ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ Süleyman BAYRAM CHEK2 GENİNDEKİ MUTASYONLAR İLE HEPATOSELÜLER KANSER VE KOLOREKTAL KANSER ARASINDAKİ İLİŞKİNİN ARAŞTIRILMASI BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2010

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ CHEK2 GENİNDEKİ MUTASYONLAR İLE HEPATOSELÜLER KANSER VE KOLOREKTAL KANSER ARASINDAKİ İLİŞKİNİN ARAŞTIRILMASI Süleyman BAYRAM DOKTORA TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Bu Tez 31/5/2010 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/ Oyçokluğu ile Kabul Edilmiştir......... Prof.Dr.Mehmet TOPAKTAŞ Prof.Dr.Hikmet AKKIZ Prof. Dr. Salih KAFKAS Danışman 2. Danışman Üye...... Prof.Dr.Eyyüp RENCÜZOĞULLARI Üye..... Prof. Dr. Gökhan CORAL Üye Bu Tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL Enstitü Müdürü Bu Çalışma Ç. Ü. Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: FEF2008D4 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

ÖZ DOKTORA TEZİ CHEK2 GENİNDEKİ MUTASYONLAR İLE HEPATOSELÜLER KANSER VE KOLOREKTAL KANSER ARASINDAKİ İLİŞKİNİN ARAŞTIRILMASI Süleyman BAYRAM ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ 2. Danışman : Prof. Dr. Hikmet AKKIZ Yıl: 2010, Sayfa: 161 Jüri : Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ : Prof. Dr. Hikmet AKKIZ : Prof. Dr. Salih KAFKAS : Prof. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI : Prof. Dr. Gökhan CORAL Hücre döngüsü kontrol noktası kinaz 2 (CHEK2) proteini çok çeşitli hücre tiplerinde DNA hasarı yanıtına katılır. Bu yüzden farklı kanser türlerine yatkınlığın belirlenmesi için bu protein genindeki mutasyonların saptanması önemlidir. CHEK2 genindeki mutasyonlar (I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC) serin/treonin kinaz aktivitesini bozar ve bu mutasyonlar çeşitli türdeki kanserler ile ilişki gösterir. Bu çalışmada, CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının Türk populasyonunda hepatoselüler ve kolorektal kanser gelişiminde önemli bir rol oynayıp oynamadıklarının araştırılması amaçlanmıştır. Toplam 210 kolorektal kanserli vaka, 165 hepatoselüler kanserli vaka ve 446 sağlıklı kontrolde CHEK2 gen mutasyonları PCR-RFLP ve ARMS-PCR metotları ile araştırılmıştır. Kolorektal kanserli, hepatoselüler kanserli ve sağlıklı kontrollerin hiçbirinde CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonları saptanmamıştır. Türk populasyonunda, CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonları yok veya çok seyrek olabilir ve bunun yanında hepatoselüler ve kolorektal kanser oluşumu üzerine bir katkıları olmayabilir. Sonuç olarak, bu çalışma sonuçları doğrultusunda Türk populasyonunda CHEK2 mutasyonlarının klinik olarak genotiplendirilmesinin gerekmediği ortaya çıkmıştır. Anahtar Kelimeler: CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonları, Hepatoselüler kanser, Kolorektal kanser, Türk populasyonu. I

ABSTRACT Ph. D. THESIS INVESTIGATION ON THE RELATION OF THE MUTATIONS IN CHEK2 GENE TO HEPATOCELLULAR AND COLORECTAL CANCERS Süleyman BAYRAM DEPARTMENT OF BIOLOGY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisors :Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ :Prof. Dr. Hikmet AKKIZ Year: 2010, Pages: 161 Jury :Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ :Prof. Dr. Hikmet AKKIZ :Prof. Dr. Salih KAFKAS :Prof. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI :Prof. Dr. Gökhan CORAL The cell cycle checkpoint kinase 2 (CHEK2) protein participates in the DNA damage response in many cell types. Therefore to determine the susceptibility to various cancer types it is important to detect mutations in this protein coding gene. Germline mutations in CHEK2 (I157T, IVS2 + 1 G>A and 1100delC) impair serine/threonine kinase activity and these mutations are associated with a range of cancer types. This study aimed to investigate whether CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A and 1100delC mutations play an important role in the development of hepatocellular and colorectal carcinomas in Turkish population. A total of 210 colorectal cancer cases, 165 hepatocellular cancer cases and 446 healthy controls were investigated for CHEK2 mutations by PCR-RFLP and ARMS-PCR methods. None of the colorectal cancer cases, hepatocellular cancer cases and healthy controls carried the CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A and 1100delC mutations. In conclusion, our results show that CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A and 1100delC mutations may be absent or be very infrequent and may not contribute to the predisposition for hepatocellular and colorectal carcinomas in Turkish population. Overall, our data suggest that genotyping of CHEK2 mutations in clinical settings in the Turkish population should not be recommended. Key words: CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A and 1100delC mutations, Hepatocellular cancer, Colorectal cancer, Turkish population II

TEŞEKKÜR Çalışmamın her aşamasında yardımlarını esirgemeyen yapıcı ve yönlendirici fikirleri ile bana daima yol gösteren öğrencileri olmaktan mutluluk duyduğum danışman hocalarım Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ a ve Prof. Dr. Hikmet AKKIZ a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Doktora Tez İzleme Komitesi üyesi Sayın Prof. Dr. Salih KAFKAS a ve Prof. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI na çalışmamın tüm aşamalarında yönlendirici ve olumlu katkılarından dolayı teşekkür ederim. Doktora tezi jüri üyesi Sayın Prof. Dr. Gökhan CORAL a yapıcı ve yönlendirici fikirleriyle katkıda bulunduğu için teşekkürlerimi sunarım. Bütün çalışmalarımda, her konuda çok büyük yardımlarını gördüğüm Ç.Ü. Tıp Fakültesi Dahiliye Gastroenteroloji Moleküler Biyoloji laboratuvarı sorumlusu Sağlık Teknikeri Aynur BEKAR a ve Kimyager Ersin AKGÖLLÜ ye teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca tez çalışmalarım sırasında yardımlarını gördüğüm, Uzman Dr. Burhan ÖZDİL, Uzman Dr. Banu KARA, Dr. Ahmet Taner SÜMBÜL ve Dr. Havva YEŞİL e teşekkürlerimi sunarım. Kalıtsal CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonları bulunan ve çalışmamızda pozitif kontrol olarak kullanılan bireylerin biyolojik materyallerini (DNA ve periferik kan) gönderen Dr. Heli NEVANLINNA (Finlandiya), Dr. Cezary CYBULSKI (Polonya), Dr. Natalia BOGDANOVA (Almanya), Dr. Børge G. NORDESTGAARD (Danimarka) ve Dr. Darina V. KONSTANTINOVA a (Bulgaristan) en içten teşekkürlerimi sunarım. Doktora çalışmalarım esnasında tüm bölüm olanaklarından yararlanmamı sağlayan Ç.Ü. Tıp Fakültesi İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı çalışanlarına ve projemize maddi destek veren Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi ne (Proje no: FEF2008D4) teşekkürlerimi sunarım. Çalışmalarım sırasında bana her zaman destek olan sevgili aileme sonsuz teşekkürlerimi sunarım. III

İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ... I ABSTRACT... II TEŞEKKÜR... III İÇİNDEKİLER... IV ÇİZELGELER DİZİNİ... XI ŞEKİLLER DİZİNİ... XII SİMGELER VE KISALTMALAR... XIV 1.GİRİŞ... 1 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR... 15 2.1. CHEK2 Mutasyonlarının Akciğer Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar... 15 2.2. CHEK2 Mutasyonlarının Beyin Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar... 16 2.3. CHEK2 Mutasyonlarının Böbrek Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar... 16 2.4. CHEK2 Mutasyonlarının Kolorektal Kanser Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar... 16 2.5. CHEK2 Mutasyonlarının Li-Fraumeni Sendromu Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar... 21 2.6. CHEK2 Mutasyonlarının Lösemi Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar... 22 2.7. CHEK2 Mutasyonlarının Meme Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar... 22 2.8. CHEK2 Mutasyonlarının Melanoma Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar... 40 2.9. CHEK2 Mutasyonlarının Mesane Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar... 41 2.10. CHEK2 Mutasyonlarının Ovaryum Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar... 41 IV

2.11. CHEK2 Mutasyonlarının Özefagus Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar... 42 2.12. CHEK2 Mutasyonlarının Pankreas Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar... 43 2.13. CHEK2 Mutasyonlarının Prostat Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar... 43 2.14. CHEK2 Mutasyonlarının Rahim Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar... 46 2.15. CHEK2 Mutasyonlarının Tiroit Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar... 46 2.16. CHEK2 Genindeki Mutasyonların Çeşitli Kanserlerin Oluşumuyla İlişkisini Araştıran Çalışmalardan Elde Edilen Sonuçların Toplu Değerlendirilmesi... 46 3. MATERYAL ve METOD... 49 3.1. Hasta ve Kontrol Grubu... 49 3.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Deney Ekipmanları... 50 3.2.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler... 50 3.2.1.1.Agaroz (Sigma)... 50 3.2.1.2. Etil Alkol (Merck)... 51 3.2.1.3. İzopropanol (Sigma)... 51 3.2.1.4. Ksilol (Merck)... 52 3.2.1.5. Mineral Yağ (Sigma)... 52 3.2.1.6. Brom Fenol Mavisi (Sigma)... 53 3.2.1.7. Ksilen Siyanol FF (Sigma)... 53 3.2.1.8. Gliserol (Sigma)... 54 3.2.1.9. Trizma-Baz (Sigma)... 55 3.2.1.10. Etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) (Sigma)... 55 3.2.1.11. Borik Asit (Sigma)... 55 3.2.1.12. Suyla Hazırlanmış % 1 lik Etidyum Bromür Çözeltisi (Merck)... 56 3.2.1.13. DNA Polimeraz Enzimi (Fermentas)... 57 V

3.2.1.14. Deoksiribonükleosid Trifosfat Seti (dntp)(promega)... 57 3.2.1.15. DNA Marker (Promega)... 58 3.2.1.16. CHEK2 I157T Mutasyonun Analizinde Kullanılan Primer Çifti... 59 3.2.1.17. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonun Analizinde Kullanılan Primer Çifti... 60 3.2.1.18. CHEK2 1100delC Mutasyonun Analizinde Kullanılan Primer Çiftleri... 60 3.2.1.19. DNA İzolasyon Kiti (Roche)... 62 3.2.1.20. PstI Restriksiyon Endonükleaz (New England Biolabs)... 63 3.2.1.21. Hyp188III Restriksiyon Endonükleaz (New England Biolabs)... 64 3.1.2. Kullanılan Deney Ekipmanları... 66 3.2.2.1. Santrifüjler... 66 3.2.2.2. Derin Dondurucular... 66 3.2.2.3. Steril Kabin... 66 3.2.2.4. Polimeraz Zincir Reaksiyon Aleti (Termal Cycler)... 66 3.2.2.5. Vorteks Aleti... 67 3.2.2.6. Kuru Isıtıcı... 67 3.2.2.7. Hasas Terazi... 67 3.2.2.8. Manyetik Isıtcı ve Karıştıcı... 67 3.2.2.9. Buzdolabı... 68 3.2.2.10. Jel Elektroforez Sistemi... 68 3.2.2.11. Jel Görüntüleme Sistemi... 68 3.2.2.12. Jel Analiz Sistemi... 68 3.2.2.13. Otomatik Mikropipetler... 68 3.3. DNA İzolasyonu... 69 3.3.1. Periferik Kandan DNA İzolasyonu... 69 3.3.2. Parafine Gömülü Kolorektal Kanser Dokusundan DNA İzolasyonu... 70 3.4. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)... 72 VI

3.5. Agaroz Jel Elektroforezi... 75 3.5.1. % 2.5 lik Agaroz Jelin Hazırlanması... 75 3.5.2. PCR, PCR-RFLP ve ARMS-PCR Örneklerinin Jele Konması ve Elektroforez... 75 3.6. CHEK2 I157T Mutasyonun PCR-RFLP Yöntemi ile Belirlenmesi... 76 3.6.1. CHEK2 I157T Mutasyonunu Saptamak Amacıyla Bu Mutasyonun Olabileceği DNA Bölgesinin PCR ile Çoğaltılması... 76 3.6.2. CHEK2 I157T Mutasyonunun Bulunabileceği Bölgenin PCR İşlemi Sonucunda Görüntülenmesi... 79 3.6.3. CHEK2 I157T Mutasyonunun Olup Olmadığını Belirlemek İçin RFLP Analizi.... 80 3.7. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonun PCR-RFLP Yöntemi ile Belirlenmesi... 84 3.7.1. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunu Saptamak Amacıyla Bu Mutasyonun Olabileceği DNA Bölgesinin PCR ile Çoğaltılması... 84 3.7.2. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun Bulunabileceği Bölgenin PCR İşlemi Sonuçunda Görüntülenmesi... 87 3.7.3. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun Olup Olmadığını Belirlemek İçin RFLP Analizi... 88 3.8. CHEK2 1100delC Mutasyonun Allele Özgü Mutasyon Belirleme Yöntemi ile Belirlenmesi... 91 3.8.1. CHEK2 1100delC Mutasyonu İçin PCR İşlemi... 94 3.8.2. CHEK2 1100delC Mutasyonunun Analizinin Agaroz Jel Elektrofez ile Analizi... 97 3.9. İstatistiksel Analizler... 101 4. BULGULAR... 103 4.1. Çalışma Gruplarını Oluşturan Bireylerin Genel Bilgileri... 103 4.1.1. Kontrol Çalışma Grubunu Oluşturan Bireylerin Genel Bilgileri... 103 4.1.2. Kolorektal Kanser Çalışma Grubunu Oluşturan Bireylerin VII

Genel, Klinik ve Patolojik Bilgileri... 103 4.1.3. Hepatoselüler Kanser Çalışma Grubunu Oluşturan Bireylerin Genel ve Klinik Bilgileri... 107 4.2. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC Mutasyon Sıklıklarının Dağılımları... 109 4.2.1. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında CHEK2 I157T Mutasyonunun (Nokta Mutasyonu) Sıklığı... 110 4.2.2. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında CHEK2 IVS2 + 1 G>A Mutasyonunun (Nokta Mutasyonu) Sıklığı... 112 4.2.3. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında CHEK2 1100delC Mutasyonunun (Bir Nükleotid Delesyonu Sonucu Oluşan Çerçeve Kayması Mutasyonu) Sıklığı... 114 5. TARTIŞMA... 117 5.1. CHEK2 Mutasyonlarının Türk Populasyonununda Kolorektal Kanser Oluşumu Üzerine Etkileri... 117 5.2. CHEK2 Mutasyonlarının Türk Populasyonununda Hepatoselüler Kanser Oluşumu Üzerine Etkileri... 126 6. SONUÇ ve ÖNERİLER... 139 KAYNAKLAR... 141 ÖZGEÇMİŞ... 161 VIII

ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 2.1. CHEK2 Genindeki Mutasyonların Çeşitli Kanserlerle İlişkisi... 47 Çizelge 3.1. CHEK2 Genindeki I157T Mutasyonunu Saptamak İçin Kullanılan Primerlerin Uzunlukları, Erime sıcaklıkları, GC Oranı ve Baz Dizisi... 59 Çizelge 3.2. CHEK2 Genindeki IVS2 + 1G>A Mutasyonunu Saptamak İçin Kullanılan Primerlerin Uzunlukları, Erime sıcaklıkları, GC Oranı ve Baz Dizisi... 60 Çizelge 3.3. CHEK2 Genindeki 1100delC Mutasyonunu Saptamak İçin Kullanılan Primerlerin Uzunlukları, Erime Sıcaklıkları, GC Oranları ve Baz Dizileri... 62 Çizelge 3.4. CHEK2 I157T Mutasyonunun Olabileceği Bölgenin Çoğaltılmasında Kullanılan Primerlerin CHEK2 Geni Üzerindeki Konumları ve Mutasyonun Meydana Geldiği Nükleotid... 77 Çizelge 3.5. CHEK2 I157T Mutasyonunu Saptamak Amacıyla Optimum Amplifikasyonun Gerçekleştirildiği PCR Reaksiyon Karışımı... 79 Çizelge 3.6. CHEK2 I157T Mutasyonu İçin PCR Sıcaklıkları ve Döngü Sayıları... 79 Çizelge 3.7. PstI Restriksiyon Enziminin Tanıma Bölgesi ve CHEK2 I157T Mutasyonuna Neden Olan Nükleotid... 81 Çizelge 3.8. CHEK2 I157T Mutasyonunun Olup Olmadığını Belirlemek İçin RFLP Reaksiyon Karışımı... 82 Çizelge 3.9. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun Olabileceği Bölgenin Çoğaltılmasında Kullanılan Primerlerin CHEK2 Geni Üzerindeki Konumları ve CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonun Meydana Geldiği Nükleotid...85 Çizelge 3.10. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunu Saptamak Amacıyla Optimum Amplifikasyonun Gerçekleştirildiği PCR Reaksiyon Karışımı... 86 IX

Çizelge 3.11. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonu İçin PCR Sıcaklıkları ve Döngü Sayıları... 87 Çizelge 3.12. Hyp188III Restriksiyon Enziminin Tanıma Bölgesi ve IVS2 + 1G>A Mutasyonuna Neden Olan Nükleotid... 89 Çizelge 3.13 CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun Belirlenmesi İçin RFLP Reaksiyon Karışımı... 90 Çizelge 3.14. CHEK2 1100delC Mutasyonunun Bulunmaması Durumunda DNA Amplifikasyonu Oluşturabilecek Primerlerin CHEK2 Geni Üzerindeki Konumları ve 1100delC Mutasyonunun Oluşmasına Neden Olan Nükleotid... 93 Çizelge 3.15. CHEK2 1100delC Mutasyonunun Bulunması Durumunda DNA Amplifikasyonu Oluşturabilecek Primerlerin CHEK2 Geni Üzerindeki Konumları... 94 Çizelge 3.16. SLC30A9 Genine Özgü Primerlerin SLC30A9 Geni Üzerindeki Konumları... 94 Çizelge 3.17. CHEK2 1100delC Mutasyonunun Bulunması Durumunda DNA Amplifikasyonu Ouşturabilecek Optimum PCR Reaksiyonu Karışımı... 96 Çizelge 3.18. CHEK2 1100delC Mutasyonunun Bulunmaması Durumunda DNA Amplifikasyonu Oluşturabilecek Optimum PCR Reaksiyonu Karışımı... 97 Çizelge 3.19. CHEK21100delC Mutasyonu İçin PCR Sıcaklıkları ve Döngü Sayıları... 97 Çizelge 4.1. Kolorektal Kanser ve Kontrol Çalışma Grubundaki Bireylerin Genel, Klinik ve Patolojik Bilgiler... 104 Çizelge 4.2. Hepatoselüler Kanser ve Kontrol Çalışma Grubundaki Bireylerin Genel, Klinik ve Patolojik Bilgileri... 108 Çizelge 4.3. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC Mutasyon Sıklıklarının Dağılımları... 112 X

Çizelge 5.1. Farklı Populasyonlarda CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC Mutasyonlarının Sağlıklı Bireylerde Sıklıkları... 120 Çizelge 5.2. Farklı Populasyonlardan Meme Kanserli ve Kontrol Bireylerinde CHEK2 1100delC Mutasyonunun Sıklığı...... 129 XI

ŞEKİLLLER DİZİNİ SAYFA Şekil. 1.1. DNA-Hasarı Kontrol Noktası Yolağında Sinyal İletiminin Kavramsal Organizasyonu... 2 Şekil 1.2. İnsan CHEK2 Proteininin Yapısı ve Aktivasyon Noktaları... 4 Şekil 1.3. CHEK2 Proteininin Aktivasyon Modeli...4 Şekil 1.4. DNA-hasarı Kontrol Noktası Yolağının Şematik Görünümü... 5 Şekil 1.5. CHEK2 Geninin Yapısı... 7 Şekil 1.6. CHEK2 Geni İçersinde Bu Güne Kadar Tanımlanmış Mutasyonlar... 8 Şekil 1.7. CHEK2 IVS2 + 1 G>A Mutasyonu Sonucu Oluşan Anormal İlmek...10 Şekil 3.1. CHEK2 I157T Mutasyonunun Olabileceği DNA Bölgesinin PCR Reaksiyonu İle Çoğaltılması Sonucu Oluşan DNA Parçasının %2.5 lik Agaroz Jeldeki Görüntüsü...... 80 Şekil 3.2. CHEK2 I157T Mutasyonunun RFLP Yöntemi İle Genotiplendirilmesi Sonucu Oluşan DNA Parçalarının % 2.5 luk Agaroz Jeldeki Görüntüsü... 84 Şekil 3.3. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun Olabileceği DNA Bölgesinin PCR Reaksiyonu İle Çoğaltılması Sonucu Oluşan DNA Parçasının %2.5 lik Agaroz Jeldeki Görüntüsü... 88 Şekil 3.4. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun RFLP Yöntemi İle Genotiplendirilmesi Sonucu Oluşan DNA Parçalarının %2.5 lik Agaroz Jeldeki Görüntüsü... 91 Şekil 3.5. CHEK2 1100delC Mutasyonunun ARMS-PCR Yöntemi İle Genotiplendirilmesi Sonucu Oluşan DNA Parçalarının %2.5 lik Agaroz Jeldeki Görüntüsü... 100 Şekil 4.1. Kalın Bağırsağın Bölümleri... 105 Şekil 4.2. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında CHEK2 I157T Mutasyonunun RFLP Yöntemi İle Genotiplendirilmesi... 111 XII

Şekil 4.3. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında CHEK2 IVS2 + 1 G>A Mutasyonunun RFLP Yöntemi İle Genotiplendirilmesi... 113 Şekil 4.4. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında CHEK2 1100delC Mutasyonunun ARMS-PCR Yöntemi İle Genotiplendirilmesi... 115 Şekil 5.1. Kolorektal Kanser Gelişiminde Adenom-Karsinom Geçişine Eşlik Eden Değişiklikler... 123 Şekil 5.2. Avrupa Kökenli Meme Kanserli Hastalarda CHEK2 1100delC Mutasyonunun Sıklığı... 128 Şekil 5.3. Genetik Anormallikler Sonucu Oluşan Monogenik Ve Poligenik Sendromlar İle Hepatoselüler Kanser Oluşumu Arasındaki İlişki.... 134 Şekil 5.3. Hepatoselüler Karsinogenezisin Oldukça Kompleks Ve Çok Basamaklı Süreci... 135 Şekil 5.4. Hepatoselüler Karsinomaya Bireysel Yatkınlık Modeli.... 138 XIII

SİMGELER ve KISALTMALAR AATF :Apoptosis antogonizing transcription factor ARMS-PCR :Amplifikasyon Refrakter Mutasyon Sistemi-Polimeraz Zincir Reaksiyonu ATM :Ataxia telangiectasia mutated ATR :Ataxia telangiectasia mutated and Rad3-related bç :baz çifti C :Santigrat derece BRCA1 :Breast cancer 1 BRCA2 :Breast cancer 2 BSA :Bovin serum albümin CDC25A :Cell division cycle 25 homolog A CDC25C :Cell division cycle 25 homolog C CHEK2 :Checkpoint kinase 2 CHEK2 1100delC :CHEK2 geninin 1100. pozisyonunda bulunan sitozin nükleotidinin delesyonu mutasyonu CHEK2 I157T :CHEK2 proteininin FHA bölgesi içersinde bulunan 157. kodonun belirlediği izolösin (I) aminoasitinin treonin (T) aminoasitine dönüşümüne neden olan mutasyon CHEK2 IVS2+1G>A :CHEK2 geninin 2. intronunun ilk nükleotidinde meydana gelen, guanin (G) nükleotidinin adenin (A) nükleotidine dönüşümü şeklindeki transisyon tipi nokta mutasyonu DNA :Deoksiribonükleik asit dntp :Deoksiribonükleosid trifosfat E2F1 :E2F transcription factor 1 EDTA :Etilendiamintetraasetik asit FHA :Forkhead e benzer bölge FOXM1 :Forkhead box M1 gr :gram HPLC :Yüksek performanslı sıvı kromatografisi XIV

Hyp188III :Helicobacter pylori 188 III MDM2 :Mouse double minute 2 MgCI 2 :Magnezyum klorür MRE11 :Meiotic recombination 11 NBS1 :Nibrin NCBI :National Center for Biotechnology Information NLS :Nükleer lokalizasyon sinyal bölgesi PCR : Polimeraz Zincir Reaksiyonu PCR-RFLP :Polimeraz Zincir Reaksiyonu-Restriksiyon Fragmenti Uzunluk Polimorfizmi ph :Hidrojen iyonu konsantrasyonu PML :Promyelocytic leukemia PstI :Providencia stuartii I RE :Restriksiyon endonükleaz SLC30A9 :Solute Carrier Family 30 (zinc transporter), member 9 SQ/TQ :Serin:Glutamin/Treonin:Glutamin bölgesi T (Thr) :Treonin TBE :Tris Borik EDTA çözeltisi Tm :Primerin erime (Melting) sıcaklığı TP53 :Tümör protein 53 I (Ile) :İzolösin XRCC1 :X-ray repair cross complementing protein 1 XV

1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM 1. GİRİŞ Hücreler DNA ya zarar veren endojen (reaktif oksijen türevleri, DNA replikasyon hatası) ve ekzojen (genotoksik kimyasallar, ultraviyole radyasyon, radyoterapötik ve kemoterapötik ajanlar) stresler tarafından sürekli tehdit altındadırlar (Ahn ve ark., 2004). Bu streslere karşı DNA doğru bir şekilde korunamaz ise DNA da meydana gelen hasarlar genomik yapının bozulmasına ve nesilden nesile genetik bilginin doğru bir şekilde aktarılamamasına neden olur (Bartek ve ark., 2001). Genetik bilginin bütünlüğü, DNA ya zarar veren bu streslerden hücre döngüsü sırasında karmaşık protein haberleşme ağları ile korunur (Antoni ve ark., 2007). Bu haberleşme ağları ile hücre döngüsü durdurulur ve DNA tamir mekanizmaları aktiflenir. Eğer DNA tamiri gerçekleştirilemez ise hücre yaşlanır veya ölür. Evrim süresi boyunca organizmalar DNA hasarına yanıt verebilecek ve DNA hasarını tamir edebilecek çok sayıda haberleşme ağları edinmişlerdir (Bartek ve ark., 2001). Bu haberleşme ağlarından biri olan DNA-hasarı kontrol noktası yolağı hücrenin genomik bütünlüğünü koruyan ve organizmada tümör gelişimini engelleyen hücresel bir denetim sistemidir (Bartek ve Lukas, 2007). Bu kontrol noktası yolağı DNA hasarını algılayabilmekte ve hücre döngüsü düzenleyicilerinin aktivitelerini inhibe ederek hücre döngüsünü durdurabilmektedir. Aktiflenen DNA-hasarı kontrol noktası yolağı böylece genetik dengesizliğin meydana gelmesini engeller veya geciktirir. Bundan dolayı bu kontrol noktası yolağı kanser gelişmesine karşı bir bariyer olarak rol oynamaktadır (Bartkova ve ark., 2005; Gorgoulis ve ark., 2005). Genotoksik kimyasallar, ultraviyole ışınlar (UV) ve iyonize radyasyon gibi çevresel mutajenlerin yanında normal hücresel metabolizma sonucu oluşan reaktif oksijen türevleri ve replikasyon hataları DNA hasarlarına neden olmaktadırlar (Rotman ve Shiloh, 1997; Bartek ve ark., 2001; Hoeijmakers, 2001; Antoni ve ark., 2007). DNA-hasarı kontrol noktası yolağında DNA hasarları algılayıcı (sensör) proteinler tarafından algılanır. Algılanmış olan bu DNA hasarı sinyali, aracı (mediyatör) proteinler ile iletim (transdüser) proteinlerine aktarılır. İletim proteinlerinden etkileyici (efektör) proteinlere aktarılan DNA hasar sinyali hücrede 1

1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM bir dizi biyokimyasal işleme neden olur. Bu işlemler sonucunda hücre döngüsünün durdurulması, DNA tamiri veya apopitozis gerçekleşir (Şekil 1.1.) (Niida ve Nakanishi, 2006). DNA da Hasara Neden Olan Etkenler Hücresel metabolizma UV ışık İyonize edici radyasyon Kimyasallar Replikasyon hatası DNA hasarı Algılayıcı (sensör) proteinler İletim (transdüser) proteinler Etkileyici (efektör) proteinler DNA tamiri Hücre döngüsünün durdurulması Transkripsiyon Apopitozis Şekil. 1.1. DNA-Hasarı Kontrol Noktası Yolağında Sinyal İletiminin Kavramsal Organizasyonu CHEK2 geni insanın 22. kromozomunun uzun kolu üzerinde bulunmaktadır. CHEK2 (checkpoint kinase 2=hücre döngüsü kontrol noktası kinaz 2) geninin ürünü bir serin/treonin kinaz olup DNA-hasarı kontrol noktası yolağında bulunan merkezi bir öneme sahip iletim (transdüser) proteinidir. Bu iletim poteini 543 aminoasitten ibaret olup, dört farklı fonksiyonel bölgeye sahiptir: 2

1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM 1) Serin:Glutamin/Treonin:Glutamin (SQ/TQ) dizi bölgesi (19.-69. aminoasit bölgesi): Bu bölge CHEK2 proteininin amino (NH 2 ) uç bölgesindedir. Bu bölgede serin-glutamin (SQ) veya treonin-glutamin (TQ) aminoasit dubletlerinin 7 tanesinin bir araya gelmesinden oluşan bölge dikkat çekicidir (örn. SQ, TQ, SQ, TQ, SQ, TQ, SQ veya SQ, TQ, SQ, SQ, SQ, SQ, TQ). Çünkü CHEK2 proteininin bu bölgesi ATM (ataxia telangiectasia mutated)/atr (ataxia telangiectasia ve Rad3 ilişkili) proteinleri tarafından fosforile edilir. Bu yüzden CHEK2 proteininin bu bölgesi düzenleyici fonksiyona sahip bir bölgedir (Şekil 1.2.) (Bartek ve ark., 2001). 2) Forkhead e benzer bölge (FHA) (115.-175. aminoasit bölgesi): CHEK2 proteininin diğer bir anahtar role sahip bölgesidir. İlk defa Forkhead (çatalbaş) transkripsiyon faktörlerinde bu Forkhead e (çatalbaş) benzer bölgeler kimliklendirilmiştir. Daha sonraları bu bölgelerin bir çok proteinde ve özellikle de nükleus içindeki proteinlerde bulunduğu bildirilmiştir. Bu bölgenin fosforlanmış treonin aminoasitlerine bağlandığı belirlenmiştir. Bu bulgular, bu bölgenin proteinprotein etkileşiminde rolü olduğunu ortaya çıkarmıştır. Bu bölge CHEK2 proteininin substratları ile dinamik etkileşiminde görevlidir (Şekil 1.2.) (Bartek ve ark., 2001). 3) Serin/Treonin kinaz bölgesi (226.-486. aminoasit bölgesi): Bu bölge CHEK2 proteininin karboksil (COOH) uç bölgesinin yaklaşık yarısını oluşturmaktadır. Serin/Treonin kinaz bölgesi CHEK2 proteininin anahtar fonksiyonlu bölgesi olup, bu fonksiyona sahip olması başka Serin/Treonin kinazlar ile homoloji göstermesinden kaynaklanmaktadır. Bu bölge içerisinde T-ilmeği (Tloop) bulunur (Şekil 1.2) (Bartek ve ark., 2001). 4) Nükleer Lokalizasyon Sinyal (NLS) bölgesi (515.-522. aminoasit bölgesi): Bu bölge bir veya daha fazla sayıda pozitif yüklü lizin veya arjinin aminoasitlerini bulunduran bölgedir. Proteinin bu bölgesi molekülün Nükleer Por Kompleks aracılığı ile hücrenin nükleusuna taşınmasında görev alan hedef bölgedir. Çünkü Sitozolik Nükler Transport Reseptörleri yeni sentezlenmiş CHEK2 proteinini bu sinyal bölgesinden tanıyarak nükleusa taşır (Şekil 1.2.) (Bartek ve ark., 2001). CHEK2 proteini hücre döngüsü süresince hücre içerisinde aktif olmayan bir formda bulunur. Hücre içerisinde DNA hasarı meydana geldiğinde hasar sinyali sensörler (algılayıcılar) tarafından algılandıktan sonra CHEK2 proteini, ATM/ATR 3

1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM Kinaz bölgesi T ilmeği Şekil 1.2. İnsan CHEK2 Proteininin Yapısı ve Aktivasyon Noktaları. Şeklin alt kısmında görülen rakamlar CHEK2 proteininin fonksiyonel bölgelerinin aminoasit aralıklarını göstermektedir. Üst kısımda kalın yazılmış olan bölgeler CHEK2 proteininin fonksiyonunun düzenlenmesi sırasında fosforlanan aminoasitleri, diğerleri DNA hasarına yanıt sırasında fosforlanan aminoasitleri göstermektedir (Antoni ve ark., 2007). aracılığı ile SQ/TQ dizi bölgesi içinde bulunan treonin 68 (T68) aminoasiti üzerinden fosforile edilir. Bu fosforilasyonu sonucunda CHEK2 proteini treonin 383 (T383) ve treonin 387 (T387) üzerinden de otofosforilasyon ile aktif forma dönüşür (Şekil 1.3.) (Bartek ve ark., 2001). Hücresel proteinlerin fosforilasyonu, fosforlanmış bu proteinlerin hızlı ve spesifik düzenlenmesini, diğer proteinlerle ve moleküllerle etkileşimini ve bu proteinlerin hücre içi lokalizasyonları (yerleşimini) gibi çok yönlü fonksiyonlarını aktifleştirir. Bir çok protein kinaz çok çeşitli hücresel sinyalleri başlatır veya yayar. Bu protein kinaz enzimleri bu görevlerini ATP (adenozin trifosfat) den protein kinaz enziminin substratına fosfat gruplarını transfer ederek substratın (=protein) modifikasyonunu (değişimini) tamamlayarak gerçekleştirirler. Kinaz bölgesi Otofosforilasyon Kinaz bölgesi Şekil 1.3. CHEK2 Proteininin Aktivasyon Modeli 4

1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM DNA hasarının meydana gelmesi DNA hasarına spesifik protein komplekslerinin oluşumunu başlatır. DNA çift iplik kırığının meydana gelmesi, çift iplik kırık hasarına spesifik protein kompleksi olan MRN (MRE11(meiotic recombination 11)-RAD50-NBS1 (nibrin)) protein kompleksinin (sensör proteinler) oluşumuna neden olur, bu kompleks de ATM yi aktive eder. Aktive olan ATM, CHEK2 proteinini fosforile eder. CHEK2 proteininin fosforlanması sonucunda hücrede bir çok CHEK2 substratı, fosforilasyon ile aktive olur. CHEK2 substratlarının fonksiyonları sonucunda, DNA hasarı meydana gelen hücrenin yaşamının geleceği belirlenir (Şekil 1.4.) (Antoni ve ark., 2007). DNA çift iplik kırığı Alkilleyici ajanlar Replikasyon stresi DNA-hasarı sensörü DNA-hasarı sinyalinin iletimi DNA-hasarı sinyali effektörleri Yaşlanma DNA tamiri Apopitozis Apopitozis G1 de durdurulma S ve G2 de durdurulma G2 de durdurulma Şekil 1.4. DNA-hasarı Kontrol Noktası Yolağının Şematik Görünümü. Yeşil ile boyanan semboller CHEK2 proteinine spesifik olan substratları, mavi olanlar CHEK1 proteinine spesifik substratları göstermektedir. Kırmızı ile gösterilenler hem CHEK2 hem de CHEK1 tarafından ortak olarak kullanılan substratlardır (Antoni ve ark., 2007). 5

1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM CHEK2, BRCA1 (breast cancer 1) proteininin serin 988 (S988) aminoasitini fosforile ederek DNA tamirini başlatır (Şekil 1.4.). Buna ek olarak CHEK2 bir transkripsiyon faktörü olan FOXM1 (forkhead box M1) i fosforile ederek bu transkripsiyon faktörünün stabilitesini artırır. FOXM1 transkripsiyon faktörü homolog rekombinasyon DNA tamir mekanizmasında görev alan BRCA2 (breast cancer 2) ve baz eksizyon (kesip-çıkarma) tamir mekanizmasında görev alan XRCC1 (X-ray repair cross complementing protein 1) genlerinin ekspresyonlarını artırır (Lee ve ark., 2000; Zhang ve ark., 2004; Wang ve ark., 2006a; Wang ve ark., 2006b; Tan ve ark., 2007). DNA da meydana gelen hasarın tamir edilebilmesi için hücre DNA sentezini ve hücre döngüsünü durdurur. CHEK2 proteini, hücre döngüsünü düzenleyen anahtar moleküllerden biri olan CDC25C (Cell division cycle 25 homolog C) nin inhibisyon aminoasiti olan serin 216 (S216) yı fosforile ederek G2/M hücre döngüsü kontrol noktasının gecikmesine ve hücrenin mitoz bölünmeye girişine engel olur (Matsuoka ve ark., 1998; Blasina ve ark., 1999; Chaturvedi ve ark., 1999). Bununla birlikte CHEK2 proteini, diğer bir hücre döngüsü düzenleyici proteini olan CDC25A (cell division cycle 25 homolog A) nın serin 123 (S123), serin 178 (S178) ve serin 292 (S292) aminoasitlerini fosforile ederek hücre döngüsünün G1 evresinin gecikmesine ve S evresine girişini engeller. Ayrıca CHEK2 proteini, DNA da hasar meydana geldiğinde hücre döngüsünü G1/S ve G2/M hücre döngüsü kontrol noktalarında p53 (tumor protein p53) proteini yolu ile durdurulmasında görev yapar. CHEK2 proteini p53 proteinini serin 20 (S20) aminoasitinden fosforile ederek p53 ün MDM2 (mouse double minute 2 homolog) ile ilişkisini bozarak p53 ün stabilitesini artırır. DNA da hasarlar meydana geldiğinde bir transkripsiyon faktörü olan AATF (apoptosisantagonizing transcription factor), ATM ve CHEK2 tarafından fosforile edilerek aktive edilir. AATF transkripsiyon faktörü p53 ekspresyonunu artırır. Ayrıca DNA hasarı durumunda p53 ün serin 366 (S366) ve treonin 387 (T387) aminoasitleri CHEK2 proteini tarafından fosforlanarak p53 proteini aktive edilir (Şekil 1.4.) (Antoni ve ark., 2007). Hücre tamir edemeyeceği kadar DNA hasarı ile karşılaştığı zaman apopitozisi başlatır. Tamir edilemeyen DNA hasarına yanıt olarak CHEK2 proteini bir çok 6

1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM substrat ile etkileşimi sonucunda apopitozisi başlatır. CHEK2 proteini tamir edilemeyen DNA çift iplik kırık hasarlarına yanıtta bir tanskripsiyon faktörü olan E2F1 (E2F transcription factor 1) in serin 364 (S364) aminoasitini fosforile eder. Bu fosforilasyon sonucunda E2F1 in stabilitesi ve transkripsiyonel aktivasyonu artar. Bunun sonucunda p53 ten bağımsız olarak apopitozis gerçekleşir. Bundan başka CHEK2 proteini, p53-bağımsız apopitozis i tümör süpressör pre-myelötik lösemi (PML= promyelocytic leukemia) proteinini, serin 117 (S117) aminoasitinden fosforile ederek başlatır. PML bir çok pro-apopitotik yola aracılık eder (Şekil 1.4.) (Antoni ve ark., 2007). Hücre yaşlanması, hücre döngüsünün durdurulmasının bir formudur. CHEK2 nin hücre yaşlanmasını indüklediği de bildirilmiştir. Sürekli replikasyon sonucunda meydana gelen telomer erozyonu CHEK2 yi aktive eder. CHEK2 proteini hücre yaşlanmasını p53 aracılığı ile başlatır (Antoni ve ark., 2007). DNA-hasarı kontrol noktası yolağı evrimsel süreç boyunca mayalardan insanlara kadar korunmuştur. İnsandaki CHEK2 geninin, Schizosaccharomyces pompe de bulunan Cds1 kinaz geni ve Saccharomyces cerevisia da bulunan Rad53 kinaz geni ile homolog olduğu bulunmuştur (Allen ve ark., 1994; Murakami ve Okayama, 1995). 1998 yılında insan CHEK2 geni klonlanmıştır (Matsuoka ve ark., 1998). CHEK2 geni 22. kromozomun uzun kolunda bulunmaktadır (22q12.1). CHEK2 geni yaklaşık olarak 50 kilobaz uzunluğunda ve 14 ekzondan meydana gelmektedir (Şekil 1.5.). CHEK2 geninin 11.-14. ekzonları ile baz sıraları yönünden yüksek homoloji gösteren DNA bölgeleri 2., 7., 10., 13., 15., 16., X ve Y kromozomları üzerinde bulunmaktadır (Bartek ve ark., 2001). Şekil 1.5. CHEK2 Geninin Yapısı. Şekilde, her ekzonun hangi anlamlı nükleotid çifti aralığında bulunduğu gösterilmiştir. Genin toplam uzunluğu (ekzon+intron) 50 kb kadardır. 7

1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM Bugüne kadar meme, kolorektal, akciğer, mesane, ovaryum kanserlerinde, lenfomalarda [Akut Lenfoid Lösemi (ALL), non-hodgking Lenfoma (NHL)] ve Lifraumeni sendromunda CHEK2 geni içerisinde bir çok mutasyon tanımlanmıştır (Bartek ve Lukas, 2003) (Şekil 1.6). Bu mutasyonlar içerisinde en çok dikkati çeken mutasyonlardan biri CHEK2 proteininin Serin/Treonin kinaz bölgesini oluşturan ekzon 10 da meydana gelen CHEK2 1100delC mutasyonudur. CHEK2 1100delC mutasyonu genin 1100. pozisyonunda bulunan tek sitozin nükleotidinin delesyonu sonucunda ortaya çıkan çerçeve kayması (frameshift) tipi gen mutasyonudur. Delesyonun meydana geldiği kodon, 360. kodondur. CHEK2 360. kodon ve bu kodondan sonraki tüm kodonların aminoasit anlamları değişir ve bununla birlikte 380. kodon bir stop (durdurucu) kodona dönüşür. Bu mutasyon sonucunda yarım (=kesik, truncated) protein oluşur ve bu protein, serin/treonin kinaz fonksiyonuna sahip değildir (Wu ve ark., 2001). Kinaz Bölgesi Şekil 1.6. CHEK2 Geni İçersinde Bu Güne Kadar Tanımlanmış Mutasyonlar. CHEK2 geninde belirlenen diğer bir mutasyon I157T mutasyonudur. Bu mutasyon CHEK2 proteininin FHA bölgesi içersinde bulunan 157. kodonun belirlediği izolösin aminoasitinin treonin aminoasitine dönüşümüne neden olur (yanlış anlamlı =missense). Bu mutasyon 470. nükleotid olan Timin in (T) Sitozin e (C) dönüşmesi şeklindeki transisyon tipi nokta mutasyonudur. Bu mutasyon I157T [İzolösin (ATT) 157 Treonin (ACT)] şeklinde gösterilmektedir. Yapılan çalışmalar I157T mutasyonuna sahip CHEK2 proteininin bozulmamış ve normal bir 8

1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM şekilde aktive olduğunu göstermiştir. Fakat aynı çalışmalarda, CHEK2 I157T mutasyonunun CHEK2 proteini ile CHEK2 nin substratları olan p53, BRCA1 ve CDC25A proteinleri arasındaki etkileşimi bozduğu gösterilmiştir. CHEK2 I157T mutant proteini doğal-tip CHEK2 i proteini ve CHEK2 I157T mutant proteini ile dimer teşkil edebilmektedir. CHEK2 I157T mutasyonunu heterozigot olarak bulunduran bireylerde aynı hücre içerisinde mutasyona uğramış allelin oluşturduğu protein ile yabani tip allelin meydana getirdiği proteinin dimer oluşturarak CHEK2 proteininin inaktivasyonuna neden olduğu ve bu mutant proteinin hücrede bu şekilde dominant negatif etki gösterdiği saptanmıştır. Bununla birlikte CHEK2 I157T mutant proteininin bozulmuş oligomerizasyonu CHEK2 I157T mutant proteinlerinde otofosforilasyonu azaltmaktadır. CHEK2 I157T mutant proteinindeki bu değişim bu proteinin fonksiyonlarını azaltmaktadır (Falck ve ark., 2001a; Falck ve ark., 2001b; Li ve ark., 2002; Schwarz ve ark., 2003). Bir diğer mutasyon ise CHEK2 geninin 2. intronunun [intervening sequence (IVS) intragenic region] ilk nükleotidinde meydana gelen, Guanin (G) nükleotidinin Adenin (A) nükleotidine dönüşümü şeklindeki transisyon tipi nokta mutasyonudur ve IVS2 + 1G>A şeklinde gösterilmektedir. CHEK2 IVS2 + 1G>A mutasyonu mrna modifikasyonu yapılırken 2. intronun kesip-çıkarma (splicing) işleminin yapıldığı tanınma bölgesindedir. Bu mutasyon anormal bir ilmek olayına neden olur. Anormal ilmek olayının gerçekleşmesi sonucunda pre-mrna nın yanlış işlenmesi meydana gelir. Böyle işlenmiş olgun mrna nın 3. ekzonunun 5 tarafına 4 nükleotidin girmesi gerçekleşmiş olur (Şekil 1.7). 4 nükleotidin ekzon 3 içerisine bu girişi sonucunda bu noktadan sonra tüm kodonların aminoasit belirleyen anlamları değişir ve ayrıca CHEK2 geninin 3. ekzon bölgesinde anlamsız (stop) kodon oluşur. Bu mutasyonu taşıyan CHEK2 geninden sentezlenen CHEK2 proteininin FHA ve serin/treonin kinaz bölgeleri yoktur. Western blot analizleri IVS2 + 1G>A mutasyonunu taşıyan hücre hatlarında CHEK2 protein düzeyinin yok denecek kadar az olduğunu göstermiştir (Dong ve ark., 2003) 9

1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM İntron-2 Normal ilmek Ekzon-2 Ekzon-3 Anormal ilmek CHEK2 IVS2 + 1G>A Şekil 1.7. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonu Sonucu Oluşan Anormal İlmek İşte hücrenin DNA-hasarı kontrol noktası yolağında bulunan CHEK2 geninde yukarda belirttiğimiz mutasyonların meydana gelmesi sonucu hücrenin DNA-hasarı kontrol noktası yolağı bozulmuş olur ve böyle bireylerin tümörleşmeye karşı doğal korunma mekanizmalarını kaybettikleri, hücre transformasyonuna ve kansere yatkınlıklarının arttığı düşünülmektedir. Kontrol noktası yolağı hasarlı hücrelerde DNA hasarlarınında fazla olduğunun bulunması, kanser biyolojisi çalışan araştırmacıların bu kontrol noktası yolağı üzerindeki ilgilerini artırmıştır (Zhou ve Elledge, 2000; Bradbury ve Jackson, 2003; Thompson ve Schild, 2002; Zhou ve ark., 2003). Genin işlevini veya ifadesini bozan ve böylece kansere yakalanma riskini artıran bu tip mutasyonların belirlenmesi ve populasyonlarda sıklıklarının araştırılması kanserin mekanizmalarının anlaşılması ve tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi açısından oldukça önemlidir. CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının bazı kanser türlerinin oluşumu üzerine etkilerini araştıran bazı çalışmalar şunlardır: CHEK2 1100delC mutasyonu ve meme kanseri oluşumu arasındaki ilişki sağlıklı bireylerden oluşan kontrol grubu, BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları belirlenmemiş ve ailesel meme kanseri hikayesi mevcut olan meme kanserli hastalar ile yapılan çalışma ile araştırılmıştır (Meijers-Heijboer ve ark., 2002). Kontrol grubu 10

1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM ile meme kanserli grup karşılaştırıldığında CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanseri oluşumunu 2 kat artırdığı ve bu artışın istatistiksel olarak önemli olduğu bildirilmiştir. Vahteristo ve ark. (2002), tarafından CHEK2 1100delC mutasyonunun frekansı mini baz sırası saptama yöntemi ile Finlandiya kökenli sağlıklı bireylerde, meme kanserli hastalarda ayrıca BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları saptanmayan ve ailesel meme kanseri öyküsü bulunan meme kanserli hastalarda araştırılmıştır. Bu araştırmada meme kanserli hasta grubu ile kontrol grubu arasındaki farkın istatistiksel olarak önemsiz olduğu, fakat ailesel meme kanserli hasta grubu ile kontrol grubu arasındaki farkın istatistiksel olarak anlamlı olduğu ve CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanseri oluşumunu 4.2 kat artırdığı saptanmıştır (p=0.0002). Kilpivaara ve ark. (2004), tarafından yapılan çalışmada, meme kanserli hastalarda ve sağlıklı kontrolde I157T mutasyonunun frekansı mini baz sırası saptama, direk baz sırası saptama ve değişime hassas jel elektroforez yöntemleri ile araştırmıştır. I157T mutasyonunun meme kanseri oluşumunu 1.43 kat artırdığı saptanmıştır (p=0.021). Bogdanova ve ark. (2005), tarafından CHEK2 I157T ve IVS2 + 1G>A mutasyonlarının meme kanseri ile ilişkisi iki farklı populasyondan oluşturulmuş iki farklı grupta polimeraz zincir reaksiyonu-restriksiyon fragmenti uzunluk polimorfizmi (PCR-RFLP) yöntemi ile araştırılmıştır. İlk grup alman kökenli meme kanserli hastadan ve sağlıklı bireyden meydana gelen kontrol grubundan oluşturulmuştur. Diğer grup Beyaz Rusya kökenli meme kanserli hasta ve sağlıklı bireyden oluşan kontrol grubundan meydana getirilmiştir. I157T mutasyonunun meme kanser oluşumunu Alman kökenli meme kanserli hastalarda 3.6 kat (p=0.044) Beyaz Rusya kökenli meme kanserli hastalarda 4.5 kat artırdığı belirlenmiştir (p=0.005). IVS2 + 1G>A mutasyonunun meme kanseri oluşumu artırmadığını belirlenmiştir. Araştırıcılar, CHEK2 I157T mutasyonunun ailesel meme kanseri yatkınlığına katkıda bulunan bir mutasyon olduğu sonuçuna varılmışlardır. Seppälä ve ark. (2003), tarafından yapılan çalışmada, Finlandiya populasyonundan prostat kanserli hastalarda CHEK2 1100delC ve I157T 11

1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM mutasyonlarının frekansları ve bu mutasyonların prostat kanseri oluşumu ile ilişkileri tek zincir konformasyon polimorfizmi ve mini baz sırası saptama yöntemleri ile araştırılmıştır. Çalışmanın hasta populasyonunda ailesel prostat kanseri öyküsü bulunan prostat kanserli hastalar ve ailesel kanser öyküsü bulunmayan prostat kanserli hastalar bulunmaktadır. Ayrıca çalışmaya sağlıklı 480 bireyden oluşturulan kontrol grubu da dahil edilmiştir. Yapılan analizler sonucunda, CHEK2 1100delC ve I157T mutasyonlarının oranlarının ailesel prostat kanserli grup ile kontrol grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı derecede farklılık gösterdiği [p=0.02 (1100delC) ve p=0.04 (I157T)] fakat kontrol grubu ile ailesel olmayan prostat kanserli grup arasında bu iki mutasyon yönünden istatistiksel olarak önemli bir farklılığın olmadığı saptanmıştır. Cybulski ve ark. (2004a), Polanyalı prostat kanserli ve sağlıklı bireylerde CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının frekanslarını PCR- RFLP ve allele spesifik oligonükleotid-pcr yöntemleri ile araştırmışlardır. Bu mutasyonlar prostat kanser riskini 3.4 kat artırmıştır (p=0.004). Araştırıcılar bu mutasyonların ailesel prostat kanser riskini 9 kat artırdığını (p=0.0002) belirtmişlerdir. I157T yanlış anlamlı mutasyonu prostat kanser riskini 1.7 kat artırmıştır (p=0.03). Aynı zamanda I157T mutasyonu ailesel prostat kanserli hastalarda %16 oranında bulunmuş ve ailesel prostat kanserli hastalarda prostat kanseri riskini 3.8 kat artırdığı bildirilmiştir (p=0.00002). Cybulski ve ark. (2004b), tarafından 4008 kanserli (mesane, meme, kolon, böbrek, larinks, akciğer, melanoma, Non-Hodgking lenfoma, ovaryum, pankreas, prostat, mide, tirod) hastada ve 4000 sağlıklı kontrol grubunda I157T, IVS2 + 1 G>A ve1100delc mutasyonlarının frekansı PCR-RFLP ve allele spesifik oligonükleotid- PCR yöntemleri ile araştırılmıştır. Bu araştırmada, 1100delC ve IVS2 + 1 G>A mutasyonlarının tiroit kanseri oluşumunu 4.9 kat (p=0.0006), meme kanser oluşumunu 2.2 kat (p=0.02) ve prostat kanseri oluşumunu 2.2 kat (p=0.04) artırdığı saptanmıştır. I157T mutasyonunun meme kanseri oluşumunu 1.4 kat (p=0.02), kolon kanser oluşumunu 2 kat (p=0.001), böbrek kanseri oluşumunu 2.1 kat (p=0.0006), prostat kanseri oluşumunu 1.7 kat (p=0.002) ve tiroit kanseri oluşumunu 1.9 kat (p=0.04) artırdığı belirlenmiştir. 12

1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM Bartsch ve ark. (2006), tarafından yapılan araştırmada CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının ailesel pankreas kanseri ile ilişkileri araştırılmıştır. Araştırıcılar pankreas kanseri ile CHEK2 mutasyonları arasındaki ilişkinin önemli olmadığını bildirmişlerdir. Brennan ve ark. (2007), tarafından CHEK2 I157T mutasyonu ile akciğer, skuamöz (yassı hücre) üst solunum yolu ve böbrek kanseri oluşumu arasındaki ilişki araştırılmıştır. CHEK2 I157T mutasyonunun akciğer kanseri ile skuamöz üst solunum yolu kanserinin oluşumunu azalttığı bildirilmiştir. Zlowocka ve ark. (2008), tarafından yapılan araştırmada CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A, 1100delC ve del5395 mutasyonlarının mesane kanseri oluşumu ile ilişkileri Polonya kökenli ve mesane kanserli hastalar ile kontrol grubunda araştırılmıştır. Yapılan analizler CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A, 1100delC ve del5395 mutasyonlarının mesane kanseri oluşumunu kontrol grubuna kıyasla 1.9 kat artırdığı ve bu artışın istatistiksel olarak anlamlı olduğu bildirilmiştir (p=0.0003). Araştırıcılar, CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A, 1100delC ve del5395 mutasyonlarının Polonya populasyonunda mesane kanseri oluşumunu artırdığını bildirmişlerdir. Suspitsin ve ark. (2009), tarafından Rus populasyonunda CHEK2 1100delC ve IVS2 + 1 G>A mutasyonların ovaryum kanseri oluşumu üzerine etkileri araştırılmıştır. Araştırıcılar CHEK2 geninin ovaryum kanserinin oluşumuna katkısının olmadığını bildirmişlerdir. Bugüne kadar CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının hepatoselüler kanser oluşumu üzerine etkileri araştırılmamıştır. Bunun yanında Türk populasyonunda kolorektal kanserli fertlerde CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının sıklıkları ve kolorektal kanser ile ilişkileri de araştırılmamıştır. İşte bu çalışmanın amacı CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonları ile hepatoselüler kanser arasında bir ilişkinin olup olmadığını ve kolorektal kanserli Türk bireylerde ve herhangi bir kanser tanısı konmamış sağlıklı bireylerden oluşan kontrol grubunda söz konusu mutasyonların frekanslarını Polimeraz Zincir Reaksiyonu-Restriksiyon Fragmenti Uzunluk Polimorfizmi (PCR- RFLP) ve Amplifikasyon Refrakter Mutasyon Sistemi-Polimeraz Zincir Reaksiyonu (ARMS-PCR) yöntemleri ile araştırmaktır. 13

1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM 14

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR CHEK2 geni içerisinde bir çok kalıtsal mutasyon tanımlanmıştır. Fonksiyonel olmayan CHEK2 proteininin meydana gelmesine neden olan CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının birçok kanserin oluşumu üzerine etkileriyle ilgili yapılan çalışmalar şu şekilde özetlenebilir. 2.1. CHEK2 Mutasyonlarının Akciğer Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar Brennan ve ark. (2007), tarafından CHEK2 I157T mutasyonu ile akciğer ve skuamöz (yassı hücre) üst solunum yolu kanseri oluşumu arasındaki ilişki 3061 kanserli hasta ve 4000 sağlıklı bireyden oluşan kontrol grubunda araştırılmıştır. Çalışmadaki hasta grubu 2250 akciğer kanserli ve 811 skuamöz üst solunum yolu kanserli (yassı hücreli karsinom) bireylerden oluşturulmuştur. CHEK2 I157T mutasyonlu fertlerde akciğer kanseri ile skuamöz üst solunum yolu kanserinin mutasyon olmayan fertlerdekine nazaran daha az oranda meydana geldiğini belirtmişlerdir. CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A, 1100delC ve del5395 mutasyonlarının akciğer ve gırtlak kanser ile ilişkileri Polonya populasyonunda araştırılmıştır (Cybulski ve ark., 2008). Araştırma 895 akciğer kanserli hasta ve 430 gırtlak kanserli hasta ve 6391 sağlıklı bireyden oluşturulan kontrol grubu ile yapılmıştır. Akciğer kanserli grup içerisinde bu mutasyonları bulunduranların oranı %1.8 (16/895), gırtlak kanseri gelişen hastalarda %3.5 (15/430) ve sağlıklı kontrol grubunda %5.8 (370/6391) oranında saptanmıştır. Yapılan analizler CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A, 1100delC ve del5395 mutasyonlarının akciğer ve gırtlak kanserine yakalanma riskini Polonya populasyonunda kontrol grubu ile kıyaslandığında azalttığı ve her iki kanser türü için bu mutasyonların koruyucu etkisi olduğunu ve bu etkinin istatistiksel olarak anlamlı olduğunu göstermiştir. Araştırıcılar bu mutasyonlar nedeniyle hücre ölümünün azaldığını ve bu yüzden hücre bölünmesinin daha az meydana geldiği, sigara gibi 15

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM oldukça tehlikeli bir çevresel etmenin fazla olduğu bu tip kanserlerde kanser oluşumunun azalabileceği görüşünü ileri sürmüşlerdir. 2.2. CHEK2 Mutasyonlarının Beyin Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar El Hallani ve ark. (2009), tarafından yapılan araştırmada en yaygın beyin tümörü olan glioma ile CHEK2 1100delC mutasyonu arasındaki ilişki araştırılmıştır. Araştırmaya ailesel glioma hikayesi olan 79 glioma tanısı almış hasta katılmıştır. 79 hastanın hiçbirinde CHEK2 1100delC mutasyonu saptanmamıştır. Araştırıcılar, CHEK2 1100delC mutasyonunun ailesel gliomaya yatkınlık için bir risk faktörü olmadığını ve bu mutasyonun bu tür kanserde bir rolünün olmadığını bildirmişlerdir. 2.3. CHEK2 Mutasyonlarının Böbrek Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar Cybulski ve ark. (2004b), 4008 kanserli (mesane, meme, kolon, böbrek, larinks, akciğer, melanoma, Non-Hodgking lenfoma, ovaryum, pankreas, prostat, mide, tirod) hastada ve 4000 sağlıklı kontrol grubunda 1100delC, IVS2 + 1 G>A ve I157T mutasyonlarının frekanslarını PCR-RFLP (restriksiyon fragmenti uzunluk polimorfizmi) ve allele spesifik oligonükleotid-pcr yöntemleri ile araştırmışlardır. Çalışılan mutasyonlar içerisinde sadece I157T mutasyonunun böbrek kanseri oluşumunu 2.1 kat (p=0.0006) arttırdığı saptanmıştır. Brennan ve ark. (2007), tarafından CHEK2 I157T mutasyonu ile böbrek kanseri oluşumu arasındaki ilişki 954 böbrek kanserli hasta ve 4000 sağlıklı bireyden oluşan kontrol grubunda araştırılmıştır. Araştırıcılar, CHEK2 I157T mutasyonunun böbrek kanseri oluşumunu zayıfta olsa artırdığını bildirmişlerdir. 2.4. CHEK2 Mutasyonlarının Kolorektal Kanser Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar 16

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM CHEK2 1100delC mutasyonunun frekansı ailesel kolorektal kanser geçmişi olan 149, ailesel kolorektal kanser hikayesi olmayan 513 kolorektal kanserli hastada ve toplam olarak 662 kolorektal kanserli hastada araştırılmıştır (Kilpivaara ve ark., 2003). Bu çalışmada, mutasyon sıklığı 662 kolorektal kanserli hastada %2.6 (17/662) oranında, ailesel kolorektal kanser öyküsü bulunan hasta grubunda %1.3 (2/149) ve ailesel olmayan 513 vakada %2.9 (15/513) oranında tespit edilmiştir. Vahteristo ve ark. (2002), tarafından yapılan araştırmada Finlandiya kökenli 1885 sağlıklı kontrolde CHEK2 1100delC mutasyonunun frekansının %1.4 olduğu bildirilmişti. Bu araştırmada, % 1.4 oranındaki 1100delC mutasyon sıklığı ve Finlandiyanın diğer bölgelerinden gelen sağlıklı populasyonun mutasyon frekansları düzenlenip CHEK2 1100delC mutasyonunun frekansı %1.9 olarak kabul edilerek istatistiksel analizler yapılmıştır. Finlandiya kökenli sağlıklı populasyonun düzenlenmiş mutasyon sıklığı ile ailesel olan veya olmayan kolorektal kanserli gruplar ayrı ayrı veya tüm kolorektal kanserli hastalar bir bütün olarak analiz edildiklerinde hiçbir istatistiksel farklılığın gözlemlenmediği saptanmıştır. Araştırıcılar, CHEK2 1100delC mutasyonunun kolorektal kansere yatkınlık alleli olmadığını, fakat bu mutasyonun kolorektal kanser üzerinde oldukça düşük düzeyde bir etkisinin olduğunun göz ardı edilmemesi gerektiğini bildirmişlerdir. Lipton ve ark. (2003), çok sayıda kolorektal adenoması bulunan ve aralarında kolorektal kanser gelişmiş 149 hastada CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı DNA dizi analizi yöntemi ile belirlenmiştir. CHEK2 1100delC mutasyonunun frekansının %2 (3/149) oranında olduğu saptanmıştır. Araştırıcılar, kendi bulmuş oldukları sonuçları CHEK2 1100delC mutasyonunun %1.1 lik populasyon frekansı (Meijers-Heijboer ve ark., 2002) ile karşılaştırarak, CHEK2 1100delC mutasyonunun kolorektal kanser oluşumunu artırmadığını bildirmişlerdir (p=0.26). Meijers-Heijboer ve ark. (2003), tarafından yapılan çalışmada CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı ve ailesel kolorektal kanser ile ilişkisi, ailesel kolorektal kanserli 329 aileden oluşan hasta grubunda araştırılmıştır. Çalışmaya katılan ailesel kolorektal kanserli aileler kolorektal kanserin türüne göre ailesel adenomatöz polipozis (kolon ve rektumda oluşan 100-1000 lerce adenom polipler) (95 aile) ve ailesel nonpolipozis kolorektal kanser (kolonda çok sayıda polip 17