HIV pozitif hastalarda proteaz, revers transkriptaz ve integraz inhibitörlerine karşı gelişen ilaç dirençlerinin Yeni Nesil Dizileme (YND-NGS) ile araştırılması Duygu Tekin 1, Rüçhan Sertöz 1, Deniz Gökengin 2, Selda Erensoy 1 KLİMUD 2017 KONGRESİ SÖZLÜ SUNUM 1 Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Tıbbı Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı, İzmir 2 Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Enfeksiyon Hastalıkları Ana Bilim Dalı,İzmir
HIV Taksonomi ve Replikasyon Döngüsü Aile Retroviridae Alt aile Lentivirinae Tipler HIV-1 HIV-2 Gruplar HIV-1 grup M,N,O,P Subtipler A-K/CRF Subsubtipler A1/A2 ve F1/F2
Antiretroviral Tedavi Ölümcül hastalık HAART Highly Active Anti- Retroviral Therapy Kronik hastalık Hastaneye yatış ve ölüm %60-80 azalma Hammer SM, Squires KH, Hughes MD, et al. A controlled trial of two nucleoside analogues plus indinavir in persons with human immunodeficiency virus infection and CD4 cell counts of 200 per cubic millimeter or less. N. Engl. J. Med. 1997; 337(11): 725-33.
Antiretroviral Tedavi HAART Temel Prensip 2 NRTI + NNRTI 2 NRTI + PI 2 NRTI+ INSTI
Antiretroviral İlaç Direnci En büyük engel antiretroviral ilaç direnci İlaç direnç testleri!!!
Antiretroviral İlaç Direnci Direnç tanı testleri Fenotipik yöntemler Genotipik yöntemler HIV-1 in genetik çeşitliliği!!! İlaç dirençli minör varyantlar antiretroviral tedavi etkinliğini Evaluation of GS Junior and MiSeq next-generation sequencing technologies as an alternative to Trugene population sequencing in the clinical HIV laboratory. Ram D ve ark. J Virol Methods. 2015 Feb;212:12-6.
Antiretroviral İlaç Direnci SANGER ZİNCİR SONLANDIRMA REAKSİYONU Altın standart >%20 viral popülasyondaki mevcut mutasyonlar Ticari kitler - Proteaz ve Revers transkriptaz
Antiretroviral İlaç Direnci YENİ NESİL DİZİLEME %0,1 %1 sıklığındaki varyantlar < %1 Klinik anlamlılık??? Multi-step inhibition against HIV lifecycle-underlying the "magic" of protease inhibitors. Poveda E. AIDS Rev. 2014 Jan-Mar;16(1):52.
GEREÇ VE YÖNTEM Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik kurul Onay tarihi: 15.02.2017 ve Onay numarası:17-2/15 Bilimsel Araştırma Projesi Onay tarihi:29.06.2017 Proje no:17-tip-020 Tez Danışmanı Prof.Dr.Rüçhan sertöz Araştırmacılar Prof.Dr.Selda Erensoy, Prof.Dr.Deniz Gökengin Teknisyen:Ergül Utkun
GEREÇ VE YÖNTEM Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbı Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Moleküler Viroloji Laboratuvarı Sanger zincir sonlandırma temelli ViroSeq (Abbott/CeleraDiagnostics, ABD) PROTEAZ RT
GEREÇ VE YÖNTEM İlaç direnç mutasyonları ve genotip Stanford Üniversitesi HIV-1 ilaç Direnci Veri (http://hivdb.stanford.edu/)
GEREÇ VE YÖNTEM MiSeq (Illumina, ABD) Sistemi Flow cell
GEREÇ VE YÖNTEM MiSeq (Illumina, ABD) Sistemi
GEREÇ VE YÖNTEM MiSeq (Illumina, ABD) Sistemi
BULGULAR 40 HIV-1 pozitif hasta (23.11.2016-8.07.2017) 1 Kadın, 39 Erkek Yaş aralığı: 21-82 yaş, ortanca yaş: 36 yaş, Naiv: 38, tedavi durumu bilinmeyen: 1, ART alan:1 Ortalama HIV-RNA düzeyi 5.05 (aralık:4.09-6.34) log 10 kopya/ml
BULGULAR YND ile 2892 bç RT (1-560 kodon) Proteaz (1-99 kodon) İntegraz (1-288 kodon) gen bölge mutasyonları Veri analizi CLC Genomics Workbench versiyon 8.1 %1 ve %5 cut off Ortalama okuma sayısı 143.485
BULGULAR ALTTİP DAĞILIM ORANLARI G+J; 2; 5% CRF07_BC; 1; 3% B+F; 1; 3% Alttip A; 3; 7% B+CRF02_AG; 6; 15% Alttip B 67% Alttip B B+CRF02_AG Alttip A G+J CRF07_BC B+F
BULGULAR Direnç mutasyonu oranı - %17,5 NRTI- %5 NNRTI -%12,5 PI ve INSTI direnç mutasyonu ise saptanmadı
BULGULAR Tablo.1. YND Dizileme İlaç Direnç ve Genotip Sonuçları
BULGULAR Tablo.2. YND Dizileme İlaç Direnç ve Genotip Sonuçları
BULGULAR Tablo.3.Yardımcı mutasyonlar ve Direnç Etki Durumu Yardımcı Mutasyonlar Hasta Sayısı Direnç Etki Durumu K20R 4 (%10) PI polimorfik mutasyon A71V/T 1 (%2,5) L10I/V 5 (%12,5) 18 (%42,5) örnekte yardımcı mutasyonlar saptanmıştır; V179I 1 (%2,5) S68G 6 (%15) K20I 4 (%10) L74I/M 3(%7,5) V118I 4 (%10) Etravirin ve Rilpivirin baskısı altında sık görülen NNRTI polimorfik mutasyondur K65R mutasyonu ile birlikteliği NNRTI duyarlılığında azamaya neden olur Alttip G ve CRF02_AG dışındaki alttiplerde NFV duyarlılığında azalmaya neden olur RAL ve EVG tedavisi altında sık görülen INSTI Polimorfik mutasyonudur TAM ile birlikte NRTI lara karşı duyarlılığın azalmasına katkıda bulunur PI %20 (8/40), NNRTI-NRTI %27,5 (11/40) INSTI %5 (2/40)
BULGULAR YENİ NESİL DİZİLEME Majör ve yardımcı direnç mutasyonları açısından Sanger zincir sonlandırma reaksiyonu ile %100 uyum On örneğin RT bölgesinde 12 ekstra varyant kodon Beş örneğin proteaz bölgesinde 10 ekstra varyant kodon
BULGULAR VİROSEQ (ABBOTT, ABD) 1144 TL YENİ NESİL DİZİLEME 109 TL SUT KOD 1480 TL
SONUÇLAR YENİ NESİL DİZİLEME RT, proteaz, İntegraz gen bölgesi Multipleks kullanım Maliyet düşüklüğü Duyarlılık yüksek
TEŞEKKÜR EDERİM