Rekombinasyon ve Bağlantı Analizi (Recombination and Linkage Analysis) Mayoz bölünme sırasında aynı kromozom (bir kromatid) üzerindeki genler gametlere beraberce, başka bir ifade ile bağlı (zincirlenmiş) olarak geçmemektedir. Kromozom sarılması (Chromosomal crossover) denen bir olay söz konusu olmaktadır. Örneğin göz rengini belirleyen genle saç rengini belirleyen genin aynı kromozom üzerinde olduğunu varsayalım. Anne sarı saçlı ve mavi gözlü, baba siyah saçlı ve kahverengi gözlü olsun. "Crossing over" (sarılma) olmasa, mayoz bölünmeler sırasında ebeveyn kromozomları hiç değişmeden birbirinden ayrılır, döllere geçer ve bu böyle devem ederdi. Bu durumda, mavi gözlü ve siyah saçlı ya da kahverengi gözlü ve sarı saçlı kimseyle karşılaşılmazdı. "Crossing over" (sarılma) ilk olarak, Thomas Hunt Morgan tarafından öne sürülmüştür. Thomas Hunt Morgan'dan sarılma çizimi (96) Sarılma (crossing over) ya da kromozomal parça değişimi, mayoz bölünmenin profaz I evresinde görülen, çift halde bulunan kromozomların yaptığı parça değişimine verilen addır. Sarılmanın mayoz I ve mayoz II'de gösterimi (Wikipedia)
(http://upload.wikimedia.org/wikipedia/tr/6/64/mimov.gif) Mayoz bölünme sırasında meydana gelen kromozom sarılması (chromosomal crossover) olayındaki sarılma noktaları gametteki kromozomda ebeveyn kromozomlarının geçiş noktalarıdır. Mayoz bölünme sonrası bir gamet, hücredeki kromozom çiftinin (ebeveyn kromozomlarının) her ikisinden de alel bulunduruyorsa bu tür gametlere rekombinant gametler denir. Rekombinant gametlerin oluşma sürecine rekombinasyon denir. Mayoz bölünme Ebeveyn kromozom çifti Gametler Sarılmaların oluştuğu noktalar Bir kromozom çifti üzerinde iki lokus göz önüne alalım. Bir birey birinci lokusa göre Aa ve ikinci lokusa göre Bb heterozigotu olup, A ile B alel leri (genleri) kromozomların bir tanesi ve a ile b alel leri kromozomun diğeri üzerinde bulunsun. Bu durum AB/ab biçiminde de gösterilsin.
A a A B b Mayoz bölünme b Ebeveyn kromozom çifti Diploid, Genotip: AaBa Ebeveyn Haplotipleri:AB/ab Bir gamet Haploid Haplotipi:Ab Rekombinant Đki lokus bakımından bir gamet in rekombinant olması için lokuslar özellik olarak heterozigot ve aralarındaki sarılma noktası sayısı tek olmalıdır. Rekombinant bir haploid gametin ortaya çıkması için gametteki alel lerin mayoz bölünme öncesinde farklı ebeveyn haploid lerinde bulunmaları gerekir. Đki lokus için rekombinant bir gamet in ortaya çıkması olasılığına rekombinasyon oranı (recombination fraction) denir. Rekombinasyon oranı genellikle θ harfi ile gösterilir. Mayoz bölünme sürecinde kromozom sarılmaları sonucu rekombinant gametlerin ortaya çıkması olasılığı yumurta oluşumunda θ f, sperm oluşumunda θ m gibi farklı değerlere sahip olabilir. Bu belirtilmediği zaman her iki durumda rekombinasyon oranı θ nın aynı olduğu düşünülecektir. Đki lokus farklı kromozomlarda olsun (farklı kromozomlardaki gibi bağımsız davransın). Bu durumda rekombinant bir gamet oluşması olasılığı, θ = P(. Lokusta ebeveyn anne aleli ve. Lokusta ebeveyn baba aleli) + P(. Lokusta ebeveyn baba aleli ve. Lokusta ebeveyn anna aleli) = P(. Lokusta ebeveyn anne aleli) P(. Lokusta ebeveyn baba aleli) + P(. Lokusta ebeveyn baba aleli) P(. Lokusta ebeveyn anna aleli) = + = Rekombinasyon oranı θ sıfır ile ½ arasında bir sayıdır. Đki lokus için θ = olduğunda, bunlar farklı kromozomlarda bulunan lokuslar gibi Mendel in ikinci yasasına göre bağımsız davranmaktadır. Rekombinasyon oranı θ < olduğunda iki lokus arasında bir bağlantı (linkage) vardır denir. Rekombinasyon oranı θ küçüldükçe bağlantı (linkage) artmaktadır. Bir kromozom üzerinde bulunan iki lokus arasındaki fiziksel uzaklık, bunlar arasındaki nükleotid sayısı olarak tanımlanmaktadır. Đki lokus arasında Morgan birimi cinsinden genetik harita uzaklığı (m), mayoz bölünme sırasında bu iki lokus arasında oluşan sarılmaların (crossovers) sayısının beklenen
8 değeri olarak tanımlanmaktadır. Đnsanlarda, Morgan yaklaşık olarak 0 baz dır (bp dir). 6 Bir santi Morgan (0.0 Morgan) yaklaşık olarak 0 baz dır. Genetik uzunluk (genetik harita uzaklığı) olarak en uzun kromozom birinci kromozom ve en kısa kromozom. kromozom olup, bunların uzunlukları sırasıyla Morgan ve 0.5 8 Morgan dır. Birinci kromozomun fiziksel uzunluğu 4700000=.47 0 baz ve. 8 kromozomun fiziksel uzunluğu 46940000=0.4694 0 baz dır. Đki lokus arasındaki rekombinasyon oranı θ ile genetik harita uzaklığı m arasındaki fonksiyon ilişkisine harita fonksiyonu denir. Aşağıdaki Haldane harita fonksiyonunda, kromozom boyunca sarılma (crossover) noktalarının Poisson sürecine göre ortaya çıktığı varsayılmaktadır. Rekombinant bir gamet in ortaya çıkması için lokuslar arasındaki sarılma noktası sayısı tek olması gerektiğinden, m m 3 m 5 e m e m e m θ = P( Sarılma noktası sayısı =,3,5,...) = + + +...! 3! 5! 3 5 m m m m m m e e = e ( m + + +...) = e 3! 5! m e = m = ln θ Genetik Harita
Bağlantı Analizi Rekombinasyon oranı θ < olduğunda iki lokus arasında bir bağlantı (linkage) vardır denir. Genetik olarak kalıtsal olan bazı özelliklerin (hastalık gibi) lokuslarının kromozomlardaki yerlerinin bulunması ve başka bazı özelliklerle bağlantılarının bilinmesi çok önemlidir. Kromozomlar üzerinde yerleri bilinen ve populâsyon farklılıklarını ortaya çıkartan bazı özelliklerin lokuslarına marker lokus denir. Bir özelliğin lokusu ile marker lokus arasındaki rekombinasyon oranı θ küçüldükçe aralarındaki bağlantı (linkage) artmaktadır. Bir özelliğin lokusu ile marker lokus arasında rekombinasyon olması için lokuslar özellik bakımından heterozigot olmalı. Marker lokus olarak, genellikle kodominant alel lerden oluşan lokuslar seçilmektedir. Bu durumda marker lokusun fenotipi aynı zamanda genotipi olmaktadır. Rekombinasyon oranı θ yı tahmin etmek için deneyler düzenlenebilir. Ancak bu insanlarda mümkün olmamaktadır. Bazı hastalıkların bazı marker lokuslara göre rekombinasyon oranı soy ağaçları (pedigree) irdelenerek ortaya çıkartılmaktadır. Örnek Aşağıdaki soy ağacını göz önüne alalım. AA BB aa bb Aa Bb aa bb Aa Bb aa bb aa bb Aa bb aa Bb Bu soy ağacı, haplotip (her kromozom üzerindeki alel dizilimi) olarak aşağıdaki gibidir. I II AB/AB ab/ab AB/ab 4 ab/ab 3 III 5 6 7 8 9 AB/ab ab/ab ab/ab Ab/ab ab/ab,,3 nolu bireylerin (kurucular, founders) ebeveynleri görülmediğinden bunlar rekombinasyon bilgisi taşımamaktadır. Ayrıca ebeveynleri homozigot olan bireyler de rekombinasyon bilgisi taşımamaktadır. Rekombinasyon olayı olup olmadığı, 4 numaralı
babadan 5,6,7,8,9 numaralı çocuklar arasında gözlenebilir. 8 ve 9 nolu çocuklarda babadan gelen gametler rekombinant gametlerdir. Buna göre, n=5 mayoz bölünmenin y= tanesinde rekombinasyon olmuştur. Mayoz bölünmeler sonucunda rekombinasyon, başarı olasılığı θ olan bağımsız Bernuolli denemeleri olarak düşünülürse, n=5 denemedeki toplam rekombinasyon sayısı Y b( n = 5, p = θ ) binom dağılımına sahiptir. Y nin gözlenen değeri y= olmak üzere, olabilrlik fonksiyonu, n y n y L( θ ) = L( θ; y) = θ ( θ ), 0 θ y dır. θ nın en çok olabilirlik tahmin edicisi, ˆ Y θ = n olup, yukarıdaki soy ağacındaki gözlemlerden ˆ θ = = 0.4 5 olarak tahmin edilmektedir. Örnek Aşağıdaki gibi bir soy ağacı göz önüne alalım. Aa Bb aa bb AB/ab ab/ab ab/ab Ab/ab ab/ab Babanın AaBb genotipi için haplotipler bilinmediğinden rekombinasyon olup olmadığı söylenemiyor. Babanın haplotipleri, fazlar (phases, evreler) denen aşağıdaki iki durumdan biri olabilir. A a B b AB/ab A a b B Ab/aB Fazların olasılıkları eşit ve ½ olarak alınırsa,
AB/ab aa bb AB/ab ab/ab ab/ab Ab/ab ab/ab durumu için olabilirlik ve 5 θ ( θ ) 5 Ab/aB (sağdaki iki çocuk rekombinant gametten oluşmuş) aa bb durumu için olabilirlik olmak üzere, AB/ab ab/ab ab/ab Ab/ab ab/ab 5 θ ( θ ) 3 3 5 3 (soldaki üç çocuk rekombinant gametten oluşmuş) L 5 5 5 3 5 3 ( θ ) ( ) ( ), 0 θ θ 3 θ θ = + θ 3 3 θ ( θ ) + θ ( θ ) = θ ( θ ) olup, ˆ θ = olarak tahmin edilir. Örnek 3 Aşağıdaki gibi bir soy ağacı göz önüne alalım. A,a alel leri marker lokus ve koyu renkler bir hastalık ile ilgili olsun. Hastalık ile ilgili lokustaki biri baskın diğeri çekinik olan iki D,d geninden (alel inden) baskın olanı hastalığa sebep olsun. Marker lokusu ile hastalık lokusu arasındaki bağlantının ölçüsü olan rekombinasyon oranı θ yı tahmin etmek isteyelim.
Aa aa Aa aa Aa aa Aa aa Aa Aa Aa Aa aa aa aa aa Đkinci nesildeki annenin genotipi AaDd (DD olamaz çünkü çocuklardan bazıları hastalanmamıştır) ve haplotipi AD/ad olmalı. Bu faz bilgisi altında 0 tane çoçuktan soldan sağa doğru.,4. ve 7. çocuk anneden gelen rekombinant gamet almıştır. n=0 tane mayoz bölünmede y=3 rekombinasyon gözlendiğine göre, 0 3 0 3 L( θ ) = θ ( θ ), 0 θ 3 ve dl( θ ) 0 = θ ( θ ) 6 ( 3 0θ ) dθ 3 olup, ˆ 3 θ = = 0.3 0 dır. Đki lokus (marker ile hastalık) arasındaki genetik harita uzaklığı, mˆ = ln( ˆ θ ) = -/*log(0.4)=0.4585 (Morgan) 45.85 santi Morgan olarak tahmin edilmektedir. Soy ağacında birinci neslin bilgileri bulunmasın, yani aşağıdaki gibi bir durum söz konusu olsun. Aa aa Aa aa Aa Aa Aa Aa aa aa aa aa Annenin genotipinin AaDd (DD olamaz çünkü çocuklardan bazıları hastalanmamıştır) olduğu söylenebilir. Annenin haplotipleri, aşağıdaki fazlardan biri olabilir.
A D a d A a d D AD/ad Ad/aD Fazların olasılıkları eşit ve ½ olarak alınırsa, L 0 3 7 0 7 3 ( θ ) ( ) ( ), 0 3 θ θ = + 7 θ θ θ L( θ ) θ ( θ ) + θ ( θ ) 3 7 7 3 olup, d 3 7 7 3 4 5 5 4 ( θ ( θ ) + θ ( θ ) ) = θ ( θ ) 7 θ ( θ ) 3θ + 3( θ ) 7 θ ( θ ) dθ solve('7*x^4*(-x)-3*x^5+3*(-x)^5-7*x*(-x)^4=0') ans = 0.5 0.3808 0.689 0.5 -.0645i 0.5 +.0645i denklem çözümünden, ˆ 0.3808 θ = olarak tahmin edilir. 3 7 7 3 θ ya (0 θ ) karşılık L( θ ) = 60 θ ( θ ) + θ ( θ ) olabilirlik fonksiyonunun grafiği aşağıdaki gibidir. teta=0:.0:/; plot(teta,60*(teta.^7.*(-teta).^3+teta.^3.*(-teta).^7)) 0.4 0. 0. 0.08 0.06 0.04 0.0 0 0 0.05 0. 0.5 0. 0.5 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5
Hipotez Testi Rekombinasyon oranı θ sıfır ile ½ arasında (0 θ ) olan bir sayıdır.θ parametresi için parametre kümesi Θ = [0, ] R dır. Đki lokus için θ = olduğunda, bunlar farklı kromozomlarda bulunan lokuslar gibi Mendel in ikinci yasasına göre bağımsız davranmaktadır. Rekombinasyon oranı θ < olduğunda iki lokus arasında bir bağlantı (linkage) vardır denir. H0 : θ = H : θ < hipotezleri söz konusu olsun. Θ = [0, ], Θ 0 =, Θ = [0, ) test fonksiyonundaki test istatistiği, olmak üzere, olabilirlik oranı max L( θ ) 0 λ = ln = ln max L( θ ) max L( θ ) olup, sıfır hipotezi altında bu test istatistiğinin dağılımı (yaklaşık olarak) bir serbestlik dereceli bir ki-kare dağılımı ile Dirac dağılımının (sıfır noktasında yoğunlaşmış dağılımın) aşağıdaki gibi bir karmasıdır. ln 0 χ max ( ) () L θ max L( θ ) λ = + Dirac Örneğin, α = 0.05 anlam düzeyi için kritik değer, dır. P( λ > c) = 0.05 x / 0.5 x e dx = c ( ) Γ x / x e dx = 0. c Γ( ) c=chiinv(.9,)=.7055 Uygulamalarda, alışılagelmiş olarak max L( θ ) LOD = log0 değeri (skoru) çok kullanılmaktadır. LOD (logarithm of odds) skoru ile λ arasındaki formül,
max L( θ ) ln ln max L( θ ) max L( θ ) log λ λ LOD = 0 = = = ln0 ln0 ln0 4.6 olmak üzere, hesaplanan LOD skoru 3 den büyük olduğunda H 0 reddedilmektedir. Böyle bir durumda testin anlam düzeyi, λ x / α = P( LOD > 3) = P( > 3) = P( λ > 3.8) = x e dx (-chicdf(3.8,))= 0.0000334 0.000 4.6 = 3.8 Γ( ) dır. LOD skoru için karşılaştırma değeri olarak 3 sayısının ve α = 0.000 anlam düzeyinin seçilmesinin sebebi, lokusu bilinmeyen bir hastalığın genellikle çok sayıda marker ile bağlantısı olup olmadığının araştırılmasındandır. Marker ler aralarında bağlantılı olabilir (bağımsız olmayabilirler). Her bir marker ile yapılan hipotez testi α = 0.000 anlam düzeyinde olursa, örneğin 00 marker için birlikte bir değerlendirme yapıldığında Bonferonni eşitsizliğinin bir sonucu olarak anlam düzeyinin 0.0 olduğu söylenebilir. Uygulamalarda çok kullanılan başka bir değer Z( θ ) -skorudur, olmak üzere, Z( θ ) = log 0 L( θ ) max L( θ ) max ( ) ( ˆ θ Z θ = Z θ ) = log0 = LOD θ dır. Farklı soy ağaçlarının birlikteki Z( θ ) -skoru, bunların Z( θ ) -skorlarının toplamına eşittir. Örneğin, k tane ailenin Z( θ ) -skorları Z( θ ), Z( θ ),..., Z k ( θ ) olduğunda, tümünün Z( θ ) -skoru dır. k = i= Z( θ ) Z ( θ ) i Aşağıdaki gözlemlere dayalı olarak, {A,a} ve {B,b} alleli iki lokus (özellik) arasındaki rekombinasyon oranı θ (0 θ ) ile ilgili, H0 : θ = H : θ < hipotezlerini, α = 0.05 anlam düzeyinde test ediniz.
Ab/aB aa bb AB/ab Ab/ab ab/ab Ab/ab ab/ab Ab/ab AB/ab Soldan sağa doğru.,3. ve 7. çocukta rekombinasyon olayı gözlenmektedir. Buna göre olabilirlik fonksiyonu, 7 3 4 L( θ ) = θ ( θ ), 0 θ 3 ˆ 3 θ = 7 9 x 0-3 8 7 6 5 4 3 0 0 0.05 0. 0.5 0. 0.5 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 t=0:.0:.5; plot(t,t.^3.*(-t).^4) ve λ ln hesaplanan = = -*log((/)^3*(-/)^4/((3/7)^3*(-3/7).^4))=0.4335<.7055 3 7 olmak üzere, sıfır hipotezi reddedilemez. α = 0.05 anlam düzeyinde iki lokus arasında bir bağlantı yoktur denebilir. Hesaplanan LOD skoru, 0.4335 LOD= =0.0358 4.6 dır.