GENETİK MARKÖRLER ve ANALİZ METODLARI
Markör ü Çalışılan organizmadaki ilgilenilen diğer özelliklerin genetiği hakkında bilgi ü DNA nın aktif bölgelerinden veya herhangi bir genetik kodlama fonksiyonuna sahip olmayan DNA dizilerinden geliştirilebilirler. Genetik Markör ü Kalıtım şekilleri, morfolojik, biyokimyasal ve DNA düzeyinde izlenebilen karakterlere denir.
Moleküler DNA markörleri tekniklerinin n n bitki ıslahına entegrasyonu Arzulanan genlerin çeşitler veya türler arasındaki hareketini hızlandırmış Akraba yabani türlerden yeni genlerin aktarılmasına izin vermiş n Kantitatif karakterlerin analizini mümkün kılmış n Klonlama çalışmalarını kolaylaştırmış n Birbiriyle çaprazlanmayan bitkiler arasındaki genetik ilişkileri açığa çıkarmıştır.
Genetik markörlerin kullanım alanları n Genetik haritaların hazırlanması n Genetik parmak izi analizi n Doğrudan gen etiketlenmesi n Genlerin klonlanması
Genetik markörlerle ilgili önemli kriterler n Polimorfizm n Lokus sayısı n Haritalar arasında transfer edilebilme n Güvenilirlik n Eş baskınlık n Çevreden ve diğer lokuslardan etkilenme n fenotipi etkileme
n Bütün dokularda gözlenebilme n Allel sayısı n Otomasyona uygunluk n Genomdaki dağılım
Genetik Markör tipi ve analiz metodları n Morfolojik markörler n Moleküler markörler 1. Protein markör 2. DNA markör
Morphological Marker Phenotypic markers Naked eye marker hulled naked Black white
Molecular markers " Sequencing (SNPs) Resolution power " Microsatellites (SSRs) " Multi-locus fingerprints (RFLP) " AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) " RAPD (random amplified polymorphic DNA) " allozymes (protein-electrophoresis)
Proteins Markers Alloenzim: Birbirinden ayırt edilebilen allelleri bulunan enzimleri ifade etmektedir. Izoenzim: Farklı genler tarafından üretilen ancak birbirine çok benzeyen enzimleri ifade etmektedir.
DNA Markörleri 1 ccacgcgtcc gtgaggactt gcaagcgccg cggatggtgg gctctgtggc tgggaacatg 61 ctgctgcgag ccgcttggag gcgggcgtcg ttggcggcta cctccttggc cctgggaagg 121 tcctcggtgc ccacccgggg actgcgcctg cgcgtgtaga tcatggcccc cattcgcctg 181 ttcactcaga ggcagaggca gtgctgcgac ctctctacat ggacgtacag gccaccactc 241 ctctggatcc cagagtgctt gatgccatgc tcccatacct tgtcaactac tatgggaacc 301 ctcattctcg gactcatgca tatggctggg agagcgaggc agccatggaa cgtgctcgcc 361 agcaagtagc atctctgatt ggagctgatc ctcgggagat cattttcact agtggagcta 421 ctgagtccaa caacatagca attaaggtag gaggagggat ggggatgttg tgtggccgac 481 agttgtgagg ggttgtggga agatggaagc cagaagcaaa aaagagggaa cctgacacta 541 tttctggctt cttgggttta gcgattagtg cccctctctc atttgaactc aactacccat 601 gtctccctag ttctttctct gcctttaaaa aaaaatgtgt ggaggacagc tttgtggag DNA Gene A M 1 M 2 MFG Gene B MFG AACCTGAAAAGTTACCCTTTAAAGGCTTAAGGAA AAAGGGTTTAACCAAGGAATTCCATCGGGAATTCCG DNA markörleri farklı genotiplere ait DNA nükleik asit diziliş farklılığını çeşitli şekillerde ortaya koyan markörlerdir.
DNA Marker 1. DNA melez markörleri 2. PCR temeline dayalı markörler DNA melez markörleri RFLP Çeşitli şekillerde etiketlenmiş bir DNA parçasının araştırılan bir DNA örneğindeki benzer veya aynı dizilişteki DNA ya melezlenebilmesini baz almaktadır. Dokulardan izole edilen genomik DNA nın nükleik asit dizilişlerini tanıyan DNA kesim enzimlerince spesifik olarak kesilmesi ve prob DNA melezlendiği DNA etrafındaki farklı kesim yapılarının saptanması esasına dayanır.
Known DNA sequence DNA/DNA Hybridization Denaturation Elevated temperature Restriction Fragment Length Polymorphism
RFLP techniques
RFLP Polymorphisms interpretation 1 MFG 1 2 3 4 5 6 2 3 4 5 6
Advantages and disadvantages Avantaj Türler arasında transferler mümkündür Ko-dominant Güvenilir Dezavantajları Zaman iş gücü gerekli Pahalı radioactive probes kullanımı
Polymerase Chain Reaction DNA polimeraz enziminin kullanılmasıyla suni şartlartda DNA üretilmesini ifade etmektedir. Çoğaltılan DNA agaroz jel elektroforezinde yürütülür.
PCR Based markers " Sequencing (SNPs) " Microsatellites (SSR) " AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) " RAPD (random amplified polymorphic DNA)
RAPD Markers DNA lar kullanılarak genom üzerinde rasgele bölgelerin DNA amplifikasyonu gerçekleştirilir.
n Reaksiyon şartlarının spesifik olmaması rasgele çoğaltıma izin verir. n Bir başlatıcı kullanılır. n Kullanılan başlatıcının DNA üzerinde birbirine iki yakın bölgeye yapışabildiği genom bölgelerinin amplifikasyonu yapılır. n DNA agaroz jel elektroforezinde bazı parçaların bazı genotipde üretilip bazılarında üretilmediği gözlenir. n Bu işlem açılan bir populasyonda olursa ebeveynlere ait üretim motiflerine bakarak döllerin genotip analizi gerçekleştirilir.
RAPD Avantaj: ü Çok hızlı sonuç ü Ucuz az iş gücü ü Az miktar ve düşük kalitede DNA ihtiyaç Dezavantaj: ü Güveniliriliği sınırlı ü Farklı lab da farklı sonuç vermesi ü Dominant özellikteki markör.
Sorgum yerli çeşitlerinin RAPD Polymorphisms Sequences of 10- mer RAPD primers RAPD gel configuration Name Sequence OP A08 5 GTGACGTAGG- 3 OP A15 5 TTCCGAACCC- 3 M OP A 17 5 GACCGCTTGT- 3 OP A19 5 CAAACGTCGG- 3 OP D02 5 GGACCCAACC- 3
AFLP Markers ü RAPD tekniğinin dezavantajlarını gidermek için geliştirilmiştir. ü Genomik DNA önce birisi altı diğeri 4 taban tanıyan iki kesim enzimi tarafından kesilir. ü Kesilen parçaların ucuna nükleotid dizilişi sentetik olan DNA lar eklenir. ü Eklenen sentetik DNA nın nükleotid dizilişini de taşıyan başlatıcı DNA lar kullanımıyla nispeten spesifik DNA çoğaltımı yapılır. ü Ilk aşamada her iki uçdan DNA kesim enzimlerinin tanıdığı diziden sonraki ilk nükleotide göre seçici çoğaltimın yapıldığı ön üretim yapılır. ü Asıl üretimde ön üretimde elde edilen parçaların kullanımıyla kesim enzimi tanıma yerinden sonraki ikici ve üçüncü nükleotidler için seçim yapılır. ü Üretilen parçacıklar bir baz uzunluğu farklarını dahi ayırt edebilen poliakrilamid jel elektroforezinde
AFLP Markers ü Polimorfizm oranı çok yüksektir. ü RFLP den daha hızlıdır ü Parmak izi analizine uygundur. ü Dominant markör verir.. ü Farklı genetik haritalar arasında transferi güçtür.
SSR (Basit Dizi Tekrarları) SSR veya mikrosatellitler ökaryotik genomlar boyunca dağılmış bulunan ve ardışık olarak tekrarlanmakta olan 2-6 nükleotid gruplarından oluşmaktadır. Sequence Primer ACTGTCGACACACACACACACGCTAGCT (AC) 7 TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA ACTGTCGACACACACACACACACGCTAGCT (AC) 8 TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA ACTGTCGACACACACACACACACACACGCTAGCT (AC) 10 TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA ACTGTCGACACACACACACACACACACACACGCTAGCT (AC) 12 TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA
SSR polymorphisms P 1 AATCCGGACTAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTTAGCGAATTAGG P 2 AAGGTTATTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTAGGCTAGGCG P 1 P 2 Gel configuration
SSR primerlerinin üretiminde genel olarak 3 farklı yaklaşım tercih edilmektedir. ü G enomik DNA kütüphanelerinin SSR oligonükleotidleriyle hibridizasyonu yoluyla gözlenmesi ü DNA veri bankalarından SSR ların araştırılması ü Akraba bitki türlerinde geliştirilmiş olan SSR spesifik primerlerinin kullanımıdır.
Avantaj: ü Yüksek oranda polimorfik ü Eş baskın markör ü PCR kolaylığı Dezavantaj: ü Yeni markörlerin geliştirilmesinin güçlüğü SSR ü SSR lar bitki genomunda oldukça bol olup uniform dağılıma sahiptir.
Genetic marker characteristics Characteristics Morphological markers Number of loci Protein markers RFLP markers Limited Limited Almost unlimited RAPD markers Unlimited SSR markers High Inheritance Dominant Codominant Codominant Dominant Codominant Positive features Visible Easy to detect Utilized before the latest technologies were available Quick assays with many markers Well distributed within the genome, many polymorphism Negative features Possibly negative linkage to other characters Possibly tissue specific Radioactivity requirements, rather expensive High basic investment Long development of the markers, expensive
Co-dominant marker Gel configuration P 1 P 2 O 1 O 2 Polymorphism -Parent 1 : one band -Parent 2 : a smaller band -Offspring 1 : heterozygote = both bands -Offspring 2 : homozygote parent 1 Dominant marker Gel configuration P 1 P 2 O 1 O 2 Polymorphism Parent 1 : one band -Parent 2 : no band -Offspring 1 : homozygote parent 1 -Offspring 2 :????
Desirable properties ü Polymorphic ü Co-dominant inheritance ü Occurs throughout the genome ü Reproducible ü Easy, fast and cheap to detect ü Selectivity neutral ü High resolution with large number of samples