KROMOTOGRAFİK YÖNTEMLER Dr.Ayhan Ünlü
Kromatografi (chromatography) Nedir? Kromatografi, bir karışımda bulunan maddelerin, biri sabit diğeri hareketli faz olmak üzere birbirleriyle karışmayan iki fazlı bir sistemde ayrılması ve saflaştırılması yöntemidir.
Kromatografi(chromatography) Nedir? Kromatografi, bir karışımda bulunan bileşenlerin birbirinden ayrılmasını gerçekleştiren ve bu sayede kalitatif ve kantitatif analizlerinin yapıldığı yöntemlerin genel adıdır. Bu yöntemlerde çalışma düzeneği temel olarak iki bileşenden oluşur. Bu bileşenlere sabit faz (stationary phase) ve hareketli faz ya da mobil faz (mobile phase) adı verilir. Çeşitli maddelerin hareketli faz yardımıyla, sabit faz üzerinde, değişik hızlarla hareket etmeleri veya sürüklenmeleri esasına dayanır.
Kromatografi İlk kez Rus botanikçi Mikhail Tsvett (1903) tarafından geliştirilen bir yöntemdir. Tsvett bu yöntemi bitki pigmentlerinin renkli bileşenlerini ayırmakta kullanılmıştır. Kullandığı kolonda renkli bandlar oluştuğundan, bu ayırma yöntemine kromatografi adını vermişti
Kromatografi Kromatografi kelimesi Latince chroma (renk) ve graphein (yazmak) kelimelerinin birlesmesinden olusmustur ve kelimesi kelimesine tercumesi renk yazmaktır. Burada anlatılmak istenen ise kolonda ayrılan farklı renkteki bilesenlerin olusturduğu bantların goruntusudur. Kromatografi kelimesi ile ilgili ilginc olan diğer bir nokta ise renk kelimesinin Ruscadaki karsılığı Tswett dir. Bu yoruma gore kromatografi aslen Tswett in yazısı manasına gelmektedir. 1960 lı yıllarda kromatografi teriminin yerine Tswettography terimi onerilmis ise de bu kabul gormemistir
Kromatografi nin Sınıflandırılması Ayrılma Mekanizmalarına Göre Uygulama Biçimine Göre Faz Tiplerine Göre
Kromatografi nin Sınıflandırılması Ayrılma Mekanizmalarına Göre Adsorpsiyon kromatografisi Partisyon kromatografisi İyon değiştirme kromatografisi Jel filtrasyon (Moleküler eleme) kromatografisi Afinite kromatografisi
Kromatografi nin Sınıflandırılması Uygulama Biçimine Göre Düzlemsel kromatografi Kağıt kromatografisi İnce tabaka kromatografisi (TLC) Kolon kromatografisi Gaz kromatografisi (GC) Sıvı kromatografisi (LC) Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC)
Kromatografi nin Sınıflandırılması Faz Tiplerine Göre Sıvı kromatografisi Sıvı-Katı kromatografisi Sıvı-Sıvı kromatografisi Gaz kromatografisi Gaz-Katı kromatografisi Gaz-Sıvı kromatografisi
Kromatografi nin Sınıflandırılması Ayrılma Mekanizmalarına Göre Adsorpsiyon kromatografisi Partisyon kromatografisi İyon değiştirme kromatografisi Jel filtrasyon (Moleküler eleme) kromatografisi Afinite kromatografisi
Adsorpsiyon Kromatografisi Adsorpsiyon kromotografisi adsorpsiyon olayı üzerine kurulmuş olup ilk keşfedilen kromotografi çeşididir. 1906 yılında botanikçi Tswett tarafından keşfedilmiştir. Tswett yeşil yaprakları kıyarak petrol eteriyle muamele etmiş, elde ettiği renkli çözeltiyi (ekstraktı ), toz halindeki kalsiyum karbonatla doldurulduğu bir kolondan geçirerek yaprakta bulunan renkli maddeleri kolonun çeşitli yerlerinde bantlar halinde toplamayı başarmıştır.
Adsorpsiyon Kromatografisi Adsorpsiyon, bir karışımda bulunan sıvı veya gaz halindeki maddelerin katı faz üzerine tutunmasıdır. Adsorpsiyon kromatografisi ise örnek bileşenlerinin dolgu maddesinin yüzeyinde farklı olarak tutunmaları sonucu meydana gelen bir ayırma işlemidir. Adsorpsiyon kromatografisinde; maddeler katı olan sabit faz ile sıvı veya gaz olan hareketli faz arasında etkileşir. Faz tiplerine göre adsorpsiyon kromatografisi sıvı-katı gaz-katı kromatografisidir.
Adsorpsiyon Kromatografisi Sabit faz Ayrılması gereken maddeleri parçalamamalı Ayrılması beklenen maddeler ile kimyasal reaksiyon vermemeli Adsorpsiyon kapasitesi yüksek olmalı Adsorpladıkları maddeleri kolaylıkla geri vermeli
Dağılma (Partisyon) Kromatografisi Archer John Porter Martin ve Richard Laurence Millington Synge gelistirdikleri sıvı partisyonkromatografisi tekniğinin detaylarını 1941 yılında acıkladılar. Richard Laurence Millington Synge Britanyalı biyokimyacı. 1952 yılında, Archer John Porter Martin ile birlikte, "partisyon kromatografisini icat ettikleri için" Nobel Kimya Ödülü'nü kazanmıştır. http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1952/martin-bio.html http://tr.wikipedia.org/wiki/richard_laurence_millington_synge
Dağılma (Partisyon) Kromatografisi Dağılma kromatografisinde; maddeler sıvı olan sabit faz ile sıvı veya gaz olan hareketli faz arasında dağılır. Birbiriyle karışmayan iki sıvıdan, yani iki fazdan oluşan bir faz sistemi içine konulan madde bu sıvılardaki çözünürlüğüne bağlı olarak iki faz arasında dağılır ve dengeye ulaşır.
Dağılma (Partisyon) Kromatografisi Böyle bir sistemde maddelerin dağılması sabit olup dağılma katsayısı ile ifade edilir ve Kd ile gösterilir. Böylece Kd değerleri birbirinden farklı olan maddeler kromatografik sistem içersinde farklı hızlarda ilerleyerek birbirlerinden ayrılırlar. Kd = C1/C2 C1 : Maddenin 1. fazdaki derişimi C2 : Maddenin 2. fazdaki derişimi Faz tiplerine göre partisyon kromatografisi sıvı - sıvı sıvı - gaz kromatografisidir.
İyon Değiştirme Kromatografisi Maddelerin iyonik grupları ile iyon değiştiricideki iyonik grupların eşdeğer miktarlarının karşılıklı yer değiştirmesi esasına dayanır.
Jel Filtrasyon (Moleküler Eleme) Kromatografisi Karışımdaki moleküllerin molekül büyüklüklerinde göre ayrılması esasına dayanır.
Afinite Kromatografisi Seçiciliği fazla olan bu yöntem, kromatografi tekniklerinin en yenisidir. Antijen Antikor Enzim Substrat Reseptör İlaç gibi oldukça spesifik etkileşimlere dayanır.
Kromatografi Çeşitleri
Kromatografi nin Sınıflandırılması Uygulama Biçimine Göre Düzlemsel kromatografi Kağıt kromatografisi İnce tabaka kromatografisi (TLC) Kolon kromatografisi Gaz kromatografisi (GC) Sıvı kromatografisi (LC) Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC)
Kağıt Kromatografisi Kolonun yerine özel olarak yapılmış kalın süzgeç kağıdı üzerine emdirilmiş sıvı faz, sabit faz olarak kullanıldığı durumda ise karışımdaki maddeler farklı dağılma eğilimlerine göre bu kağıt üzerinde ilerler. "Kağıt Kromatografisi" adını alan bu yöntemde hareketli faz kağıdın daldırıldığı sıvıdır ve bu sıvı kağıt üzerinde kılcallık etkisiyle ilerler ve karışımdaki maddeleri sürükleyerek ayrılmalarını sağlar.
ince tabaka kromatografisi Kağıt kromatografisinde, kromatografi kağıdından kesilmiş şeritin ucuna ayrılması istenen karışımdan damlatılır ve bu kağıt kapalı bir kaptaki (yürütme tankı) çözücüye daldırılır. İnce tabaka kromatografisinde de üzerine ince katı bir faz sürülmüş cam plakanın bir ucuna karışımdandamlatılır ve yürütme tankına yerleştirilir.
ince tabaka kromatografisi Kağıt kromatografisine benzer olarak uygulanan "ince tabaka kromatografisi" ise bir sıvı-katı kromatografisidir. Bu yöntemde sabit faz, cam plaka üzerine sıvanmış bir katıdır. Karışımdaki maddelerin ayrılması katı yüzeyindeki farklı adsorpsiyon ilgilerine bağlı olarak gerçekleşir.
ince tabaka kromatografisi Kağıt veya ince tabaka üzerinde kılcal kanallardan ilerleyen çözücü, karışımdaki bileşenleri bunların sabit faza olan ilgileri ile ilişkili olarak farklı hızlarla sürükler ve birbirinden ayırır. Kağıt veya lehva üzerinde, belli bir süre sonra, bileşenlerin yol aldığı uzaklık ile çözücünün ulaştığı uzaklığın oranı, Rf değeri olarak bilinir ve bu değerler kalitatif analizde kullanılır.
Gaz kromatografisi Gaz kromatografisi yöntemleri, bir karışımda gaz halinde bulunan veya kolayca buharlaştırılabilen maddelerin birbirlerinden ayrılmasında kullanılır. Bu yöntemde hareketli faz bir gazdır. Bu gaz azot,helyum, argon gibi bir gaz olup "taşıyıcı gaz" adını alır. Sabit faz ise kolonda yer alır ve alumina, silika gibi bir katı olabilir.
Gaz kromatografisi Ölçmenin kısa sürede ve çok duyarlı şekilde başarılması metodun üstünlüğünü ortaya koymaktadır. Gaz kromatografisi kimya alanında gazların ve uçucu maddelerin analizleri ve ayrılmasında uygun bir metod olarak yaygın bir şekilde kabul edilmiştir.
Gaz kromatografisi Gaz-katı kromatografisi; adsorpsiyon olayına dayandığından elde edilen pikler kuyruklu olduğu için ayrılmaları güçleştirirler. Bu nedenle gaz-katı kromatografisi az kullanılır. Gaz-sıvı kromatografisi; yüzeyi geniş gözenekli katı maddeye özel bir sıvı emdirilir. Bu sıvı, katı maddenin gözenekleri dahil bütün yüzeyine dağılır ve sabit bir faz gibi davranır. Hareketli olan gaz fazı bu fazın içinden kolayca geçer. Analizi yapılacak numune içindeki maddeler bu iki faz arasında özelliklerine göre dağılırlar.
Gaz kromatografisi Kromatografik sistem şematik olarak şekilde görülmektedir. Sürükleyici gaz, basınç ve akışı ayarlayan kısım, Numune enjekte etme kısmı, Kolon kısmı, Isıtma kısmı, Detektör kısmı, Kaydetme kısmı.
Sıvı Kromatografisi: Injector Mixer Pumps Chromatogram Column Detector Solvents
Ayırmada Rol Oynayan Unsurlar Kolon Seçimi Durgun faz, partikül büyüklüğü, vs.. Kolon Uzunluğu Hareketli Faz Bileşimi Kolon Sıcaklığı Akış Hızı
katı dolgu maddeleri (hareketsiz faz) Silika jel: Genellikle nötür ve asidik yapıdaki bileşikler için uygundur. Alumina: Genellikle nötür ve bazik yapıdaki bileşikler için uygundur. Sellüloz: Genellikle biyokimyasal maddeler için uygundur. Hareketli faz görevini üstlenecek çözücüler; Sikloheksan, Kloroform, Metanol, Petrol eter, Metilen klorür, Etanol, Benzen, Etil asetat, Aseton, Toluen, Dietil eter, Karbon tetraklorür, n-butanol İzopropanol olabilir.
Sıvı Kromatografisi: t o Kolonda tutunamayan piklerin elusyon zamanı t R - retansiyon zamanı numuneyi belirleyicidir. t R mau t R Alan numunenin miktarı ile orantılıdır. t o Enjeksiyon zaman Kromatogram
Sıvı Kromatografisi:
Sıvı Kromatografisi:
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) HPLC High Pressure Liquid Chromatography High Performance Liquid Chromatography High Price Liquid Chromatography
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC)
HPLC nin KULLANIM SAHASI Gıda analizleri Çevre analizleri Biokimyasal analizler İlaç formülasyonları Polimerler
HPLC nin AVANTAJLARI Eş zamanlı analiz Doğruluk Yüksek hassasiyet (ppm - ppb) Küçük enjeksiyon hacmi (1-1000µl) Geniş uygulama sahası Zor olmayan analiz koşulları Çok iyi tekrarlanabilirlik
HPLC Sistemi Akış Diyagramı
HPLC SİSTEM TÜRLERİ ISOCRATIC SYSTEM LOW-PRESSURE GRADIENT SYSTEM HIGH-PRESSURE GRADIENT SYSTEM
ISOCRATIC SYSTEM İzokratik sistem: Bu sistemde tek pompa ve tek çözgen kullanılır. Kullanılan çözgen bir karışım olabilir. Bu sistemdeki ayırım yetersizdir.
LOW-PRESSURE GRADIENT SYSTEM Düşük basınçlı gradient sistem: Bu sistemde tek pompa, polariteleri önemli derecede birbirinden farklı maksimum dört farklı mobil faz vardır. Ayırım, izokratik sistemden daha iyidir.
HIGH-PRESSURE GRADIENT SYSTEM Yüksek basınçlı gradient sistem: Bu sistemde iki yada üç pompa ve polariteleri önemli derecede birbirinden farklı iki yada üç mobil faz vardır. Karışma pompadan sonra meydana gelir.
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi tekniğinin düzgün bir şekilde uygulanabilmesi için Enjeksiyonun yapılabilmesi için örnekler mutlaka sıvı olmalıdır. Katı örnekler ise durgun ve hareketli faza uyumlu olan bir çözgenle çözüldükten sonra yada ekstraksiyon işlemi yapıldıktan sonra enjekte edilebilmektedir.
Tipik bir HPLC cihazı sekiz üniteden meydana gelmektedir. çözgen tankı örnek giriş ünitesi pompa kolon dedektör atık toplama ünitesi bağlantı tüpü bilgi işlemcidir.
Kolon Kolon üretiminde yapı materyali olarak paslanmaz çelik Teflon cam Kolonun ayırım gücü ve performansı yapıldığı materyalden çok iç yüzeyine yapılan kaplamada kullanılan malzemenin kimyasal ve fiziksel özelliklerinden etkilenmektedir.
Kolon Seçilecek kolonun HPLC uygulamasında kullanılacak akış hızı ve dolayısıyla oluşacak basınça dayanıklı olmalıdır. Kolon iç çapı arttıkça akış hızı ve iç doldurma hacmi artmakta ama oluşacak piklerin çözünürlüğü ve dolayısıyla duyarlılık azalmaktadır. Birçok analitik kolonun iç çapı 2-5 mm, boyları çok çeşitli olup genellikle 30-300 mm aralığında değişmektedir. Kolon uzunluğu arttıkça örnek bileşenlerinin ayrımı daha iyi olmakta fakat analiz süresi uzadığı için daha fazla mobil faz harcanmaktadır.
Dedektörler HPLC donanımında temel bileşenden birisi olan dedektörler, örneğin veya hareketli fazın bazı özellikleri ile doğru orantılı olarak bir elektriksel sinyal üretirler. Dedektörleri genel dedektörler ve seçici dedektörler olmak üzere ikiye ayırmak mümkündür. Kullanılan dedektör hem örneğin hemde hareketli fazın özelliklerini ölçüyorsa (refraktif indeks dedektörü gibi) buna genel dedektör, eğer sadece örneğin özelliklerini ölçüyorsa (UV dedektörleri gibi) buna seçici dedektör denilmektedir. Seçici dedektörler, genel dedektörlerine göre yaklaşık 1000 kat daha duyarlıdır.
Dedektörler Ultraviolet / Visible detector (UV/VIS) Photodiode Array detector (PDA) Fluorescence detector (RF) Conductivity detector (CDD) Refractive Index detector (RID) Electrochemical detector (ECD) Mass detector (MS)
Ultraviyole-görünür bölge dedektörü Absorbans ölçen dedektörler olup HPLC de kullanılan dedektörlerin yaklaşık % 80 ini oluşturmaktadırlar. Lambert-Beer yasası geçerlidir. Spektrum taraması yapmak, farklı dalga boyunda çalışmak veya dalga boyunu zamana karşı programlamak mümkündür. Hareketli faz, UV/VIS fotometre ya da spektrofotometrenin bulunduğu küçük bir akış hücresinden geçirilir. Bu dedektörler ile sadece alkenler, aromatik yapılar, C-O, C-N, C-S bağı içeren bileşenlerin tayin edilebilmektedir
Ultraviyole-görünür bölge dedektörü
fotodiyot array dedektör UV/VIS dedektörler içerisinde fotodiyot array dedektör son yıllarda yaygın olarak kullanılmaktadır. UV/VIS dedektörden farkı, her elementin ayrı bir dalga boyundaki absorbansını eş zamanlı olarak ölçebilmesidir. Bu sayede üç boyutlu kromatogramlar almak ve istenilen her pikin çok hızlı spektrum taramasını görebilmek ve farklı dalga boyunda absorbans yapan türleri ayni anda tayin etmek olasıdır. Ayrıca istenilen dalga boyu aralığında çalışılabilmesi bu dedektörün sağladığı bir diğer önemli avantajdır.
fotodiyot array dedektör
fotodiyot array dedektör
fotodiyot array dedektör
fotodiyot array dedektör
fotodiyot array dedektör PDA nın sağladığı olanaklar İstenilen dalga boyu aralığında çalışabilmek Analiz sonrası istenilen çok sayıda dalga boyunda ölçüm yapabilmek Oran kromatogramı alabilmek istenilen her pikin spektrumunu görebilmek Benzerlik kıyaslaması yapabilmek Pikin saflığını tayin edebilmek D2 ve W lambayı aynı anda kullanabilmek
Fluoresans dedektörü Organik maddelerin yaklaşık % 15 i fluoresans oluşturma yeteneğine sahiptir. Oluşan fluoresans ölçülmektedir. Kullanılan ışık kaynağı ksenon lamba olup duyarlılığı UV/VIS dedektöre göre yaklaşık 10 3 kat fazladır.
İletkenlik dedektörü İletkenlik ölçülür. Daha çok anyon ve katyon analizlerinde ve iyon kromatografisinde kullanılır. Kullanılan mobil fazın iletkenliği ne kadar düşük olursa oluşan sinyal de o kadar düşük olmaktadır.
Refraktif indeks dedektörü Kırılma indisi ölçülür. Sıcaklıktan etkilenir. Örnek bileşenlerinin bulunduğu ortamda yoğunluk artacağından gelen ışık kırılarak hücreyi terkeder. Işığın ölçülen kırılma oranından (kırılma indisi) kantitatif tayin yapılır.
Kütle dedektörü Hareketli iyonları kütle/yük oranlarına göre hızlı biçimde ayırabilen bir cihazdır. İyonların çoğu tek yüklü olduklarından, oran basitçe iyonun kütlesine eşittir. Bu dedektörün kullanımı ile örnek bileşenlerine ait çok özgün kromatogramlar elde edilir, dolayısıyla kalitatif tayinlerde teşhis amaçlı kullanımlarda çok önemli bir dedektördür. İyon kaynağı, kütle analizörü ve iyon dedektör sistemi olmak üzere başlıca üç kısımda incelenebilir
Kütle dedektörü Ion Max API Kaynağı: Analizi yapılcak numuneye bağlı olarak ESI (Electrospray Ionization) veya APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) iyonizayon teknikleri kullanılabilir. Her iki teknikte atmosferik basınçta gerçekleşir. Genel olarak aminler, peptidler ve proteinler gibi polar bileşikler ESI tekniği, steroidler gibi apolar bileşikler ise APCI tekniği ile analiz edilir. Kütle Analizörü: İyon kaynağından gelen iyolar, kütle analizöründe değişen elektrik alana tabi tutularak m/z (kütle/yük) oranlarına göre ayrılırlar. MS İyon Dedektör Sistemi: MS dedektörü yüksek duyarlılığa sahip, pozitif ve negatif iyon modlarında çalışan bir iyon dedektör sistemidir.
HPLC tekniğinde sınırlamalar Karmaşık örneklerde iyi çözünürlük sağlamak zor olabilmektedir. Aynı anda sadece bir örnek analizlenebilmektedir.