Çocukluk Çağı Lösemilerinde Minimal Kalıntı

Çocukluk Çağı Lösemilerinde Minimal Kalıntı Hastalık Ebru TUĞRUL SARIBEYOĞLU *, Günter HENZE ** Çocukluk Çağı Lösemilerinde Minimal Kalıntı Hastalık Akut lösemi hastalarında minimal kalıntı hastalığın takibi erken tedavi cevabının değerlendirilmesine ve relapsın saptanmasına olanak sağlamaktadır. Akut lenfoblastik lösemide MRD tayini için antijenreseptör genlerin PCR ile amplifikasyon yöntemi ve akım sitometri kullanılabilirken akut myeloid lösemide günümüzde MRD takibi için sadece akım sitometre kullanılmaktadır. MRD pozitif hastalarda relaps olasılığının arttığının gösterilmesinden sonra bu hastalara daha yoğun tedaviler öneren tedavi protokolleri oluşturulmaya başlanmıştır. MRD sonuçları hematopoetik kök hücre nakli için en uygun zamanın belirlenmesinde de kullanılabilmektedir. MRD erken dönemde negatifleşen hastalarda tedavi yoğunluğunun azaltılması da araştırılmaktadır. MRD ölçümleri ile ilgili yapılan çalışmalarla tedavi yoğunluğu değiştirme kararının verileceği en uygun ölçüm zamanlaması, klinik önemi olan MRD düzeyinin belirlenmesi ve ölçüm için etkin ve maliyeti uygun yöntemin belirlenmesi mümkün olacaktır. MRD takibinin kliniğe kazandırdığı bilgilerin dışında in vivo ilaç direncinin moleküler ve hücresel mekanizmalarının anlaşılmasında da ışık tutacaktır. Lösemide yeni markerların belirlenmesi, nadir hücrelerin ileri teknolojiler ile tespit edilmesi MRD nin rutin monitörize edilmesini, böylece ilaçlara dirençli lösemik hücrelerin özelliklerinin saptanmasını sağlayacaktır. Anahtar kelimeler: Lösemi, çocukluk çağı, minimal kalıntı hastalık Minimal Residual Disease in Childhood Leukemias In patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL), monitoring of minimal residual disease (MRD) offers a way to precisely assess early treatment response and detect relapse. In acute lymphoblastic leukaemia (ALL), the most useful MRD assays are based on polymerase chain reaction (PCR) amplification of antigen-receptor genes, and of flow cytometric detection of abnormal immunophenotypes. The latter is the only MRD assay available for most patients with acute myeloid leukaemia (AML). Because of the strong correlation between MRD levels and risk of relapse, several ongoing regimens include treatment intensification for children wtih higher MRD. Results of MRD studies can be also used to estimate the optimal timing for hematopoeietic stem cell transplantation. Treatment de-intensification for patients with early MRD clearance is also being tested. Practical issues in the implementation of MRD assays in clinical studies include determining the most informative time point to study MRD and the levels of MRD that will trigger changes in treatment intensity, as well as the relative cost and informative power of different methodologies. In addition to their direct clinical application, MRD measurements can be used to better unterstand the molecular and cellular mechanisms of drug resistance in vivo. The identification of new markers of leukaemia and the use of increasingly sophisticated technologies for detection of rare cells should further facilitate routine monitoring of MRD and elucidate the features of drug-resistant leukaemic cells. Key words: Leukemia, childhood, minimal residual disease Son yıllarda kemoterapi protokollerinin yoğunlaştırılması, daha iyi destek tedavilerinin düzenlenmesi ve kemik iliği transplantasyonu (KİT) yapılan hastalarda sağkalımın artmasıyla pediatrik akut lenfoblastik lösemi (ALL) hastalarının yaklaşık % 80 inde uzun dönem hastalıksız sağkalım mümkün olmaktadır (1). Tüm bu başarılı sonuçlara rağmen ALL de erken relaps yapan ve bu nedenle tedavi edilemeyen % 20 lik bir hasta grubu vardır. Günümüzde özellikle bu hasta grubunun belirlenmesi, bu hasta grubuna yönelik daha yoğun tedavilerin planlanması pediatrik hematoloji çalışmalarının büyük kısmını oluşturmaktadır. Pediatrik lösemilerde hastanın remisyona girmesi prognozu etkileyen en önemli bağım- * İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi, Çocuk Hematoloji Onkoloji Bilim Dalı, Uzm. Dr. **Berlin Charite Üniversitesi, Virschow Kampüsü, Çocuk Hematoloji-Onkoloji Bölümü, Prof. Dr. 17

sız risk faktörüdür. İster akut lenfoblastik lösemi (ALL) ister akut nonlenfoblastik lösemi (ANLL) olsun, indüksiyon tedavisi ile remisyona girmeyen tüm hastalarda prognoz çok kötüdür. Remisyon sitomorfolojik olarak kemikiliğinde (K.İ.) % 5 den az blast saptanması durumudur. Ancak sitomorfolojik remisyondaki hastalarda bile K.İ nde 1x10 10 blast yükü olabildiği gösterilmiştir (2). Bu nedenle moleküler teknikler kullanılarak sitomorfolojik olarak tanınamayan K.İ. ndeki kalıntı malign hücrelerin belirlenmesi günümüzde çok popüler bir konudur. Minimal kalıntı hastalığın (minimal residual disease-mrd) saptanması ile sitomorfolojik olarak K.İ. nde saptanamayan ama varolan ve relapstan sorumlu olan blast yükünü tanımlamak mümkün olmuştur. Ancak bu bilginin kliniğe ve tedavi protokollerine ne şekilde yansıyacağı halen tartışmalıdır. MRD ölçümünün çok zaman alıcı ve pahalı yöntemler gerektirmesi, standardizasyonunun zor olması yanında değişik tedavi protokolleri ile tedavi edilmekte olan hastalarda MRD ölçümlerinin hangi zamanlarda ve ne sıklıkla yapılacağı, hangi ölçümün klinik öneminin daha fazla olduğu, MRD negatif hastalarda tedavinin azaltılması ve/veya MRD pozitif hastalarda tedavinin yoğunlaştırılması gibi çözüm bekleyen pek çok konu vardır. MRD belirleme yöntemleri B ve T hücrelerinin erken diferansiyasyonu esnasında, immunglobulin (Ig) ve T hücre reseptör (TCR) lerinin germline segmentlerinde (variable [V], diversity [D], ve joining [J]) rearanjmanlar olur. Böylece her lenfosit, Ig ve TCR moleküllerinin değişken bölgelerini kodlayan kendine özgü bir V-D-J kombinasyonundan oluşan gen segmentine sahip olur. Nukleotidlerin V, D, J gen segmentlerindeki bağlanma bölgelerinde rastlantısal insersiyonu veya delesyonu sonucu her lenfositte sadece o lenfosite özgü Ig ve TCR birleşme bölgeleri meydana gelir. Lösemi klonal bir hastalık olduğundan prensip olarak bir hastadaki tüm blast hücreleri aynı Ig ve TCR rearanjman bölgelerine sahiptirler ve bu bölgeler sanki bu hücrelerin parmak izi gibidir. Tanı anında blastlardaki nukleotid sekanslarının tanımlanması ile her hastaya özgü lösemik hücrelerin parmak izi çıkartılmış olur. Bu yöntemle hem lösemi spesifik kromozomal aberasyonların kırılma bölgeleri hem de Ig ve TCR gen rearanjmanları tespit edilir. PCR yöntemleri ile 10 5-10 6 normal hücrede 1 malign hücreyi tanıyacak duyarlılığa ulaşılmaktadır (1,3,4,5). Tanı anında saptanan rearanjmanlar tedavi izlemi sırasında alınan örnekler için hedef sekanslar olarak kullanılırlar. Böylece lösemik klona ait parmak izleri aranarak minimal hastalığın izi sürülür (1). Her hastaya özgü rearanjmanların belirlenmesi ve tedavi boyunca izlenmeleri için hücre kültürü sistemleri, floresan in situ hibridizasyon (FISH) yöntemleri, Southern blotting, immunfenotipleme, akım sitometrisi ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) teknikleri ve kombinasyonları kullanılır. MRD izleminde en can alıcı nokta klonal rearanjmanların tedavi sürecinde klonal stabilitelerini koruyup korumamalarıdır. Stabil olmayan klonlar söz konusu olduğunda yanlış negatif MRD bulma olasılığı yükselmektedir. Bu nedenle en az iki primer ile MRD tayini yapılmalıdır (2). 18

ALL hastalarında kullanılabilecek, tüm ALL lerde sık görülen, yanlış negatif sonuç oranını en aza indirecek çeşitli PCR primer ları geliştirilmiştir (2). RQ-PCR analizinin duyarlılığı rearanjmanının tipine, birleşme bölgesinin büyüklüğüne ve DNA miktarına göre değişkenlik gösterir. MRD tayininde akım sitometrisi de kullanılabilmektedir. Akım sitometrisi yönteminde malign hücreler tarafından eksprese edilen immunofenotipik kombinasyonlar aranmaktadır. Malign hücreler florokromlarla işaretlenmiş spesifik monoklonal antikorlar ile inkübe edildikten sonra sitometre aracılığıyla sayılmaktadırlar. Bu yöntem ile 10 4 normal hücrede 1 malign hücreye kadar duyarlılıkla sayım yapılabilmektedir. Akım sitometrisi ile PCR yöntemlerini karşılaştıran çalışmalar iki yöntem arasında özgüllük ve duyarlılık açısından büyük fark olmadığını, bu konuda merkezin deneyiminin çok önemli bir kriter olduğunu göstermektedir (1,6,7,8). Akım sitometrisi daha ucuz ve daha az zaman alıcı bir yöntem olmakla birlikte standardizasyonu büyük bir sorun oluşturmaktadır. Özellikle çok merkezli çalışmalarda sonuçlar merkezin deneyimine göre değişkenlik gösterdiğinden akım sitometrisi yönteminin daha kesin standardizasyon basamaklarına ihtiyacı olduğu öngörülmektedir (1,6,7,8,9). MRD ölçümünde standardizasyon en önemli sorundur. Yapılan multisentrik çalışmalarda tüm laboratuarların aynı özgüllük ve duyarlılıkla çalışabilmesi için yöntemlerin standardizasyonu her aşamada kontrol edilmelidir. 2002 yılında kurulan Avrupa MRD çalışma grubunda (ESG-MRD-ALL) Avrupa, Avustralya ve Singapurdan 30 dan fazla merkez bulunmaktadır. Bu laboratuarlar kalite kontrolü amacıyla yılda 2 kez birbirlerinin örneklerinin kör olarak çalışmakta, bir araya gelmekte ve sonuçlarını toplu olarak değerlendirmektedirler. Bir çok çalışma ALL de tedavi yanıtının belirlenmesinde en duyarlı yöntemin MRD olduğunu göstermiştir. Ayrıca tedavi yanıtı prognoz ile direkt ilişkili olduğundan prognozun belirlenmesinde de çok yardımcı bir yöntemdir (4,10). Remisyon indüksiyonunun herhangi bir fazında 10-2 blastı olan hastalarda relaps riski çok fazladır, bu hastalarda erken dönemde transplantasyon gündeme gelmelidir (4). Sorun <10-2 blastı olan hastalardır, çünkü bu gruptaki hastalarda sağkalımı arttırmak için yapılması gereken tedavi seçeneği (tedavi yoğunluğunun arttırılması, tedavi süresinin uzatılması, transplantasyon) halen tartışmalıdır. Bir çok çalışma çocukluk çağı ALL sinde MRD nin prognostik öneminin olduğunu kanıtlamıştır. I-BFM çalışma grubunun çalışmasında hastalar 33. ve 78. günkü MRD sonuçlarına göre 3 risk grubuna ayrılmışlardır. MRD cut off değeri olarak <10-3 kullanılmıştır. Hastaların yaklaşık % 45 i hem 33. hem de 78. günde MRD negatif olduklarından (<10-3 ) düşük risk grubuna girmişlerdir ve bu grup hastalarda 5 yıllık relaps riski % 2 olarak saptanmıştır. Hastaların yaklaşık % 15 inde her iki ölçümde de MRD 10-3 saptanmış ve yüksek risk grubuna alınan bu hastalarda 5 yıllık relaps oranı % 80 bulunmuştur. Bu sonuçlar ışığında halen yürümekte olan AIEOP/BFM ALL 2000 ve DCOG ALL 10 protokollerinde MRD, risk stratifikasyonunda kullanılmaya başlanmıştır (5). ALL de 15. gündeki ve indüksiyon sonundaki MRD ölçümlerinin in vitro prednizolon duyarlılığının da bir göstergesi olduğu saptanmıştır, ancak bu durum vinkristin ve daunorubisin 19

için kanıtlanamamıştır (11). Ayrıca MRD, T ALL ve prekürsör B ALL de tedavi yanıtındaki farklılıkları da göstermektedir (12). Böylelikle T ALL ve pre B ALL de kişiye özel tedavi protokollerinin uygulaması da gündeme gelmektedir (13). Erken relaps yapan ALL hastalarında KİT yapılmaksızın sağkalım çok kötüdür. Bu gruptaki hastalarda MRD sonucu ne olursa olsun nakil önerilmektedir (14,15). ALL REZ BFM çalışma grubu orta risk grubundaki (S2) hastalarda 36. günde bakılan MRD değerinin prognoz ile direkt ilişkisini gösterdiğinden halen yürümekte olan ALL REZ BFM 2002 protokolünde MRD risk stratifikasyonunda ve KİT kararı alınmasında MRD rutin olarak kullanılmaktadır (14). İlginç olarak St Jude ve BFM çalışma gruplarının verdiği sonuçlara göre relaps ALL vakalarında uygulanan protokolden bağımsız olarak MRD prognoz hakkında önemli bilgi vermektedir (16). İzole ekstramedüller relapslarda MRD nin yeri ise halen tartışmalı bir konudur. Çünkü bu hasta grubunda baştaki K.İ tutulumu MRD teknikleri ile bile tanımlanamayabilir. Beyin omurilik sıvısından elde edilen örneklerdeki işaretleyicilerin tedavi sırasında stabilitelerini koruyup koruyamadıkları ve K.İ. relapsını izlemedeki etkinlikleri de henüz kanıtlanmamış bir durumdur (17,18). Hem ALL de hem AML de KİT sonrası MRD tayinleri relapsın erken belirlenmesinde faydalı olabilirler. Ancak sıklıkla nakil sonrası MRD pozitifliği belirlendikten sonraki ilk 8 haftada sitomorfolojik relaps da ortaya çıkmakta olduğundan relapsı erken belirlemenin klinik önemi tartışmalıdır. Bazı çalışmalar postransplant dönemde MRD pozitifliği belirlenir belirlenmez immunsupresyonun azaltılarak graft versus lösemi etkisinin arttırılmasını, donor lenfosit infüzyonu uygulanmasını veya retransplantasyon yapılmasını önermektedirler, ancak bu konuda veri çok azdır (19,20,21,22). Nakil öncesi bakılan MRD nin prognostik önemi ise bir çok çalışmada kanıtlanmıştır. MRD negatifleşmişken nakil yapılan hastalarda sağkalım belirgin olarak daha iyidir (23,24). Nakil öncesi MRD pozitif hastalarda prognozun kötü olması, postransplant kurtarma rejimlerinin çok etkin olmaması nedeni ile nakil öncesi MRD pozitif hastalara nakil işlemi gerçekleşmeden ek tedavilerin verilmesi de gündeme gelebilir (25). Ayrıca standart riskli ALL relaps hastalarında MRD negatif alt gruba nakil gerekliliğinin olmadığı da kanıtlanmıştır (14). AML de MRD nin klinik önemi halen tartışmalıdır. Özellikle MRD ölçümü için en uygun zaman ve en etkin primer en çok tartışılan konudur. AML-BFM çalışma grubunun yaptığı çalışmada MRD tayininin bilinen diğer AML risk faktörleri ile birlikte değerlendirildiğinde klinik gidiş için ek bir bilgi vermediği, ancak 28. gün remisyonun kalitesini belirlemede faydalı olabileceği sonucuna varılmıştır (26). Yüksek risk AML hastalarında çoğu protokol KİT önermektedir. Standart risk grubu hasta- 20

ların yaklaşık % 50 si ise nakil yapılmaksızın uzun dönem yaşam şansı elde etmektedirler. Bu nedenle özellikle standart risk hastalarda nakil ihtiyacı olacakların belirlenmesinde MRD faydalı bir yöntem olabilir (27,28). AML de relaps göstergesi olarak MRD uygulamasında karşılaşılan en büyük sorun AML blastlarının tedavi sırasında ve/veya relaps anında çok fazla antijenik değişikliğe uğramalarıdır. Bu nedenle relaps AML vakalarında başlangışta belirlenenden farklı hedefler seçilmesi gerekli olabilir (29). MRD tayini tüm pediatrik lösemilerde araştırılmaya değer bir konu olarak kalmaktadır. MRD tekniklerinin standardize edilmesi, MRD sonuçlarına göre yapılan protokollerin sonuçlarının elde edilmesi ile yakın gelecekte lösemi tedavisinde kişiye göre tasarlanmış kemoterapi rejimlerinin gündeme gelmesi mümkün olacaktır. KAYNAKLAR 1. Jolkowska J, Derwich K, Dawidowska M. Methods of minimal residual disease (MRD) detection in childhood haematological malignancies. J Appl Genet 2007; 48:77-83. 2. Cazzaniga G, Gaipa G, Rossi V et al. Monitoring of minimal residual disease in leukemia, advantages and pitfalls. Ann Med 2006; 38:512-21. 3. Faderl S, Kurzrock R, Estrov Z. Minimal residual disease in hematologic disorders. Arch Pathol Lab Med 1999; 123:1030-1034. 4. Cazzaniga G, d Aniello E, Corral L et al. Results of minimal residual disease (MRD) evaluation and MRDbased treatment stratification in childhood ALL. Best Pract Res Clin Haematol 2003; 15:623-38. 5. Van der Velden VHJ, Panzer-Grimayer ER, Cazzaniga G, et al. Optimization of PCR based minimal residual disease diagnostics for childhood acute lymphoblastic leukemia in a multicenter setting. Leukemia 2007; 21:706-713. 6. Campana D, Coustan-Smith E. Detection of minimal residual disease in acute leukemia by flow cytometry. Cytometry 1999; 15:139-152. 7. Kerst G, Kreyenberg H, Roth C et al. Concurrent detection of MRD in childhood acute lymphoblastic leukemia by flow cytometry and real time PCR. Br J Hematol 2000; 128:774-782. 8. Neale GA, Coustan-Smith E, Stow P et al. Comparative analysis of flow cytometry and polymerase chain reaction for the detection of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2004; 18:934-938. 9. Von Stackelberg A, Seeger K, Henze G. Clinical significance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia after first relapse. Leukemia 2004; 18:1727-1728. 10. Flohr T, Schrauder A, Cazzaniga G et al. Minimal residual disease-directed risk stratification using realtime quantitative PCR analysis of immunoglobulin and T-cell receptor gene rearrangements in the international multicenter trial AIEOP-BFM ALL 2000 for childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2008; 31 [Epub ahead of print]. 11. Schmiegelow K, Nyvold C, Seyfarth J et al. Post-induction residual leukemia in childhood acute lymphoblastic leukemia quantified by PCR correlates with in vitro prednisolone resistance. Leukemia 2001; 15:1066-1071. 12. Szczepanski T, Orfao A, van der Velden VHJ et al. Minimal residual disease in leukemia patients. The Lancet Oncology 2001; 2:409-417. 13. Willemse MJ, Seriu T, Hettinger K et al. Detection of minimal residual disease identifies differences in treatment response between T ALL and precursor B ALL. Blood 2002; 99:4386-4393. 14. Eckert C, Biondi A, Seeger K et al. Prognostic value of minimal residual disease in relapsed childhood acute lymphoblastic leukemia. Lancet 2001; 358:1239-1241. 15. Coustan-Smith E, Gajjar A, Hijiya N et al. Clinical significance of minimal residual disease in relapsed childhood acute lymphoblastic leukemia after first relapse. Leukemia 2004; 18:499-504. 16. Von Stackelberg A, Seeger K, Henze G. Clinical significance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia after first relapse. Leukemia 2004; 18:1727-1728. 17. Henze G, von Stackelberg A. Treatment of relapsed acute lymphoblastic leukemia. In: Pui CH (ed). Treatment of acute leukemias. New directions for clinical research. Totova, USA:Humana Pres 2002:199-219. 18. Goulden N, Langlands K, Steward C et al. PCR assessment of bone marrow status in isolated extramedullary relapse of childhood B precursor acute lymphoblastic leukemia. Br J Haematol 1994; 87:282-285. 19. Knechtli CJ, Goulden NJ, Hancock JP et al. Minimal residual disease status before allogeneic bone marrow transplantation is an important determinant of successful outcome for children and adolescents with acute lymphoblastic leukemia. Blood 19981; 92:4072-4079. 20. Tamura K, Kanazawa T, Suzuki M et al. Successful rapid discontinuation of immunosuppressive therapy at molecular relapse after allogeneic bone marrow transplantation in a pediatric patient with myelodysplastic syndrome. Am J Hematol 2006; 81:139-141. 21. Schilham M.W, Balduzzi A, Bader P. On behalf of the PD-WP of the EBMT. Is there a role for minimal residual 21

disease levels in the treatment of ALL patients who receive allogeneic stem cells? Bone Marrow Transplant. 2005; 35:49-52. 22. Izraeli S, Waldman D. Minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia: current status and challenges. Acta Haematol 2004; 112:34-39. 23. Goulden NJ, Bader P, van der Velden V et al. On behalf of the ESG on MRD. MRD prior to allogeneic SCT. Br J Hematol 2003; 122:24-29. 24. Sramkova L, Muzikova K, Fronkova E et al. Detectable minimal residual disease before allogeneic hematopoietic stem cell transplantation predicts extremely poor prognosis in children with acute lymphoblastic leukemia Pediatr Blood Cancer 2007; 48:93-100. 25. Bader P, Hancock J, Kreyenberg H et al. Minimal residual disease status prior to allogeneic stem cell transplantation is a powerful predictor for posttransplant outcome in children with ALL. Leukemia 2002; 16:1668-1672. 26. Langebrake C, Creutzig U, Dworzak M et al. Residual disease monitoring in childhodd acute myeloid leukemia by multiparameter flow cytometry: The MRD AML BFM Study Group. J Clin Oncol 2006; 24:3686-3692. 27. Goulden N, Virgo P, Grimwalde D et al. Minimal residual disease directed therapy for childhood acute myeloid leukemia; the time is now. Br J Hematol 2006; 134:273-282. 28. Sievers EL, Lange BJ, Alonzo TA et al. Immunophenotypic evidence of leukemia after induction therapy predicts relapse:results from a prospective Children s Cancer Group study of 252 patients with acute myeloid leukemia. Blood 2003; 101:3398-3406. 29. Langebrake C, Brinkmann I, Teigler-Schlegel A. Immunophenotypic differences between diagnosis and relapse in childhood AML: Implications for MRD monitoring. Cytometry B Clin Cytom 2005; 63:1-9. 22