LEPTİN RESEPTÖRÜ VE HİPOKSİ-İNDÜKLENEBİLİR FAKTÖR-1ALFA GENLERİNDEKİ POLİMORFİZMLERİN OSAHS LA İLİŞKİSİ

T.C. SELÇUK ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ LEPTİN RESEPTÖRÜ VE HİPOKSİ-İNDÜKLENEBİLİR FAKTÖR-1ALFA GENLERİNDEKİ POLİMORFİZMLERİN OSAHS LA İLİŞKİSİ Sümeyra ÇETİNKAYA YÜKSEK LİSANS TEZİ TIBBİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman Prof.Dr. Sennur DEMİREL KONYA-2013

T.C. SELÇUK ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ LEPTİN RESEPTÖRÜ VE HİPOKSİ-İNDÜKLENEBİLİR FAKTÖR-1ALFA GENLERİNDEKİ POLİMORFİZMLERİN OSAHS LA İLİŞKİSİ Sümeyra ÇETİNKAYA YÜKSEK LİSANS TEZİ TIBBİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman Prof. Dr. Sennur DEMİREL Bu proje Selçuk Üniversitesi Bilimsel Araştırma Proje Koordinatörlüğü Tarafından 11202005 proje numarası ile desteklenmiştir KONYA 2013

ÖNSÖZ Yüksek lisans öğrenimim boyunca bilgi ve deneyimlerini benimle paylaşan danışmanım Prof. Dr. Sennur DEMİREL e ve desteklerini hiçbir zaman eksik etmeyen bölüm öğretim üyelerimiz Yard. Doç. Dr. A.Bülent TURHAN, Yard. Doç. Dr. H.Gül DURSUN a Tez aşamasında desteğini esirgemeyen Göğüs Hastalıkları öğretim üyesi ve Uyku Laboratuarı sorumlusu Yard. Doç. Dr. Şebnem YOSUNKAYA ya, Araştırma sırasında bizi destekleyen Selçuk Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinatörlüğü ne, Bilgi ve deneyimlerini paylaşan Serkan KÜÇÇÜKTÜRK e Tezin kontrolleri esnasında zaman ayırıp destekleriyle yanımda olan anatomi bölümü asistanlarından Döndü AKIN ve Didem AYDIN a ve sevinç ve hüzünleri beraber paylaştığımız İlknur ÇINAR a, Eğitim ve tez aşamasında maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen sevgili aileme, Sonsuz teşekkürlerimi sunarım. ii

İÇİNDEKİLER ÖNSÖZ...ii İÇİNDEKİLER...iii SİMGELER VE KISALTMALAR...vi ÇİZELGELER...viii ŞEKİLLER...ix 1. GİRİŞ...1 1.1. Uykuda Solunum Bozuklukları... 1 1.2. Uyku Apne Sendromu... 1 1.2.1. Genel Özellikler... 2 1.2.2. Epidemiyoloji... 3 1.2.3. Etiyoloji... 4 1.2.4. Klinik Özellikler... 4 1.2.5. Polisomnografi... 5 1.3. Obezite, Leptin, Leptin Reseptörü... 5 1.3.1. Obezite... 5 1.3.2. Leptin... 6 1.3.3. Leptin Reseptörü (LEPR)... 8 1.3.4. Leptin Reseptörü Gen Polimorfizmleri...8 1.4. Hipoksi ve Hipoksiyle İndüklenen 1-α (HIF-1α) Geni......9 1.4.1. Hipoksi ve OSAHS İlişkisi... 9 1.4.2. İntermittent (Aralıklı) Hipoksi... 9 1.4.3. Kronik İntermittent(Aralıklı) Hipoksi... 10 1.4.4. Hipoksiyle İndüklenen Faktör 1α (HIF-1α) Geni...10 1.4.5. HIF-1α nın Hedef Genleri...14 1.5.Obezite, HIF-1α Geni ve Leptin Arasındaki Bağlantılar...15 1.6.Leptinin Uyardığı Sinyal Yolakları ve HIF-1α Bağlantısı...15 iii

1.7. Amaç...17 2.GEREÇ ve YÖNTEM... 19 2.1. Hasta Kabulü... 19 2.2. Çalışma gruplarının oluşturulması... 19 2.3. Uyku Çalışması...19 2.4. Hastadan kan alınması... 20 2.5. Genomik DNA izolasyonu... 20 2.5.1. İzolasyonda kullanılan çözeltiler... 21 2.6. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)... 22 2.7. Agaroz Jelde Görüntüleme... 24 2.8. Restriksiyon Fragment Uzunluk Polimorfizmi (RFLP)... 24 2.9. ARMS (Amplifikasyon Refraktör Mutasyon Sistem)...25 2.9.1. Agaroz Jelde Görüntüleme...25 2.10. İstatistiksel değerlendirme... 25 2.11. Etik Kurul Onayı... 26 3. BULGULAR... 27 3.1. Pro582Ser Polimorfizmini İçine Alan Gen Bölgesinin PZR Sonuçları...27 3.2. Lys109Arg Polimorfizmini İçine Alan Gen Bölgesinin PZR Sonuçları... 28 3.3. Lys109Arg Bölgesi PZR Ürünlerinin HaeIII Restriksiyon Enzimi ile Kesimi...28 3.4 Lys656Asn Polimorfizmini İçine Alan Gen Bölgesinin PZR Sonuçları...29 3.5. Lys656Asn Bölgesi PZR Ürünlerinin BstU1 Restriksiyon Enzimi ile Kesimi...29 3.6. Pro582Ser Polimorfizminde Hasta ve Kontrol Gruplarının Karşılaştırılması...30 iv

3.7. Lys109Arg Polimorfizminde Hasta ve Kontrol Gruplarının Karşılaştırılması...34 3.8. Lys656Asn Polimorfizminde Hasta ve Kontrol Gruplarının Karşılaştırılması...36 4. TARTIŞMA... 40 5. SONUÇ VE ÖNERİLER... 46 6. ÖZET... 47 7. SUMMARY... 48 8. KAYNAKLAR... 49 9. EKLER... 54 EK-A. ETİK KURUL ONAYI... 54 EK-B. BİLGİLENDİRİLMİŞ ONAY FORMU...55 10. ÖZGEÇMİŞ... 56 v

SİMGELER VE KISALTMALAR AHI: Apne/Hipoapne İndeksi ARNT: aryl hydrokarbon reseptör nüklear translokator ARMS: Amplifikasyon Refraktör Mutasyon Sistem bç: Baz çifti bhlh: basic helix loop heliks BMI: Body Mass Index CBR: CREB bağlanma bölgesi CIH: Kronik İntermittent Hipoksi DNA: Deoksiribonükleik asit DSÖ: Dünya Sağlık Örgütü EDTA: Etilendiamintetraasetikasit EEG: Elektroensefalogram EKG: Elektrokardiyogram EMG: Elektromyogram EOG: Elektrookülogram EPO: Eritropoietin EtBr: Etidyum Bromür EtOH: Etanol FIH: Faktör İnhibe edici HIF HDL: High-Density Lipoprotein HIF-1α: Hipoksiyle İndüklenen Faktör-1α HRE: Hipoksi Yanıt Elementi ICSD: Uluslararası Uyku Apne Sendromu Sempozyumu IL-6: İnterlökin 6 IL-12: İnterlökin 12 JAK: Janus-aktive kinaz LDL: Low-Density Lipoprotein LEPR: Leptin Reseptörü mrna: Messenger RNA NaAc: Sodyum Asetat NHANES: National Health and Nutrition Examination Survey Ob gen: obezite geni OB-Ra: Kısa reseptör OB-Rb: Uzun reseptör OD: Optik Dansite ODD: Oksijen Bağlama Bölgesi OSAHS: Obstructive Sleep Apnes/Hypoapnes Syndrome pmol: pikomol PO2 : Parsiyel Oksijen Basıncı PHD: Prolil Hidroksilaz Domain PI3K: Phosphatidylinositol 3-kinase PSG: Polisomnografi REM: Rapid Eye Movement RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism RNA: Ribonükleik Asit vi

ROS: Reaktif Oksijen Ürünleri SDS: Sodyum Dodesil Sülfat SNP: Single Nucleotid Polymorphisms Tris: Tris (hidroksimetil) aminometan STAT: Sitozolik Transkripsiyon Aktivatörü SREBP-1: sterol düzenleyici element bağlama protein-1 ul: Mikrolitre USB: Uykuda Solunum Bozuklukları VEGF: Vasküler Endotelyal Growth Faktör vii

ÇİZELGELER Çizelge 2.1. PZR reaksiyon bileşenleri ve reaksiyon koşulları (Lys109Arg ve Lys656Asn için) Çizelge 2.1. Pro582Ser için PZR reaksiyon bileşenleri ve reaksiyon koşulları Çizelge 3.1. Tüm SNP lere hasta ve kontrol gruplarında Yaş, BMI ve PSG karakteristiklerine ait değerler Çizelge 3.2. Pro582Ser polimorfizminde hasta ve kontrol grupları arasında birey sayıları ve genotip dağılım sıklıkları Çizelge 3.3. Pro582Ser polimorfizminde hasta gruplarında AHI ve BMI ya göre ayrılmış alt grupların genetik modellerle karşılaştırılması Çizelge 3.4. Pro582Ser polimorfizminde hasta grupları içerisinde klinik ve biyokimyasal parametrelerin kodominant modelde karşılaştırılması Çizelge 3.5. Pro582Ser polimorfizminde hasta grupları içerisinde klinik ve biyokimyasal parametrelerin dominant ve resesif modelde karşılaştırılması Çizelge 3.6. Pro582Ser polimorfizminde hasta ve kontrol grupları arasında birey sayıları ve genotip dağılım sıklığı değerleri Çizelge 3.7. Lys109Arg polimorfizminde hasta gruplarında AHI ve BMI ya göre ayrılmış alt grupların genetik modellerle karşılaştırılması Çizelge 3.8. Lys109Arg polimorfizminde hasta grupları içerisinde klinik ve biyokimyasal parametrelerin kodominant modelde karşılaştırılması Çizelge 3.9. Lys109Arg polimorfizminde hasta grupları içerisinde klinik ve biyokimyasal parametrelerin dominant ve resesif modelde karşılaştırılması Çizelge 3.10. Hasta ve Kontrol grupları arasında birey sayıları ve genotip dağılım sıklıkları Çizelge 3.11. Lys656Asn polimorfizminde hasta gruplarında AHI ve BMI ya göre ayrılmış alt grupların genetik modellerle karşılaştırılması Çizelge 3.12. Lys656Asn polimorfizminde hasta grupları içerisinde klinik ve biyokimyasal parametrelerin kodominant modelde karşılaştırılması Çizelge 3.13. Lys656Asn polimorfizminde hasta grupları içerisinde klinik ve biyokimyasal parametrelerin dominant modelde karşılaştırılması. Çizelge 3.14. Lys656Asn polimorfizminde hasta grupları içerisinde klinik ve biyokimyasal parametrelerin resesif modelde karşılaştırılması. viii

ŞEKİLLER Şekil 1.1. LEPR geninin şematik görünümü. Şekil 1.2. HIF-1 in yapısı. Şekil 1.3. HIF-1α geninde görülen varyantlar. Şekil 1.4. HIF-1 in oksijen-bağımlı regülasyonu. Şekil 1.5. Normoksi ve Hipoksi koşullarında HIF-1α geni Şekil 1.6. Tamir edilmemiş glukoz homeostazı ve adiposit bozukluğunda HIF-1α nın rolü Şekil 1.7. Leptinin uyardığı sinyal yolakları Şekil 3.1. Pro582Ser Polimorfizminin ARMS-PZR Sonucu Şekil 3.2. Pro582Ser polimorfizminin dizi analizi sonucu Şekil 3.3. Lys109Arg Polimorfizmininin PZR Sonucu Şekil 3.4. Lys109Asn Polimorfizmininin RFLP Sonucu Şekil 3.5. Lys656Asn Polimorfizmininin PZR Sonucu Şekil 3.6. Lys656Asn Polimorfizmininin RFLP Sonucu ix

1. GİRİŞ Uyku, hayatımızın üçte birini geçirdiğimiz ve sağlıklı yaşam için vazgeçilmez olan bir olgudur. Kimilerine göre sadece dinlenme olarak görülen uyku Aristo, Hipokrat, Freud gibi pek çok düşünür ve bilim adamı için gizemli bir süreç olarak yorumlanmış ve pek çok çalışmaya konu olmuştur. Bu süreçte uykunun bazı uyaranlar ile geri döndürülebilen bir bilinçsizlik hali olduğu bildirilmiş ve bu konudaki ilk gelişme Luigi Galvini nin yaptığı hayvan deneylerinde, beyin hücrelerinde elektriksel aktiviteyi göstermesi, bunu takiben Richard Caton tarafından EEG yi oluşturan potansiyellerin keşfi ile hız kazanmıştır (Köktürk 1998). Teknolojinin de gelişimi ile bu alanda bilgi birikimleri sonucu 1972 yılında ilk Uluslararası Uyku Apne Sendromu Sempozyumu düzenlenmiştir. Bilgi birikimlerinin artmasıyla Uyku Apne Sendromunun günümüzdeki tanımı 1973 yılında Christian Guilleminault tarafından yapılmıştır (Pack 1994). 2005 yılında yeni bir sınıflama hazırlanarak Uyku Bozuklukları Sınıflaması-2 (ICSD-2) yayınlamıştır. 1.1. Uykuda Solunum Bozuklukları Uyku sırasında solunum paterninde patolojik olarak değerlendirilebilecek düzeydeki değişikliklere bağlı olarak gelişen morbidite ve mortalitenin artmasına yol açan tablolara uykuda solunum bozuklukları (USB) denilmektedir. USB adı altında farklı klinik tablolar yer almakla birlikte, USB denince ilk akla gelen tablo Uyku Apne Sendromu dur. Uyku apne sendromu içinde en yaygın olan Obstrüktif Uyku Apne/Hipoapne Sendromu (Obstructive Sleep Apnes/Hypoapnes Syndrome- OSAHS ) tüm olguların 90-95 ini içermektedir (Köktürk 1998). 1.2. Uyku Apne Sendromu Guilleminault ve ark (1973), çalışmalarında apnenin tanımını (süresi ve tipi) ve apne indeksini (AHI-uyku saati başına düşen apne sayısı) ortaya koymuşlardır. Obez olmayan hastalarda bu sendromun ortaya çıkmasının önemini vurgulamak için daha genel anlamda 1976 da Uyku Apne Sendromu olarak ifade edilmiştir. Aynı yıl çocuklarda da bu sendromun varlığı gösterilmiştir. 1977 yılında kardiyovasküler komplikasyonlar için geri döndürülebilir bir tehlike olarak hipersomni-uyku apne sendromu tanımlanmıştır. 1983 yılında OSAHS ile ilişkili kardiak aritmiler ve iletim bozuklukları tanımlanmış, daha sonra obstrüktif uyku apnesinin sebep olduğu gece uyku bölünmeleri ve gün boyu uyuklama arasındaki ilişki gösterilmiştir. Bunları OSAHS a bağlı kardiak aritmi, hipertansiyon, hipoksi ile ilişkili hastalıklar, 1

miyokardial iskemi ve infeksiyon, serebrovasküler kazalar ve ani ölümlerin incelendiği birçok çalışma takip etmiştir. 1.2.1. Genel Özellikler Obstruktif uyku apne/hipoapne sendromu (OSAHS) solunumla ilgili uyku bozuklukları içinde incelenen, birçok vücut sistemini ilgilendiren önemli bir sağlık sorunu olup erişkin dönemdeki en yaygın uykusuzluk (insomnia) nedenidir (A report of National Commission on Sleep Disorders Research 1995, Young ve ark 2002). Gerek uyku fizyolojisinin gerekse uyku apnesinin anlaşılmasında son 30-50 yılda önemli gelişmeler kaydedilmiştir. Uykunun bilimsel olarak incelenmesinde önemli dönüm noktaları: 1950 lerde REM (rapid eye movement: hızlı göz hareketi) döneminin tanımlanması; 1960 larda üst havayolunda tıkanma ile uyku bozukluğunun ilişkilendirilmesi; 1970 lerde uyku apne sendromunun tanımlanması, 1980 lerde uyku apne sendromunun tedavisinde çığır açıcı bir gelişme olan basınç tedavisinin keşfedilmesidir (Demir ve Şahin 2004). OSAHS, uykuda üst havayolunda tekrarlayan tıkanıklıklar nedeniyle oksijen desaturasyonu ve uyanma dönemleri olarak tanımlanmıştır. Uykuda kısa süreli solunum durması (apne) veya solunum azalması (hipopne) tek başına hastalık tanısı için yeterli değildir. Obstruktif uyku apne sendromu tanısı, apne-hipopne indeksinin (AHI: uykuda saat başına düşen toplam apne ve hipopne sayısı) 5 veya üstünde olması ile gündüz uykulu olma veya aşağıda sıralanan şikayetlerden en az ikisinin varlığında konur: i. uyku sırasında boğulur gibi olma, ii. uykudan sık uyanma, iii. dinlendirici olmayan uyku, gündüz yorgunluk, konsantrasyon güçlüğü gibi bilişsel bozukluk (The report of an American Academy of Sleep Medicine Task Force 1999). Apne ve hipopne en az 10 saniye süresince sırasıyla solunumun durması ve azalması olarak tanımlanmıştır. Hastalık tanısı için seçilen eşik apne-hipopne indeksi (AHI) değeri olan 5 rakamı epidemiyolojik araştırmalar sonucunda ortaya çıkmıştır. İzlem araştırmalarında AHI si 5 ve üstünde olan hastalarda gündüz uykululuk, hipertansiyon ve motorlu araç kaza riskinin artış gösterdiği görülmüştür (Fleetham 2004). Hastalık derecesi sınıflandırılırken de AHI den yararlanılmıştır. Hastalık şiddetini belirlemede kabul edilen AHI düzeyleri hafif düzey için 5-14, orta düzey için 15-30, ağır düzey için ise >30 şeklindedir (The report of an American Academy 2

of Sleep Medicine Task Force 1999). İlk hastalık tanımlarında apne üzerinde durulurken hipopnenin de apneye benzer şekilde oksijen saturasyonunda düşme (desaturasyon) ve uyanmaya neden olduğu gösterilmiş ve OSAHS tanımına hipopne de eklenmiştir (Meoli ve ark 2001). Literatürde OSAHS la eşdeğer şekilde kullanılan Obstruktif uyku apne hipopne sendromu veya uyku apne hipopne sendromu tanımlarına rastlanılabilir. Üst havayolunda direnç artışı sonucu apne-hipopne olmaksızın uyanma oluşması gece boyunca sık uyku kesilmelerine ve klinik olarak OSAHS benzeri sonuçlara yol açabilir (Guilleminault ve ark 1993). 1.2.2. Epidemiyoloji Prevalans oranları hastalığı tanımlamak için kullanılan ölçütlere göre değişmektedir. Çalışmalarda tanım olarak apne hipopne indeksi (AHI) AHI 5 alındığında OSAHS prevalansı erkeklerde 24, kadınlarda 9 olarak bildirilmektedir (Young ve ark 1993). Obstrüktif uyku apne/hipoapne sendromu çeşitli yaş gruplarını etkileyebilir. Amerikalı yetişkinlerde OSAHS görülme sıklığı 30-60 yaş arası erkeklerde 4 ve kadınlarda 2 olarak rapor edilmiştir. daha Orta yaş yetişkinlerde erkeklerin 82 sine kadınların 93 üne klinik olarak tanı konulmadığı tahmin edilmektedir (Young ve ark 1993). Köktürk ve ark (1997) tarafından Türkiyede yapılan bir araştırmada ise OSAHS prevalansı 0,9-1,9 olarak saptanmıştır. İleri yaş döneminde (65 yaş ve üstü) hastalık prevalansının arttığı tahmin edilmektedir (Partinen ve ark 1998). OSAHS ın maksimum sıklığı 50 ve 70 yaşlar arasında artmaktadır (Guilleminault 2004). Yaş ile OSAHS arasındaki ilişki karmaşıktır. Birkaç çalışmada orta yaşlı bireyler ile yaşlı bireyler karşılaştırıldığında yaşlı bireylerde daha yaygın olduğu rapor edilmiştir. Ayrıca erkekler kadınlardan OSAHS bakımından daha yüksek bir risk taşımaktadır. Sebebi tam olarak açık değildir; fakat hormonal etkiler kısmi bir açıklama sağlayabilir. Kadınlarda menopoz sonrası hastalık riski menopoz öncesinden daha yüksek görülmektedir (Silke ve Sean 2007). Yaş ve cinsiyetin haricinde obezite, horlama, ırk, ilaçlar, kraniofasial anatomi, nasal obstrüksiyon, ailesel ve genetik faktörler de OSAHS ın gelişme riskini artırabilir. Avrupalılar ile Maori ve Pasifik adalarında yaşayanlar arasında yapılan bir çalışmada boyun çevresi, vücut kitle indeksi, yaş gibi faktörler alındığında ırkın, uyku apnesinin ciddiyetinde önemli olmadığı gösterilmiştir (Guilleminault 2004). Wisconsin uyku grubunun topladığı bilgiler ışığında hafif dereceli OSAHS lı hastalarda vücut ağırlığındaki 10 luk bir artışın orta veya ciddi 3

dereceli OSAHS gelişimini 6 kat artırdığı gösterilmiştir (Sean ve ark 2005). Hipertansiyonlu hastalarda yapılan çalışmalarla OSAHS ın sıklığının 26-49, kontrol gruplarında ise 0-12 oranında olduğu belirlenmiştir (Houwelingen 1999). 1.2.3. Etiyoloji OSAHS çok sayıda gen, çeşitli çevresel faktörler ve gelişimsel faktörler tarafından etkilenen kompleks bir hastalıktır. Bu hastalık tekrar eden üst havayolu tıkanmalarına eğilim gösterir. Bu eğilim üst havayolu boyutu veya fonksiyonunu etkileyen nöromüsküler ve anatomik faktörler tarafından belirlenir. OSAHS için en güçlü risk faktörleri obezite ve erkek cinsiyetidir. Diğer risk faktörleri arasında boyun yapısı, yumuşak damak gelişimi, yaş, ilaçlar, çevresel etkiler ve genetik faktörler sayılabilir. 1.2.4. Klinik Özellikler OSAHS solunum çabası devam etmesine rağmen tam (apne) veya kısmi (hipoapne) kesilme ile sonuçlanarak uyku süresince farengeal hava yolunda tekrar eden tıkanmalarla karakterizedir. Bunlar aralıklı olarak kan gazı bozulmalarına (hiperkapni ve hipoksemi) ve sempatik aktivasyonunda dalgalanmalara yol açan solunum bozulmalarıdır. Gürültülü horlama OSAHS ın tipik bir özelliğidir ve birçok durumda bir solunum olayının sonucu kısa bir uyanıklık (arousal) ile sonlanmaktadır. Bu olaylar hastada, uyku ile uyanıklık arasında dalgalanmalar yaptığı için uyku bölünmeleri ve döngüsel bir solunum paterni ile sonuçlanır (Danny ve ark 2008). Bir diğer önemli semptom gün boyu aşırı uyuklamadır. Bu subjektif bir durum olduğu için belirlenmesi zordur. Klinik açıdan gün boyu uyuklamanın diğer sebepleri (metabolik) sorgulanmalıdır. Diğer olası semptomlar tıkanıklık olsun ya da olmasın kısa uyanıklıklar, gece terlemesi, uyku süresince anormal motor aktivitesi, idrar kaçırma, gastroözofagal reflü, başağrısı, göğüs ağrısı, cinsel yetersizlik, konsantrasyon ve hafıza kayıpları, kişilik değişiklikleri ya da depresyon olabilir (Houwelingen 1999). OSAHS kesin tanısı için altın standart tanı yöntemi olarak uyku laboratuarlarında kullanılan Polisomnografi (PSG) testinin yapılması gerekir (Houwelingen 1999). 4

1.2.5. Polisomnografi (PSG) Kesin tanısı konulacak hastaya, uyku süresince durumunu gözleyebilmek için bir gece uyku laboratuvarında polisomnografi testi uygulanır. Ayrıca subjektif bir test olan Epworth uykululuk skalası, gündüz aşırı uyku halini ölçmek için kullanılır. 10 puan ve üzeri patolojik olarak değerlendirilir. Uyku süresince saatteki apne/hipoapne sayısı olan apne/hipoapne indeksi (AHI) tanı kriteri olarak önemlidir. Obstrüktif apne, oksijen saturasyonundaki düşme ve uyanıklığa yol açan, göğüs ve karında bir çaba olmasına rağmen ağız ve burundaki hava akışının en az 10 saniye süre ile kesilmesidir. Hipoapne ise ağız ve burundaki hava akışının 50, oksijen saturasyonunun 3 lük düşmesi ya da hava akışının 30, oksijen saturasyonunun 4 azalması olarak tanımlanır (Kaparianos ve ark 2006). Bu hastalığın ağırlık derecelerine göre sınıflandırılması ise AHI <5 normal, AHI 5-14 arası hafif dereceli, 15-30 arası orta dereceli, 30 ve daha yukarısı ağır dereceli OSAHS olarak tanımlanır (Sousa ve ark 2008). 1.3. Obezite, Leptin, Leptin Reseptörü 1.3.1. Obezite Obezite, OSAHS için en büyük risk faktörlerinden birisidir (Redline ve Tishler 2000, Hiestand ve ark 2006). Klinikte görülen obez hastaların 50-77 sinde OSAHS saptandığı bildirilmiştir (Vgontzas ve ark 1994). Obstruktif uyku apne sendromlu olguların ise 70 inde obezite görülmektedir (Göçmen ve Karadağ 2007). Obez ve obez olmayan bireyleri ayırmada; vücut ağırlığının (kg), boy uzunluğunun (m) karesine bölünmesi ile elde edilen vücut kitle indeksi (Body Mass Index: BMI) yaygın olarak kullanılır. BMI; 25,0-29,9 arası olanlar aşırı kilolu 30,0 ve daha yukarı olanlar ise obez olarak tanımlanmıştır (Marik 2000). BMI, OSAHS insidansı ve şiddetiyle direkt olarak ilişkilidir (Lopez 2008). Obezite, boyun ve özellikle farenks çevresinde adipoz dokunun artmasıyla üst hava yolunu daraltmaktadır (Schwab ve ark 1995). Obezlerde üst hava yolu kapanma eğiliminin arttığı gösterilmiştir (Schwartz ve ark 1991). Özellikle santral obezite ile vital kapasitenin azalması, farenks üzerinde aşağı doğru genişletici kuvveti de azaltarak farenksin kapanabilirliğini arttırmaktadır (Demir 2007). Amerikada yapılan NHANES araştırması 1960 lı yıllardan 2000 li yıllara, 20-74 yaş grubu erişkinlerde BMI nin ortalama 25 kg/m² den 28 kg/m² ye çıktığını göstermiştir (Zhang ve ark 5

2009). Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) verilerine göre ise 2015 yılı içinde dünya nüfusunun yaklaşık 10 unun obez olacağı tahmin edilmektedir (McClean ve ark 2008). Obezite metabolik sendromun bir komponenti olarak kardiyovasküler hastalıklar için bilinen en önemli risk faktörlerinden biridir. OSAHS da da apneler sırasında kapalı hava yoluna karşı inspirasyon yapılmaya çalışılması sonucu oluşan intratorasik negatif basınç, hipoksemi, hiperkapni ve sık tekrarlayan arousallar ile otonom sinir sisteminin uyarılması, kardiyovasküler komplikasyonlara neden olmaktadır (Guilleminault ve ark 1993, Young ve ark 2002). Amerika Birleşik Devletleri nde her yıl uykuda solunum bozukluğunun kardiyovasküler komplikasyonları ile 38.000 kişinin öldüğü ve 42 milyon dolarlık hastaneye yatış maliyetinden sorumlu olduğu tahmin edilmektedir. Ciddi obez hastalar ventilasyon-perfüzyon uyumsuzluğuna sebep olan genişlemiş alveolar-arteriel oksijen değişimi ile sık sık hipoksemiktir. Dahası obezite pulmoner tromboembolizim için büyük bir risktir. Obezitenin etiyolojisi uzun bir periyod boyunca pozitif bir enerji dengesine sebep olacak potansiyele sahip birkaç faktör ile birlikte heterojen bir durum oluşturmaktadır. Bu faktörler yüksek bir yağ diyeti, alışılmış düşük seviyeli bir fiziksel aktivite, belirli bir vücut kitlesi ve kompozisyonu için düşük bir dinlenme metabolik hızı, açlık durumunda (standart koşullar altında lipidlerden daha çok karbonhidrat oksidasyonuna eğilim gibi) daha yüksek bir solunum oranı, muhtemelen yüksek insülin duyarlılığını içerebilir (Marik 2000). Obezite, düşük leptin seviyelerinden daha çok yüksek leptin seviyeleri ile karakterizedir. Bu durum obez insanlarda leptin direncinin olduğunu düşündürmektedir (Considine ve ark 1996). Birçok mekanizma leptin direnci ile ilgili olabilir. Mutant leptin reseptörüne bağlı azalmış leptin reseptör sinyalizasyonu bu durumun açıklamalarından biri olabilir (Schwartz ve ark 2005). 1.3.2. Leptin Adipoz dokunun sadece lipidlerin depo edildiği bir yer olmadığı, aynı zamanda bir faktör salgılayarak vücut ağırlığını kontrol edebileceği fikri ilk kez 1953 yılında ortaya atılmıştır (Tritos ve Mantzoros 1997). Zhang ve ark (1994) tarafından obezitenin tipik fenotipinden sorumlu obezite geninin (ob/ob) bulunduğu bildirilmiştir. Ob geni sitokinlere benzeyen, 167 aminoasit içeren, 16 kilodalton ağırlığında olan ve adını Yunanca leptos (ince) kelimesinden alan bir protein olan leptin hormununu sentezler (Tritos ve Mantzoros 1997). Obezitenin patogenezinin anlaşılmasındaki başlıca ilerleme leptin hormonunun keşfidir. Leptin yapıca 6

sitokinlere olan benzerlikleri nedeniyle, sitokin olarak da sınıflandırılabilmektedir. Sıçanlarda 6 nolu kromozomda bulunan ob geni (Considine ve Caro 1997) insanlarda 7q31.3 de (7. kromozomun uzun kolunun 31. ci bölgesi) lokalizedir (Green ve ark 1995). Bu genin iki intron tarafından ayrılmış üç ekzondan oluştuğu, bunlardan iki tanesinin (2. ve 3. ekzon) leptini kodlayan baz dizisini içerdiği gösterilmiştir (Considine ve Caro 1997). Bu baz dizisi 3.5 kb lik bir mrna kodlar ve translasyonla N terminalinde 21 aminoasitlik bir sinyal peptidi bulunan 167 aminoasitli prohormon sentezlenir (Brann ve ark 2002). Sirkulasyonda bu sinyal peptidi ayrılır, 146 aminoasitli ve 14-16 kda ağırlığındaki leptin molekülü oluşur (Sandoval ve Davis 2003). İnsan leptini sıçan leptini ile 83, fare leptini ile 84 homoloji gosterir (Considine ve Caro 1997). Vücutta başlıca adipoz (yağ) dokuda sentezlenen leptinin az miktarda plasenta, gastrik epitelyum, iskelet kası, hipofiz ve meme bezi tarafından da salgılandığı gösterilmiştir (Bado ve ark 1998). Leptin enerji dengesine oldukça duyarlıdır; diyet ve fiziksel aktivite leptin konsantrasyonunu etkilemektedir. Vücut yağ dokusu miktarı arttıkça leptin miktarı da artar. Obezlerde normale göre yaklaşık iki misli daha fazla leptin düzeyi vardır ve kan leptin miktarı vücut yağ kitlesiyle korelasyon gösterir. Vücut ağırlığındaki küçük değişiklikler serum leptin düzeyinde büyük değişikliklere yol açmaktadır. Obez insanlarda vücut ağırlığında 10 luk bir azalma ile serum leptin düzeyinde 53 lük bir azalma, ve vücut ağırlığında 10 luk bir artış ile ise serum leptin düzeyinde 300 lük bir artış görülür (Considine ve ark 1996). Leptinin vücuttaki başlıca rolü, gıda alınımı ve enerji metabolizmasını düzenlemek ve obezite gelişmesini engellemektir. Ayrıca, metabolizmanın düzenlenmesi, cinsel gelişim, üreme, hematopoez, immünite, gastrointestinal fonksiyonların düzenlenmesi, sempatik sinir sistemi aktivasyonu, anjiogenez ve osteogeneziste de çok önemli rolleri olduğu saptanmıştır. Leptin eksikliği veya direnç durumları insanda obezite, diyabet ve infertilite ile sonuçlanmaktadır (Hekimoğlu 2006). Leptin lipid oksidasyonunu arttırması ile birlikte yağ asidi ve trigliserit sentezini azaltarak intraselüler lipid artışını engeller. Lipid metabolizmasına etkisi, yağ asiti sentezinde enzim hızını sınırlayarak, asetil CoA karboksilaz aktivitesini engelleyen bir etki olabilir (Marik 2000). Leptin regülasyonunun incelenmesinde bazal leptin ve plazma leptin düzeyindeki değişikliklere etki eden genetik ve çevresel faktörlerin anlaşılması önem taşır. 7

1.3.3. Leptin Reseptörü (LEPR) Tartaglia ve ark (1995), leptin reseptörlerinin yapısını ve yerleşimini tanımlamışlardır. Leptin reseptörü, sitozolik transkripsiyon aktivatörü (STAT) proteinlerinin aktivasyonu yoluyla gen transkripsiyonunu uyardığı bilinen gp130 sitokin reseptör ailesinin bir üyesidir (OMIM 2009). Leptin reseptörü OB-Rb (uzun reseptör) ve OB-Ra ( kısa reseptör) olarak 2 alternatif kırpılma (splicing) izoformuna sahiptir (Yiannakouris ve ark 2001). Biyolojik olarak aktif olanlardan birisi Ob-Rb izoformu sinyal transdüksiyonu kapasitesine sahiptir ve hipotalamusta (nükleus arkuatus) bol olarak ifade edilir. OB-Ra ise intraselüler sinyal için gerekli olan segmentlerin tümünü taşımazlar ve bu nedenle sinyal iletiminde rolleri çok az veya yoktur. OB-Ra reseptörlerinin bulunduğu başlıca dokular böbrek, akciğer, pleksus koroideus ve beyin kapillarlarıdır. Son ikisinde OB-Ra reseptörlerin bol bulunması bunların leptinin merkezi sinir sistemine transportunda önemli görevleri olduğunu düşündürmektedir (Aslan 2004). Leptin reseptör geninin OB-Rb formu 70 kb dır ve 20 exon içerir (Şekil 1.1.). LEPR reseptörü protein yapısına göre hücredışı, transmembran ve hücreiçi bölgelerden oluşur. LEPR geninde birkaç fonksiyonel önemli domain vardır. Hücredışı bölgede ligand bağlanmasını sağlayan iki sitokin motifi (GXWSXWS) içerir. Hücreiçi bölge hipotalamusta STAT ve Janus-aktive kinazla (JAK) etkileşen diziler bulundurur (Matsuoka 1997, Yong-Jun ve ark 2003). 1.3.4. Leptin Reseptör Gen Polimorfizmleri Evrim boyunca seçici baskı altında olan mutasyonların toplumda nadir gözlenen değişiklikler olmasına karşın polimorfizmler toplumda yaygın olarak bulunurlar (1 in üzerinde). Oluş mekanizmalarına ve bulundukları yere göre farklı tipte polimorfizmler mevcuttur: kısa DNA baz tekrarları (mikrosatellit), uzun DNA baz tekrarları (VNTR), DNA nın tek bir bazındaki değişiklikler (SNP). LEPR genine ait OB-Rb gen yapısında 7 varyant bulunur. Bu tek nükleotid polimorfizmleri (SNP ler) Şekil 1.1. de verilmiştir. 8

Şekil 1.1. LEPR geninin şematik görünümü. LEPR deki tek nükleotid polimorfizmleri; ekzon 4 de 329. nükleotid de A G (Lys109Arg), ekzon 6 da 668. nükleotitte A G (Gln223Arg=Q223R), ekzon 9 da 1029.nükle otitte T C (Ser343Ser), ekzon 11 de 1475. nüklotitte G C (Ser492Thr), ekzon 14 de 1968. nükleotitte G C (Lys656Asn), ekzon 20 de C A (Ala976Asp), G A(Pro1019Pro) transisyon ve transversiyonları görülür (Matsuoka 1997). 1.4. Hipoksi ve Hipoksi İndüklenebilir Faktör-1α (HIF-1α) Geni 1.4.1. Hipoksi ve OSAHS İlişkisi Hipoksi; oksijen verimi veya oksijen varlığının azalmasına yol açan nedenlerden kaynaklanır. Sürekli veya aralıklı olarak ve zamanla akut ya da kronik olarak ortaya çıkabilir. Kronik sürekli hipoksi fizyolojik ve patolojik durumda meydana gelirken, kronik aralıklı hipoksi yalnızca patolojik durumda meydana gelir (Semenza 2009). Vücut içinde parsiyel oksijen basıncı (PO2) seviyeleri, üst hava yolunda 150 mm Hg dan, retinada 5mm Hg ye kadar düşer (Taylor 2008). Oksijen homeostazının korunması kompleks bir olaydır; hormonal, otokrin ve nöronal mekanizmalar arasındaki ilişkiyi gerektirir. Bu faktörlerde meydana gelecek bir dengesizlik, patolojik süreçleri beraberinde getirir ve hipoksi ile ilişkili hastalıklara yol açar. Günümüzdeki çalışmalar metabolik sorunların OSAHS la ilişkili hipoksik stresle bağlantılı olduğunu göstermektedir (Jianguo ve ark 2006). 1.4.2. İntermittent (Aralıklı) Hipoksi İntermittent (Aralıklı) Hipoksi, 15-30 sn lik kısa süreli hipoksinin ardından, daha uzun süreli (örn 5 dak) yeniden oksijenlenme periyotlarından oluşur. İntermittent hipoksinin bir fare modelinde OSAHS ve metabolik sendrom arasındaki ilişki değerlendirilmiştir (Polotsky ve ark 2003, Li ve ark 2005a, 2005b). 5 gün boyunca intermittent hipoksiye maruz bırakılan farelerde hiperkolesterolemi ve 9

hipertrigliseritemi görülmüştür (Li ve ark 2005a). İntermittent hipoksi, lipid biyosentezinin anahtar bir transkripsiyon faktörü olan sterol düzenleyici element bağlama proteini (SREBP)-1 tarafından karaciğerde trigliserit biyosentezini arttırır (Shimano ve ark 1999, Horton ve ark 2002, Li ve ark 2005). İntermittent hipoksinin, HIF-1 in lipid biyosentezini arttıran SREBP-1 yolağını düzenleyerek uyardığı düşünülmektedir (Cai ve ark 2003, Yuan ve ark 2005). 1.4.3. Kronik İntermittent Hipoksi Hipoksemiye yol açarak solunumun kesilmesi ve hava yolunu tıkaması ile sonuçlanan, sonrasında soluk alıp verme için bireyin uyarıldığı OSAHS lı hastalarda görülür. Li ve ark (2006) nın yaptığı bir çalışmada, OSAHS ın kronik intermittent hipoksiyle tanımlandığını, lipid metabolizması ve aterosklerozun düzensizliği ile ilişkili olduğunu söylemişlerdir. Ayrıca, obezitenin varlığında kronik intermittent hipoksinin hiperkolesterolemi ve lipid peroksidasyonuna yol açtığını ortaya koymuşlardır. Hem hipoksemi (kanın eksik oksijenlenmesi) hem de hiperkapni (kanda karbondioksit fazlalığı) nöronal refleks mekanizmaları aracılığıyla çeşitli kardiyovasküler etkilere sahiptirler (Xie ve ark 2000). Bundan dolayı, hipoksinin uyku apnesinde kardiyovasküler hastalıkların gelişiminde rol oynadığı düşünülmektedir. Kronik intermittent hipoksi ayrıca sistemik hipertansiyonla uyarılır, OSAS ın sistemik hipertansiyonlu bireylerin 30 unda arttırıcı etki yaptığı düşünülmektedir (Laughner 2001). Ayrıca, rodentlerde ve insanlarda ROS üretimini ve HIF-1α ekspresyonunu da uyarır (Dyugovskaya ve ark 2002, Peng ve ark 2006, Prabhakar ve ark 2007). 1.4.4.Hipoksi İndüklenebilir Faktör-1 α (HIF-1α) Geni HIF in tanımlanması, eritropoietinlerde kronik hipoksinin çarpıcı etki mekanizmalarının araştırılmasına dayanır. Eritropoietin (EPO) geninin 3 enhansır bölgesinde DNA-protein etkileşimlerini kullanarak yalnızca hipoksik koşullar boyunca kısıtlanan bir protein kompleksi keşfedildi. Bu protein kompleksine bağlanarak EPO geninin transkripsiyonunun artmasına ve sonuç olarak EPO üretiminde artışa neden olmuştur. Bu kompleks daha sonraları Hipoksiyle İndüklenen Faktör-1 (HIF-1) olarak isimlendirildi (Semenza ve ark 1991). Hipoksiye hücresel yanıt çok aşamalı bir süreçtir ve transkripsiyonel yanıtların çoğu HIF ler tarafından düzenlenir. Bu HIF gen ailesinin ana elemanları hipoksi ile indüklenen genlerin ifadelenmesini aktive eden HIF-1α geni ve diğeri HIF-1α proteini ile heterodimer oluşturan aryl hydrokarbon reseptör nüklear translokator (ARNT) 10

proteininin sentezinden sorumlu HIF-1β genidir. Bu heterodimer yapı PAS (Per- Arnt-Sim) ailesinin temel heliks-loop-heliks (bhlh) proteinleridir (Şekil 1.2.). (Kelsey 1993, Park ve ark 2003, Yamada ve ark 2005, Ke ve Costa 2006). Dimerizasyon+DNA bağlanma Transaktivasyon+regülasyon Şekil 1.2. HIF-1 in yapısı (Semenza 2009). HIF-1α, HIF-1 in varlığını saptadığı ve hipoksi ile indüklenen genleri aktive ettiği için ana proteindir (Yamada ve ark 2005). HIF-1α; kromozom 14q20-24 de bulunan, 15 ekzon ve 14 introndan oluşan bir gendir. Bu gen yapısında 3 ü yaygın 6 sı nadir olmak üzere toplam 9 varyant bulunmaktadır. Bunlardan exon 12 de 85. nükleotitde görülen C T değişikliği, proteinin aminoasit dizisinde prolinin serine dönüşümüyle sonuçlanır (Şekil 1.3.). Şekil 1.3. HIF1-α geninde görülen varyantlar (Prior ve ark 2003). 11

HIF-1β, oksijene yanıt oluşturmaz; fakat fonksiyonel HIF kompleksinin oluşumu için gereklidir. HIF α/ β heterodimerleri; 5 -RCGTG-3 merkezi nükleotid sekansı ile hedef genin güçlendirici ya da promotorunda bir DNA bağlanma motifi olan hipoksi yanıt elementleri (HRE) üzerindeki hedef genlere bağlanır (Semenza 1992). HIF-1 proteinleri hücre ve dokularda düşük oksijen basıncına adaptasyon hücre sağ kalımı ve çoğalması, anjiyogenez, eritropoez, glikoz alınımı ve demir metabolizması gibi proseslere bağlı birçok genin hipoksiye transkripsiyonel aktivasyon cevaplarının anahtar düzenleyicisidir. HIF-1α normoksik koşullar altında, oksijen bağımlı prolin hidroksilaz proteinleri (PHD) tarafından, oksijen bağımlı degregasyon domaini (ODD) prolin 402 ve 564 bölgesine hidroksillenir. Hidroksillenen HIF-1α alt üniteleri sonraki degradasyonlar için E3 ubikütin ligaz kompleksinin bir parçası olan VHL proteininin hedefidir. Bunun dışında HIF-1α nın normoksik modifikasyonları onun transkripsiyonel aktivasyonunu da etkileyebilir. HIF-1α nın C-terminal transaktivasyon domeynine asparajin 803 üzerindeki hidroksilasyon, faktör inhibe edici HIF-1 (FIH) tarafından normokside katalizlenir (Jessica and Karen 2011). Bu hidroksilasyon ile HIF-1α nın CBR (CREB bağlanma proteini) ve P300 transkripsiyonel ko-aktivatörler ile etkileşimleri FIH tarafından baskılanarak regüle edilir (Hewitson ve ark 2002, Lando ve ark 2002). (Şekil 1.4). FIH sitoplazmada lokalize olmakla birlikte bazı fraksiyonları için çekirdekte de bulunabilir. FIH transkripsiyonu oksijen konsantrasyonundan bağımsızdır ve HIF-1α stabilitesini etkilemez (Metzen ve ark 2003). 12

Şekil 1.4. HIF-1 in oksijen-bağımlı regülasyonu. Normakside (sağ taraf), HIF-1α nın iki prolin resüdüsü (P 402 ve P 564 ) ve asparajin (N 803 ) sırasıyla PHD ve FIH la O 2, 2- OG ve Fe 2+ ye bağımlı şekilde hidroksilize edilir. Hidroksillenen HIF-1α VHL proteini için bağlanacak bir yer oluşturur ve bu şekilde HIF-1α nın ubikuitinasyonu ve proteozom aracılı yıkımı tetiklenir. Hipoksi dumunda (sol taraf) PHD ve FIH aktiviteleri baskılanarak prolin ve asparajinlerin hidroksilasyonu ortadan kalkar, ve VHL bağlanması olmaz. Bu durumda hidroksillenmemiş HIF-1α nın CBP bağımlı p300 proteinlerine yönlendirilmesine, fosfatlanmasına ve HIF-1α stabilizasyonuna yol açılır. Stabillenen ve biriken HIF-1α proteinleri çekirdeğe transloke olur, HIF-1β ya bağlanır. Oluşan heterodimer DNA nın hipoksi ile regüle olan element (HRE) sekanslarına bağlanır ve hedef genlerin transkripsiyonunu sağlar (Benarroch 2009). Hipoksik koşullarda ne PHD ler ne de FIH fonksiyoneldir. HIF-α proteazomal yıkımdan kaçar, sitozolde birikir, stabil hale gelir, fosforillenir ve nükleusa geçerek HIF-β ile heterodimerik bir kompleks oluşturur. Bu kompleks hipoksiyle indüklenebilen genlerin promotor ya da güçlendirici DNA sekanslarına bağlanır. HRE lere HIF bağlanması sonucu hedef genlerin transkripsiyonu başlar (Lee ve ark 2004, Maynard ve Ohh 2005) (Şekil 1.5.). Hipoksiye ek olarak, TNF-α ve interlökin 1β gibi proinflamatuar sitokinler de HIF ifadesini tetikleyebilir (Rabie ve Marti 2008). 13