemie GmbH, Steinheim, GE) 10-4M olacak şekilde absolü etanol içerisinde sulandırıldı. 1,25 α-dihidroksivitamin D3 1,5 ml NBM+ içeren petrilere, final konsantrasyon 10-8 M ve olacak şekilde 48 saat süreyle uygulandı. Uygulamadan sonra NGF miktarı saptanacak olan medyumlar toplanana kadar medyum değiştirilmedi. Sitotoksisite Testi Sitotoksisite ölçümü, kültürdeki membranı hasarlı veya ölü hücrelerden medyuma salınan laktat dehidrogenaz (LDH) miktarının belirlenmesiyle gerçekleştirildi. LDH salınımı deneylerinde kullanılacak negatif kontrol, düşük konsantrasyonlu kontrol, yüksek konsantrasyonlu kontrol grupları diğer deneylerle birlikte hazırlandı. NBM+ dan oluşan negatif kontrol, kültür medyumundaki LDH aktivitesini belirlemek üzere hazırlandı. Her deneyde kullanılan ve hiçbir madde uygulanmayan kontrol grupları hücrelerden normal koşullardaki LDH salınımı belirlemek üzere düşük konsantrasyonlu kontrol grubu olarak kullanıldı. Kültür medyumuna %2 Triton X-100 verip 24 saatlik inkübasyon ile oluşturulan yüksek konsantrasyonlu kontrol grubu hücrelerden salınabilecek en yüksek LDH miktarını belirlemek için hazırlandı. Uygulama süreleri sonunda kontrol gruplarına ve deney gruplarına ait kültür medyumlarından 500 er µl örnek ELISA çalışmaları için toplandı ve -80oC de saklandı. LDH salınımı Cytotoxicity Detection (LDH) kiti (Roche 11 644 793 001. Roche Diagnostics GmbH Roche Applied Science Mannheim, GE) kullanılarak firmanın sağladığı protokole göre yapıldı. NGF Miktarının Ölçümü Kültür medyumuna salınan NGF miktarı ölçümü Chemikine Nerve Growth Factor (NGF) Sandwich ELISA kiti (Chemicon CYT304. Millipore Corp. California, USA) kullanılarak firmanın sağladığı protokole göre gerçekleştirildi. İstatistik Her örnek için okunan 3 adet absorbans değerinin ortalaması alındı. Bu değerlerden ve kontrollerin ortalama değerlerinden negatif kontrolün ortalaması çıkartıldı. Örneklerin kontrole göre sitotoksisite yüzdesi aşağıdaki formüle göre hesaplandı ve Microsoft Office Excel yazılımda grafik haline getirildi. Sitotoksisite (%) = beklenen değer düşük konsantrasyonlu kontrol x100 yüksek konsantrasyonlu kontrol - düşük konsantrasyonlu kontrol hücrelerden salınan NGF miktarının belirlenmesinde firma tarafından sağlanan NGF miktarı bilinen 7 farklı standart kullanıldı. Standartların içerdiği NGF miktarı ve OD değerleri kullanılarak çizilen dağılım grafiğinden elde edilen formül ile (R2:0,935) gruplar arasında NGF miktarları hesaplandı ve yüzde NGF miktarına çevrilerek grafik çizildi. Her bir gruba ve kontrollere ait ham veriler GraphPad InStat DTCG 3.06 (GraphPad Software, Inc. San Diego USA) yazılımda Tek yönlü ANOVA metodu kullanılarak karşılaştırıldı, p<0,05 istatistiksel açıdan anlamlı fark olarak kabul edildi. Bulgular Kültürdeki Glia Hücresi Sayısı Her bir petrinin rastgele alanlarından çekilen 10 ar adet fotoğraftaki nöron ve glia hücrelerinin sayımı sonucunda glia sayıları toplam hücre sayısına oranlanarak yüzde glia oranı %20 olarak saptandı (Şekil 2b). Böylece kültür nöronca zengin kültür olarak tanımlandı. Sitotoksisite Sonuçları Kırk sekiz saat süreyle vitamin D uygulanan primer hippokampal nöron kültürüne ait deney grubunun LDH salınımının kontrol grubuna oranla %4,9 oranla azaldığı ve bu farkın istatistiksel olarak anlamlı olduğu saptandı (%95 CI 2,330-6,074; p<0.001). 48 saat süreyle 10-8 M etanol uygulanmış primer hippokampal nöron kültürüne ait deney grubundaki LDH salinimi ise kontrol grubuna gore %0,9 oranında artmış olduğu, bu farkın ise istatistiksel açıdan anlamlı olmadığı belirlendi (%95 CI -0,632-1,104; p>0,05). NGF Ölçüm Sonuçları 48 saat süreyle 10-8 M vitamin D uygulanmış primer hippokampal nöron kültürüne ait deney grubunun NGF salınımının kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı derecede arttığı saptandı (%95 CI 43-76; p<0,0001) (Şekil 3). Kırk sekiz saat süreyle 10-8 M etanol uygulanmış primer hippokampal nöron kültürüne ait deney grubunun NGF salınımının kontrol grubuna kıyasla %2,7 oranında arttığı ancak bu artışın istatistiksel açıdan anlamlı olmadığı gözlendi (%95 CI -0,921-3,526; p>0,05). %NGF 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Kontrol Gruplar Vitamin D Şekil 3. Vitamin D uygulaması yapılan primer hippokampal nöronlarda NGF salınımı *Kontrol grubuna göre anlamlı olarak artmıştır (p<0,0001). Gruplara ait veriler ortalama+sd olarak verilmiştir.

Gezen-Ak ve ark. 161 Tartışma Nörotrofik faktör hipotezine göre, nöronlar aksonlarını hedef hücreye kadar uzatırlar, hedef hücreler ise sınırlı miktarda nörotrofik faktör salgılarlar. Nörotrofik faktörler özel hücre reseptörlerine bağlanır ve yeterli miktarda nörotrofik faktör alamayan nöronlar apoptoz ile ölür. Örneğin, NGF nin reseptörü olan trka ya bağlanması Bcl-2 adı verilen bir molekülü aktif hale geçirir. Bu şekilde apoptotik yolakta bir sonraki molekül olan Apaf 1 baskılanır ve apoptoza yol açacak olan kaspazlar inaktif halde kalır. Ancak yeterli NGF nin olmadığı durumlarda bu sinyal alınmayacağından Bcl-2 aktif hale geçemez ve Apaf 1 baskılanamaz. Böylece aktif kalan Apaf 1 tarafından kesilen kaspazlar aktif hale geçer ve apoptoz gerçekleşir (20). Alzheimer hastalığında oluşan amiloid plaklar ve nörofibriler yumaklar, kolinerjik sistem nöronlarının hasarlanmasına yol açar. Kolinerjik sistem, bilgileri işleyen ve beyin fonksiyonlarını düzenleyen sinir hücrelerini içerir. Bu sistemdeki nöronların dejenerasyonu asetilkolin kaybına yol açar ve sonrasında Alzheimer hastalığında görülen kortikal demansı belirgin şekilde arttırır. Bu nöronların hayatta kalması büyük oranda NGF almalarına bağlıdır (21). Vitamin D nin sinir büyüme faktörünün (NGF) sentezini düzenlediğinin rapor edilmesiyle birlikte başlayan çalışmalar, vitamin D nin sinir sistemi hücrelerinde diğer nörotrofinlerin sentezini de düzenlediğini göstermiştir. Vitamin D, NGF, nörotrofin 3 (NT3) ve glial kökenli nörotrofik faktör (GDNF) sentezini uyarırken, nörotrofin 4 (NT4) sentezini azaltır (3,4,6,15). Vitamin D tarafından düzenlenen nörotrofin üretiminin nöron korunmasına aracılık ettiği sınırlı sayıdaki çalışmalarda gösterilmiştir (8). NGF ile vitamin D ilişkisi üzerindeki bilgiler ise glia hücreleri, nöroblastoma hücre soyları ve serum içeren medyumda kültürü yapılmış olan hippokampal nöronlarda (6,15,16,17) ve kortikal nöronlar üzerinde gerçekleştirilen çalışmalar (8,9) ile sınırlıdır. Bu çalışmalardan hippokampal nöron kültürü üzerinde gerçekleştirilenlerin önemli bir özelliği medyumlarında serum kullanmış olmalarıdır (16,17). Serum içeren medyumların içerisinde bilinmeyen miktarda büyüme faktörleri, hormonlar, vitaminler ve proteinler mevcut olduğu bildirildiğinden özellikle nörotrofik faktör ve vitamin çalışmaları için serum kullanımı önerilmemektedir (18). Serum içeren medyumlar ile hazırlanmış olan hippokampal nöron kültürlerinde gerçekleştirilen bu çalışmalarda bizim sonuçlarımızla da uyumlu olarak NGF miktarının arttığı saptanmıştır. Ancak serum içerisinde 25-hidroksivitamin D bulunma olasılığı çok yüksek olduğundan söz konusu çalışmalardaki NGF değişiminin sadece kültüre uygulanan vitamin D miktarına bağımlı olmayabileceği de göz önünde bulundurulmalıdır. Bu yüzden çalışmamızda vitamin D nin NGF üzerine olan direkt etkisini saptamak için serum içeren herhangi bir medyum kullanılmamıştır. Grubumuz çalışmalarında Alzheimer hastalığına (AH) katılan 2 esas patolojik yapıdan biri olan beta amiloid 1-42 uygulamasının kültürdeki nöronlarda, L-tipi voltaj duyarlı kalsiyum kanalı-a1c (LVSCC- A1C), A1D (LVSCC-A1D) ve NGF seviyelerini toksik olarak arttıran, VDR anlatımını ise azaltan bir mekanizma aracılığı ile nörodejenerasyonu tetiklediğini göstermiştir (8,9,11). Bu Alzheimer benzeri in vitro model üzerine uygulanan vitamin D ise LVSCC A1C, LVSCC A1D anlatımını azaltarak, VDR anlatımının azalmasını önleyerek ve NGF seviyelerini yükselterek nöronları korumaktadır (8). Diğer taraftan VDR geninin VDR sirna uygulaması ile susturulması sonucu oluşturulan vitamin D eksikliği modeli, yaşlanma ile ilişkili nörodejenerasyon mekanizmalarına benzer bir model olarak iş gördüğü grubumuz tarafından bildirilmiştir (9). Kısa süreli vitamin D eksikliğine cevaben oldukça hızlı bir şekilde artan LVSCC A1C ve azalan NGF miktarları, eksikliğin sürekli olduğu durumlarda nöronların kalsiyum artışı, oksidatif stresin tetiklenmesi ve nörotrofik faktörlerin azalması ile yaşlanmaya ve nörodejenerasyona karşı korumasız duruma gelebileceğini göstermiştir (9). Hücrelerin, VDR geni baskılanması sonucu oluşan vitamin D eksikliğine karşı beta amiloid uygulanan hücrelerle benzer cevaplar vermesi, beta amiloidin VDR yi baskılayarak bir çeşit vitamin D eksikliğine sebep olduğunu düşündürmektedir (9). 2012 de yapılan diğer bir çalışmamızda vitamin D kullanımının işareti olarak kabul edilen 25hidroksivitaminD3-24hidroksilaz (24OHaz) enziminin kortikal ve hippokampal nöronlarda anlatımının yapıldığı literatürde ilk kez gösterilmiştir (11). Ayrıca 24OHaz enziminin hippokampal nöronlarda kortikal nöronlara göre daha fazla anlatımının olduğu saptanarak, Alzheimer hastalığı için oldukça önemli bir bölge olan hippokampusun vitamin D ye daha fazla ihtiyacı olabileceğine dikkat çekilmiştir (11). Sunulan çalışmamızda elde edilen sonuçlar NGF salınımının hippokampal nöronlarda da kortikal nöronlarda olduğu gibi vitamin D tarafından düzenlendiğini göstermektedir. Diğer taraftan 48 saat süreyle 10-8 M vitamin D uygulanan gruplarda hiç bir madde uygulanmayan kontrol grubuna göre LDH salınmasının azalması, vitamin D uygulamasının kortikal nöronlarda olduğu gibi hippokampal nöronlarda da normal kültür şartlarında gerçekleşen hücre hasarını bile engellediğini ortaya koymaktadır. Alzheimer hastalığında görülen en önemli değişikliklerden biri NGF seviyesinin beyin korteksi ve hippokampusta artarken bazal ön beyinde azalmasıdır. Korteks ve hippokampusta Trk A ekspresyonunun azalmasından dolayı artan NGF nin bazal önbeyine taşınamadığı ileri sürülmektedir (22). Buna göre AH da kolinerjik nöronların atrofisi NGF taşınmasındaki bozukluk sonucu bazı nöronların trofik faktör kaynağı bulamamasından ve NGF nin belirli alanlarda birikmesinden kaynaklanmaktadır (23). Nitekim bizim çalışmamızda vitamin D nin NGF ekspresyonunu arttırdığı ve bu artışın nöronun korunmasını sağladığı gösterilmiştir. Vitamin D nin bir diğer etkisi de p75 NTR reseptörlerinin ekspresyonunu arttırmasıdır (24). Daha çok apoptoz uyarıcı etkileri bilinen p75 NTR nin özel bölgelerine bağlanan adaptör proteinlerin çeşitliliği sebebiyle, hücrenin tipine ve içinde bulunduğu duruma bağlı olarak apoptozu uyaran veya engelleyen yolakları aktif hale geçirebilmektedir (25). Sonuç olarak bu bulgularımız önceki çalışmalarımızdan elde ettiğimiz verilerle birlikte yorumlandığında, Alzheimer hastalığının önemli bir bileşenini oluşturan hippokampal tutulma ve nöronların NGF kaybının vitamin D uygulaması ile engellenebilmesi, hastalığın ve nörodejenerasyonun moleküler mekanizmalarının anlaşılmasında yeni ufuklar açabilecek, tedavide ve hastalığın önlenmesinde yeni yaklaşımların geliştirilmesine olanak sağlayabilecektir. Teşekkür Bu çalışma TUBİTAK tarafından 107S041 ve İstanbul Üniversitesi BAP Birimi tarafından 548 nolu projeler ile desteklenmiştir.

162 Gezen-Ak ve ark. Kaynaklar 1. Cekic M, Sayeed I, Stein DG. Combination treatment with progesterone and vitamin d hormone may be more effective than monotherapy for nervous system injury and disease. Front Neuroendocrin. 2009;30:158-172. 2. Eyles DW, Smith S, Kinobe R, Hewison M, McGrath JJ. Distribution of the vitamin D receptor and 1 alpha-hydroxylase in human brain. J Chem Neuroanat. 2005;29:21-30. 3. Garcion E, Wion-Barbot N, Montero-Menei CN, Berger F, Wion D New clues about vitamin D functions in the nervous system. Trends Endocrinol Metab. 2002;13:100-105. 4. Holick M. Noncalcemic actions of 1,25-dihydroxyvitamin D3 and clinical applications. Bone. 1995;17:107-111. 5. Kato S, Sekine K, Matsumoto T, Yoshizawa T. Molecular genetics of vitamin D receptor acting in bone. J Bone Miner Metab. 1998;16:65-71. 6. Wion D, MacGrogan D, Neveu I, Jehan F, Houlgatte R, Brachet P. 1,25 dihydroxivitamin-d3 is a potent inducer of NGF synthesis. J Neurosci Res. 1991;28:110-114. 7. McCann J, Ames BN. Is there convincing biological or behavioral evidence linking vitamin D deficiency to brain dysfunction? FASEB J. 2008;22:982-1001. 8. Dursun E, Gezen-Ak D, Yilmazer S. A novel perspective for Alzheimer s disease: vitamin D receptor suppression by Amyloid-β and preventing the Amyloid-β induced alterations by vitamin D in cortical neurons. J Alzheimers Dis. 2011;23:207-219. 9. Gezen-Ak D, Dursun E, Yilmazer S. The effects of vitamin D receptor silencing on the expression of LVSCC-A1C and LVSCC-A1D and the release of NGF in cortical neurons. PLOS ONE. 2011;6(3): e17553. 10. Gezen-Ak D, Dursun E, Ertan T, Hanagasi H, Gurvit H, Emre M, Eker E, Ozturk M, Engin F, Yilmazer S. Association between vitamin D receptor gene polymorphism and Alzheimer s disease. Tohoku J Exp Med. 2007;212:275-282. 11. Gezen-Ak D, Dursun E,Yilmazer S. Vitamin D inquiry in hippocampal neurons: Consequences of vitamin D-VDR pathway disruption on calcium channel and the vitamin D requirement. Neurol Sci. 2013;34(8):1453-1458. 12. Masoumi A, Goldenson B, Ghirmai S, Avagyan H, Zaghi J, Abel K, Zheng X, Espinosa- Jeffrey A, Mahanian M, Liu PT, Hewison M, Mizwickie M, Cashman J, Fiala M. 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3 interacts with curcuminoids to stimulate amyloidbeta clearance by macrophages of Alzheimer s disease patients. J Alzheimers Dis. 2009;17:703-717. 13. Mizwicki MT, Menegaz D, Zhang J, Barrientos-Durán A, Tse S, Cashman JR, Griffin PR, Fiala M. Genomic and Nongenomic Signaling Induced by 1α,25(OH)2-Vitamin D3 Promotes the Recovery of Amyloid-β Phagocytosis by Alzheimer s Disease Macrophages. J Alzheimers Dis. 2011;29:51-62. 14. Annweiler C, Fantino B, Parot-Schinkel E, Thiery S, Gautier J, Beauchet O. Alzheimer s disease--input of vitamin D with memantine assay (AD-IDEA trial): study protocol for a randomized controlled trial. Trials. 2011;12:230. 15. Neveu I, Naveilhan P, Jehan F, Baudet C, Wion D, De Luca HF, Brachet P. 1,25-dihydroxyvitamin D3 regulates the synthesis of nerve growth factor in primary cultures of glial cells. Brain Res Mol Brain Res. 1994;24:70-76. 16. Brown J, Bianco JI, McGrath JJ, Eyles DW. 1,25-dihydroxyvitamin D3 induces nerve growth factor, promotes neurite outgrowth and inhibits mitosis in embryonic rat hippocampal neurons. Neurosci Lett. 2003;343:139-143. 17. Marini F, Bartoccini E, Cascianelli G, Voccoli V, Baviglia MG, Magni MV, Garcia-Gil M, Albi E. Effect of 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3 in embryonic hippocampal cells. Hippocampus. 2010;20:696-705. 18. Price P, Brewer GJ. Serum-Free Media for Neural Cell Cultures. In: Fedoroff S, Richardson A, editor. Protocols for Neural Cell Culture. 3 ed. New Jersey: Humana Press; 1998. p. 255-264. 19. Goslin K, Asmussen H, Banker G. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. In: Banker G, Goslin K, editor. Culturing Nerve Cells. 2 ed. Cambridge: MIT Press; 1998. p. 339-371. 20. Jessel T, Sanes JR. The generation and survival of nerve cells editor. In: Kandel E, Schwarz JH, Jessel TM, editor. Principals of Neural Science. 4 ed. New York: McGraw-Hill; 2000. p. 1149-1161. 21. Tuszynski MH, Hoi Sang U, Alksne J, Bakay RA, Pay MM, Merrill D, Thal LJ. Growth factor gene therapy for Alzheimer disease. Neurosurg Focus. 2002;13:1-5. 22. Capsoni S, Cattaneo A. On the Molecular Basis Linking Nerve Growth Factor (NGF) to Alzheimer s Disease. Cell Mol Neurobiol. 2006;26:4-6. 23. Salehi A, Delcroix JD, Swaab DF. Alzheimer s disease and NGF signaling. J Neural Transm. 2004;111:323-345. 24. Naveilhan P, Neveu I, Baudet C, Funakoshi H, Wion D, Brachet P, Metsis M. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 regulates the expression of the low-affinity neurotrophin receptor. Brain Res Mol Brain Res. 1996;41:259-268. 25. Meldolesi J, Sciorati C, Clementi E. The p75 receptor: first insights into the transduction mechanisms leading to either cell death or survival. TiPS. 2000;21:242-243.