Yeni Genetik Testler Dr. Fatih Ezgü Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Metabolizma ve Çocuk Genetik Hastalıkları Bilim Dalları Ankara
Nadir Genetik Hastalıklar
Genetik Biliminin Gelişmesi Gregor Mendel Archibald Garrod Watson-Crick CRISPR/Cas9 Tedavide Yenilikler Tanıda Yenilikler İnsan Genom Projesi
Hangi Durumlarda Genetik Hastalık Düşünmeli? A G E N E S Aile öyküsü Gruplar şeklinde konjenital anomaliler Sık gözlenen hastalıklarda ekstrem klinik Nörogelişimsel retardasyon ya da regresyon Ekstrem patolojik bulgular Şaşırtıcı laboratuvar bulguları
Genetik Hastalık Oluşturan Mekanizmalar (Mutasyonlar) Büyük değişiklik Kromozomal Sayısal (Anöploidi, Poliploidi vb.) Yapısal (Del / dup vb.) Büyük değişiklik Gen Bölgesel del / dup Tüm gen del / dup A Protein A G T C A GEN 1 GEN 2 GEN 3 Epigenetik değişiklikler Küçük değişiklik Gen Tek nükleotid değişikliği Küçük insersiyon / delesyon
Genetik Analiz Yöntemleri Sitogenetik Analizler Hücresel düzeyde genetik materyalin incelenmesidir. Moleküler Genetik Analizler Moleküler düzeyde genlerin yapı ve fonksiyonlarının incelenmesidir. Epigenetik Analizler Epigenetik değişikliklerin rol oynadığı genom bölümlerinde yapılan incelemelerdir.
Sayısal ve Yapısal Kromozom Anomalileri Terminal delesyon Intertsiyel delesyon Esit olmayan crossing over Ring Izokromozom Robertsonian translokasyon Insersiyon SAYISAL YAPISAL
Kromozom (Karyotip) Analizi Karyotip Metafaz yayılımı incelenir Periferik kan/ diğer dokular Kültür Gimsa ile boyanır 37 0 C 3 gün Lam üzerine Yayılır Metafazda durdurulur Hipotonik sıvı Fikse edilir
Kromozom Analizi Kullanım alanları ve olumlu yönleri Sayısal ve yapısal kromozomal anomali tanısı için kullanılır. Tüm genom incelenebilir. Olumsuz yönleri Duyarlılığı 5 Mb (5.000.000 baz) civarındadır. Aktif hücre kültürü gerektirir.
Kromozom Analizi Örnekleri Turner Sendromu Ring Kr 15 46,XY,t(4;11)(q21;q23)
Flöresan In Situ Hibridizasyon (FISH)
Flöresan In Situ Hibridizasyon (FISH) Kullanım alanları ve olumlu yönleri Duyarlılığı 100kb-1Mb dır. Mikrodelesyon ve duplikasyonlarda, translokasyonlarda anöploidilerde kullanılır. Anöploidilerde hızlı sonuç verir. Mozaisizmlerde daha güvenilirdir. Hücre siklusunun her safhasında analiz yapılabilir. Karyotipe göre hızlıdır, hücre bazında analiz yapılabilir. Olumsuz yönleri Ancak hedeflenmiş belirli bölgeleri analiz eder. Özgüllüğü azdır. Genomik imbalans yanında epigenetik faktörlerin rol oynadığı PWS ve AS gibi hastalıklarda ilk tercih değildir.
FISH Örnekleri del 22q11.2 Velokardiyofasiyal Sendrom dup 1p36.1 Trizomi 21
Karyotip / FISH Endikasyonları Erken başlangıçlı büyüme ve gelişme anormallikleri İzole anomaliler (Yarık damak-dudak, konjenital kalp hastalığı vb.) Kuşkulu genitalya Gecikmiş puberte / uygun olmayan ikincil seks karakterleri Kızlarda boy kısalığı ve/veya amenore İnfertilite İleri gebelik yaşı Kanserler Aile öyküsünde etkilenmiş birey
Karyotip / FISH Hafif-orta MR, hipotoni Büyüme geriliği Strabismus, epikantal katlantılar Simian çizgisi Makroglossi, hipodonti Eklem hiperfleksibilitesi Hipogonadizm Konjenital kalp defekti (AV kanal defekti) Duodenal atrezi, Hirschprung Hipotirioidizm Karakteristik yüz Supravalvuler aort stenozu Kalın ses, herni, rektal prolapsus Aşırı sıcak davranış Hiperkalsemi Büyüme geriliği Mikrosefali, MR Hipotoni Strabismus
Alel B Alel A Array Bazlı Genomik Analizler Dup Del Hasta DNAsı Kontrol DNA Amplifikasyon Sindirim İşaretleme Amplifikasyon Sindirim İşaretleme Hasta DNAsı Alel A Alel B Oligonükleotid Array Hibridizasyon Hibridizasyon Normal Delesyon Duplikasyon Normal Delesyon Duplikasyon
Array Bazlı Genomik Analizler Kullanım alanları ve olumlu yönleri Delesyon/duplikasyon analizlerinde kullanılır. Tüm genom incelenir. Duyarlılığı 1 Mb 10 Kb arası değişir. Olumsuz yönleri Pahalıdır. Bioinformatik analiz güçlüğü bulunur.
Olgu-1 10 aylık erkek hasta; Oturamama, emekleyememe, anormal yüz görünümü yakınmaları ile başka merkeze başvurmuş Mukolipidoz ön tanısı ile bölümümüze sevk edildi. Mukolipidoz için enzim analizi NORMAL Karyotip NORMAL
Olgu-1 Dup Del 1pdel 1pdup
Olgu-2 6 yaşında kız hasta Konuşamama nedeniyle başvurdu Önce yapılan karyotip analizi, temporal CT ve BSND, CDC14A, CDH23 gen analizleri ve karyotip NORMAL Fizik incelemede hafif MR ve minör dismorfik bulgular saptandı.
Olgu-2 15q11 e yakın bölgede dup
Mental Retardasyon Tanısında Sitogenetik İncelemeler METOD TANISAL ORAN Karyotip / FISH % 5-10 CGH Array SNP Array Karyotip / FISH (-) EK % 16.7 olgu Karyotip / FISH (-) EK % 22.7 olgu
Array CGH ve SNP Array Endikasyonları Açıklanamayan öğrenme güçlüğü Kognitif bozukluklar Gelişme geriliği Otizim benzeri davranış problemleri Kromozomal anomali telkin eden dismorfik bulgular/çoklu konjenital anomaliler Düşük / ölü doğum (SNP Array) USG ile saptanmış prenatal anomalisi olan bebekler
Multiplex Ligand-Dependent Probe Assay (MLPA) Denatürasyon ve 2. Hibridizasyon PCR primeri X Hibridizasyon dizisi PCR primeri Y İşaretleyici dizi Hedef A Hedef B Ligasyon 5 Y X Hedef A Y 3 Hedef B X Elektroforez ile ayrıştırma ve Okuma
Multiplex Ligand-Dependent Probe Assay (MLPA) Kullanım alanları ve olumlu yönleri Gen içi büyük yeniden yapılanmalar, delesyon ya da duplikasyonları saptamak için geliştirilmiştir. 50 değişik genomik DNA ya da RNA bölgesinde 50-75 bazlık bölgeler hedeflenir. Multipleks analiz yapılabilir. acgh e göre daha ucuzdur. Dezavantajları Önceden hedeflenmiş bölgeler analiz edilir. Epigenetik faktörler için farklı analiz gerekir.
Olgu-3 6 aylık erkek hasta; Emmede bozulma ve gevşeklik nedeniyle başvurdu. Ekokardiyografi de sol ventrikül hipertrofisi saptandı Alfa-glukosidaz düzeyi çok düşük Pompe Hastalığı tanısı ile ERT başlandı
Olgu-3 G.Ü.T.F. Metabolizma, Ege Üniv. Genetik, Hollanda Erasmus Üniv. Genetik Laboratuvarlarında GAA geni dizi analizi NORMAL Karşılıklı alellerde iki gen delesyonu? Erasmus Üniv: İncelemeye gerek yok İspanya da özel laboratuvarda MLPA : Karşılıklı alellerde iki gen içi delesyon mevcut
Gen İçi Mutasyonlar Amino asit Yer değiştirme Amino asit Küçük insersiyon Nokta Değişiklikler Amino asit Küçük delesyon Büyük insersiyon Amino asit Büyük delesyon
Hedefli Mutasyon Analizi Mutasyon analizi
Hedefli Mutasyon Analizleri Sorumlu genin sadece belirli bölümlerinde belirli mutasyonların varlığı araştırılır. Kullanıldığı Alanlar Sık tekrarlayan mutasyon (olguların büyük bölümünde az sayıda ve benzer mutasyon) gözlenen metabolik hastalıklarda tercih edilebilir. Aynı mutasyonun pek çok bireyde gözlendiği topluluklarda uygundur. Kullanılan teknikler ASO, ARMS, AFLP Olumlu Yanları Daha ucuz ve hızlıdır. Olumsuz yanları Yeni mutasyonların, büyük delesyonların saptanması mümkün değildir.
DNA Dizi Analizi Dizi (sekans) analizi
Kapiller Elektroforez ile Dizi Analizi Kapiller elektroforez ile DNA dizi analizi yöntemi ile gen boyunca bulunan yeni ya da daha önce tanımlanmış tüm tek baz değişiklikleri, küçük delesyonlar insersiyonlar büyük bir doğruluk oranı ile belirlenebilir. Olumlu yanları Moleküler genetik tetkikler arasında altın standart olarak kabul edilir. Bu yöntem ile kalıtsal metabolik hastalıkların tümüne tanı konulabilir. Tüm gen dizi analizine tabi tutulduğunda tanı koyma yeteneği çok yüksektir (%90) Olumsuz yanları Büyük yapısal değişiklikler (delesyon ya da duplikasyonlar) bu yöntem ile saptanamaz. Belirli gen bölgelerine (Örn. Belirli ekzonlar) uygulandığında diğer bölgelerdeki mutasyonları atlar. Maliyeti yüksektir ve daha uzun zaman alır.
DNA dizi Analizi-1 PCR Boyama Kapiller Flöresan dedektör Lazer Homozigot Mutasyon Örnek/Tampon DNA fragmanlarının göçü - + Tampon Heterozigot Mutasyon
Yeni Jenerasyon DNA Dizi Analizi Günümüzde DNA dizi analizinin altın standardı olarak kabul edilen kapiller elektroforez ile DNA dizileme teknolojisine göre daha fazla (onlar, yüzler, binlerce) genin hatta tüm genomun, daha hızlı ve daha ucuza dizi analizine tabi tutulmasını sağlar. Elde edilen büyük veriler ise özel olarak geliştirilmiş yazılımlar ile kısa zaman içerisinde analiz edilebilmektedir.
Yeni Jenerasyon DNA Dizi Analizi Yöntemler Massively parallel sequencing (Illumina) Pyrosequencing (Roche) Semiconductor sequencing (Ion Torrent) Olumlu yönleri Aynı anda çok sayıda gen (Metabolizma doktoru için kolaylık) ve hasta (Laboratuvar için kolaylık) dizi analizine alınabilir. Aynı belirti ve bulgu ile kendini gösteren tüm hastalıklar panel yapılabilir. Bulguları hiçbir tanımlanmış hastalık ile açıklanamayan olgularda Egzom dizi analizi ile insandaki tüm genler taranabilir, yeni hastalık tanımlanabilir Olumsuz yönleri Analiz edilen hasta sayısı azaldıkça ya da hastalık arttıkça maliyet artar. Klinik tanı güvenirliği tam netleşmemiştir. Çok yüklü miktarda verinin biyoinformatik analizi gerekir.
YJDA de Akış Gen panellerinin oluşturulması Örneklerin hazırlanması Örneklerin dizilenmesi Çipe yükleme ve Dizileme Verilerin okunması (Biyoinformatik Analiz) Biyoinformatik analiz
Yeni Jenerasyon DNA Dizi Analizi İle Panel Şeklinde Gen Dizilemesi Organ/sistem bazlı paneller Örn. Kc hastalıkları paneli, göz hastalıkları paneli vb. Semptom bazlı paneller Örn. Epilepsi paneli, sağırlık paneli vb. Ekzom analizi 20.000 genin kodlayan bölgeleri (ekzonları) (WES) Genom analizi 20.000 genin tüm tüm bölgeleri (ekzon+intron) (WGS)
G.Ü.T.F Çocuk Metabolizma YJDA Panelleri 5 Hastalık Kistik fibrozis+ailevi hiperkolesterolemi + Gaucher + Pompe + Hiperokzalüri Tip 1 Kalısal metabolik hastalıklar 450 hastalık Lizozomal hastalıklar+marfan+ehler Danlos 60 hastalık Nefroloji+İmmünoloji paneli 60 hastalık Egzom sekansı 22.000 gen YAKINDA İmmünoloji paneli (200 hastalık) Organik asidemi+kobalamin bozuklukları (60 hastalık) Pulmoner hipertansiyon (10 hastalık) Dismorfik hastalıklar (700 hastalık)
G.Ü.T.F. Çocuk Metabolizma Metabolik Hastalıklar Paneli 450 Kalıtsal Metabolik Hastalık (450 GEN) Yeni Jenerasyon DNA Dizileme Teknolojisi KALITSAL METABOLİK HASTALIK ŞÜPHESİ BULUNAN OLGULARDA TANIMLANMIŞ TÜM METABOLİK HASTALIKLARIN (450 HASTALIK) AYNI ANDA YENİ JENERASYON DNA DİZİLEME TEKNOLOJİSİ İLE ARAŞTIRILMASI
Olgu-4 3 yaşında kız Üçlü antiepileptik kullanmasına karşın kontrol altına alınamayan konvülsiyonları bulunuyor Konvülsiyonların erken yaşta başlaması ve dirençli olması Kalıtsal Metabolik Hastalık?
Kalıtsal Metabolik Hastalıklara Bağlı Konvülsiyonlar 100 ün üzerinde hastalık Mitokondriyal hastalıklar Kreatin metabolizma bozuklukları GLUT1 eksikliği Amino asit metabolizma bozuklukları Üre siklus bozuklukları Organik asidemiler Pürin ve pirimidin bozuklukları Nörotransmitter bozuklukları Non-ketotik hipoglisemi Biyotinidaz eksikliği Molibden kofaktör / sülfit oksidaz eksikliği CDG Serin biyosentez bozuklukları
KMH a YJDA ile Panel Yaklaşımı Araştırması (Konvansiyonel vs YJDA) FİZİK İNCELEME RUTİN LABORATUVAR (CBC, BİYOKİMYA..) FİZİK İNCELEME EEG 1. BASAMAK METABOLİK TESTLER (AMİNOASİTLER, AÇİLKARNİTİNLER, İDRARDA ORG. ASİT ) YJDA GÖRÜNTÜLEME (MRI, MRS) BOS İNCELEMESİ TEK GEN DİZİ ANALİZİ TANI? TANI YA DA YENİ GEN
GLDC c.2203-2a>g (HOMOZİGOT) NON-KETOTİK HİPERGLİSİNEMİ
Yeni Jenerasyonda Veri Analizi
Olgu-5 Yenidoğan erkek olgu Sorunsuz gebeliği takiben hastanemizde doğdu Ailenin daha önce erken dönemde kaybedilen bebek öyküsü bulunuyor Gözlem
Olgu-5 İlerleyen günlerde; - Metabolik (Laktik) asidoz - KCFT bozukluğu - Renal tübülopati - Konvülsiyon ve nistagmus Kalıtsal Metabolik Hastalık (Mitokondriyal hastalık?) 450 gen içeren KMH paneli ile YJDA
DGUOK geni p.s52c mutasyonu (Homozigot) Mitokondriyal Hastalık
Ekzom Dizileme Tüm genom Mendelyen kalıtım gösteren hastalıkların % 85 inden sorumludur. Egzom %1
Egzom /Genom Analizi Endikasyonları Fizik inceleme ve laboratuvar analizleri sonucu tanıya ulaşılamamış KMH düşünülen olgular. Fizik inceleme ve laboratuvar bulguları, daha önce tanımlanmış bir klinik duruma uyan ancak geni bilinmeyen olgular.
Olgu-6 3 yaş erkek olgu Sık tekrarlayan ketoasidoz atakları mevcut Dünyada bilinen tüm hastalıklar araştırıldı NORMAL
TÜM EGZOM DİZİLEME Monokarboksilat Transporter 1 (MCT1 geni) MUTASYON
Sonuç (Genetik Analiz Seçimi) Kromozomal Anomali Ön tanı var Ön tanı yok Karytotip FISH Karyotip Karyotip Sonucu NORMAL ise Array (CGH, SNP) Tüm sonuçlar NORMAL ise Tüm EKZOM / GENOM Analizi
Sonuç (Genetik Analiz Seçimi) Tek gen hastalığı Sık gözlenen değişiklik Hayır Evet Hedefli mutasyon analizi Mutasyon var Mutasyon yok Kapiller elektroforez ile DNA dizi analizi Mutasyon var Mutasyon yok Küçük delesyon / duplikasyon analizi (MLPA) Mutasyon var Mutasyon yok TANI Yeni jenerasyon DNA dizi analizi ve yüksek rezonanslı kromozom analizi (CGH)