ÖZEL EGE LİSESİ BUĞDAY YETİŞTİRİCİLİĞİNDE KULLANILAN HERBİSİDLERİN YARATTIĞI BİYOKİMYASAL DEĞİŞİMLER VE TOPRAK MİKROORGANİZMALARININ ÜZERİNE ETKİSİ HAZIRLAYAN ÖĞRENCİ: Umut Can YAĞAN İZMİR 2006
İÇİNDEKİLER Giriş... 2 Materyal ve yöntem... 3 Toplam aerob mezofilik bakteri sayımı... 4 Malondialdehid tayini... 5 Asetilkolinesteraz aktivite tayini... 5 Katalaz aktivite tayini... 6 Sonuçlar ve tartışma... 6 Kaynakça... 9 1
BUĞDAY YETİŞTİRİCİLİĞİNDE KULLANILAN HERBİSİDLERİN YARATTIĞI BİYOKİMYASAL DEĞİŞİMLER VE TOPRAK MİKROORGANİZMALARININ ÜZERİNE ETKİSİ Sebze yetiştiriciliğinde tarım alanlarında kullanılan pestisitler, su içerisinde doğal olarak güç parçalanan bileşikler olup bunların bir bölümü besin döngüsü ile insanlar ve hayvanlara geçerek birikim yapmakta ve toksik etkilere neden olmaktadır. Ayrıca doğal ortamlarda etki süresi uzun olduğundan, bunların parçalanarak kaybolması yıllarca sürebilmektedir. Buğday yetiştiriciliği Türkiye de yaygındır ve yabani otlara karşı sıklıkla kullanılan herbisitlerin özellikle önerilen dozda kullanımında buğday ve toprak mikroorganizma sayısı üzerine etkisi incelenmiştir. Kontrol grubu, önerilen doz ve yüksek doz herbisid uygulanarak yetiştirilen buğdayların kök ve gövdeleri ayrılıp homojenizasyon, santrifüjleme ile hücre atıklarının ayrılmasının ardından bazı biyokimyasal analizler ve toprak örneklerinde mikroorganizma sayı tespiti yapılmıştır.. Her bir örnekte yapılan protein tayinlerine bakılınca yüksek dozda yaklaşık 2 kat azalma, MDA da 1.8 kat artış saptanmıştır. Pestisit uygulama ile asetilkolin esteraz aktivitesinde özellikle yüksek dozda inhibisyon görülmektedir. Katalaz aktivite sonuçları antioksidan enzimin pestisit uygulanmış örneklerinde kontrol grubuna kıyasla azalma saptanmıştır. Her bir grup toprak örneklerinde 5 farklı seyrelme kullanılarak yapılan mikroorganizma sayıları pestisit uygulanan örneklerde azalmıştır. Buğday, tek yıllık bitki olup, her türlü iklim ve toprak koşullarında yetişebilecek çok sayıda çeşitliliğe sahip olması nedeniyle, gerek dünyada gerekse ülkemizde en fazla üretilen tarım ürünlerinden biridir. Buğday yetiştiriciliğinde yabani otlara karşı herbisidlerin kullanımı yaygındır. Bu projede önerilen dozda (200 ml / dekar) ve aşırı (400 ml/dekar) dozda uygulanan pestisitin buğdayın protein içeriğiyle, malondialdehid düzeyine, asetil kolin esteraz ve antioksidan enzimlerden katalaz düzeyine etkisini saptamak amaçlanmıştır. Çalışmamızda, ayrıca kullanılan herbisidin toprak mikroorganizmaları üzerine etkisinin belirlenmesi ve verilerin kontrol grubuyla karşılaştırılması amaçlanmıştır. Buğday, tek yıllık bir bitki olup, her türlü iklim ve toprak koşullarında yetişebilecek çok sayıda çok sayıda çeşitlere sahip olması nedeniyle, dünyanın hemen her tara fında yetiştirilmektedir. Buğday gerek dünyada; gerekse ülkemizde en fazla üretilen tarım ürünüdür. Buğday yetiştiriciliğinde hastalık, zararlı ve yabancı otların neden oldukları zararlara bakıldığında, yabancı otlardan kaynaklanan verim kaybının %10 civarında olduğu tahmin edilmektedir. Örneğin, buğdayda zararlıların meydana getirdiği ürün kaybı %5 iken hastalıklarım %9.4, yabancı otların meydana getirdiği ürün kaybı ise %9.8 olmaktadır. Anlaşılacağı üzere kültür bitkileri açısından yabancı otlarda zararlı ve hastalıklar kadar önemli olduğu ve mutlaka mücadele yapılması gerektiği ortaya çıkmaktadır. Sebze yetiştiriciliğinde tarımsal savaşım, bitkilerin hastalık, zararlı ve yabancı otların etkilerinden ekonomik ölçüler içinde korunması, ürünün ve kalitenin arttırılmasıdır. Tarımsal savaşımın yöntemlerinden biri de pestisitlerin kullanıldığı kimyasal savaşımdır. Tarım alanlarında kullanılan pestisitler, su içerisinde doğal olarak güç parçalanan bileşikler olup bunların bir bölümü besin döngüsü ile insanlar ve hayvanlara geçerek birikim yapmakta ve toksik etkilere neden olmaktadır. Ayrıca doğal ortamlarda etki süresi uzun olduğundan, bunların parçalanarak kaybolması yıllarca sürebilmektedir. Bunlar bitki üzerinde etki ettiği gibi toprak mikroorganizmaları üzerine de etki ederek ekolojik dengeyi etkileyebilirler. 2
Serbest radikaller bir veya daha fazla eşleşmemiş elektrona sahip, kısa ömürlü, kararsız, molekül ağırlığı düşük ve çok etkin moleküller olarak tanımlanır. Çoğu olayda serbest radikal üretimi, pato-mekanizmanın bir parçasıdır ve pek çok ksenobiyotiğin toksisitesi, serbest radikal üretimi ile ilgilidir. Pestisid gibi bazı çevre kirleticilere uzun süre maruz kalmalar, oksidatif strese neden olabilir ki bu, biyolojik sistemlerdeki istenmeyen etkilerin altında yatan bir mekanizmadır. Oksidatif stres basit bir şekilde, vücudun antioksidan savunması ile hücrelerin lipid tabakasının peroksidasyonuna neden olan serbest radikal üretimi arasındaki dengesizlik olarak tanımlanabilir. Oksidatif stres, toksisitenin olası bir mekanizması olarak son yıllarda toksikolojik araştırmaların odağı haline gelmiştir. Oluşan serbest radikaller, özellikle oksijen kaynaklı radikaller, hücre zarlarının fosfolipid, glikolipid, gliserid ve sterol yapısındaki doymamış yağ asitleriyle reaksiyona girerek peroksitler, alkoller, aldehitlermgibi çeşitli lipid peroksidasyon ürünlerini oluşturur. Lipid hidroperoksitlerin yıkımı ile oluşan ve biyolojik olarak aktif olan aldehidler ya hücre düzeyinde metabolize olurlar ya da başlangıçtaki etki alanlarında diffüze olup hücrenin diğer bölümlerine hasarı yayarak sekonder bozuklukların da göstergesi olabilirler. Lipid peroksidasyonun en önemli ürünü malondialdehid (MDA) dir. Üç ya da daha fazla çift bağ içeren yağ asitlerinin peroksidasyonunda MDA meydana gelir. Oluşan MDA, hücre membranlarından iyon alış-verişine etki ederek membrandaki bileşiklerin çapraz bağlanmasına yol açar ve iyon geçirgenliğinin ve enzim aktivitesinin değişimi gibi olumsuz sonuçlara neden olur. MDA bu özelliği nedeniyle, DNA nın bazları ile reaksiyona girebilir ve bundan dolayı mutajenik, hücre kültürleri için genotoksik ve karsinojeniktir. Çalışmamızda makarnalık buğday tohumları bir gece soğuk odada( 4 0 C) şoklanarak çimlendirildi. Çimlenen buğdaylar gübre, bahçe toprağı ve perlit karıştırılarak hazırlanan ortamlara 3 grup halinde ekildi ve iklim dolabında tutuldu. 10. günde önerilen dozda 200ml/dekar ve aşırı dozda (400 ml / dekar) herbisid uygulanarak 1 hafta sonunda buğdaylar toplandı ve protein, MDA düzeyi, asetilkolinesteraz enzim aktivite tayini ve antioksidan enzim katalaz aktivite tayinlerini içeren biyokimyasal deneylerin yanı sıra herbir toprak örneklerinde mikroorganizma sayımı yapıldı. MATERYAL VE YÖNTEM Çalışmamızda kullanılan tiyobarbütirik asit Merck firmasından temin edildi. Makarnalık buğday tohumları Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesinden temin edildi. Çalışmada kullanılan herbisid(weed Killer D, 2.4-D) Koruma Klor alkali firmasından temin edildi. Kullanılan diğer kimyasallar analitik saflıktadır. Çalışmamızda makarnalık buğday tohumları bir gece soğuk odada( 4 0 C) şoklanarak çimlendirildi. Çimlenen buğdaylar gübre, bahçe toprağı ve perlit karıştırılarak hazırlanan ortamlara 3 grup halinde ekildi ve iklim dolabında tutuldu. 10. günde önerilen dozda 200ml/dekar ve aşırı dozda (400 ml / dekar) herbisid uygulanarak 1 hafta sonunda buğdaylar toplandı ve kök, gövde ayırılarak bidestile su ile yıkanıp süzgeç kağıdından kurutuldu. Her bir örneğin kütlesi tespit edilerek homojenizasyon işlemine geçildi. Şekil 1 de verilen deney şeması kullanılarak denemeler yapıldı. 3
Buğday örneklerinin ( kök ve gövde) 10mM ph 7.0 fosfat tamponunda homojenizasyonu Çökelek (Hücre atıkları atıldı) 5000 g x 10 dak santrifüj Lipid peroksidasyonunun tayini Santrifüjat *TBA yöntemi Oluşan MDA nın TBA reaktifi kullanılarak spektrofotometrik tayinine dayanır. Oluşan renkli komplex 532 nm de belirlendi. Hesaplamada 0-15µM aralığın da 1,1,3,3-tetrametoksipropan ile çizilen standart grafik kullanıldı. MEZOFİLİK BAKTERİ SAYIMI Protein Tayini *Bradford reaktifi kulanılarak oluşan renkli komplexin 595 nm de spektrofotometrik tayinine dayanır. TOPLAM AEROB Asetilkolin esteraz aktivite tayini Ellman reaktifi kullanılarak Deney oluşan Şeması rengin spektrofotometrik tayini yapıldı. Dökme plaka yöntemine göre, toprak örneklerinde gerekli seyreltmeler yapılarak 1 er ml petrilere konularak üzerlerine 45 o C ye kadar Antioksidan enzim olan katalaz aktivite tayini soğutulmuş PCA döküldü. 8 hareketi ile karışması sağlanmış ve H 2 O 2 in 240 nm deki absorbansındaki azalmanın katılaşması için beklenilmiştir. 25- spektrofotometmetrik tayine dayanır. 27 o C de 2 gün süre ile inkübe edilmiştir. Süre sonunda koloniler sayılarak seyreltme faktörü ile çarpılıp 1 gramda bulunan toplam aerobik mezofilik bakteri sayısı belirlenmiştir. Homojenizasyon: Kontrol grubu da dahil kök ve gövdeleri içeren herbir örnek ph 7,0 50 mm fosfat tamponunda homojenize edilerek santrifüjlendi. Santrifüjlemenin ardından üst fazlar biyokimyasal analizlerin yapılması amacıyla 20 0 C de depolandı. MALONDİALDEHİD(MDA) TAYİNİ: Kontrol ve pestisid uygulanarak yetiştirilen buğday örneklerinde lipid peroksidasyon düzeyi MDA tayini yapılarak saptandı. Yöntem, oluşan MDA nın TBA reaktifi kullanılarak spektrofotometrik tayinine dayanmaktadır. Oluşan MDA, TBA ile komplex oluşturur ve oluşan renkli komplexin absorbans şiddeti 532 nm de belirlendi. 4
MDA miktarının hesaplanmasında 0-15 µm konsantrasyon aralığında 1,1,3,3-tetrametoksi propan ile çizilen standart grafiği kullanıldı. Reaktifler: TCA : %20 lik trikloroasetik asit TBA : %20 lik (w/v) TCA içinde %0.8 lik(w/v) tiyobarbuturikasit Yöntem: Deney tüpüne 1 ml örnek 1 ml d-su konulup üzerine 2 ml TBA reaktifi eklendi, vortexlemenin ardından 95 o C de 30 dak inkübe edildi. İnkübasyonun ardından tüpler soğutularak 532 nm de suya karşı absorbans değerleri kaydedildi. Protein Tayini: Örneklerde protein tayini Bradford reaktifi kullanılarak yapıldı. Reaktifler: Bradford reaktifi: 40 mg Coomassie Brillant Blue G-250, %95 lik 50 ml etanolde çözüldü, üzerine 55 ml %88 lik fosforikasit ilave edilerek d-su ile hacim 1 L ye tamamlandı. Yöntem: 0,1 ml örnek üzerine 1.0 ml Bradford reaktifi ilave edilerek oda sıcaklığında 10 dak inkübasyonun ardından 595 nm de absorbans değerleri köre karşı okunur. 0-0.30 mg/ml serum sığır albumin kullanılarak çizilen standart grafik yardımıyla her bir örnek için protein miktarları tespit edildi. ASETİLKOLİNESTERAZ AKTİVİTE TAYİNİ Asetilkolinesteraz kolinesterazlar sınıfına ait bir enzim olup, asetilkolin gurubunun hidrolizini katalizlemektedir. Enzim aktivitesinin belirlenmesinde spektrofotometrik yöntem olan Elman yöntemi kullanıldı. Reaksiyon sonunda oluşan sarı renkli bileşiğin oluşum hızı 412 nm de absorbans ölçümü yapılarak belirlendi. Reaktifler: 50 mm ph 7.0 fosfat tamponu Ellmann reaktifi, 0.267 mm DTNB içeren 25 ml distile suda hazırlandı. ACThI, 75mM/2 ml asetilkolin iyodür. Yöntem: Kör Örnek DTNB 0,50 ml 0,50 ml ACThl 0,05 ml 0,05 ml Tampon 2,50 ml 2,30 ml Deney tüpleri yavaşça karıştırılarak 37 o C su banyosunda 10 dak inkübe edildi. İnkübasyon süresi sonunda tüplerin 420 nm de absorbansları kaydedilerek aşağıda verilen bağıntı ile aktivite hesapları yapıldı. U/ dak Hacimsel aktivite: 9,6x t 5
KATALAZ AKTİVİTE TAYİNİ Her bir örnekte katalaz aktivitesi, H 2 O 2 parçalanmasının 240 nm de spektrofotometrik olarak izlenmesine dayanır. Reaktifler: 50 mm ph 7.0 fosfat tamponu H 2 O 2 çözeltisi, 80 µl %30 luk H 2 O 2 alınarak hacim 50 ml ye fosfat tamponu ile tamamlandı. Yöntem: H 2 O 2 in başlangıç absorbans değeri belirlendikten sonra 20 ml örnek eklenerek 10 sn aralıklarla 240 nm de absorbans değerleri kaydedildi ve aşağıda verilen bağıntı kullanılarak enzim aktivite hesapları yapıldı. Hacimsel aktivite : A 2,3log A 0 13,1 x 0,02x6,93.10 3 U/ml SONUÇLAR VE TARTIŞMA Kontrol ve pestisid uygulanarak yetiştirilen buğday örneklerinde lipid peroksidasyon düzeyi MDA tayini yapılarak saptandı. MDA miktarının hesaplanmasında 0-15 M konsantrasyon aralığında 1,1,3,3-tetrametoksi propan ile çizilen standart grafiği kullanıldı. Çizilen standart grafik, denklemi y=0,106x olarak hesaplandı(şekil 2). Bilinmeyen örnekler de 532 nm de okunan absorbans değerleri denklemde yerine konularak her bir örnekte MDA düzeyi saptandı ve tablo1 de verildi. A (532nm) 2 1,5 1 0,5 0 0 5 10 15 20 C (µm) Şekil 2: MDA Standart Grafiği Tablo 1: Lipidperoksidasyon Düzeyinin Belirlenmesi Toplam MDA (µm) MDA/g kütle Örnek Kök Gövde Kök Gövde Kontrol 42,122 123,770 7,130 7,140 6
Düşük doz 62,358 127,810 9,240 8,280 Yüksek doz 84,460 174,430 12,990 17,240 MDA tayinlerine bakıldığında yüksek doz örneklerde lipid peroksidasyon düzeyinde 1.8 kat artış saptanmıştır. Tablo 1 de görüldüğü gibi lipid peroksidasyonu buğday kök örneklerinde daha fazladır. Her bir örnekte protein tayini Bradford reaktifi kullanılarak yapıldı ve çizilen standart grafik, denklemi y=2.0209x olarak hesaplandı(şekil 3). Bilinmeyen örnekler de 595 nm de okunan absorbans değerleri denklemde yerine konularak her bir örnekte protein düzeyi saptandı. Toplan hacim ve kök, gövde kütleleri dikkate alınarak toplam protein içerikleri tespit edildi. Tablo 2 de her bir örnek için saptanan toplam protein miktarları özetlenmiştir. A(595nm) 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 c(mg/ml) Şekil 3: Protein Standart Grafiği Tablo 2: Protein Miktarları Toplam protein (mg) Mg-protein/g kütle Örnek Kök Gövde Kök Gövde Kontrol 7,345 17,590 2,266 2,451 Düşük doz 8,450 21,220 1,251 1,374 Yüksek doz 13,495 12,860 1,139 1,234 Her bir örnekte yapılan protein tayin sonuçlarına bakılınca kontrol grubuna kıyasla yüksek dozda yaklaşık 2 kat azalma görülmektedir. Antioksidan enzim olan katalazın her bir örnekte tayini yapılarak hacimsel aktivite ve toplam aktivite değerleri tablo3 de verildi. Pestisidler, oksidatif strese, serbest radikal üretimine, 7
antioksidanlarda değişime yol açabilirler. Lipid peroksidasyon, pestisidlerin neden olduğu zehirlenmelerde zehirlenme mekanizmalarından biri olarak belirtilmiştir. Fazla miktarda reaktif oksijen grubunun açığa çıkması, glutasyon tükenmesine yol açılması, selenyum, bakır gibi bazı metallerin eksikliği veya fazlalığı (Se) bu yeteneği sınırlandırır. Böylece açığa çıkan reaktif oksijen türleri hücre zarları, DNA, RNA gibi yapılarda hasara neden olur. Tablo değerleri dikkate alındığında kontrole kıyasla yüksek doz pestisit uygulanan örneklerin köklerinde katalaz aktivitesi yaklaşık 32 kat azalırken gövdede bu katsayı 1.6 kat olarak saptanmıştır. Tablo 3: Katalaz Aktivite Düzeyinin Belirlenmesi Hacimsel aktivite (U/ml) Toplam aktivite (U) Örnek Kök Gövde Kök Gövde Kontrol 61.29 29,93 1496,50 3064,50 Düşük doz 16,78 36,44 419,53 2186,40 Yüksek doz 1,85 37,14 46,33 1857,00 Farklı seyrelme oranı kullanılarak hazırlanılan toprak örneklerinde mikroorganizma sayı tespiti yapıldı ve bulgular tablo 4 de verildi. Tablo 4: Toprak örneklerinde Mikroorganizma Sayı Tespiti Örnek Mikroorganizma Sayısı Kontrol 8,00.10 6 Düşük doz 4,80.10 6 Yüksek doz 4,80.10 6 KAYNAKLAR: 8
1-Touati D., in: Scandalios J.G. (Ed.), Oxidative Stress and the Molecular Biology of Antioxidant Defenses,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,1997, 447 493. 2-Özdemir, G., Hamarat Baysal, Ş., Chromium and alımınum biosorption on Chrysomonas luteola, Applied Microbiology and Biotechnology, 64, 599-603, 2004. 3-Halliwel, B. and Gutteridge J.M.C, 2000, Free Radicals in Biology and Medicine, Oxford Science Publication, London. 4-Abdollahi M., Ranjbar A., Shadnia S., Nikfar S. and Rezaie A., 2004, Pesticides and oxidative stress: a review, Med. Sci. Monit., 10(6), 141-147 5-http: // www.bahce.biz/ bitki / tarla / tahil / buğday 9