Tanı konulmamış hastalarda yeni nesil dizileme ile tanı projeleri

Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü Tanı konulmamış hastalarda yeni nesil dizileme ile tanı projeleri Onur Emre Onat emre@fen.bilkent.edu.tr 13. Ulusal Sinirbilim Kongresi 30 Nisan-3 Mayis 2015, Konya

Taslak 1. Yeni nesil dizileme yöntemleri ile gen bulma calışmaları 2. Yeni nesil dizileme yöntemleri ile tanı projeleri Yöntem Örnek çalışmalar

Tanı konulmamış hastalarda yeni nesil dizileme ile tanı projeleri Roche/454 AB SOLiD Illumina MiSeq Complete Genomics Illumina HiSeq2000 Pacific Biosciences RS Oxford Nanopore MinION Ion Torrent PGM Ion Torrent Proton Oxford Nanopore GridION Amaç? Yeni nesil dizileme yöntemleri ile genetik tanı Neden Önemli? Geleneksel yöntemler bir çok vakada tanı koymada yeterli değil Geleneksel yöntemler maliyet/zaman açısından uygun değil Hedef? Yeni nesil dizileme yöntemleri ile tek adımda tanısı konulamamış hastaların genetik tanısı yapılabilir mi?

Yeni nesil dizileme yöntemi ile tek ve çok gen hastalıklarının genlerinin bulunması Prefix Autosomal X Linked Y Linked Mitochondrial Totals Gene description 14,116 695 48 35 14,894 Gene and phenotype, combined 84 2 0 2 88 Phenotype description, molecular basis known 4,095 291 4 28 4,418 Phenotype description or locus, molecular basis unknown 1,528 130 5 0 1,663 Other, mainly phenotypes with suspected mendelian basis 1,715 113 2 0 1,830 Totals 21,538 1,231 59 65 22,893 Moleküler temelleri bilinen fenotipler 5,466 Fenotipe neden olan mutasyonları olan genler 3,382

Yeni nesil dizileme yöntemi ile tek ve çok gen hastalıklarının genlerinin bulunması Eksom vs Genom dizileme Tüm Genom Dizileme Tüm Eksom Dizileme Maliyet 5000-15000$ 500-2000$ Zaman 10-12 gün 2-3 gün Avantajı Muhtemel tüm varyantlar belirlenebilir Protein kodlayan bölgelerde SNV, indel'lerin yuksek kapsamda okunması (80-100X) Dezavantajı Yüksek maliyetten dolayı okuma ve kapsamı düşük (30-50X) CNV, büyük indel, translokasyon, kompleks değişimler ve regulatör varyantlar Boyut Yaklaşık 3000 Mb Yaklaşık 40-60Mb (%1-2) Genom dizilemesi ile ekzonik bölgelerde tespit edilen varyantların ortalama %96 sının Eksom dizileme yöntemiyle de %99,2 doğruluk oranında tespit edildiği gösterilmiştir. Belkadi A, doi:10.1073/pnas.1418631112 (2014) Tüm eksom dizileme insan genomundaki tüm eksonların %95 ini kapsamaktadır Mendalyan hastalıklara neden olan mutasyonların %85 den fazlası protein kodlayan bölgelerde yer almaktadır. Botstejn D, doi:10.1038/ng1090 (2003)

Tüm genom dizileme ile kompleks hastalıklarda ilk denovo mutasyonlar bulundu Mental retardasyon -> 9 gen Tüm genom ve tüm eksom dizileme ile ilk dominant hastalık genleri bulundu Metachondromatosis -> PTPN11 Schinzel-Giedion Sendromu -> SETBP1 Tüm genom dizileme ile ilk resesif hastalık geni bulundu Charcot Marie Tooth -> SH3TC2 Eksom dizileme ile ilk resesif hastalık geni bulundu Miller Syndrome -> DHODH Eksom dizileme yöntemi ile hastalık genleri bulunabilir Washington Üniversitesi Gilissen C, doi:10.1186/gb-2011-12-9-228 (2011)

2010-2011 in ilk çeyreği 32 genes-> 31 hastalık Rabbani B, doi:10.1038/jhg.2013.114 (2012)

Rabbani B, doi:10.1038/jhg.2013.114 (2012) 2010-2012 102 genes

Tanı konulmamış hastalarda yeni nesil dizileme ile genetik tanı Geleneksel yöntemler: Fenotipik ve radyolojik bulgular, Biyopsi analizleri, Metabolit ölçümleri Karyotipleme Spesifik testler: Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon Aday gen incelemeleri Gen panelleri Geleneksel yöntemlerin yetersiz kaldığı durumlar: Klinik ayrımı yapılamamış çok nadir gözüken Çok değişkenli klinik bulguları olan Klinik olarak birbirine benzeyen Genetik hastalıkların toplumun binde 40-82 sini etkilediği düşünülmektedir. Bu hastaların %50 ye yakınının spesifik bir tanısı konulamamıştır. Epidemiyolojik çalışmalar göstemektedir ki tüm doğumsal anomaliler de bu gruba dahil edildiğinde bu oran %8 lere çıkmaktadır. Yang Y, doi:10.1056/nejmoa1306555 (2012)

Yeni nesil dizileme ile genetik tanı algoritmaları Hastadan alınan örnek DNA izolasyonu Proband Eksom dizileme Genom dizileme SNV Array CGH & SNP genotipleme <25bp indel Büyük delesyonlar + Trio Duplikasyonlar, Büyük delesyonlar Kromozom anomalileri Duplikasyonlar, Yapısal degisiklikler Kromozom anomalileri Uniparental dizomi Yapısal degisiklikler SNV <25bp indel SNV <25bp indel + denovo mutasyonlar Varyant yorumlamaları 1. Populasyon taramaları: dbsnp, 1000g, EVS, ExAC vb... 2. Evrimsel korunmuşluk skorları: SIFT, PPH2, GERP, CADD vb... 3. Veritabanları: OMIM, HGMD, Pubmed (yayınlar) Mendelyan hastalıklarla ilgili bilinen genler (Sanger doğrumaları) Daha önce hastalıklarla ilişkilendirilmeyen genler (Metaanalizler, fonksiyonel incelemeler)

Tanı konulmamış hastalarda yeni nesil dizileme ile tanı projeleri

12 trio -> anne-baba-çocuk Exome dizileme -> trio 1. Açıklanamayan zihinsel engel ve gelişimsel gecikme 2. 1 major doğumsal anomali 3. 2-3 minor doğumsal anomali 4. Yüz dismorfizmi Dahil edilme kriterleri 1. Anne babanın araştırmaya katılması 2. Genetik testler ile kromozomal anomalilerin dışlanmış olması 3. Teratojen etkisi, doğum asfiksisi veya kaza dışı travmaya dair herhangi bir bulgu olmaması

Trio Sex Age Symptoms Gene Disease Status 1 M 8 2 M 3 3 M 3 Developmental delay, possible autism, microcephaly, dysmorphic features, spine abnormalities, sensorineural hearing loss Developmental delay, multifocal epilepsy, involuntary movements, abnormal liver function, absent tears Developmental delay, autism, coarctation of the aorta, tethered cord, congenital nystagmus and strabismus EFTUD2 NGLY1 4 F adult multiple congenital abnormalities and macular degeneration EFEMP1 5 F 12 6 M 18 7 M 2 8 M 16 9 F 4 10 M 11 11 M 9 12 F 4 Severe intellectual disability, autism, bilateral hyperpronated feet, facial dysmorphisms Intellectual disability, epilepsy, panhypopituitarism, hypertension, bifid great toe, vertebral segmentation anomalies and sagittal cleft of the vertebra, hypoplastic 13th rib, and delayed bone age Microcephaly, facial asymmetry, acyanotic Tetralogy of Fallot; history of small muscular ventricular septal defect; right aortic arch with mirror image branching Severe intellectual disability, dysmorphic features evident, bicuspid aortic valve, bilateral coronal craniosynostoses Developmental delay, bilateral congenital cataracts and strabismus, ventricular and atrial septal defects, a unilateral clubfoot, and unilateral choanal atresia Attention deficit hyperactivity disorder, language delays, coarse facial features, bilateral mandibular cysts, low muscle tone Severe intellectual disability, developmental delay, seizures/infantile spasms, hypotonia and minor dysmorphisms Speech delay, borderline microcephaly, failure to thrive, dysplastic nails, ventricular septal defect and hip dysplasia Mandibulofacial Dysostosis with microcephaly congenital disorder of glycosylation novel novel SMAD4 Myhre syndrome known TCFA HNRNPU, SMAD1 EFTUD2 None None - SCN2A None early onset maculopathies. Pitt-Hopkins syndrome preaxial polydactyly? Mandibulofacial Dysostosis with microcephaly severe intellectual disabilities known known Known? novel known

11Mayıs2012 12 trio -> anne-baba-çocuk 1. Açıklanamayan zihinsel engel ve gelişimsel gecikme 2. 1 major doğumsal anomali 3. 2-3 minor doğumsal anomali 4. Yüz dismorfizmi Dahil edilme kriterleri 1. Anne babanın araştırmaya katılması 2. Genetik testler ile kromozomal anomalilerin dışlanmış olması 3. Teratojen etkisi, doğum asfiksisi veya kaza dışı travmaya dair herhangi bir bulgu olmaması Exome dizileme -> trio Genetik tanı 4/12 hasta %33 tanı oranı 2/12 hasta 1 yeni gen 6/12 hasta %50 tanı oranı

65 trio + 6/12 trio 48 trio Exome dizileme -> trio 15Ocak2013 Genetik tanı 29/119 hasta %24 tanı oranı

1August2013 Ocak 2011 - Eylül 2011 kliniğe başvuran Hiç bir eleme yapılmadan rasgele 500 hasta 249/500 hastaya moleküler tanı konuklamadı. %49.8 Exome dizileme 39/500 kişide genetik hastalık olmadığına karar verildi %49.8 212/500 kişide moleküler tanı konuldu %46 152/212 hastaya ilk etapta tanı konulmuştu %72 Eksom dizileme 60/212 hasta %28 tanı oranı

Ekim 2011 - Haziran 2012 kliniğe başvuran Tanısı konulamayan rasgele 250 proband Exome dizileme

Exome dizileme Genetik tanı 62/250 hastada %25 tanı oranı 30/250 hasta 16 yeni aday gen

Haziran 2012 - Kasım 2013 kliniğe başvuran hiç bir eleme yapılmadan rasgele 2000 hasta Exome dizileme 504/2000 hastaya moleküler tanı konuldu %25.2 Nörolojik grupta bu oran %36.1 1756 (%88) pediatrik 888 (%44) kadın 1101 (%55) erkek 11 (%1) fetüs 87,8% nörolojik hastalık

92/2000 hastada (%4.6) 95 gen (tesadüfi bulgular)

Clinical Genomics Center Ocak 2012 - Agustos 2014 kliniğe başvuran hiç bir eleme yapılmadan rasgele 338 hasta+410 trio Exome dizileme Denovo mutasyonlar %7.4 213/814 hastaya moleküler tanı konuldu %26.2 Trio-> 127/410 hastada %31.0 Proband-> 74/338 hastada %21.9

Clinical Genomics Center 520 (64%) pediarik 254 (49%) <5 yaşında 453 (%56) erkek 361 (%44) kadın Gelişimsel geçikme 298/814 hasta (%37) GG+Hipotoni (111/298 hasta, %37) GG+Epilepsi veya nöbetler (108/298 hasta, %36) GG+Dismorfik Özellikler (144/298 hasta, %48) GG+Otizm (69/298 hasta, %23) GG+ Kalp rahatsızlıkları (36/298 hasta, %12) En yüksek moleküler tanı oranı Retinal hastalıklar 15/31 hastada %48 5 yaşın altındaki gelişimsel gelişmesi olan çocuklarda moleküler tanı oranı 56/148 hastada %41

Deciphering Developmental Disorders (DDD) Study İngiltere ve İrlanda çevresindeki 24 Ulusal Klinik Merkezlerine başvuran tanısı konulmamış gelişimsel hastalığı olan 1133 pediatrik hasta Mediyan yaş ortalaması = 5.5 Exome dizileme 1133 proband 1101 anne-baba 1071 control 30 kardeş Eksom-aCGH 1009 proband SNP array 1006 proband Büyük delesyonlar Duplikasyonlar, Kromozom anomalileri Uniparental dizomi

Geri kalan 816 hastada Hastalar arası benzerlikler Mevcut model organizma bilgisi Genlerin fonksiyonel bilgisi Meta-analiz 12 yeni gen Moleküler tanı oranı 317/1133 %28 35 hastada 12 yeni gen 352/1133 %31

Özet ve Gelecek Perspektifleri Geleneksel yöntemlerle penotip-odaklı tanı oranı %50 Tanı konulamamış hastalarda yeni nesil dizileme yöntemleri ile genotip odaklı tanı oranı %25-30 Tanısı konulamamış nörolojik hastalarda bu oran %35-40 Yeni bulunan hastalık genlerinin sayısı artmaktadır

Fiyat 3.5 billion$->500$ Süre 10 yıl->2-3 gün Elde edilen veriler Haftada 6Tb 2008 2009 2010 2011 Technologies ABI capillary 454 Solexa/ pyroseq Illumina ABI Roche/454 ABI SOLID TitaniumSOLID 3.0 Ion Torrent Illumina HiSeq Output kbp / run 10 16 10 14 10 12 10 10 10 8 10 6 10 4 10 2 Capillary (Sanger) Sequencing Next Generation Sequencing (NGS) 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011

Tüm genom dizileme -> hedef örnek başına 100$ Otomatize edilmiş doğruluk oranı yüksek varyant okuma ve yorumlama algoritmaları Büyük delesyonlar, duplikasyonlar, kromozom anomalileri ve uniparental dizomi için geliştirilmiş algoritmalar Büyük veri tabanlarının oluşturulması Hastalık veritabanları Kontrol veritabanı Mutasyon veritabanları Klinik veritabanları Özet ve Gelecek Perspektifleri Genom merkezleri (Klinisyenler, genetik ve biyoinformatik uzmanları yetiştirilmeli) HEDEF -> kişiye özgün moleküler tanı ve tedavi Ameliyat kararı için destekleyici bilgi Kişiye özel ilaç kullanımı (Ör: Plavix -> CYP2C19 varyant taşıyıcıları) Ebeveyn tarama ve aile planlaması (Ör: alfa-talesemi, sistik fibroz, vb...) Presemptomatik tanı (Ör: kanser yatkınlığı)

Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü Tanı konulmamış hastalarda yeni nesil dizileme ile tanı projeleri Onur Emre Onat emre@fen.bilkent.edu.tr TEŞEKKÜRLER 13. Ulusal Sinirbilim Kongresi 30 Nisan-3 Mayis 2015, Konya