M47 MICROGEN STREP MICROGEN Strep; kültür ortamından Streptococcus Lancefield gruplarının (A, B, C, D, F ve G) tespitini hızlı bir şekilde gerçekleştiren latex slide aglütasyon testidir. İnsanda enfeksiyona sebep olan birçok Streptococcus suşu serolojik gruplarına özgü antijenlere sahiptirler. Bu mikroorganizmaların identifikasyonu, kültür ortamında büyütülen mikroorganizmalardan ilgili antijenlerin elde edilip karakterize edilmesiyle mümkündür. Streptococcal gruplama sistemi, karbohidrat antijenlerin hızlı ekstraksiyonunu sağlayan enzim reaktifi ve elde edilen antijenlerin hızlı bir şekilde tespiti ve identifikasyonunu gerçekleştiren A, B, C, D, F ve G gruplarına özel bir seri latex aglütinasyon reaktifi içerir. ÇALIŞMA PRENSİBİ MICROGEN Strep kit, Streptokok gruplarının (A, B, C, D, F ve G) karbohidrat antijenlerine özgü tavşan antibodylerine duyarlı latex partikülleri içermektedir. Streptokok kültür ortamında büyütülen koloniler, antijen ekstraksiyonu için enzim solüsyonunda inkübe edilir. Elde edilen antijen ekstraktı, latex slide üzerinde herbiri ayrı 6 gruba (A, B, C, D, F ve G) duyarlı antibody bağlı reaktifler ile test edilir. Homolog antijen varlığında, süspansiyon içerisinde partiküller ile aglütinasyon sonucu agregat ( çökelti) oluşur. Tersi durum söz konusu ise aglütinasyon gözlenmez. KİT İÇERİĞİ M47a REAG A Streptococcus Grup A antijenlerine duyarlı tavşan antibodyleri bağlı M47b REAG B Streptococcus Grup B antijenlerine duyarlı tavşan antibodyleri bağlı M47c REAG C Streptococcus Grup C antijenlerine duyarlı tavşan antibodyleri bağlı M47d REAG D Streptococcus Grup D antijenlerine duyarlı tavşan antibodyleri bağlı M47
M47f REAG F Streptococcus Grup F antijenlerine duyarlı tavşan antibodyleri bağlı M47g REAG G Streptococcus Grup G antijenlerine duyarlı tavşan antibodyleri bağlı M47p CONTROL + Pozitif Kontrol, Streptococcus Grup A, B, C, D, F ve E ye özgü inaktif polyvalant antijen preparatı M47x ENZ Liyofilize Ekstraksiyon Enzimi Kullanım Talimatı Disposable Aglütinasyon Slideları Disposable Karıştırıcı Çubuklar 1.0mL 2 X 10mL KİT İÇERİĞİNE İLAVE EDİLECEKLER Bakteriyal öze Cam veya plastik test tüpleri Pipet ( 0.4 ml hacimlik) 37 C de su banyosu Pasteur pipeti Laboratuar zamanlayıcısı KÜLTÜR ve ÖRNEK HAZIRLAMA Testin yapılacağı günün öncesinde 18-24 saat büyütülmüş birincil izolasyon ortamından- taze kültürlerden- Streptokok morfolojisi ve büyüme karakteristiği gösteren kolonileri seçiniz. Saklanan, eski kültürler test için uygun değildir. İdentifikasyon için kültürlerin hemolitik özellikleri önemlidir ve test edilecek kültürün kan bazlı medyumdan alınıp alınmadığı tespit edilmelidir.
PROSEDÜR KONTROL PROSEDÜRÜ POZİTİF KONTROL Pozitif Kontrolü reaktiflerin işlevlerinin doğruluğu açısından kitin her kullanımında test ediniz. Pozitif Kontrol (M47p CONTROL +) ( kit içerisinde mevcut); kullanıma hazırdır ve kontrol uygulaması test prosedüründeki gibi olup, kültür ekstraktı yerine test edilir. Pozitif Kontrol; tüm latex test reaktifleri (M47a, b, c, d, f ve g) ( kit içerisinde mevcut) ile aglütinasyon oluşturmalıdır. Pozitif Kontrol testinin başarısızlığı reaktiflerde bozulma olduğunu gösterebilir. NEGATİF KONTROL Negatif kontrol istenirse; kültür ekstratı yerine inokülasyon yapılmamış enzim solüsyonunu (M47x ENZ) test prosedüründeki gibi uygulanız. Latex test reaktifleri ile aglütinasyon oluşturmamalıdır. TEST PROSEDÜRÜ 1. Pozitif kontrol (M47p) ( kit içerisinde mevcut) ve latex reaktiflerinin (M47a, b, c, d, f ve g) ( kit içerisinde mevcut) oda sıcaklığına gelmesini sağlayınız. 2. Kullanmadan önce, ekstraksiyon enzim (M47x ENZ) ( kit içerisinde mevcut) şişesine 10 ml distile su ilave edilerek iyice çözünmesi sağlanır. 0.4 ml enzim estraksiyon solüsyonu ayrı bir test tüpüne aktarınız. 3. Öze yardımıyla agar üzerinden Streptococcus kolonileri ( en iyi sonuç için en fazla 4-5 koloniaşırı miktarda koloni spesifik olmayan aglütinasyona sebep olabilir) seçilerek 0.4 ml enzim ekstraksiyon solüsyonu içerisinde emülsiyon oluşturunuz. (Minute-colony strainler için bir sürüntü olmak yeterli olacaktır) 4. 37 C de su banyosu içerisinde bakteri süspansiyonunu 10-15 dk inkübe ediniz. İlk 5 dk lık inkübasyon sonrası antijen süspansiyonu elde etmek için iyice karıştırınız. 5. Homojen hale gelmesi için latex test reaktiflerini (M47a, b, c, d, f ve g) çalkalayınız. Latex slide üzerindeki ayrı altı kuyuya herbiri ayrı latex reaktiflerden 1 er damla damlatınız. 6. İyice karıştırılmış bakteriyal ekstraktan ( veya pozitif kontrolden- bk.nız kontrol prosedürü) 1 er damla latex reaktiflerinin bulunduğu kuyulara ayrı ayrı damlatınız. 7. Her kuyu için ayrı bir karıştırma çubuğu kullanarak bakteri ekstraktı ile reaktifleri iyice karıştırıp kuyu içerisinde yayınız. 8. Slide ı hafifçe sallayıp, 1 dakika bekletiniz ve aglütinasyon sonuçlarını gözleyiniz. 9. Okuma sonrasında kullanılan tüm latex slidelar ve karıştırma çubuklarını atınız.
YORUM Bekleme süresi sonunda latex partikülleri slide üzeri üzerinde aglütinasyon sonucunda agregat (çökelti) oluşturuyorsa, o grup için sonuç pozitif denir. Ekstrakt yoğunluğuna göre aglütinasyon hızı ve yoğunluğu da değişir, fakat bu durum sonucu değiştirmez. Tersi durumda, reaktif solüsyonunun görüntüsünde değişiklik olmaz ise aglütinasyon gerçekleşmemiş ve sonuç negatiftir. OLASI SONUÇLAR β- Hemolozis ile İlişkili Koloniler 1. Tek reaktif için oluşan aglütinasyon, o grubun identifikasyonunu gösterir. Özellikle aşağıdaki durumlarda testi doğrulamak amaçlı karşılaştırma testleri yapılmalıdır : a. D grubu suşları için, D grubu Streptokoklardan Enterococcus türlerini ayırmak amaçlı biyokimyasal test yapınız. b. Minute-colony morfolojisindeki A, C ve G grupları için, biyokimyasal test ile S.milleri / S.anginosus için identifikasyon karşılaştırması. 2. Aynı anda birden fazla farklı latex reaktifi için aglütinasyon oluşumu, farklı gruplara ait karışık kültür olduğu veya bir türün farklı iki grup antijenlerine sahip olduğunu gösterir (ör., bazı grup D Streptokoklar aynı zamanda grup G antijeni taşıyabilmektedir). a. Saf kültürlerin izole edilebilmesi için alt kültürlerinin oluşturulması gerekmektedir. b. Grup D ve grup G antijenlerine sahip suşlar için D grubu Streptokoklardan Enterococcus türlerini ayırmak amaçlı biyokimyasal test yapılması gerekmektedir. 3. Tüm reaktifler için aglütinasyon, ekstraksiyon enzim solüsyonuna aşırı miktarda inokülasyon yapıldığını veya Streptococcus kültürünün ( latex reaktifleri ile spesifik olmayan aglütinasyon oluşturan) başka mikroorganizma ile kontamine olduğunu gösterir. a. Kalan ekstraktın bir iki dakika kaynatılıp soğutularak tekrar test edilmesi sonucu netleştirebilir. b. Testin yeniden enzim solüsyonunda daha küçük inokülasyon ile hazırlanılarak tekrarlanması sonucu netleştirebilir. c. Saf kültürlerin izole edilebilmesi için alt kültürlerinin oluşturulması sonucu netleştirebilir. 4. Reaktiflerin hiçbiriyle aglütinasyon oluşmaması, test kültüründe grup A, B, C, D, F ve G den hiçbirinin bulunmadığını veya test hassasiyetinin altında bir sayıda bulunduklarını gösterir. a. Özellikle D ve F grubu şüphesi varsa daha fazla inokülasyonla testi tekrar ekmek gerekmektedir. b. Gruplanamayan beta-hemolitik Streptokoklar için eğer gerekliyse, biyokimyasal testler ile identifikasyon yapılabilir.
β- Hemolozis ile İlişkili Koloniler Tek reaktif için oluşan aglütinasyon, grup B veya grup D için güvenilir identifikasyon sonucu verirken, eğer sonuç grup A, C, F veya G ise bu grupların identifikasyonu için yeterli olmayabilir ve diğer doğrulama metodlarının uygulanması gerekebilir. D grubu suşları için, D grubu Streptokoklardan Enterococcus türlerini ayırmak amaçlı biyokimyasal test yapınız.