ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ DOMAT ZEYTİNİ POLİFENOL OKSİDAZ ENZİMİNİN BİYOKİMYASAL ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ADANA, 2009

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOMAT ZEYTİNİ POLİFENOL OKSİDAZ ENZİMİNİN BİYOKİMYASAL ÖZELLİKLERİNİN İNCELENMESİ YÜKSEK LİSANS TEZİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Bu tez 30/06/2009 tarihinde aşağıdaki jüri üyeleri tarafından oybirliği/oyçokluğu ile kabul edilmiştir. İmza: İmza: İmza: Doç.Dr.M.Ümit ÜNAL Prof. Dr. Sadık DİNÇER Yrd. Doç. Dr. Sertaç Özer Danışman Üye Üye Bu tez Enstitümüz Gıda Mühendisliği Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve mühür Bu çalışma Çukurova Üniversitesi Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: ZF 2008 YL 19 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

ÖZ YÜKSEK LİSANS DOMAT ZEYTİNİ POLİFENOL OKSİDAZ ENZİMİNİN BİYOKİMYASAL ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Danışman : Doç. Dr. M. Ümit ÜNAL Yıl : 2009, Sayfa : 47 Jüri : Doç. Dr. M. Ümit ÜNAL Prof. Dr. Sadık DİNÇER Yrd. Doç. Dr. M. Sertaç ÖZER Bu çalışmada, Çukurova bölgesinde yetiştirilen Domat çeşidi zeytinden izole edilen ve kısmen saflaştırılan polifenol oksidaz enziminin (PFO) optimum sıcaklık, optimum ph, kinetik parametreler, termal inaktivasyon, inhibitörlerin etkisi gibi biyokimyasal özellikleri araştırılmıştır. Substrat olarak 4-metil kateşol kullanılmış ve enzimin K m değerinin 14.52 mm, V m değerinin ise 1.73 Abs/dk olduğu bulunmuştur. PFO aktivitesi için optimum ph değeri 4,5 olarak bulunmuş ve optimum ph dan sonra enzim aktivitesinde hızlı bir düşüş görülmüştür. Enzimin optimum sıcaklığı 30 C olarak bulunmuştur. Enzim 20-50 C gibi sıcaklık aralığında %70 in üzerinde aktivite göstermiştir. Enzimin aktivasyon enerjisi (Ea) ve Z değerleri sırasıyla, 121 kj.mol -1 (r²=0.9496) ve 18.55 C (r²=0.9532 olarak hesaplanmıştır. Denenen inhibitörlerden en düşük inhibisyon etkisi askorbik asit te görülmüştür. Anahtar Kelimeler: Zeytin, enzimatik esmerleşme, polifenol oksidaz, kinetik, termal inaktivasyon. I

ABSTRACT MSc THESIS DETERMINATION OF BIOCHEMICAL PROPERTIES OF POLYPHENOL OXIDASE FROM DOMAT OLIVE DEPARTMENT OF FOOD ENGINEERING INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor : Assoc. Prof. Dr.M. Ümit ÜNAL Year : 2009, Pages : 47 Jury : Assoc. Prof. Dr. M. Ümit ÜNAL Prof. Dr. Sadık DİNÇER Assist. Prof. Dr. M. Sertaç ÖZER This research was undertaken to determine some of the biochemical properties (substrate specificity, optimum ph, optimum temperature, heat inactivation, and effect of inhibitors) of polyphenol oxidase (PPO) which was isolated from Domat olives grown in Çukurova region and partially purified. 4-methylcatechol was used as substrate and K m dand Vm values of the enzyme were found to be 14.52 mm and 1.73 Abs/dk, respectively. The optimum ph and temperature for PPO activity was found to be 4.5 and 30 C, respectively. After the optimum ph enzyme activity declined rapidly. The enzyme had more than 70% activity between 20-50 C. Energy of activation (Ea) and Z values were found to be 121 kj.mol -1 (r²=0.9496) and 18.55 C (r²=0.9532), respectively. Of the inhibitors tested, ascorbic asid was the least effective inhibitor. Key Words: Olive, enzymatic browning, polyphenol oxidase, kinetics, thermal inactivation. II

TEŞEKKÜR Yüksek lisans eğitimim boyunca, çalışmanın düzenlenmesi, gerçekleştirilmesi ve değerlendirilmesinde katkılarıyla beni yönlendiren, bana yol gösteren ve destekleyen, bilgi ve deneyimlerinden faydalandığım danışman hocam Sayın Doç. Dr. M. Ümit Ünal a teşekkürlerimi sunarım. Çalışmamın her aşamasında yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen; Araştırma Görevlisi Aysun Şener e ve değerli arkadaşım Murat Yılmaz a, İlgi, sabır ve maddi manevi desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen babam Ahmet Taş, annem Hatun Taş ve ablam Derya Taş a, Destek ve katkılarından dolayı Çukurova Üniversitesine ve Gıda Mühendisliği Bölümü personeline teşekkürlerimi borç bilirim. III

İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ... I ABSTRACT... II TEŞEKKÜR... III İÇİNDEKİLER... IV ÇİZELGELER DİZİNİ... VI ŞEKİLLER DİZİNİ... VII 1.GİRİŞ... 1 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR... 3 2.1.Dünya Zeytin Üretimi ve Türkiye nin Bu Üretimdeki Payı... 3 2.2. Türkiye Zeytin Ağacı Varlığı ve Üretim Durumu... 4 2.3. Zeytin Danesinin Yapısı... 6 2.4. Zeytinin Bileşimi... 6 2.5. Polifenol Oksidaz Enzimi... 8 3.MATERYAL ve METOT.... 20 3.1.Materyal........ 20 3.1.1.Analizlerde Kullanılan Araç-Gereç ve Kimyasal Maddeler 20 3.2.Metot.. 20 3.2.1.Polifenol Oksidaz Ekstraktının Hazırlanması 20 3.2.2.Enzimin Kısmi Saflaştırılması. 21 3.2.3. İyon Değişim Kromatografisi ile Saflaştırma.. 21 3.2.4.Protein Tayini 21 3.2.5.Enzim Aktivitesinin Ölçümü. 22 3.2.6.Enzimin Biyokimyasal Özelliklerinin Belirlenmesi.. 22 3.2.6.1.Optimum ph.. 22 3.2.6.2.Optimum Sıcaklık.. 22 3.2.6.3.Kinetik Parametreler.. 23 3.2.6.4.Termal İnaktivasyon.. 23 3.2.6.5.İnhibitörlerin Etkileri..... 25 IV

4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA... 26 4.1.Enzimin Saflaştırılması........ 26 4.2.Optimum ph...... 27 4.3.Optimum Sıcaklık...... 29 4.4.Kinetik Parametreler... 31 4.5.Termal İnaktivasyon.. 32 4.6. İnhibitörlerin Etkisi...... 34 5.SONUÇ...... 37 KAYNAKLAR... 38 ÖZGEÇMİŞ. 47 V

ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 2.1 Dünya Zeytin Alanlarının Ülkelere Göre Dağılımı... 3 Çizelge 2.2. Dünya Zeytin Üretiminin Ülkelere Göre Dağılımı... 3 Çizelge 2.3. Ülkemizde Bölgeler İtibariyle Zeytin Üretimi... 5 Çizelge 2.4. Zeytin Tanesinin Ortalama Bileşimi... 7 Çizelge 4.1 Zeytin PFO sunun Saflaştırma Çizelgesi... 28 Çizelge 4.2. Çeşitli Ürünlerden İzole Edilen Polifenol Oksidaz Enziminin Optimum ph Değerleri... 30 Çizelge 4.3. Çeşitli Ürünlerden Elde Edilen Polifenol Oksidaz Enzimlerinin Optimum Sıcaklık Değerleri 32 Çizelge 4.5. Çeşitli Ürünlerin Polifenol Enzimlerinin Km Değerleri 34 Çizelge 4.6. Beyaz Kiraz Polifenol Oksidaz Enziminin Termal İnaktivasyon Parametreleri 34 Çizelge 4.7. Çeşitli Ürünlerden İzole Edilen Polifenol Oksidaz Enzimlerinin Aktivasyon Enerjileri.. 35 Çizelge 4.8. İnhibitörlerin Beyaz Kiraz Polifenol Oksidaz Enzimine Etkileri 36 VI

ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 2.1. Türkiye nin Zeytin Üretim Alanlarını Gösteren Harita... 5 Şekil 2.2. Zeytin Danesinin Yapısı... 6 Şekil 2.3. Zeytinin Temel Fenolik Bileşenlerinin Kimyasal Yapısı... 8 Şekil 2.4. Enzimatik Esmerleşme Mekanizması... 11 Şekil 4.1. DEAE-selüloz İyon Değişim Kromotografisi ile Zeytin PFO sunun Saflaştırılması... 27 Şekil 4.4. Sıcaklığın Zeytin PFO suna Etkisi 31 VII

1. GİRİŞ 1. GİRİŞ Zeytin ağacı, tarihin her aşamasında Akdeniz de kurulan bütün uygarlıkların vazgeçilmez bir parçasını oluşturmuştur. Anadolu nun en eski kültür bitkilerinden olan zeytin, oleceae familyasının, Olea cinsinin Oleaeuropa türünün Oleaeuropa sativa alt türünü teşkil etmektedir. Akdeniz iklim kuşağında en iyi yetiştirme koşullarını bulmuş olan zeytinin gen merkezinin, Güneydoğu Anadolu da Hatay, Kahramanmaraş ve Mardin üçgeninde olduğu ve buradan da dünyaya yayıldığı birçok yazar tarafından doğrulanmaktadır. Güneydoğu Anadolu dan önceleri Batı Anadolu ya yayılan zeytin, Ege Adaları yoluyla Yunanistan, İtalya, Fransa ve İspanya ya kadar ulaşmıştır (Bozdoğan, 2002). Dünya üzerinde ekonomik olarak zeytin yetiştiriciliği 300 450 kuzey ve güney enlemleri arasında yapılmaktadır (Ulaş, 2001). Geleneksel olarak zeytin hasadı elle yapılmaktadır. Bu işlemin fiyatı işlenmemiş zeytin fiyatının % 50-70 ini oluşturmaktadır. Son zamanlarda ise zeytin hasadı büyük makinelerle zeytin ağaçlarının sallanması veya küçük makinelerle zeytin ağacı dallarının hareketi ile mekanik olarak yapılmaktadır. Ancak mekanik yöntem hasat sırasında zeytinlere zarar verip ezme ve berelenmelere neden olabilmektedir. Yeşil zeytinlerin mekanik olarak toplanması istenmez çünkü yeşil zeytinin mekanik olarak hasadı sırasında zedelenmeler nedeni ile zeytinlerde kahverengi lekeler oluşmaktadır. Bu durum zeytinlerin kalitesinin düşmesine ve istenmeyen görünüm nedeni ile tüketici açısından kabul görmemesine neden olmaktadır. Zeytinlerde görülen kahverengi lekeler esmerleşme reaksiyonlarından kaynaklanmaktadır (Segovia-Bravo ve ark., 2007). Hasat sonrası depolama veya meyve ve sebzelerin işlenmesi sırasında mekanik zedelenmelerden kaynaklanan esmerleşme reaksiyonları çok sık görülmektedir. Meyve ve sebzelerde görülen bu esmerleşme reaksiyonları polifenol oksidaz (PFO) enziminin fenolik bileşiklerle reaksiyonu sonucu meydana gelmektedir (Godfrey ve West, 1996). Fenol bileşiklerinin miktarı ve çeşidi zeytinin olgunlaşmasına çeşidine, yağış miktarına, sıcaklığa bağlı olarak değişmektedir. Bu nedenle bazı çeşitler fenol 1

1. GİRİŞ bileşenlerce zengin bazı çeşitler ise fakirdir. Zeytinde bulunan başlıca fenolik bileşenler; oleuropein, verbaskosid, ligrosit gibi fenolik glikozitler ile flavonoidler, flavonol glikozitleri, antosiyaninler ve glikozitleri, fenolik asitler ve diğer bileşenlerdir (Ryan ve Robards, 1998; Keçeli, 2000). Fenolik bileşiklerin oksidasyonla esmerleşmesi sonucu oluşan renk, sofralık siyah zeytin için istenilen bir değişimdir. Polifenollerin oksidatif kararması, zeytinde bulunan enzimlerin (difenoloksidaz) veya zeytinde bulunmayan ve dışarıdan katılan metal katyonlarının katalitik etkisiyle oluşmaktadır (Garcia ve ark., 1996; Robards ve ark., 1999). PFO, oksidoredüktaz grubuna giren enzimlerdir ve bakır içerirler. Substratları fenolik bileşiklerdir. Özellikle bitkiler âleminde yaygın olarak bulunan PFO lar hayvansal dokular ve küf mantarlarında da bulunmaktadırlar. Substratlarını oksijen eşliğinde esmer renkli bileşiklere oksitlemektedirler. Bu olay gıda teknolojisinde enzimatik esmerleşme olarak da bilinmektedir (Godfrey ve West, 1996). Bu çalışmada Domat zeytini kullanılmıştır. Domat zeytini Türkiye nin en önemli yeşil sofralık çeşididir. Meyvesi iri, silindirik yapıda olup, saptan meyve ucuna doğru bir sırt bulunur. Kilogramdaki ortalama dane adedi 180 200 arasında değişir. Et- çekirdek oranı 5/1 ve yağ miktarı %20 22 dir. En uygun hasat zamanı Ekim ayıdır. Zeytinler hasattan sonra tatlandırılır ve fermantasyon kaplarında stoklanır. Fermantasyonunu tamamlamış zeytin karakteristik bir sarı renk alır. Ülkemizde zeytin PFO su üzerine çalışmaya rastlanmamıştır. Bu çalışmanın amacı zeytinden PFO enzimini ekstrakte ederek kısmen saflaştırmak ve enzimin optimum ph, sıcaklık, termal inaktivasyon, inhibitörlerin etkisi ve kinetik parametreler gibi özelliklerini belirlemektir. 2

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.1. Dünya Zeytin Üretimi ve Türkiye nin Bu Üretimdeki Payı Dünya zeytin üretiminin yaklaşık % 97 sini karşılayan Akdeniz havzası ülkelerinin başında İtalya, İspanya, Yunanistan, Türkiye, Tunus, Portekiz ve Fas gelmektedir (Bozdoğan, 2002). İspanya dünyada en fazla zeytin alanına sahip ülke durumundadır (Çizelge 2.1). FAO kaynaklarına göre 2004 yılı Dünya zeytin üretimi 15 340 488 ton olup, ülkemizde ise 1 800 000 ton dur (Çizelge 2.2). Dünya zeytin üretimi bakımından Türkiye, % 10.7 lik bir payla 4. sırayı almaktadır (Bozdoğan, 2002). Ülkemizde zeytin üretiminin hala ilkel yöntemlerle yapılması nedeniyle üründe büyük zararlar oluşmakta ve kalitesi düşmektedir. Bu nedenle Avrupa ülkelerine olan zeytin dış satımımız yok denecek kadar azdır. Bu ülkeler zeytin gereksinimini daha çok diğer Akdeniz ülkelerinden sağlama yoluna gitmektedir. Türkiye ise ihracatının büyük çoğunluğunu Doğu Bloğu ülkelerine gerçekleştirmektedir (Öksüz, 1998). Çizelge 2.1 Dünya Zeytin Alanlarının Ülkelere Göre Dağılımı (Anonim, 2004) Alan (Ha) Yıllar 2000 2001 2002 2003 2004 Yunanistan 765 151 767 144 765 000 765000 765 00 İtalya 1 136 627 1 142 579 1 140 546 1 140 685 1 140 685 İspanya 2 300 000 2 400 000 2 300 000 2 400 000 2 400 000 Tunus 1 387 240 1 377 700 1 377 700 1 500 000 1 500 000 Türkiye 594 072 599 400 599 000 597 000 597 000 Çizelge 2.2. Dünya Zeytin Üretiminin Ülkelere Göre Dağılımı (Anonim, 2004) Üretim (ton) Yıllar 2000 2001 2002 2003 2004 Yunanistan 2 273 000 2 249 430 2 573 835 2 050 260 2 300 000 İtalya 2 821 000 2 894 097 3 231 300 3 149 830 3 149 830 İspanya 4 943 800 6 762 600 4 290 700 7 290 900 4 556 000 Tunus 550 000 150 000 350 000 500 000 350 000 Türkiye 1 800 000 600 000 1 800 000 900 000 1 800 000 3

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.2. Türkiye Zeytin Ağacı Varlığı ve Üretim Durumu Ilıman iklim zeytin ağacı için uygundur, çok kurak ve çok sulak yerler pek uygun değildir. -7 derecenin altındaki sıcaklıklarda ve 400 mm nin altında yağış alan bölgelerde yetiştirilmesi ekonomik olmamaktadır. Toprak istekleri bakımından fazla seçici olmadığından dolayı birçok bitkinin yetiştirilemediği alanların değerlendirilmesinde kullanılmaktadır (Ulaş, 2001). Zeytin meyvesinin besi dokusu bol miktarda yağ içermektedir. Zeytin ağacı en fazla 15 20 m ye kadar boylanmakta ve çapı ise 5 6 m ye kadar ulaşmaktadır. Ağaç ömrü ortalama olarak 1000 yıl kadardır. Zeytin meyvesi ham ve olgun halde salamura yapılarak yenmekte; ayrıca ezilerek yağı çıkarılmaktadır. Yağ çıkarıldıktan sonra geriye kalan pirina olarak adlandırılan küspe; gübre ve hayvan yemi şeklinde değerlendirilmektedir (Öksüz, 1998). Türkiye de işlenen tarım alanlarının % 4.1 inde zeytin tarımı yapılmaktadır. DİE 2007 yılı istatistiklerine göre Ülkemizde yaklaşık 597 000 ha alanda, 90 000 000 adedi meyve veren, 9 000 adedi meyve vermeyen olmak üzere toplam 99 000 000 adet zeytin ağacı olmakla birlikte bu rakam dünyadaki zeytin ağacı varlığının (700 milyon) yaklaşık % 13 üne karşılık gelmektedir. İklim ve toprak özellikleri bakımından büyük bir zeytin üretimi potansiyeline sahip olan Türkiye de zeytin üretimi Marmara, Ege, Akdeniz ve Güneydoğu Anadolu Bölgelerinde yoğunlaşmıştır. Yetiştirilen zeytinlerin ortalama % 30 u sofralık, % 70 i ise yağ üretiminde kullanılmaktadır. Gerek zeytin ağacı varlığı gerekse zeytin üretimi bakımından sırasıyla Ege (% 75), Akdeniz (% 14), Marmara (% 10) Bölgeleri ilk sıralarda gelmektedir. Ancak Ege ve Akdeniz Bölgesi yağlık zeytin çeşitleri, Marmara Bölgesi ise sofralık zeytin çeşidi bakımından öndedir Ülkemizde yaygın bulunan zeytin çeşitleri Memecik, Tavşan yüreği, Ayvalık, Domat ve Gemliktir. Zeytin üretimi, sofralık ve yağlık olmak üzere iki farklı şekilde yapılmaktadır. Sofralık çeşitlerde meyve tam olgunlaşmadan (yağ içeriği % 18 22) hasadı yapılarak değişik yöntemlerle tüketiciye iletilmektedir. Yağlık çeşitler ise meyve olgunlaştıktan sonra (yağ içeriği % 30 40) hasadı yapılarak değerlendirilmektedir (Aydın, 2000). 4

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Çizelge 2.3. Ülkemizde Bölgeler İtibariyle Zeytin Üretimi (Anonim, 2001) Bölgeler Ege Akdeniz Marmara Ortagüney Güneydoğu Kuzeydoğu Karadeniz Orta Kuzey Toplam Ağaç Sayısı Meyve Veren Yaştaki Ağaç Sayısı MeyveVermeyen Yaştaki Ağaç Sayısı Üretim (Ton) 70 382 781 65 880 590 4 502 191 1 384 667 15 920 254 12 961 205 2 959 049 298 081 10 368 825 9 608 980 759 845 106 342 125 055 112 480 12 575 4 119 205 161 164 296 40 865 2 079 180 750 156 900 23 850 1 855 203 085 154 699 48 386 1 365 220 479 138 755 81 724 1 331 Ortadoğu 163 610 22 095 141 515 161 Türkiye Toplamı 7 770 000 89 200 000 8 570 000 1 800 000 Şekil 2.1. Türkiye nin Üretim Alanlarını Gösteren Harita 1.Ege, 2. Marmara, 3. Akdeniz, 4. Güneydoğu Anadolu, 5. Karadeniz (Numaralar bölgelerin ağaç sayısı ve üretim miktarlarına göre çoktan aza doğru verilmiştir.) 5

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.3. Zeytin Danesinin Yapısı Meyve sapı %1 2 Epikarp (kabuk) %63-86 Mesokarp (meyve eti) %10 30 Endokarp (çekirdek) %2 6 Çekirdek içi Şekil 2.2. Zeytin Danesinin Yapısı (Boskou, 1996) Oval olan zeytin meyvesi perikarp (etli kısım) ve endokarptan (çekirdek) oluşmuştur. Perikarp ise epikarp (kabuk) ve mezokarptan (etli kısım) meydana gelmiştir. Meyve eti meyvenin yaklaşık % 68-83 ünü, çekirdek ise % 13-30 unu teşkil etmektedir. Meyvedeki su oranı % 70 lere kadar çıkabilse de genellikle % 50 civarındadır. Bunun yanında meyvede % 1.6 protein, % 20 yağ, % 20 karbonhidrat, % 5 6 selüloz, % 1.5 kül bulunmaktadır (Boskou, 1996). 2.4. Zeytinin Bileşimi Zeytin, çeşidine göre şekli ve rengi değişen, besin değeri açısından oldukça zengin bir üründür. Zeytinin yapısında önemli miktarda su ve yağ bulunurken protein, selüloz, şeker, mineral maddeler, hidrokarbonlar, fenolik bileşikler ve tokoferoller de bulunmaktadır (Çizelge 2.7). Bunlar arasında zeytinde iz miktarda bulunduğu halde özellikle yağı oksidasyona karşı koruyarak antioksidan özellik gösteren fenolik bileşikler, yağın rengi, lezzeti, oksidatif stabilitesi ve besin değeri açısından önemli rol oynamaktadır (Kritsakis, 1998). 6

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Çizelge 2.4. Zeytin Tanesinin Ortalama Bileşimi (Kiritsakis, 1998) Bileşim Miktar (%) Su 50 Yağ 22 Protein 1.5 Şeker 19.1 Selüloz 5.8 Mineral Madde (Kül) 1.6 Zeytinde bulunan fenol bileşikleri, sofralık zeytin veya zeytinyağının oksidatif stabilitesini ve duyusal özelliklerini etkilediği için oldukça önemlidirler. Bunun dışında fenol bileşenlerinin beslenme ve farmokolojik etkileri doğal antioksidatif ve antimikrobiyel özellikleri bulunmaktadır. Ayrıca bu işlemler renk ve tadı etkilediğinden meyvenin işlenmesinde de önemlidirler (Esti ve ark., 1998). Meyvenin doğal savunma sisteminin oluşturulmasında da fenol bileşenleri önemli rol oynamaktadır (Siciancalepore ve Longone; 1984; Brenes-Balbuena ve ark., 1995; Robards ve ark., 1999). Fenolik bileşikler, meyvenin duyusal özellikleri açısından önemli parametrelerdir ve özellikle o-difenoller, meyve veya yağın oksidasyona karşı dayanıklılığında antioksidan olarak görev yapmaktadır (Keçeli ve Gordon, 2001). Zeytin; başlıca oleuropein, verbaskosit, ligrosit ve flavonollerin glikozit türevleri ile flavonlar, antosiyaninler ve glikozitleri ve fenolik asitleri içermektedir (Montedoro ve ark., 1993; Esti ve ark., 1998; Saija ve ark., 1998; Tsimidou, 1998; Keçeli ve Gordon, 2001). Zeytinin temel fenolik bileşenlerinin kimyasal yapısı Şekil 2.3 de verilmiştir. 7

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Şekil 2.3. Zeytinin Temel Fenolik Bileşenlerinin Kimyasal Yapısı (Keçeli, 2000) 2.5. Polifenol Oksidaz Enzimi PFO, bitki ve hayvan dokularında yaygın olarak görülen bir enzimdir. Bitkilerde tüm kısımlarda bulunabilirken, gelişmiş hayvanlarda deri, saç, tüy ve gözlerde bulunur. Bitkisel dokularda öncelikle latent (inaktif) formlar halinde sentezlenmekte ve zamanla çeşitli etkenlerle, örneğin dokuda doğal olarak bulunan proteazlar veya etilen gibi birtakım solunum metabolitlerince aktif hale getirilmektedirler (Yemenicioğlu ve ark., 1997). Sağlıklı meyve ve sebze dokularında, PFO enzimlerinin substratları olan fenolik bileşiklerle teması, yok denecek kadar sınırlıdır. Bunun başlıca nedeni, enzim 8

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR ve substratlarının bitkisel hücrenin farklı kısımlarında yer almalarıdır. Nitekim PFO enzimlerinin bir kısmı sitoplazmada serbest halde bulunurken, büyük bir kısmı hücrenin tilakoid ve kloroplast gibi unsurlarında, membrana bağlı olarak bulunmaktadır. Buna karşın, fenolik bileşiklerin neredeyse tamamı vakuollerde yoğunlaşmış halde bulunmaktadır. Ancak doku olgunlaşmasının ileri aşamalarında hücredeki pektinazların faaliyetiyle, doku kontrollü ve sınırlı bir şekilde doğal olarak değişimlerle uğrar. Ayrıca, hasat, taşıma ve işleme sırasındaki etkiler veya uygulanan çeşitli işlemlerle hücre ve buna bağlı olarak doku bütünlüğü bozulmaktadır. Böylece, PFO enzimleri kendi substratları olan fenolik bileşiklerle ve havadaki oksijen ile bir araya gelmektedirler (Muchuweti ve ark., 2006). Meyve ve sebzelerin olgunlaşmasına paralel olarak, gerek PFO aktivitesinde, gerekse bunların substratları olan fenolik bileşiklerin konsantrasyonunda önemli değişimler görülmektedir. Örneğin elmalarda PFO substratı niteliğindeki o-difenolik bileşiklerin konsantrasyonu ve kateşol oksidaz aktivitesi, olgunlaşmayla beraber sürekli düşüş gösterirken şeftalilerde olgunlaşmayla birlikte o-difenollerin miktarında önce büyük bir artış ve bunu takip eden sınırlı bir düşüş, kateşol oksidaz aktivitesinde sürekli bir düşüş fakat lakkaz aktivitesinde sürekli bir artış görülmektedir. Aynı şekilde zeytinlerde olgunlaşmayla birlikte PFO aktivitesinde sınırlı bir düşüş, ancak buna karşın o-difenollerin konsantrasyonunda sürekli olarak devam eden büyük bir artış görülmektedir. Buna göre, hasat zamanında zeytinlerin esmerleşmeye büyük bir eğilim göstermesinin nedeni kolaylıkla anlaşılmaktadır. Yine mantarlarda olgunlaşmayla birlikte PFO aktivitesinde büyük bir düşüş görülmekte ancak bu durum onların esmerleşmeye eğilimini azaltmamaktadır (Ben- Shalom ve ark., 1977; Ingebrigtsen ve ark., 1989). Birçok meyve ve sebzelerde gerek hasat veya tasıma sırasında mekaniki bir zedelenme sonucu, gerekse bunların herhangi bir ürüne islenmesi aşamasında uygulanan doğrama, parçalama ve ezme gibi işlemler sırasında renkte esmerleşme ve bozulmalar meydana gelmektedir. Bu olay polifenol oksidaz enziminden kaynaklanmaktadır. Enzimatik esmerleşme denilen bu reaksiyon; hem polifenol oksidaz aktivitesi hem de fenolik madde konsantrasyonuyla ilgilidir. Polifenol oksidazlar, gıda endüstrisinde genellikle istenmeyen enzimlerdir. Enzimatik 9

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR esmerleşme ürünün duyusal özelliklerini bozar, satın alınabilirliğini azaltır ve aynı zamanda besin değerinde azalmaya neden olur (Coseteng ve Lee, 1987). PFO lar meyve ve sebzelerin hasat, depolama ve işlenme kalitesi ve ekonomisini belirleyen çok önemli enzimlerdir. Oksijen geçişine neden olan hasat, depolama ve işleme sırasındaki zedelenme, kesilme ve diğer mekanik zararlar çoğu meyve ve sebzelerde melanin oluşumuna, bu da hızla esmerleşmeye neden olur. Esmerleşme yüzünden meyvelerde önemli kayıplar olmaktadır. Ürün renginin değişmesi, kötü tat ve besin değeri kaybı tüketici açısından kabul edilemez hususlardır. Muz, şeftali, kayısı, elma, üzüm, çilek ve bazı tropik meyveler ve suları ayrıca patates, marul ve diğer yapraklı sebzelerde esmerleşme görülmektedir. Buna karşılık çay, kahve, kakao, siyah üzüm ve siyah incirlerde PFO aktivitesi istenen bir durumdur (Casado-Vela ve ark., 2005). PFO tirosinaz, fenolaz, kateşoloksidaz, kateşolaz, o-difenoloksidaz, mono fenoloksidaz ve kresolaz olarak da bilinir ve ilk olarak Schoenbein tarafından 1856 da keşfedilmiştir. PFO Uluslar arası Biyokimya Birliği nin sınıflandırmasına iki kez girmiştir: EC 1.14.18.1 (monofenol, L-dopa: oksijen oksidoredüktaz) monohidroksifenolü (ör.p-kresol) o-pozisyonuna hidroksile eder. EC 1.10.3.1 (1,2- benzendiol: oksijen oksidoredüktaz) o-dihidroksifenolleri (ör: kateşol) okside edip hidroksil grubundan hidrojenleri uzaklaştırarak benzokinonlar oluştururlar. Bu enzim iki çeşit oksidatif reaksiyonu katalizler: Monofelik bileşiklerin o-difenollere hidroksilasyonu (kresolaz aktivitesi), diğeri ise o-difenollerin o-kinonlara oksidasyonudur (kateşolaz aktivitesi) (Cash ve ark., 1976). Uluslar arası enzim sistematiğine göre; kresolaz aktivitesi; monofenol monooksigenaz, kateşolaz aktivitesi ise difenol oksidaz ismi ile anılan enzimlerce gerçekleştirilmektedir (Rocha ve ark., 1998). Enzimatik esmerleşme olayı, iki farklı mekanizmaya göre gelişmektedir. Bunlardan birisi, monofenolik bileşiklerin o-difenollere hidroksilasyonu (kreşolaz aktivitesi), diğeri ise o-difenollerin o-kinonlara oksidayonudur (kateşolaz aktivitesi) (Şekil 1). 10

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR monofenol 0-difenol o-kinon OH OH O 1/2 O 1/2O 2 OH 2 O R (1) R H 2 O (2) R (çoğunlukla renksiz) (çoğunlukla renksiz) (çoğunlukla kırmızı) Şekil 2.4. Enzimatik Esmerleşme Mekanizması (Cemeroğlu ve Ark., 2001) (1) Kreşolaz aktivitesi (hidroksilasyon) (2) Kateşolaz aktivitesi (oksidasyon) PFO gıdalarda yol açtığı enzimatik esmerleşmeyle önemli kalite kayıplarına neden olmaktadır. PFO nun meyve ve sebzelerden izole edilip biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi depolama ve işleme sırasında kalite kayıplarının en aza indirilmesi ve böylece daha kaliteli ürünlerin üretilmesine olanak sağlayabilir. Bu nedenle PFO enzimi üzerinde çok sayıda araştırma yapılmış, çok değişik meyve ve sebzelerdeki PFO enziminin özellikleri belirlenmiştir. Zeytin PFO su üzerinde yapılmış çok az sayıda çalışma bulunmaktadır. Domat çeşidi zeytindeki PFO enzimi üzerine ise herhangi bir çalışmaya rastlanmamıştır. Zeytin PFO su ve enzimatik esmerleşme üzerinde yapılmış araştırmalar aşağıda özetlenmiştir. Segevia-Bravo ve ark. (2007), Manzanilla çeşidi zeytinden PFO enzimini saflaştırmışlar ve bazı özelliklerini belirlemişlerdir. Enzimin optimum ph sı 6.0 olarak bulunmuştur. Termodinamik parametrelerin ph ya bağlı olduğu bildirilmiştir. Sciancalepore ve Longone (1984), yeşil zeytinlerde PFO ve esmerleşmeyi inceledikleri çalışmalarında enzim aktivitesi ile esmerleşme derecesi arasında pozitif bir korelasyon bulmuşlardır. Goupy ve ark. (1991), 10 farklı zeytin çeşidinde enzimatik esmerleşme, oleuropein içeriği ve PFO arasındaki ilişkiyi araştırmışlardır. Esmerleşme kapasitesinin PFO aktivitesi ve oleuropein arasındaki karmaşık ilişkiye bağlı olduğu bildirilmiştir. 11

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Zeytin dışındaki ürünlerden izole edilen PFO üzerine çok sayıda araştırma yapılmış ve bunlardan bazıları aşağıda verilmiştir. Yemenicioğlu ve Cemeroğlu yaptıkları çalışmada (1996), Hale Haven şeftalilerinde polifenol oksidaz (PFO) enziminin niteliklerini araştırmışlardır. Ham, yarı olgun ve tam olgun şeftalilerden öncelikle aseton tozu hazırlanmıştır. Aseton tozundan hazırlanan enzim çözeltisinde optimum ph, Michaelis sabiti (K m ), maksimum hız (Vm) ve enzim aktivitesinin termal inaktivasyonu incelenmiştir. Olgunluk durumuna göre enzimin optimum ph derecesi 6.0-6.5 arasında bulunmuştur. Tam olgun şeftalilerde elde edilmiş enzimin ph 6.2 de K m değerinin 14.3 mm ve Vm değerinin 1.25 Abs.dk -1. ml -1 olduğu saptanmıştır. Enzimin termal inaktivasyon kinetiği 70 C de araştırılmıştır. Her enzim ekstraktının termal inaktivasyon kurvesinin, başlangıçta dik bir doğru, sonra daha yatık bir doğru olmak üzere iki bölümden oluştuğu belirlenmiştir. Bu nedenle şeftali PFO enziminin ısıya dirençli farklı iki izoenzimden oluştuğu sonucuna varılmıştır. Aydemir ve arkadaşları yaptıkları çalışmada (2003), polifenol oksidaz (PFO) enzimini yer elmasından izole etmişlerdir. PFO, kateşol, L-dopa, DL-dopa ya karşı aktivite göstermiş fakat bir monofenol olan L-tirozine karşı aktivite göstermemiştir. Yer elmasından izole edilen PFO nun optimum ph ve sıcaklık değeri sırasıyla 7.0 ve 25 C dir. Enzim nötr ph civarında oldukça kararlıdır. 60 ve 80 C deki aktivitenin % 50 inaktivasyonu için gerekli olan zaman sırasıyla, 40 ve 20 dakika olarak bulunmuştur. Kateşol için K m ve Vm değerleri sırasıyla, 5.88 mm ve 25.402 IU/mg.dk dır. Ayrıca, yapılan çalışmada en etkili inhibitörlerin potasyum siyanid, β- merkaptoetanol ve tiyoüre olduğu belirlenmiştir. Yemenicioğlu ve ark. (1997), altı elma çeşidinin (Golden Delicious, Starking Delicious, Granny Smith; Gloster, Starcrimson ve Amasya) PFO larının ısıl inaktivasyon kinetiklerini üç sıcaklıkta (68, 73 ve 78 C) çalışmışlardır. PFO aktivitesi başlangıçta artmış ve daha sonra ısıcaklıktaki artışla beraber birinci dereceden kinetik modele uyarak azalmıştır. Aktivitedeki artış bağlı PFO nun varlığını göstermektedir. İnaktivasyon eğrisinin lineer bölümü için regresyon katsayısı inaktivasyon parametrelerini belirlemek için hesaplanmıştır. 78 C de 12

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Amasya elması PFO sunun en az, Starking Delicious cinsi PFO nun ise en yüksek ısıl-dirence sahip olduğunu göstermiştir. Saygılı ve arkadaşları (1998), Türkiye Şeker Fabrikaları A.Ş. Şeker Enstitüsü (Ankara) deneme tarlalarında yetiştirilen Evita, TŞ. Poly, Gisela, Adonis ve Agra adlı şeker pancarı çeşitlerindeki polifenoloksidaz (PFO) aktivitesini incelenmişlerdir. PFO enzim aktivitesi substrat olarak kateşolün kullanıldığı dolaylı bir yöntemle ölçülmüştür. Absorbans-zaman grafiğinin eğimi toplam enzim aktivitesi olarak değerlendirilmiştir. Bazı şeker pancarı çeşitlerinde (Evita, T.Ş. Poly) ortalama PFO aktivitesinin yüksek olduğu ve aynı çeşit örneklerdeki enzim aktivitesi değerlerinin çok geniş sınırlar arasında değiştiği belirlenmiştir. Fakat Adonis çeşidi için ortalama PFO aktivitesi ve standart sapma değerleri oldukça düşük bulunmuştur. Tam doğal şeker (Whole Sugar) üretiminde pancardaki polifenol oksidazlar ürün rengini olumsuz etkilemekte ve bu nedenle üretimin ilk aşamasında PFO buharla inaktive edilmektedir. Bu tür düşük PFO aktivitesine sahip çeşitlerin kullanımı ile proseste ve ürün kalitesinde iyileştirme sağlanabilecektir. Wissemann ve Lee (1981), üzümden elde ettikleri PFO nun niteliklerinin belirlenmesi ile ilgili yaptıkları çalışmada, iki farklı üzüm çeşidi kullanmışlar (Ravat 51 ve Niagara) ve her iki üzüm çeşidinde optimum ph ve sıcaklık değerlerinin 5.5 ve 25 C olduğunu bildirmişlerdir. Niagara üzümünden elde edilen PFO nun, Ravat 51 den elde edilen üzüm PFO suna göre ısıya karşı daha dirençli olduğu bildirilmiştir. Enzim üzerine çeşitli inhibitörlerin etkisi denenmiş ve en etkili inhibitörler L-sistein ve sodyum dietilditiyokarbomat olarak bulunmuştur. Nakamura ve ark. (1983), Japon çeşitlerinden Koshu üzümlerinden aseton tozu yöntemi ile ekstrakte ettikleri PFO enzimini amonyum sülfat çöktürmesi ve kolon kromatografisi ile saflaştırmışlar ve enzimin bazı özelliklerini belirlemişlerdir. Enzimin molekül ağırlığının 39000-41000, optimum ph sının 6.0 ve optimum sıcaklığının ise 25 C olduğunu belirlemişlerdir. Ayrıca, enzim o-difenolik bileşiklere yüksek aktivite gösterirken, monofenollere hiç aktivite göstermemiştir. Ünal (2007), Anamur muzundan polifenol oksidaz enzimini saflaştırıp, enzimin karakteristik özelliklerini belirlemiştir. PFO nun muz için optimum sıcaklığı 30 C bulunmuştur. Enzimin optimum ph derecesi 7.0 olarak bulunmuştur. 60-75 C deki 13

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR termal inaktivasyon çalışmalarından, enzimin yarı ömür değeri 7.3 ve 85.6 dakika arasında değişmektedir. E a ve Z değerleri, sırasıyla, 155 kj.mol -1 ve 14.2 C olarak hesaplanmıştır. K m ve Vm değerleri sırasıyla 8.5 mm ve 0.754OD 410 dak -1 dır. İnhibitör testlerinde ise askorbik asit ve sodyum metabisülfit en etkili inhibitör olarak tespit edilmiştir. Rapeanu ve arkadaşları (2006), Güney Afrika da yetişen Viktorya üzümlerinden ekstrakte edilen PFO enziminin biyokimyasal tanımlanmasını ve kimyasal stabilitesini araştırmışlardır. McIlvaine tamponu ile hazırlanmış 10 mm kateşol substratı ile üzüm PFO aktivitesi için optimum ph ve sıcaklık sırasıyla 5.0 ve 25 C olarak bulunmuştur. 10 mm kateşol substrat olarak kullanıldığında K max ve Vm değerleri sırasıyla 52.6±0.00436 mm ve 653±24.0 OD 400 nm/dk dır. Çalışmada sekiz inhibitör test edilmiş ve en etkili inhibitörlerin askorbik asit, L-sistein ve sodyum metabisülfit olduğu bulunmuştur. Kinetik çalışmalar, Viktorya üzümleri PFO sunun termal inaktivasyonunun, E a =225±13.5 kj/mol lük bir aktivasyon enerjisi ile birinci dereceden kinetiğe uyduğunu göstermiştir. Yemenicioğlu ve arkadaşları Taro yumrularından ekstrakte edilmiş peroksidaz (POD) ve polifenol oksidaz (PFO) enzimlerinin 50 80 C arasındaki ısıl inaktivasyonunun birinci dereceden reaksiyon kinetiğine uygun olarak geliştiğini saptamışlardır. Her iki enzimin, ısıl dirençleri birbirinden farklı iki izoenzimden oluştuğu belirlenmiştir. 60 70 C aralığında, ısıl direnci yüksek olan fraksiyonun oranı POD için; %33 34 ve PFO için; %67 72 olarak bulunmuştur. Diğer taraftan, bu enzimlerin E a ve Z değerlerinin sırasıyla POD için 19.4 kcal.mol -1 ve 25.9 C ve PFO için ise 21 kcal.mol -1 ve 25.5 C olarak saptanmıştır. Aynı şekilde, ph optimumu POD için 5.9 ve PFO için 6.5 olarak belirlenmiştir. Bu enzimlerin yumrudaki dağılımı da incelenmiş ve POD enziminin yumruların yüzey kısımlarında, buna karsın PFO enziminin ise daha çok merkez kısımlarında yoğunlaştığı saptanmıştır. PFO enziminin kateşol oksidaz ve floroglusinol oksidaz aktivitesi içermesine karşı, lakkaz aktivitesine sahip olmadığı görülmüştür. EDTA, SO 2, NaCl ve askorbik asidin PFO enzimi üzerindeki inhibe edici özellikleri de belirlenmiştir. Gόmez (2002), gıda işleme operasyonları sırasında yol gösterici olarak yararlı bilgi sağlamak amacıyla iki avokado çeşidinden (Booth 1 (B1PFO) ve Julio Millian 14

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR (JMPFO)) elde edilen kaba PFO enzimi üzerinde çalışmıştır. İki ekstrakt için de optimum aktivitenin görüldüğü ph 7.5-7.6 bulunmuştur. 67-84ºC arasındaki ısıl aktivasyon enerjisinin, 21.4-64.1 kcal/mol arasında değiştiği bildirilmiştir. Yağar (2004), çalışmasında, ph 7 de, 0.1M fosfat tamponu kullanarak kereviz köklerinden PFO ekstrakte etmiştir. Substrat spesifikliği denemeleri, kateşol, pirogallol, L-DOPA, p-kresol, resorsinol ve tirozin kullanılarak yapılmıştır. Pirogallol, kateşol ve L-DOPA için K m değerleri 25 C de sırasıyla; 4.5, 8.3 ve 6.2 mm bulunmuştur. Optimum ph ve sıcaklık kateşol, pirogallol ve L-DOPA ile belirlenmiştir. Optimum ph kateşol ve L-DOPA için 7, pirogallol için 7.5 dir. Maksimum PFO aktivitesi için optimum sıcaklıklar; pirogallol için 25 C, kateşol için 40 C ve L-DOPA için 45 C bulunmuştur. Isıl inaktivasyon çalışmaları, 60 C nin üzerinde enzimatik aktivitede düşüş olduğunu göstermiştir. İnhibitörlerin etki sırası şu şekilde bulunmuştur: L-sistein>askorbik asit>glisin>resorsinol>nacl. Sabancılar ve ark. (2007), yaptıkları çalışmada Denizli Narından PFO enzimi Afinite Kromatografisi yardımı ile saflaştırmış ve karakterizasyonunu yapmışlardır. Denizli narından saflaştırılan polifenol oksidaz enzimi afinite kromatografisi kullanılarak 67 kat saflaştırılmıştır. Enzimin optimum ph sı 7.5 optimum sıcaklığı 40 C olarak bulunmuştur. Enzimin kinetik parametreleri olan Vm ve K m değerleri ise Linewearver-Burk grafiğinden saptanmıştır. Gülçin ve ark., (2005) ısırgan PFO nun saflaştırılması, karakterizasyonu ve bazı inhibitörlerin enzim aktivitesine etkisini inceledikleri çalışmada, amonyum sülfat çökeltmesi ve iyon değişim kromatografisi ile saflaştırma yapmışlardır. Saflaştırdıkları enzime 8 farklı substratın etkisini denemişler ve en uygun substratın L-tirozin olduğunu bulmuşlardır. Optimum ph ve sıcaklık değerleri sırası ile 4.5 ve 30 C olarak bulunmuştur. K m ve Vm değerleri ise 7.90x10 4 mm ve 11290 EU/mL olarak bildirilmiştir. Ayrıca, birkaç inhibitörün etkisi denenmiş ve en etkili inhibitörün sodyum dietil ditiyokarbomat olduğu saptanmıştır. Orenes-Pinero ve ark. (2006), ayva PFO sunu kısmi olarak saflaştırmışlar ve bazı biyokimyasal özelliklerinin belirlemişlerdir. Araştırmacılar amonyum sülfat çökeltmesi uygulayarak kısmi saflaştırma yapmışlar ve 0.5 g/dm 3 sodyum dodesil sülfat (SDS) varlığında ve asidik ph da enzimin maksimum aktivite gösterdiğini 15

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR bulmuşlardır. SDS varlığında enzimin maksimum hız değerinin 15 kat daha fazla ve optimum ph değerinin 5.0 olduğu, her iki durumda da K m değerinin 1.2 mm olduğu bildirilmiştir. Araştırmacılar birkaç inhibitörün etkisini denemişler ve en etkili inhibitörün tropolon olduğunu bulmuşlardır. Yağar ve Sağıroğlu (2000), ayvadan ekstrakte ettikleri PFO enzimini (NH 4 ) 2 SO 4 çökeltmesi ile kısmen saflaştırılmıştır. Substrat spesifikliği denemeleri, kateşol, pirogallol, L-DOPA, p-kresol, resorsinol ve tirozin kullanılarak yapılmıştır. Kateşol en iyi substrat olarak belirlenmiştir. Michealis sabiti kateşol, pirogallol, L- DOPA için, sırasıyla 4.54 mm, 7.35 mm, 1.78 mm olarak bulunmuştur. Optimum ph ve sıcaklık, spesifik substrat olan kateşol için sırasıyla 8.0 ve 40ºC olarak belirlenmiştir. Sekiz çeşit inhibitör test edilmiş ve ayva PFO su üzerinde en etkili olanlarının L-sistein, askorbik asit, potasyum siyanid olduğu tespit edilmiştir. Ziyan ve Pekyardımcı (2003), polifenol oksidaz enzimini amonyum sülfat çökelmesi, jel filtrasyon ve diyaliz yöntemi ile yerli armut çeşidi olan Ankara armudundan izole etmişlerdir. Amonyum sülfat çökeltmesinden sonra diyalizde elde edilen enzimin biyokimyasal özelliklerini belirlemiştlerdir. Optimum ph değerleri, pirogallol için 8.2, 4-metil kateşol için 7.2, kateşol için 7.0, D-tirosin için 5.6, p- kresol için 5.0, L-dopa için 4.8 olarak belirlenmiştir. Optimum sıcaklık 4-metil kateşol için 35ºC olarak bulunmuştur. 4-metil kateşol, klorogenik asit, kafeik asit iyi substratlar olmasına karşın, kateşol en etkili substrat olarak saptanmıştır. Ayrıca, 6 farklı inhibitörün PFO üzerindeki etkisi araştırılmıştır. L-askorbik asit, L-sistein ve Dietilditiyokarbomat en etkili inhibitör olarak tespit edilmiştir. K m ve Vm değerleri sırasıyla kateşol için 5.55 mm ve 344.5 IU/mL olarak hesaplanmıştır. Termal inaktivasyon çalışmalarında aktivasyon enerjisi 0.19 kal/mol olarak belirlenmiştir. Ankara armudu PFO sunun üç izoenzimi polikirilamid jel elektroforezindeki aktivitesiyle tespit edilmiştir. Molekül ağırlıkları ise sodyum dodesil sülfat PAGE için 60, 20, 28 kda olarak bulunmuştur. Mazzafera ve Robinson (2000), kahve yaprakları ve kahve endosperminin kısmen saflaştırılmış ekstraktından PFO enzimini karakterize etmişlerdir. PFO aktivitesi meyve endospermi ve yaprakların ikisinde de, erken gelişme safhasında daha yüksek oranda bulunmuştur. PFO proteaz uygulamalarıyla aktive edilememiştir 16

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR ve bağlı değildir. PFO aktivitesi 0.35-1.75 mm sodyum dodesil sülfat (SDS) ile %10-15 civarında arttırılmıştır. Ancak, daha yüksek konsantrasyonlarda çalışmalar deterjansız kontrol yöntemleriyle benzerdir. Tripsin veya proteinaz K ile ekstraktın uzun inkübasyonu PFO aktivitesini inhibe etmiştir ancak pepsinin hiçbir etkisi olmamıştır. Proteinaz K ile PFO inhibisyonu SDS varlığında artmıştır. İki dokudaki PFO aktivitesi ph 6-7 de ve 30 C de en yüksektir. Substrat olarak klorojenik asit 0.882 mm (PFO-L) ve 2.27 mm (PFO-E) K m ile en yüksek aktiviteye sahiptir. Hekzadekil trimetil-amonyum bromid polivinilprolidon 40, sinnamik asit ve salisihidroksamik asid her iki dokudan PFO su her iki dokudan inhibe etmiştir. Espin ve arkadaşları (1997) enginardan elde edilen PFO enziminin monofenolaz aktivitesini incelemişlerdir. Enginar PFO su aseton tozu gibi basit bir yöntem kullanılarak izole edilmiştir. Enzim ekstraktı hem monofenolaz hem de difenolaz aktivitesi göstermiştir. Enzim monofenolaz aktivitesi, substrat olarak çiftli bir nükleofil olarak 3-metil-2-benzothiazolinon ile birlikte 4-hidroksianisol, kullanılarak tanımlanmıştır. Bu metot yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlik göstermiş ve PFO nun mikro miktarlarını tespit etmede faydalı olabilecek olan, bir kalibrasyon eğrisi elde etmeye izin vermiştir. Doğan ve arkadaşları (2002), kurutma işlemleri için en uygun patlıcan çeşidini tanımlamak için, farklı patlıcan çeşitlerinden elde edilen PFO enziminin biyokimyasal özelliklerini araştırmışlardır. PFO kateşol, 4-metilkateşole karşı aktivite göstermiş, fakat L-tirozin ile aktivite göstermemiştir. Çeşit I (Vm=3333.3 EUdk -1 ml -1, K max =8.7 mm ve Vm/K max = 384.9 dk -1 ) ve çeşit III (Vm 1000 EU dk -1 ml -1, K max =9.3 mm ve Vm/K max = 107.5 dk -1 ) için en iyi substrat kateşol bulunurken, çeşit II için (Vm=5000 EU dk -1 ml -1, K max =35.5 mm ve Vm/K max = 140.8 dk -1 ) en iyi substrat 4-metilkateşoldür. Kateşol için optimum ph 7, 4-metilkateşol için optimum ph 6 dır. Isıl inaktivasyon çalışmalarına göre 40 C nin üzeri sıcaklıklarda enzim aktivitesi düşmüştür. Kateşol ve 4-metil kateşol substratları için maksimum aktivite elde etmek için optimum sıcaklık, kateşol kullanılan ve optimum sıcaklığı 20 C bulunan çeşit I dışında, tüm patlıcan çeşitleri için 30 C olarak bulunmuştur. Katalizlenen PFO reaksiyonları üzerine Tropolon, D, L-ditiotreitrol ve glutation gibi 17

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR bileşenlerin inhibitör olarak etkileri test edilmiş ve genelde en etkili inhibitör olarak tropolon bulunmuştur. Serradell ve ark. (2000), çilek PFO sunu amonyum sülfat çökeltmesi ve iyon değişim kromatografisi kullanarak saflaştırmışlar ve karakterizasyonunu çalışmışlardır. Substrat olarak prokateşol kullanılmış ve bu substratta K m değeri 11.2 mm, optimum ph değeri 50 C de SDS varlığında 7.2 ise olarak bulunmuştur. Sanchez-Ferrer ve ark. (1988), Monastrell üzümlerinden izole edip kısmen saflaştırdıkları PFO enziminin kateşolaz ve kresolaz aktivitelerini incelemişlerdir. Kateşolazın sıcaklık ve ph optimum aralıkları sırasıyla 20-40 C ve 3.5-5.0 arasında bulunmuştur. Kresolaz aktivitesinde lag periyodu gözlenmiştir. Enzim konsantrasyonu, sıcaklık veya ph daki artış lag periyodununda düşmeye neden olurken substrat konsantrasyonunun artırılması artışa neden olmuştur. Sanchez-Ferrer ve ark. (1989), Monastrell ve Airen üzüm tanelerinde gelişme ve olgunlaşma sırasında kateşolaz ve kresolaz aktivitelerini araştırmışlardır. Monastrell üzümü PFO nun kateşolaz aktivitesi ölçümde kullanılan ph ya bağlı olarak artmış veya azalmıştır. Airen üzümlerinde ise ph dan bağımsız olarak sürekli artmıştır. Monastrell üzümlerinde ağır yağmurlu gün ve ben düşme döneminde daha yüksek kateşolaz aktivitesi gözlenmiştir. Gauillard ve Richard-Forget (1997), yaptıkları çalışmada armuttan elde ettikleri PFO yu saflaştırmış ve bazı özelliklerini belirlemişlerdir. Saflaştırma için amonyum sülfat çökeltmesi ve iyon değişim kromatografisi kullanılmıştır. Saflaştırma sonunda F1 ve F2 olmak üzere iki farklı fraksiyon elde edilmiştir. F1, 124 kat ve F2 ise 36 kat saflaştırılmıştır. Her iki fraksiyon da benzer K m değeri göstermiştir. K m değeri 5-11 mm arasında değişmiştir. Ayrıca, değişik substratlar denenmiş ve en iyi substrat klorojenik asit olarak bulunmuştur. Ding ve ark. (1998), yenidünyadan elde ettikleri PFO enziminin bazı biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi ile ilgili yaptıkları çalışmada enzimi amonyum sülfat çökeltmesi, jel değişim ve iyon değişim kromatografisi kullanarak 157 kat saflaştırmışlardır. Saflaştırma sonunda enzimin optimum ph sı 4.5, optimum sıcaklığı 30ºC ve enzimin stabil olduğu ph aralığı 4-8 olarak bulunmuştur. Ayrıca, araştırmacılar substrat olarak klorojenik asit ve neoklorojenik asit kullandıkları 18

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR çalışmada enzimin K m değerinin 0.105 ve 0.425 mm olduğunu ve inhibitörlerin etkisini çalışmada ise sodyum L-askorbik asit, sodyum dietil ditiokarbomat ve sodyum metabisülfitin enzimi tamamen inhibe ettiğini bildirmişlerdir. Rocha ve ark. (1998), elmadan elde ettikleri PFO ın bazı biyokimyasal özelliklerini belirlemişlerdir. Araştırmacılar farklı substratların etkisini denemişler ve en etkili substratın klorojenik asit olduğunu bulmuşlardır. Weemaes ve ark. (1998), yaptıkları çalışmada elma, avokado, armut ve erikten PFO enzimi izole etmişler ve bazı biyokimyasal özelliklerini belirlemişlerdir. En yüksek PFO aktivitesi avokadodan elde edilen PFO da bulunmuştur. Arslan ve ark. (2004), duttan elde ettikleri PFO yu amonyum sülfat ve affinite kromatografisi kullanarak saflaştırmışlardır. Araştırmacılar substrat olarak kateşol, 4- metil kateşol ve pirogallol kullanmışlardır. Optimum ph ve sıcaklık değerlerinin bu 3 substrat için 4.5-8.0 ve 20-45 C arasında değiştiğini bildirmişlerdir. 19

3.MATERYAL VE METOT 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3. 1. Materyal Denemelerde Ç.Ü. Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Araştırma ve Uygulama Bahçesinden temin edilen Domat zeytini kullanılmıştır. 3.1.1. Analizlerde Kullanılan Araç Gereç ve Kimyasal Maddeler Aseton tozunun elde edilmesinde Torrington HGBTWTS3 (Amerika) marka Waring blendor kullanılmıştır. Tamponların ayarlanmasında ve ph ölçümlerinde cam elektrodlu Inolab (Almanya) marka ph metre kullanılmıştır. Spektrofotometrik ölçümler, sıcaklık kontrol ünitesi olan Shimadzu UV-1700 marka (Japonya) spektrofotometrede gerçekleştirilmiştir. Enzim ekstraktının elde edilmesinde Nüve NM 110 marka karıştırıcı ve Kubota 7780 (Japonya) marka santrifüj kullanılmıştır. Enzimlerin saflaştırılmasında Atto AC-5750 (Japonya) marka fraksiyon kollektörü kullanılmıştır. Enzimlerin biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi sırasında Memmert WB14 ve Nüve BM402 marka su banyosu kullanılmıştır. Enzimin saflaştırılması ve biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesinde kullanılan triton X-100, sodyum metabisülfit, PVPP (polivinilpolipirolidon), askorbik asit, commasie brillant blue (CBB) Merck (Darmstadt, Almanya) firmasından temin edilmiştir. DEAE-Toyopearl 650-M Supelco (Montgomeryville, Amerika) firmasından sağlanmıştır. PEG (polietilen glikol), PMSF (fenilmetilsülfonil florid), 4-metil kateşol, sodyum disülfit, askorbik asit, L-sistein, aseton, amonyum sülfat ve selüloz membran (76mm 49mm) Sigma-Aldrich (St. Louis, Amerika) firmasından temin edilmiştir. 3.2. Metot 3.2.1. Polifenol Oksidaz Ekstraktının Hazırlanması Dondurulmuş (-25ºC), zeytinlerden çekirdekleri çıkartıldıktan sonra 150 gr alınmış, 1.875 g polietilen glikol (PEG) içeren 225 ml önceden soğutulmuş (-18ºC) 20

3.MATERYAL VE METOT aseton içerisinde 2 dk Warring blendorda homojenize edilmiştir. Homojenat vakumlu filtreden geçirilmiştir. Elde edilen filtre keki 150 ml soğutulmuş aseton ile karıştırılarak aynı işlemler uygulanmıştır. Filtre üzerinde kalan kısım, beyaz aseton tozu elde edilene kadar 150 ml soğuk aseton kullanımlarıyla ekstrakte edilmiştir. Elde edilen aseton tozu bir gece oda sıcaklığında kurutulduktan sonra cam kavanoz içerisinde 25ºC de saklanmıştır (Coseteng ve Lee, 1987). 3.2.2. Enzimin Kısmi Saflaştırılması Elde edilen aseton tozundan 10g alınarak 10 mm askorbik asit, %0.1 polivinilpoliprolidon, %0.5 Triton X-100 ve 1mM PMSF (fenil metil sülfoni florid) içeren 300 ml, 0.1 M, ph 6.8 fosfat tamponunda 40 saniye homojenize edilmiştir. Homojenat 3 saat, +4ºC de magnetik karıştırıcı ile karıştırılmış ve daha sonra 10.000 x g de 45 dakika +4ºC de santrifüjlenmiştir. Santrifüj sonrası, berrak kısma %90 amonyum sülfat çökeltmesi uygulanmıştır. Çökeltilen fraksiyonlar 10 000 x g de 45 dakika, + 4ºC de santrifüj edilerek ayrılmıştır. Çökelti, az miktarda 0.01 M ph 6.8 fosfat tamponunda çözülmüş ve +4ºC de aynı tampona karşı bir gece boyunca diyaliz edilmiştir (Serradell ve ark., 2000). 3.2.3. İyon Değişim Kromatografisi ile Saflaştırma Diyaliz edilen enzim çözeltisi, 0.01 M ph 6.8 fosfat tamponu ile dengelenmiş DEAE-Toyopearl 650-M iyon değişim kolonuna (2.5 x 30 cm) 0.5 ml.dk -1 hızla verilmiştir. Enzim çözeltisi verildikten sonra 0.5 ml.dk -1 hızla yaklaşık 200 ml başlangıç tamponu geçirildikten sonra 0.01 0.20 M, ph 6.8 fosfat tamponu kullanılarak gradient elüsyon yapılmıştır. Toplam 40 ml enzim çözeltisi kolona verilmiştir. Fraksiyonlar 4 er ml olacak şekilde toplanmış ve elde edilen fraksiyonlarda enzim aktivitesi ve protein tayini yapılmıştır. 3.2.4. Protein Tayini Enzimlerin protein içeriği standart olarak sığır serum albumini kullanılan Bradford yöntemine göre belirlenmiştir (Bradford, 1976). 21

3.MATERYAL VE METOT 3.2.5. Enzim Aktivitesinin Ölçümü Enzim aktivitesi 30 C de 410 nm de 40 sn boyunca absorbanstaki artıştan belirlenmiştir. Absorbans-zaman grafiğinin lineer kısmının eğiminden enzim aktivitesi hesaplanmıştır. Ölçümler iki paralelli olarak yapılmış ve sonuçlar ortalama değerler şeklinde ifade edilmiştir. Optimum ph daki tampon ile hazırlanmış ve 30 C ye ısıtılmış 0.9 ml substrat çözeltisi 0.1 ml enzim çözeltisi ile karıştırıldıktan sonra absorbanstaki artış otomatik olarak kaydedilmiştir. Sadece inhibitörün etkisini belirlemek için yapılan enzim aktivitesi ölçümlerinde 0.8 ml substrat, 0.1 ml inhibitor ve 0.1 ml enzim çözeltisi kullanılmıştır. Kontrol olarak fosfat tamponunda hazırlanmış substrat kullanılmıştır. 1 ünite PFO aktivitesi 30 C de dakikada 0.001 birimlik absorbans artışına neden olan enzim miktarı olarak tanımlanmıştır (Ünal ve Şener, 2006). 3.2.6. Enzimin Biyokimyasal Özelliklerinin Belirlenmesi Enzimin optimum ph ve sıcaklığı, kinetik parametreler, termal inaktivasyon, inhibitörlerin etkisi gibi biyokimyasal özellikleri Ünal (2007) a göre belirlenmiştir. 3.2.6.1. Optimum ph Enzimin en yüksek aktivite gösterdiği optimum ph yı bulabilmek için 3.04-6.7 ph aralıklarında aktiviteler ölçülmüştür. ph 3.04-5.80 için 0.2 M sitrat tamponu, ph 6.30-6.70 için 0.2 M fosfat tamponu kullanılmıştır. PFO aktivitesi farklı tamponlarda, standart reaksiyon karışımı kullanılarak ölçülmüştür. Enzimin en yüksek aktivite gösterdiği ph değeri optimum ph olarak belirlenmiş ve diğer deneyler bu ph da gerçekleştirilmiştir.. 3.2.6.2. Optimum Sıcaklık Optimum sıcaklığı belirleyebilmek için 20-70 C ler arasında enzim aktivitesi ölçülmüştür. Bunun için optimum ph daki tamponla hazırlanmış 0.9 ml 4-metil kateşol çözeltisi ilgili sıcaklıkta su banyosunda 5 dakika bekletildikten sonra üzerine 22

3.MATERYAL VE METOT 0.1 ml enzim çözeltisi ilave edilerek enzim aktivitesi ölçülmüştür. Maksimum enzim aktivitesinin görüldüğü sıcaklık değeri optimum sıcaklık olarak belirlenmiştir. 3.2.6.3. Kinetik Parametreler Enzimin Michaelis-Menten sabiti (K m ) ve maksimum hız V m değerlerini bulabilmek için optimum ph ve sıcaklıkta değişik konsantrasyonlarda 4-metil kateşol kullanılarak enzim aktiviteleri ölçülmüştür. Kinetik parametreler Lineweaver-Burk metoduyla grafiksel olarak hesaplanmıştır. Bu amaçla 1/Substrat-1/Reaksiyon hızı grafiği çizilmiş ve eğim ve y eksenini kestiği noktalardan K m ve V m değerleri hesaplanmıştır. 3.2.6.4.Termal İnaktivasyon Sıcaklığın enzim stabilitesine etkisini belirlemek için enzim 65, 70 ve 75ºC de (5, 10, 15 dk ) ısıtıldıktan sonra kalıntı enzim aktiviteleri belirlenmiştir. Vidalı deney tüpü ilgili sıcaklıktaki su banyosunda 5 dk bekletildikten sonra içerisine 0.3 ml enzim konulup değişik sürelerde sıcaklığa maruz bırakılmıştır. Süre sonunda enzim hızlı bir şekilde su banyosundan çıkarılıp buz banyosunda soğutulmuş, ardından oda sıcaklığına getirildikten sonra enzim aktivitesi standart reaksiyon karışımı kullanılarak ölçülmüştür. Kontrol olarak sıcaklığa maruz bırakılmayan enzim kullanılmıştır. Sıcaklığa maruz kalan enzimlerdeki kalıntı aktivite (E t ), sıcaklığa maruz kalmamış enzimin aktivitesi (E o ) ile kıyaslanarak birinci dereceli inaktivasyon sabiti (k d ), yarı ömür (t1/2), aktivasyon enerjisi E t, sabit bir sıcaklıktaki enzim aktivitesinin %90 ını inaktive etmek için gereken süre (D değeri) ve D değerinde bir log10 azalma için (% 90 azalma için) gereken sıcaklık artışı (Z değeri) hesaplanmıştır. Bu değerlerin hesaplanması aşağıda özetlenmiştir. Belli bir zaman süreci içerisinde doğal enzimin aktivitesindeki kayıplar ya da konsantrasyonundaki azalmalar birinci dereceden kinetiğe uyar ve aşağıdaki gibi ifade edilebilir. 23

3.MATERYAL VE METOT k d N D Burada N doğal enzimi, D denatüre olmuş enzimi ve k d ise (1/zaman) enzim için birinci dereceli inaktivasyon sabitini göstermektedir. Enzimlerin termal inaktivasyonu genellikle birinci dereceden reaksiyonla ifade edilir: E t = E o. e -kdt Et, t anındaki enzim aktivitesi ve E o başlangıçtaki aktiviteyi, t ise ısıl işlem uygulama süresini ifade eder. Sabit sıcaklıkta ln(e t / E o ) ın süreye karşı grafiği çizildiğinde, kurvenin eğimi k d dir. Yarı ömür (t 1/2 ) değeri, enzim stabilitesinin belirlenmesinde yaygın bir şekilde kullanılan bir parametredir. Belli bir sıcaklıkta enzim aktivitesinin yarı yarıya azalması için gereken süredir. Enzimlerin ısıl yolla inaktivasyonu çoğunlukla birinci dereceden kinetiğe uyduğundan aşağıdaki formülden kolaylıkla hesaplanabilir: (t 1/2 )=0.693/ k d Sabit bir sıcaklıktaki orijinal enzim aktivitesinin %90 ını inaktive etmek için gereken süre olarak tanımlanmaktadır. D değeri aşağıdaki formülden hesaplanabileceği gibi, D=ln(10)/ k d log 10 (E t / E o ) ın zamana karşı grafiğinin eğiminden de hesaplanabilir. Eğer hız sabitleri farklı sıcaklıklarda elde edilirse denatürasyon için aktivasyon enerjisi hesaplanabilir. Aktivasyon enerjisi aşağıda verilen Arrhenius modeli yardımıyla hesaplanabilir. ln k d = lna-( E a /RT) A (1/zaman), kimyasal reaksiyonlar sırasında meydana gelen çarpışmaların toplam sayısı ile ilgili bir parametredir. E a (kj.mol -1 ), aktivasyon enerjisidir. R (kj.mol -1.K -1 ), üniversal gaz sabiti ve T(K) mutlak sıcaklıktır. Aktivasyon enerjisi ile yakından ilişkili bir parametre olan Z değeri, desimal azalma süresinin (D) sıcaklığa bağımlılığını ifade eder ve enzimin ısıl direncini yansıtan bir parametredir. Z değeri, D değerinde bir log10 azalma için (% 90 azalma için) gereken sıcaklık artışıdır. Log10D nin sıcaklığa karşı grafiği çizildiğinde, doğrunun eğimi 1/Z dir (Marangoni, 2003). 24

3.MATERYAL VE METOT 3.2.6.5. İnhibitörlerin Etkileri İnhibitörlerin enzim aktivitesine etkisini belirleyebilmek için 0.01, 0.10 ve 1.00 mm konsantrasyonlarda 3 farklı inhibitör (askorbik asit, sodyum disülfit ve L- sistein) kullanılarak enzim aktivitesi ölçülmüştür. Bunun için optimum ph daki tampon ile hazırlanmış 4-metil kateşol çözeltisinden 0.8 ml ve optimum ph daki tampon ile hazırlanmış değişik konsantrasyonlardaki inhibitör çözeltilerinden 0.1 ml deney tüpüne konularak 5 dk 30 C de su banyosunda bekletilmiş ve daha sonra üzerine 0.1 ml enzim ilave edilerek aktivite ölçümü yapılmıştır. Kontrol olarak inhibitör kullanılmadan hazırlanan standart reaksiyon karışımında enzim aktivitesi belirlenmiştir. İnhibisyon yüzdesi ise aşağıdaki formülden hesaplanmıştır: İnhibisyon (%) = [(Ao Ai)/Ao)]*100 Ao: İnhibitör kullanmadan belirlenen enzim aktivitesi Ai: İnhibitör varlığında enzim aktivitesi. 25

4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA 4.1. Enzimin Saflaştırılması İyon değişim kromatografisinde elde edilen fraksiyonlarda absorbans (280 nm) ve enzim aktivitesi ölçümleri yapılmıştır. Aktivite ölçümleri ph sı 4.98 olan 0.2 M sitrat tamponunda hazırlanmış, 100 mm 4-metil kateşol kullanılarak yapılmış ve absorbans ve aktivite değerlerinden elde edilen grafik Şekil 4.1 de verilmiştir. Şekil 4.1 de görüldüğü gibi iki protein piki elde edilmiş, fakat bunlardan sadece bir tanesinde enzim aktvitesi görülmüştür. Bu aktivite pikinde 21-26 ncı fraksiyonlar birleştirilerek biyokimyasal özellikleri belirlenmiştir. Optimum ph değeri ( ph 4.5) ve 50 mm 4-metil kateşol ile yapılan enzim aktivitesi ölçümlerine göre elde edilen saflaştırma çizelgesi Çizelge 4.1 de verilmiştir. Çizelgeden de görüldüğü gibi PFO enzimi % 24.5 verimle 11.7 kat saflaştırılmıştır. Absorbans (280 nm) 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 18000 16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 1 10 19 28 37 46 55 64 73 82 91 100109118127136145 Fraksiyon Sayısı Absorbans (280 nm) PFO aktivitesi (Ünite/mL) PFO aktivitesi (Ünite/mL) Şekil 4.1. DEAE-selüloz İyon Değişim Kromatoğrafisi ile Zeytin PFO sunun Saflaştırılması. 26

4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Çizelge 4.1 Zeytin PFO sunun Saflaştırma Çizelgesi Saflaştırma Adımları Hacim (ml) Toplam protein (mg) Toplam aktivite (ünite) Spesifik aktivite (ünite/mg protein) Saflaştırma Katsayısı Verim (%) Kaba ekstrakt 270 67.446 3759210 55736.6 1.00 100.0 (NH 4 ) 2 SO 4 çökeltmesi diyaliz DEAE- Toyopearl 650M ve 40 20.6 494280 23994.2 0.43 13.1 24 1.41 922320 654127.7 11.7 24.5 4.2. Optimum ph Enzimlerin maksimum aktivite gösterdikleri bir ph veya ph aralığı vardır. Bu optimum ph nın altında ve üzerinde aktiviteleri düşer. Enzimler kuvvetli asit ve bazlara fazla dayanıklı değildirler. Ortam ph sındaki aşırı olmayan değişiklikler enzimin ve çoğu kez de substratın iyonik durumunda değişikliklere neden olur. Enzimler kendileri için aşırı ph değerlerinde aktivitelerini kaybederler. Enzimlerin maksimum reaksiyon hızına sahip oldukları ph değerine optimum ph denir. Optimum ph nın altında ve üstündeki ph larda enzim veya substratta mevcut fonksiyonel grupların yapılarında değişmeler oluşur ve reaksiyon hızı da değişime uğrar (Koolman ve Roehm, 2005). Kovalent olmayan elektrostatik bağlar, hidrojen bağları, hidrofobik bağlar ve kovalent disülfit bağları enzimlerin üçüncül ve dördüncül yapılarını stabilize eder. Enzim üzerindeki pozitif ve negatif gruplar arasında oluşan elektrostatik bağlar ph dan etkilenirler. Nötral ph'larda iyonlaşabilen yan gruplar COO-, H 3 N+ ve H 2 N-C gruplarıdır ve bunlar kuvvetli elektrostatik bağlar oluşturabilirler. ph 3 ün altında karboksil grupları protonlanırlar (-COOH) ve elektrostatik bağ oluşturamazlar. ph 10 un üzerinde ise amino grupları protonlanırlar (-NH 2 ) ve elektrostatik bağlar oluşturamazlar (Whitaker, 2003). Optimum ph daki bu değişiklikler, doku kültürlerinin yaşlanmasına, dokudaki stres şartlarının artmasına ve enzimin deterjan, üre gibi, denatüre ajanlarla etkileşimine, yüksek sıcaklığa veya kısa süreliğine asid ph'ya maruz kalmasına bağlıdır. 27

4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Zeytin PFO nun en yüksek aktivite gösterdiği optimum ph sını belirleyebilmek için standart reaksiyon karışımında ph sı 3.04 6.70 arasında değişen tamponlar kullanılarak enzim aktivitesi ölçülmüş ve sonuçlar % nispi aktivite olarak Şekil 4.2 de gösterilmiştir. Şekilden de görüleceği gibi ph 3.04 ten 4.50 a doğru aktivite artmış en yüksek aktivite ph 4.5 te görülmüştür. Optimum ph dan sonra enzim aktivitesi önemli ölçüde azalarak % 20 lere kadar düşmüştür. 120 100 Nisbi Aktivite (% ) 80 60 40 20 0 3.04 3.46 4.08 4.5 4.98 5.49 5.8 6.3 6.7 ph Şekil 4.2. ph nın Zeytin PFO Aktivitesine Etkisi Değişik ürünlerde PFO ile yapılan optimum ph çalışma sonuçları Çizelge 4.2 de verilmiştir. Çizelgeden görüldüğü gibi değişik ürünlerden izole edilen PFO nun optimum ph değerleri 3 9 gibi geniş bir aralıktadır ve bu çalışmada elde edilen sonuç (ph 4.5) literatürdeki değerlerle uyum içindedir. 28

4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Çizelge 4.2. Çeşitli Ürünlerden İzole Edilen PFO ların Optimum ph Değerleri Optimum ph Ürün Substrat Kaynak 9.0 Fasulye Sürgünleri Kateşol Nagai ve Suzuki, 2003 8.5 Kayısı (Malatya) Kateşol Arslan ve ark., 1998 7.5 Cassava kökleri Kateşol, L-Dopa Barthet,1997 7.0 Muşmula 4-Metil Kateşol Ayaz ve ark., 2008 7.0 Patlıcan Kateşol Doğan ve ark., 2002 7.0 Anamur muzu Kateşol Ünal, 2007 5.0 7.5* Jonagored elması Kateşol Rocha ve Morais, 2001 5.0 Hint çay yaprağı Kateşol 4.0 7.0* Zambak Kateşol Hadler ve ark., 1998 Yang ve Wang, 2008 3.0 Napolyon üzümü 4-tert-bütilkateşol Delicado ve ark., 2007 *Enzimin iki optimum ph sı bulunmuştur. 4.3 Optimum Sıcaklık Kimyasal reaksiyonların hızı genellikle sıcaklıktaki artışla artar. Enzimlerle katalizlenen reaksiyonların hızları da sıcaklıkla artmakla birlikte, yüksek sıcaklıklarda enzimler protein yapılarından dolayı aktivitelerini kaybederler. Yüksek sıcaklıklar enzimatik reaksiyonda rol oynayan fonksiyonel grupların disosiye olma durumunu etkileyebilir; enzimin aktivatörlere ve inhibitörlere ilgisini etkileyebilir; reaksiyonda substrat olabilecek oksijeninin çözünürlüğünü etkileyebilir. Bunların dışında, yüksek sıcaklık enzimleri inaktive edebilir. Reaksiyon hızının maksimuma 29

4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA eriştiği noktadaki sıcaklık derecesine optimum sıcaklık denir. Enzimlerin büyük çoğunluğunun optimum aktivitesi 30 40 C dir ve 45 C nin üzerinde denatürasyon başlar. Zeytin PFO sunun en yüksek aktivite gösterdiği optimum sıcaklığı belirleyebilmek için 20 80 C ler arasında enzim aktivitesi ölçülmüş ve sonuçlar % nispi aktivite olarak şekil 4.3 de verilmiştir. Ölçümlerde standart reaksiyon karışımı kullanılmıştır. 120 100 %Nispi aktivite 80 60 40 20 0 20 30 40 50 60 70 80 SıcaklıkºC Şekil 4.3. Sıcaklığın Zeytin PFO suna Etkisi Şekilden de görüldüğü gibi enzim en yüksek aktiviteyi 30 C de göstermiştir. 30 C den itibaren sıcaklıktaki artışla beraber enzim aktivitesi azalarak % 30 lara kadar düşmüştür. Farklı bitkisel ürünlerde PFO ile yapılan optimum sıcaklık çalışma sonuçları Çizelge 4.3 de verilmiştir. Çizelgeden görüldüğü gibi değişik ürünlerden izole edilen PFO nun optimum sıcaklık değerleri 12-45 C gibi geniş bir aralıktadır ve bu çalışmada elde edilen sonuç (30 C) diğer araştırmacıların çalışmaları ile benzerlik göstermektedir. 30

4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Çizelge 4.3. Çeşitli Ürünlerden İzole Edilen PFO ların Optimum Sıcaklık Değerleri Optimum Sıcaklık C Ürün Kaynak 45 Dut Arslan ve ark., 2004 40 Fasulye Sürgünleri Nagai ve Suzuki, 2003 30 Muşmula Ayaz ve ark., 2008 30 Anamur Muzu Ünal, 2007 25 Enginar Aydemir, 2004 12 Ferula Bitkisi Erat ve ark., 2006 4.4. Kinetik Parametreler Çeşitli ürünlerde bulunan PFO ların substrat spesifikliği önemli bir farklılık gösterirken, aynı ürünün farklı çeşitlerinde substrat spesifikliği büyük bir değişim göstermeyebilir. Buna göre belli bir çeşitte PFO nun öncelikli olarak kullandığı fenolik bileşiklerin diğer çeşitlere kıyasla daha az bulunması durumunda, işleme açısından bu çeşidin tercih edilmesi bir avantaj sayılabilir (Cemeroğlu ve ark., 2001). Fenolik bileşikler PFO enzimi için birincil substratlardır. Birçok fenolik bileşik PFO enzimi için substrat olarak görev yapar. Farklı bitki kaynaklarında çok farklı türde ve miktarda doğal fenolik bileşikler bulunmaktadır. Örneğin klorojenik asit üzüm ve çayda bulunan ana fenolik bileşiktir. Öte yandan klorojenik asit elma, patates ve ayçiçeği gibi diğer birçok üründe bulunmaktadır. Kateşin, epikateşin ve kafeik asit türevleri meyvelerde yaygın olarak bulunan fenolik bileşiklerdir. Ayrıca muz pulpunda bulunan dopaminin endojen PFO etkisiyle oksidasyonu sonucu enzimatik esmerleşme meydana geldiği bildirilmiştir. Bazı çalışmalarda farklı fenolik bileşiklerin farklı esmerleşme derecesine sahip olduğu belirtilmiştir. Örneğin üzümlerde bulunan monomerik kateşinler ve dimerik prosiyanidinler diğer fenolik bileşiklerden daha çok esmerleşmektedir (Yoruk ve Marshall, 2003). Substratın yan zincirinin doğası, hidroksil gruplarının sayısı ve benzen halkasındaki pozisyonu enzimin katalitik aktivitesinde önemli etkiye sahiptir. PFO nun substrat spesifikliği bitki türüne ve bitkinin yetiştirme koşullarına da bağlıdır. Örneğin, DeChaunac üzüm PFO su kafeik asidi diğer substratlardan daha hızlı okside etmektedir. Aynı zamanda 4-metil kateşol ve klorojenik aside karşı PFO 31

4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA yüksek aktivite göstermektedir. Ancak, Koshu üzümünden elde edilen PFO klorojenik asitte en yüksek aktivite göstermektedir ve bunu kafeik asit ve d-kateşin izlemektedir. Öte yandan, Concord üzümü PFO su kateşolü kafeik asitten daha hızlı okside etmektedir (Yoruk ve Marshall, 2003). Enzimin K m ve V m değerlerini bulabilmek için 3.125mM-50mM arasında değişen substrat konsantrasyonlarında enzim aktivitleri ölçülmüştür. K m ve V m değerleri, sırasıyla 14.52 mm ve 1.73 Abs/dk olarak hesaplanmıştır. Değişik ürünlerden elde edilen PFO ların K m değerleri Çizelge 4.4 te görülmektedir. Görüldüğü gibi K m değerleri bu kaynağa göre büyük değişiklik göstermektedir. Bu çalışmada elde edilen K m değeri bu değerlerle uyum içerisindedir. Çizelge 4.4. Çeşitli Ürünlerin PFO larının K m Değerleri Ürün Substrat K m (mm) Kaynak Zambak Kateşol 3.40 Yang vewang, 2008 Anamur muzu Kateşol 8.50 Ünal, 2007 Enginar başı Kateşol 10.20 Aydemir, 2004 Hint çay yaprağı Kateşol 12.52 Halder ve ark.,1998 Cassava kökleri Kateşol 28.21 Barthet,1997 Fasulye sürgünleri Kateşol 71.00 Nagai ve Suzuki, 2003 Jonagored elması Kateşol 230.00 Rocha ve Morais, 2001 4.5. Termal İnaktivasyon PFO ın termal inaktivasyon kinetiği 65, 70 ve 75ºC de 5, 10, 15 dk sürelerde çalışılmıştır. Termal inaktivasyon parametreleri ısıl işleme maruz kalmış enzimlerin aktivitelerinin ısıtılmamış örneğin aktivitesine kıyaslanmasıyla kd (inaktivasyon sabiti), t1/2 (yarı ömür) ve D (desimal indigenme süresi) değerleri hesaplanmış ve sonuçlar çizelge 4.5 de verilmiştir. Sıcaklık arttıkça kd değerleri artmış buna karşılık enzim aktivitesini yarı yarıya azaltmak için gereken süre ve D değerleri azalmıştır. 65ºC de enzimin yarı ömür değeri 31.9 dk iken 75ºC de 9.24 dk olmuştur. 32

4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Çizelge 4.5. Zeytin PFO sunun Termal İnaktivasyon Parametreleri Sıcaklık ( C) kd (dak-¹) r² t½ (dak) D (dak) 65 0.0217 0.9556 31.9 106.1 70 0.0318 0.9983 21.8 72.4 75 0.0750 0.9808 9.24 30.7 Termal inaktivasyon çalışmalarının diğer önemli parametreleri aktivasyon enerjisi (E a ) ve enzimin D değerinde bir log10 azalma için (% 90 azalma için) gereken sıcaklık artışı ifade eden Z değeridir. Bu çalışmada, Z ve E a değerleri sırasıyla 18.6 C (r²=0.9532) ve 121.043 kj.mol -1 (r²=0.9496) olarak hesaplanmıştır. Termal inaktivasyon parametrelerinin diğer araştırıcıların sonuçları ile karşılaştırılması çalışılan sıcaklık ve sürelerdeki farklılıklar nedeniyle zordur. Çizelge 4.6 da değişik ürünlerden izole edilen PFO enzimlerinin aktivasyon enerjileri (E a ) değerleri görülmektedir. Bu değer ürüne göre ve hatta aynı üründe bile önemli farklılık göstermektedir. Çizelgeden görüldüğü gibi değişik ürünlerin aktivasyon enerji değerleri 15.80-225.43 kj.mol -1 gibi geniş bir aralıkta değişmektedir. Bu çalışmada bulunan E a değeri literatürdeki değerlerle uyum içindedir. Çizelge 4.6. Çeşitli Ürünlerden izole edilen PFO ların Aktivasyon Enerjileri Ürün E a (kj.mol -1 ) Kaynak Victoria üzümü 225.43 Râpeanu ve Bulancea, 2005 Anamur muzu 155.00 Ünal, 2007 Zambak 100.80 Yang ve Wang, 2008 Ananas püresi 82.80 Chutintrasria ve Noomhormb, 2006 Enginar başı 15.80 Aydemir, 2004 Z değerinin büyük olması enzimin ısıl dayanıklılığının diğer bir göstergesidir. Yemenicioğlu ve arkadaşları yaptıkları çalışmada Taro yumrularından ekstrakte ettikleri PFO enziminin Z değerinin 25.5 C olduğunu bulmuşlardır. Ünal (2007) çalışmasında Anamur muzu PFO enziminin Z değerinin 14.2ºC olduğunu bulmuştur. Chutintrasria ve Noomhormb (2006) çalışmalarında Ananas püresi PFO enziminin Z 33

4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA değerini 21.5ºC bulmuşlardır. Râpeanu ve Bulancea (2005) Victoria üzümü PFO enzimi ile yaptıkları çalışmada enzimin Z değerinin 9.66ºC olduğunu bulmuşlardır. Domat zeytinindeki Z değeri ise bu değerlere yakın bulunmuştur. 4.6. İnhibitörlerin Etkisi Enzimatik emerleşme nedeniyle meyve ve sebze ürünlerinde yıllık milyon dolarlarca kayıplar meydana gelmektedir. Meyve ve sebze ürünlerinde olduğu kadar deniz ürünlerinde de PFO nedeniyle meydana gelen esmerleşme reaksiyonları önemli ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Bu nedenle ürünün raf ömrünü uzatmak ve kalitesini korumak amacıyla bu enzimin kontrol altına alınması gerekmektedir. Zarar görmüş dokuların esmerleşmesini önlemek veya azaltmak için deneysel bazı yaklaşımlar geliştirilmiştir. Bu amaçla PFO aktivitesini önlemek için çeşitli inhibitörler kullanılmaktadır. Kullanılan inhibitörler 5 grup altında toplanabilir (Yoruk ve Marshall, 2003). İndirgeyici ajanlar (askorbik asit ve analogları, sülfitler): i. Çelat oluşturucu ajanlar (etilendiamintetraasetat (EDTA), sodyum dietilditiokarbomat (DIECA), sodyum azid) ii. Kompleks oluşturucu ajanlar (siklodekstrin, chitosan) iii. Asitlendiriciler (askorbik asit, sitrik asit, malik asit, fosforik asit) iv. Enzim inhibitörleri (substrat analogları, halidler) v. Enzimatik uygulamalar (proteazlar, o-metiltransferaz) Bu bileşikler aktif reaksiyon elementlerinden birini (enzim, substrat, bakır veya o-kinonlar) reaksiyondan elimine etmek yolu ile esmerleşme reaksiyonlarını inhibe eder veya azaltır (Yoruk ve Marshall, 2003). İndirgeyici ajanlar gıda endütrisinde yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Bu ajanlar 0-kinonların birikimini önlemek yolu ile melaninlerin oluşumunu inhibe eder veya stabil renksiz ürünler oluştururlar. Bu ajanlardan en önemlisi sülfür dioksit (SO 2 ) veya sülfitlerdir (sodyum sülfit, sodyum bisülfit ve sodyum metabisülfit). Bu ajanlar ekonomik olmaları ve esmerleşmeyi önlemede yüksek etkinliklerinden dolayı meyve ve sebze endüstrisinde yaygınlıkla kullanılmaktadır(yoruk ve Marshall, 2003). Sodyum disülfit, indirgeyici bir ajandır. İndirgeyici ajanlar gıda endütrisinde 34

4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Bu ajanlar o-kinonların birikimini önlemek yolu ile melaninlerin oluşumunu inhibe eder veya stabil renksiz ürünler oluştururlar. L- sistein ise antioksidan özellikte bir maddedir (Zawistowski ve ark., 1991). Askorbik asit (vitamin C) ve onun izomeri eritorbik asit sülfitlere alternatif olarak kullanılan en iyi indirgeyici ajandır ve yaygın olarak meyve suları, püreleri, dondurulmuş dilimlenmiş meyveler ve konserve meyve ve sebzelerde kullanılmaktadır. Askorbik asidin tükenmesinden sonra esmerleşme başlar. PFO nun neden olduğu esmerleşmeyi daha iyi kontrol altına almak için askorbik asit diğer inhibitörlerle birlikte kullanılmalıdır. Örneğin askorbik asit ve sitrik asidin birlikte kullanımı tek başına kullanılmalarından daha etkilidir. Bu çalışmada, askorbik asit, sodyum disülfit ve L-sisteinin zeytin PFO suna olan inhibibe edici etkileri 0.01, 0.10 ve 1.00 mm konsantrasyonlarda incelenmiştir. Sonuçlar % inhibisyon olarak Çizelge 4.7 de verilmiştir. Denenen tüm inhibitörlerde % 100 inhibisyon görülmemiş, en yüksek inhibisyon derecesi % 69.63 lük inhibisyon derecesi ile 1 mm konsantrasyonda L-Sisteinle olmuştur. L-Sistein ve Sodyum Disülfitin inhibe edici etkileri birbirine yakın olmuş, buna karşılık askorbik Asit en düşük inhibisyonu göstermiştir. Çizelge 4.7. İnhibitörlerin Zeytin PFO suna Etkileri İnhibitör Konsantrasyon(mM) İnhibisyon (%) Askorbik asit Sodyum disülfit L-Sistein 0.01 0.10 1.00 0.01 0.10 1.00 0.01 0.10 1.00 13.20 ± 2.09 23.33 ± 6.53 31.65 ± 1.24 33.58 ± 0.58 59.66 ± 5.33 69.42 ± 2.78 23.71 ± 0.23 48.48 ± 8.4 69.63 ± 3.01 Ünal ın (2007) Anamur muzu PFO su üzerine yaptığı çalışmada askorbik asit ve sodyum metabisülfit en etkili inhibitörler olarak bulunmuştur. NaCl ve sitrik asit 35

4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA daha az etkili bulunmuştur. Ziyan ve Pekyardımcı nın (2003) Ankara armudu PFO su üzerine yaptıkları çalışmada sodyum dietilditiyokarbamat en etkili inhibitör olarak bulunmuştur. Rapeanu ve arkadaşları (2006), Güney Afrika da yetişen Viktorya üzümlerinden ekstrakte ettikleri PFO enzimi üzerinde sekiz inhibitör test etmişler ve en etkili inhibitörlerin askorbik asit, L-sistein ve sodyum metabisülfit olduğunu bildirmişlerdir. Orenes-Pinero ve ark. (2006), yaptıkları çalışmada ayva PFO sunu kısmi olarak saflaştırarak birkaç inhibitörün etkisini denemişler ve en etkili inhibitörün tropolon olduğunu bulmuşlardır. Yağar ve Sağıroğlu (2000), PFO enzimini ayvadan ekstrakte ettikleri çalışmada, sekiz çeşit inhibitörü test etmişler ve ayva PFO su üzerinde en etkili olanlarının L-sistein, askorbik asit, potasyum siyanid olduğunu bulmuşlardır. Yang ve Wang ın (2008) zambak bitkisi PFO su üzerine yaptıkları çalışmada en etkili inhibitör sodyum sülfit (0.1 mm) bulunurken, askorbik asit, L-sistein ve tiyoürenin yüksek konsantrasyonlarda (10 mm) oldukça etkili inhibe edici etki gösterdiği bulunmuştur. NaCl ve sitrik asit bu bitki enzimi için zayıf inhibitörler olarak belirtilmiştir. Nagai ve Suzuki nin (2003) fasulye filizi PFO su üzerine yaptıkları çalışmada 3 mm konsantrasyonda askorbik asit, L-sistein, 2- merkaptoetanol ve glutation etkili inhibitörler olarak gösterilmiştir. 36

5.SONUÇ 5. SONUÇ Bu çalışmada Domat çeşidi zeytinden izole edilerek kısmen saflaştırılan polifenol oksidaz ın (PFO) biyokimyasal özellikleri araştırılmıştır. Bu bağlamda, enzimin optimum ph ve sıcaklığı, kinetik parametreleri, termal inaktivasyonu ve bazı inhibitörlerin etkisi incelenmiştir. Elde edilen bulgulardan; Substrat olarak 4-metil kateşol kullanılmış ve enzimin K m değerinin 14.52 mm, V m değerinin ise 1.73 Abs/dk olduğu, ph 3.04 den ph 4.5 a doğru arttırıldıkça, enzim aktivitenin de arttığı, en yüksek aktivitenin ph 4.5 da görüldüğü ve enzim aktivitesinin optimum ph dan sonra önce hızlı sonra yavaş olarak düştüğü, Enzimin en yüksek aktiviteyi 30 C de gösterdiği, 30 C den itibaren sıcaklıktaki artışla beraber enzim aktivitesinin hızla azalarak 70 C de yaklaşık % 20 ye düştüğü, Enzimin Z ve Ea değerlerinin 18.55 C (r²=0.9532) ve 121.043 kj.mol -1 (r²=0.9496) olduğu, L-Sistein ve sodyum disülfitin inhibe edici etkilerinin birbirine yakın olduğu buna karşılık askorbik asitin inhibisyon etkisinin denen diğer inhibitörlere göre daha düşük olduğu belirlenmiştir. 37

KAYNAKLAR ANONİM, 2001. Tarımsal Göstergeler (1998-2004). T.C. Başbakanlık Devlet İstatistik Enstitüsü Yayınları, Ankara. ANONİM, 2004, Food and Agriculture Organization of the United Nations.(1998-2004). ANONYMOUS, 2006b, Modern Zeytincilikte Kültürel İşlemler www.zae.gov.tr/yetiştirme/41.asp. ARSLAN, O., TEMUR, A., ve TOZLU, İ., 1998. Polyphenol oxidase from Malatya apricot (Prunus armeniaca L.). Journal of Agriculture and Food Chemistry, 46: 1239-1241. ARSLAN, O., ERZENGİN, M., SİNAN, S. ve ÖZENSOY, Ö., 2004. Purification of Mulbery (Morus alba L.) polyphenol oxidase by Affinity Chromatography and Investigation of Its Kinetic and Electrophoretic Properties. Food Chemistry, 88:479-484. AYAZ, F.A., DEMIR, O., TORUN H., KOLCUOGLU Y. ve ÇOLAK, A., 2008.Characterization of Polyphenoloxidase (PPO) and Total Phenolic Contents in Medlar (Mespilus germanica L.) Fruit During Ripening and Over Ripening, Science Direct, Food Chemistry, 106: 291 298. AYDEMİR, T., KAVRAYAN, D., ve ÇINAR, S., 2003. Isolation and Characterisation of Polyphenoloxidase from Jerusalem Artichoke (Helianthus tuberosus) S.Ü. Fen-Edebiyat Fakültesi Fen Dergisi, Sayı 21, 115-125, KONYA. AYDEMİR, T., 2004. Partial Purification and Characterization of Polyphenol Oxidase from Artichoke (Cynara scolymus L.) Heads, Food Chemistry, 87: 59 67. AYDIN, C., 2000. Bazı Zeytin Çeşitlerinde Meyvenin Fiziko- Mekanik Özellikleri, Selçuk Ü. Zir. Fak. Dergisi 14 (23): 83-88. 38

BARTHET, V. J. 1997. Polyphenol Oxidases from Cassava (Manihot Esculenta C.)Root: Extraction, Purification and Characterization, Submitted to PartialFulfilment of the Requirements for the degree Philosophiae Doctor in the Department of Food Science and Agricultural Chemistry University McGiU (Macdonald Campus) Montreal, PQ, Canada, i-ii. BEN-SHALOM, N., KAHN, V., HAREL, E. ve MAYER, A.M. 1977. Journal of Science of Food and Agriculture, 28:545. BOSKOU, D. 1996. Oive Oil Chemistry and Techonology. AOCS Press, Champaign,IL, 161p, USA BOZDOĞAN, D., 2002. Hatay da Üretilen Natürel Zeytin Yağlarının Bazı Fiziksel, Kimyasal ve Duyusal Özelliklerinin İncelenmesi. Mustafa Kemal Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi, Antakya. BRADFORD, M. M., 1976. a Rapid and Sensitive for the Quantitation of Microgram Quantitites of Protein Utilizing the Principle of Protein-dye Binding, Analytical Biochemistry, 72: 248-254. BRENES-BALBUENA, M., ROMERO, C., GARCIA, P. ve GARRIDO, A., 1995. Effect of ph on the Colour Formed by Fe-Phenolic Complexes in Ripe Olives. J. Sci. Food Agric., 67: p. 35-41. CASADO-VELA, J., SELLES, S. ve BRU, R., 2005. Purification and Kinetic Characterization of Polyhphenol oxidase from Tomato Fruits. Journal of Food Biochemistry, 29:381-401. CASH, J. N., SİSTRUNK, W. A., ve STUTTE, C. A. 1976. Characteristics of concord grape polyphenoloxidase involved in juice color loss. Journal of Food Science, 41, 1398 1402. CEMEROĞLU, B., YEMENİCİOĞLU, A. ve ÖZKAN, M., 2001. Meyve ve Sebzelerin Bileşimi Soğukta Depolanmaları, Gıda Teknolojisi Derneği Yayınları No:24, Ankara. 39

CHUTINTRASRIA, B. ve NOOMHORMB, A., 2006. Thermal Inactivation of Polyphenoloxidase in Pineapple Puree, LWT - Food Science and Technology, 39: 492 495. COSETENG, M.Y., LEE, C.Y. ve 1987. Changes in Apple Polyphenoloxidase and Polyphenol Concentrations in Relation to Degree of Browning, Jounal of Food Science, 4, 985-989. DELICADO,E. N, MEGI AS, M.S., LO PEZ, A.J.P. ve NICOLA S, J.M.L., 2007. Characterization of Polyphenol Oxidase from Napoleon Grape, Food Chemistry, 100: 108 114. DING, C., CHACHIN, K., UEDA, Y. ve IMAHORI, Y., 1998. Purification and Properties of Polyphenol oxidase from Loquat. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 46: 4144-4149. DOĞAN, M., ARSLAN, O. ve DOĞAN, S., 2002. Substrate specificity, heat inactivation and inhibition of polyphenol oxidase from different aubergine cultivars International Journal of Food Science and Technology 2002, 37, 415-423. ESPİN, J.C., TUDELA, J. ve GARCİA-CANOVAS, F., 1997.Monophenolase Activitiy of Poliphenol Oxidase from Artichoke Heads (Cynara scolymus L.). Lebensmittel Wissenschaft u. Technology, 30 (1997)819-825. ESTİ, M., CİNQUANTA, L. ve LA NOTTE, E., 1998. Phenolic Compounds in Different Olive Varieties. J. Agric. Food Chemistry, 46 (1): s. 32-35. FAO, 2004. http://www.fao.org. GAUILLARD, F. ve RICHARD-FORGET, F., 1997. Polyphenoloxidase from Williams Pear (Pyrus communis L, cv Williams): Activation, Purification and Some Properties. Journal of the Science of Food and Agriculture, 74:49-56. 40

GARCIA, P., CONCEPCION, R., BRENES, M. ve GARRIDO, A., 1996. Effect of Metal Cations on the Chemical Oxidation of Olive o-diphenols in Model Systems. J. Agric. Food Chem., 44 (8): s. 2101-2105. GODFREY, T. ve WEST, S., 1996. Industrial Enzmology. Stockton Pres, New York. GΌMEZ, V. M., 2002. Some biochemical properties of polyphenol oxidase from two varieties of avocado, Food Chemistry 77 (2002) 163-169. GOUPY, P, FLEURIET,A., AMIOT, M. ve MACHEIX, J., 1991. Enzymatic Browning, Oleuropein Content, and Diphenol Oxidase Activity in Olive Cultivars (Olea europaea L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 39: 92-95. GÜLÇİN, İ., KÜFREVİOĞLU, Ö. İ. ve OKTAY, M., 2005. Purification and Characterization of Polyphenol oxidase from Netle (Urtica dioica L.) and inhibitory effects of some chemicals on enzyme activity. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 20(3):297-302. HALDER, J., TAMULI, P. ve BHADURI, A.N., 1998. Isolation and Characterization of Polyphenol Oxidase from Indian Tea Leaf (Camellia sinensis), Nutritional Biochemistry, 9: 75-80. INGEBRIGSTEN, J., KANG, B. ve FLURKEY, M.W.H. 1989. Journal of Food Science, 54:128. KEÇELİ, T., 2000. Antimicrobial and Antioxidant Activity of Olive Oil Phenolics, in Food Science and Tecnology. The University of Reading : Reading 312s. KEÇELİ, T. ve GORDON, M.H., 2001. The Antioxidant Activity and Stability of the Phenolic Fraction of Green Olives and Extra Virgin Olive Oil. J. Sci. Food and Agric., 81: s. 1391-1396. KOOLMAN, J. ve ROEHM, K. H., 2005. Color Atlas of Biochemistry, 2nd Ed. Thieme, Stuttgart, s. 88-94. 41

KRISTAKIS, A. K., 1998. Olive Oil. From Tree to the Table. 2nd Edition. Food & Nutrition Pres., Inc., 347 s. MARANGONI, A. G., 2003. Enzyme Kinetics: A Modern Approach, New Jersey: John Wiley & Sons, 140-157. MAZZAFERA P. ve ROBİNSON S.P., 2000. Characterization of polyphenol oxidase in coffee. Phytochemistry 55: 285-296. MONTEDORO, G., 1993. Simple and Hydrolyzable Phenolic Compounds in Virgin Olive Oil. 3. Spectroscopic Characterisations of Secoiridoid Derivatives. J. Agric.,Food Chem., 41: 2228-2234. MUCHUWETI, M., MUPURE, C. H., NDHLALA, A. R. ve KASIYAMHURU, A., 2006. Characterization of Polyphenoloxidase from Uapaca kirkiana Fruit. Journal of the Science of Food and Agriculture, 86: 328-332. NAGAI, T. ve SUZUKI, N., 2003. Polyphenol Oxidase from Bean Sprouts (Glycine max L.), Journal of Food Science (68) issue 1, 16-20. NAKAMURA, K., AMANO, Y. VE KAGAMİ, M., 1983. Purification and some properties of a polyphenol oxidase from Koshu grapes. Journal Enology Viticulture, 34:122-127. ORENES-PINERO, E., GARCIA-CARMONA, F., SANCHEZ-FERRER, A., 2006. Latent Polyphenoloxidase from Quince Fruit Pulp (Cydonia oblonga): purification, activation and some properties. Journal of the Science of Food and Agriculture, 86:2172-2178. ÖKSÜZ, E., 1998. Ülkemizde Zeytin Hasat Mekanizasyon Düzeyi, Hasat Edilebilirlik Kriterleri ve Maliyetinin Belirlenmesi Üzerine Bir Araştırma, Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Tarım Makineleri Anabilim Dalı, Yüksek Lisans Tezi, Adana. RAPEANU, G. ve BULANCEA, M., 2005. Thermal Inactivation Kinetics of Polyphenoloxidase Extracted from White Grapes, Acta Universitatis Cibiniensis Series E: Food Technology, Vol. IX, no.1. 42

RAPEANU, G., LOEY, A. V., SMOUT, C. ve HENDRİCKX, M., 2006. Biochemical Characterization and Process Stability of Poliphenoloxidase Extacted from Victoria Grape (Vitis vinifera ssp. Sativa). Food Chemistry 94 (2006) 253-261. ROBARDS, K., PRENZLER, P. D., TUCKER, G., SWATSITANG, P. ve GLOVER, W., 1999. Phenolic Compounds and Their Role in Oxidative Process in Fruits. Food Chemistry., 66 (4): s. 401-436. ROCHA, A.M.C.N., CANO, M.P., GALEAZZI, M.A.M. ve MORAIS, A.M.M.B., 1998. Characterisation of Starking Apple Polyphenoloxidase. Journal of the Science of Food and Agriculture, 77:527-534. ROCHA, A.M.C.N. ve MORAIS, A.M.M.B., 2001. Characterization of Polyphenoloxidase (PPO) Extracted from "Jonagored" Apple, Food Control, 12: 85-90. RYAN, D., ve ROBARDS, K., 1998. Phenolic Compounds in Olives. Analyst, 123 (5) : s. 31R 44R. RYAN, D., ROBARDS, K. ve LAVEE, S., 1999a. Determination of PhenolicCompounds in Olives by Reversed Phase Chromatography and Mass Spectrometry. J. Chromatography, 832 (1-2): s. 87-96. SABANCILAR, İ., EMRE, Ö., BAYCAN, Y.S., DEMİR, H. ve ERGE, H., 2007, Denizli Narından Afinite Kromatografisi Yardımı ile Polifenol Oksidaz Enziminin Saflaştırılması ve Karakterizasyonu, Yüzüncü Yıl Üniversitesi, Eğitim Fakültesi, Kimya Eğitimi ABD, VAN. Yüzüncü Yıl Üniversitesi, Fen-Edb. Fakültesi, Kimya Bölümü, Biyokimya ABD, VAN. SAIJA, A., TROMBETTA, D., CASCIO, R., PRİNCİ, P., UCCELLA, N.,BONİNA, F. ve CASTELLİ, F., 1998. 'In Vitro' Evaluation of the Antioxidant Activity and Biomembrane Intraction of the Plant Phenols 43

Oleuropein and Hydroxytyrosol. _nternational Journal of Pharmaceutics, 166 (2): s. 123-133. SANCHEZ-FERRER, A., BRU, R., CABANES, J. ve GARCİA-CARMONA., F., 1988. Characterizition of catecholase and cresolase activities of Monastrell grape polyphenol oxidase. Phytochemistry, 27: 319-321. SANCHEZ-FERRER, A., BRU, R., VALERO, E. ve GARCİA-CARMONA., F., 1989. Changes in ph-dependent grape polyphenol oxidase acitivity during maturation. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 37: 1242-1245. SAYGILI, N., LEBLEBİCİ, F. ve KÖKSEL, H. 1998. Farklı şeker pancarı türlerindeki polifenoloksidaz varlığının araştırılması. Gıda Dergisi, (98/3); 165 169. SCIANCALEPORE, V. ve LONGONE, V. 1984. Journal of Agriculture and Food Chemistry 32:320. SERRADELL, M. A., ROZENFELD, P. A., MARTINEZ, G. A., CIVELLO, P. M.,CHAVES, A. V. ve ANON, M. C., 2000. Polyphenoloxidase Activity From Strawberry Fruit (Fragaria x ananassa, Duch., cv Selva): Characterisation and Partial Purification, Journal of the Science of Food and Agriculture, 80: 1421-1427. SEGOVIA-BRAVO, K., JAREN-GALAN, M., GARCIA-GARCIA, P., ve GARRIDO-FERNANDEZ, A., 2007. Characterization of Polyphenol oxidase from the Manzanilla Cultivar (Olea europea pomiformis) and prevention of Browning Reactions in Bruised Olive Fruits. Journal of Agriculture and food Chemistry. DOI 10.1021/jf063675f. TSİMİDOU, M., 1998. Polyphenols and Quality of Virgin Olive Oil in Retrospect. Ital. J. Food Sci., 10: 99-116. ULAŞ, M., 2001. Çukurova Bölgesinde Yaygın bazı Sofralık ve Yağlık Zeytin Çeşitlerinin Morfolojik, Fenolojik ve Pomolojik Özelliklerinin 44

Belirlenmesi. Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı, Yüksek Lisans Tezi, Adana. ÜNAL, M. Ü. ve ŞENER, A., 2006. Determination of Some Biochemical Properties of Polyphenol Oxidase from Emir Grape (Vitis vinifera L. cv. Emir), Journal of the Science of Food and Agriculture, 86: 2374 2379. ÜNAL, M. Ü., 2007. Properties of Polyphenol Oxidase from Anamur Banana (Musa cavendishii), Food Chemistry, 100: 909-913. WEEMAES, C. A., LUDIKHUYZE, L. R., BROECK, I. V., HENDRICKX, M. E. ve TOBBACK, P.P., 1998. Activity Electrophoretic Characteristics and Heat Inactivation of Polyphenoloxidase from Apples, Avocados, Grapes, Pears and Plums. Lebensmittel-Wissenschaft und-technogile, 31:44-49. WHITAKER, J. R., 2003. Enzyme Catalyzed Reactions: Experimental Factors that Affect Rates, Handbook of Food Enzymology (Editörler; Whitaker, J. R., Voragen, A. G. J. ve Wong D. W. S) Marcel Dekker, New York, 31-65. WISSEMANN, K. W. ve LEE, C. Y., 1981. Characterization of Polyphenoloxidase from Ravat 51 and Niagara Grapes. Joural of Food Science, 46:506-508. YAGAR, H. ve SAĞIROĞLU A., 2000, Partially Purifcation and Characterization of Polyphenol Oxidase of Quince, Trakya University, Department of Chemistry, 22030 Edirne-TURKEY. YAGAR, H., 2004. Some Biochemical Properties of Poliphenol Oxidase from Celery. Preparative Biochemistry and Biotechnology vol. 34, no. 4, (2004) 378-397. YANG, Y. ve WANG, Z., 2008. Some Properties of Polyphenol Oxidase from Lily,International Journal of Food Science and Technology, 43: 102 107. 45

YEMENİCİOĞLU, A. ve CEMEROĞLU, B., 1996. Hale Haven Şeftalilerinde Polifenoloksidaz Enzimlerinin Bazı Nitelikleri. Journal of Agricultural and Forestry, 22:261-265. YEMENİCİOĞLU, A., ÖZKAN, M. ve CEMEROĞLU, B.,1997. Inactivation Kinetics of Apple Polyphenoloxidase and Activation of its Latent Form. Journal of Food Science, Volume 62, No. 3, (1997) 508-510. YEMENİCİOGLU, A., OZKAN, M. ve CEMEROGLU, B. (1999). Some characteristics of polyphenol oxidase and peroxidase from taro (Colocasia antiquorum). Turkish Journal of Agriculture and Forestry, 23, 425 430. YORUK, R. ve MARSHALL, M. R., 2003. Physicochemical Properties and Function of Plant Polyphenol Oxidase: A review. Journal of Food Biochemistry, 27: 361-422. ZAWISTOWSKI, J., BILIADERIS, C. G., ve ESKIN, N. A. M., 1991. Polyphenol Oxidase (D. S. Robinson and N. A. M. Eskin editör). Oxidative Enzymes in Foods, Elsevier, s. 217-273. ZİYAN, E., ve PEKYARDIMCI, Ş., 2003. Characterization of polyphenol oxidase from Jerusalem Artichoke (Helianthus tuberosus). Turkish Journal of Chemistry, 27:217-225. 46

ÖZGEÇMİŞ 1983 yılında İstanbul da doğdum. İlköğrenimimi Trabzon da, orta ve lise öğrenimimi İstanbul da tamamladım. 2002 yılında Çukurova Üniversitesi Gıda Mühendisliği Bölümünde lisans öğrenimime başladım. 2006 yılında Gıda Mühendisi unvanı ile mezun oldum. 2006 yılında Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı nda yüksek lisans öğrenimime başladım. Hala Yüksek lisans öğrenimime devam etmekteyim. 47