T.C. SAĞLIK BAKANLIĞI ŞİŞLİ ETFAL EĞİTİM VE ARAŞTIRMA HASTANESİ I. PLASTİK VE REKONSTRÜKTİF CERRAHİ KLİNİĞİ Klinik Şefi: Prof. Dr. Lütfü BAŞ DERİ FLEBİ MODELİNDE FARKLI PEDİKÜL ÖNKOŞULLAMALARINDA SAĞKALIMIN ARAŞTIRILMASI ( Deneysel Çalışma ) UZMANLIK TEZİ Dr. Kemalettin YILDIZ İstanbul, 2006
İÇİNDEKİLER SAYFA I- Giriş 2 II- Genel Bilgiler 5 1- Flep Kan Akımının Düzenlenmesi 5 2- Flep Kaybı ve İskemi-Reperfüzyon Hasarı 6 3- İskemik Hasar ve Hücrenin Programlı Ölümü 9 4- Yeni Damar Oluşumu 9 5- Tedavi Protokolleri 10 6- İskemik Önkoşullama ve Geciktirme Fenomeni 11 III- Gereç ve Yöntem 15 1- Kullanılan Denekler 15 2- Kulanılan Alet ve Malzemeler 15 3- Sıçan İnferior Epigastrik Arter Flebinin Hazırlanması 16 A) Anatomi 16 B) Cerrahi Yöntem 17 4- Deney Protokolü ve Deneklerin Gruplandırılması 18 5- Hayvanların Bakımı 24 6- Değerlendirmeler 24 A) Klinik ve Yüzey Alanı (Topografik) Değerlendirmesi 24 B) Histolojik Değerlendirme 25 C) İmmunohistokimyasal Değerlendirme 26 D) İstatistiksel Değerlendirme 26 IV- Bulgular 27 1- Topografik Değerlendirme Sonuçları 27 2- Histolojik ve İmmunohistokimyasal Değerlendirme Sonuçları 35 3- İstatistiksel Değerlendirme Sonuçları 40 V- Tartışma 50 VI- Sonuç 63 VII- Özet 64 VIII- Kaynakça 65 1
I GİRİŞ Doğumsal veya edinsel defektlerin uygun şekil ve fonksiyonda onarımı, onarım merdiveni üzerinden basit yöntemden karmaşık olana doğru yapılır. Bu sıra primer onarım, defektin ikincil iyileşmeye bırakılması, deri greftleri, lokal, uzak ve serbest fleplerle onarım şeklindedir. Koşullara göre en basit seçenek kimi zaman ilk tercih olabilirse de artan bilgi, gelişen mikro cerrahi ve teknoloji nedeniyle uygun olgularda daha üst basamaklar ilk tedavi seçeneği olabilmektedir 104. Son yıllarda onarım için daha fonksiyonel ve estetik sonuçlar ile daha az verici alan hasarı beklentisine yönelik perforatör ve serbest stilde serbest flepler geliştirilmiştir 42,136. Günümüzde vücuttaki hemen her vaskularize yapının aktarılabilmesi mümkündür 30. Taylor flep kanlanmasında devamlı 3 boyutlu damarsal yapının sadece deride değil tüm doku tabakalarında gerçekleştiğini göstermiştir. Segmental damarların deri ile kemik arasında beslediği üç boyutlu alana veya dolaşımları tanımlanmış arter ve eşlik eden ven ile sağlanan doku bloğuna anjiozom denilmektedir. Anatomik çalışmalarda insanda ortalama 374 major perforatör gösterilmiştir. Taylor, vücudu anatomik olarak çeşitli kaynak arterlerden beslenen 40 kompozit doku (anjiozom) alanına ayırmıştır. Böylece birçok flep tanımlanmayı beklemektedir. Bu nedenlerle anjiozomlar kompozit nakli mümkün olan dokular olarak tanımlanırlar 49,61,122-3. Artan anatomik çalışmalar ile flep tasarımlarının ve anjiozomların tanımlanmasına rağmen, halen flep nekrozu rekonstrüktif cerrahi için sorun teşkil etmektedir. Günümüzde, gittikçe yaygınlaşan serbest doku uygulamalarında, başarı oranı %90 üzerine kadar ulaşsa da, pediküllü fleplerde kısmi veya tam flep kayıplarının ve komplikasyonlarının, farklı serilerde %25 e kadar ulaşabildiği bildirilmiştir 10,12,42,113-4. Rekonstrüktif cerrahide flep sağkalımı; hasta seçimi, cerrahi teknik, iskemi süresi ve derinliği ile doğrudan ilişkilidir. İskemi özellikle mikrovasküler cerrahide ileri derecede önem kazanmaktadır. Serbest doku aktarımları sonrasında iskemiden kaynaklanan yıkımın patofizyolojisinde reperfüzyon hasarı ve oluşan serbest radikallerin önemli bir pay sahibi olduklarına olan inanç giderek artmaktadır. Bu konu üzerinde plastik cerrahi alanında son 20 yılda pek çok çalışma yapılmış olmasına rağmen, reperfüzyon hasarının patofizyolojisi halen tümüyle anlaşılabilmiş değildir 146. 2
Flep sağkalımı flep içi damar yapılanmasına bağlıdır. Flep içi damarsal yapılanma ve vaskular fizyoloji flep cerrahisinde başarı ve kaybını belirler 130. Tüm dokularda olduğu gibi fleplerde de makro ve mikro dolaşım vardır. Makro dolaşım anatomisi flep tanımı ve dizaynında kullanılır. Mikro dolaşım seviyesindeki arteriol, kapiller, venül ve arterio-venöz anastomozlar; besin, oksijen, karbondioksit (CO 2 ) ve atık ürünlerin yani hücresel metabolizmanın gerçekleştiği ve çoğunlukla perfüzyonun kontrol edildiği yerlerdir 130. Bazı fleplerin tamamı yaşarken, bazılarının distal veya periferik kısımlarında kayıp olmasında pek çok faktör etkili olmakla birlikte mekanizma tam anlamıyla açıklanamamaktadır. Flep içeriği; kendi kan akım ve iskemi toleransı nedeniyle kritik faktördür. Deri flepleri her ne kadar daha az kan akımına sahip olsalar da, metabolik ihtiyaçları kaslardan daha azdır ve iskemi periyotlarına kastan daha toleranslıdır 17. Mikro dolaşımdaki etkin perfüzyon, besleyen damara yakınlığa bağlıdır. Aksiyal akımlı flepler, diğer fleplere oranla daha güvenlidirler. Baskın besleyici damar sistemine bağlı olmayan random fleplerde akım, subdermal ve subfasyal pleksuslar yoluyla gerçekleşir. Sonuçta daha az güvenlidirler ve uzunlukları daha sınırlıdır 19-21. Bir çok farmakolojik ajanın flep sağkalımı ve perfüzyonun düzelmesine yönelik farklı etkinlik gösterdiği birdirilmektedir. Çoğu deneysel olarak etkili bulunsa da, öngörülebilir klinik etkileri hala gösterilememiştir 39,64,88. Artık bir önkoşullama yöntemi olarak da kabul edilen cerrahi geciktirme (delay) işlemi, flep sağkalımını klinik olarak arttırdığı defalarca gösterilen tek gerçekçi yöntemdir 109,121. Bu yöntemde, flep kısmi olarak kaldırılmakta ve flep distalinde nekroza yol açmayacak kadar iskemi oluşturulmaktadır. Böylece, flebin tamamı akut olarak kaldırıldığında oluşması beklenen distal nekrozun, bu yöntem sonrasında, flebin tamamı kaldırıldığında oluşmadığı gösterilmiştir. Bununla birlikte iki ayrı cerrahi girişim gerektirmesi, kullanımını sınırlamaktadır 88,92,108. Ayrıca cerrahi geciktirme ile flep uzunluğuna en azından bir vaskuler sulama alanının güvenle eklenebileceği bildirilmiştir 88,121. Fizyolojik vaskuler alanlar, cerrahi geciktirme gibi bir uyarana cevap olarak, anastomotik ( choke ) damarların genişlemesiyle birbirlerine bağlantı kurarlar 31,88,121. 3
İlk olarak Murry ve arkadaşları, köpek kalbinde, koroner arter üzerinde klempleme ile oluşturdukları kısa iskemik periyotları ve bunu takiben doku reperfüzyonları ile daha uzun bir iskemik periyoda toleransın arttığını göstererek, iskemik önkoşullama fenomenini tanımladılar 91. Plastik cerrahide önkoşullama uygulanması ile flep sağkalımının arttığına dair birçok çalışma yapılmıştır 101,105-6,129,135,141. Flep geniş bir random kısım ile birlikte planlanıyorsa, iskemik önkoşullama yöntemlerinden birinin uygulanması önerilmektedir 88. Birden fazla pedikül varlığında, iskemik önkoşullama, selektif pedikül ligasyonu ile standart delay işlemi veya tekrarlayan pedikül klemplemeleriyle gerçekleştirilebilir 109,130,141. Uzak önkoşullama yöntemi de bir seçenek olmakla birlikte klinik kullanımı yaygınlaşmamıştır 72-4,132. Serbest doku nakillerinde dokunun iskemiye önkoşullandırılması yoluyla canlılıkta artış olmasının değeri büyüktür. Günümüz birçok flep araştırmasında da odaklanan alan iskemik önkoşullamadır 130. Literatürde flep sağkalımını arttırmak için yapılan aksiyel fleplerde iskemik önkoşullama çalışmaları bulunmaktadır 89,141. Bu çalışmalarda önkoşullama tek pedikül üzerinden uygulanmıştır. Birden fazla pedikül içeren fleplerde ise farklı pediküllerin önkoşullamasının flep sağkalımına etkileri karşılaştırılmamıştır. Bu deneysel çalışmanın amacı; farklı pediküller üzerinden yapılan iskemik önkoşullamanın etkilerini araştırmaktır. Topografik, histolojik ve immunohistokimyasal değerlendirme yöntemlerini kullanarak birden fazla pedikül ve/veya perforan içeren fleplerde nekrozun azaltılmasına yardımcı olup olmayacağını göstermeyi hedefledik. 4
II GENEL BİLGİLER 1 - FLEP KAN AKIMININ DÜZENLENMESİ Derinin primer fonksiyonlarından biri; deri kan akımının düzenlenmesiyle oluşan ısı düzenlenmesidir. Deri kan akımı esas olarak, arteriolar seviyede düzenlenir. Sempatik etki, prekapiller sfinkter, arteriol ve arteriovenöz anastomozlarda kan akımını düzenler. Sempatik etki sonrası prekapiller sfinkterin kasılmasıyla kan doğrudan arteriovenöz anastomoza yönelir 64,130. Kan akımına etkili diğer faktörler arasında; mikro dolaşımdaki endotel, trombosit ve lökosit gibi hücresel faktörler ve sistemik santral kan basıncı sayılabilir. Endotel gerek direkt vazoaktif maddeler salarak, gerekse dolaşımdaki lökosit ve trombositler üzerindeki etkileri nedeniyle kan akımının düzenlenmesinde kritik rol oynamaktadır 22. Deriye olan kan akımı yaklaşık olarak 100 gr doku için 20 ml. dir. Bu miktar artan metabolik aktivite nedeniyle kaslarda çok daha yüksektir. Flep sağkalımı, kan akımı ile metabolik ihtiyaç arasındaki kritik dengeye dayanmaktadır. Deri kan akımı, lokal ve sistemik olmak üzere iki seviyede kontrol edilmektedir. Sistemik kontrol; nöral ve hormonal olabilmektedir. Nöral dengeleme daha baskındır ve başlıca; vazokonstrüksiyonu sağlayan sempatik lifler, alfa adrenerjik reseptörler ile vazodilatasyon yapan beta adrenerjik reseptörler aracılığıyla gerçekleşir. Arteriol ve arteriovenoz anastomoz seviyesinde damar düz kas tonusunu düzenlerler 30,64,98. Hormonal dengeleme, sistemik vazoaktif maddelerin kendilerine özgün reseptörlerdeki aktiviteleriyle sağlanmaktadır. Sistemik vazokonstriktörler; serotonin, tromboksan A 2 ve prostaglandin F 2α yı içerir. Vazodilatatörler ise prostaglandin E 1, prostaglandin I 2 (prostasiklin), histamin, bradikinin ve lökotrien C 4 ve D 4 ten oluşur 30,64. Lokal düzeyde vazodilatasyona yol açan hiperkapni, hipoksi ve asidoz gibi metabolik faktörler, deri kan akımını etkilemektedir. Artmış doku perfüzyonu ve hipotermi ise lokal olarak vazokonstriksiyon ile kan akımını azaltmaktadırlar 30,98. 5
Flep kaldırılırken, kutanöz damarlar ve sempatik sinirlerin uçları hasarlanmaktadır. Akut olarak kaldırılan flepte akım oranı düşmektedir. Distale doğru akım düşerken iskemi artmaktadır 64. Ayrıca, cerrahi geciktirme ile sağlanan akımın genişleyen arteriovenöz şantların kendiliğinden kapanmasına kadar süreceği bildirilmiştir 107. Flep kaldırılmasındaki bu hemodinamik, anatomik ve metabolik değişiklikler, sonucu belirler. Yapılan pek çok hemodinami çalışmalarında; flebin pedikülündeki akım korunsa bile, flebin ucundaki akım, ilk 6-12 saatte normalin %20 sinin altına düşer. İlk 12-18 saat süresince; ilerleyen lökosit aracılı endotel hasarı, sempatik vazokonstriktörlerin salınımı ve düşen perfüzyon basıncının kombinasyonu nedeniyle, özellikle flep distal kısımlarında akım dramatik olarak düşer. Uç kısmın yaşayabilmesi için yeterli akım, 6-12 saat devam etmelidir. Nörotransmitterlerin 12-24 saatte ortaya çıkması ve flep yatağından 2-3 gün inoskülasyonun gerçekleşmesiyle perfüzyon dereceli olarak düzelir. Uç kısımlar 6-12 saat süreyle ciddi seviyede iskemide kalırsa, akım geri dönmesi reperfüzyon hasarına yol açar, mikro damarlar iflas eder ve doku nekroze olur 65-6,95. 2 - FLEP KAYBI ve İSKEMİ-REPERFÜZYON HASARI Flep kaldırıldıktan sonra distal kısımdaki lokal iskemi azami vazodilatasyona yol açar. Proksimal kısımdaki yetersiz perfüzyon basıncı flebin distalinde arteryel yetersizlik ve kayba neden olur 64-66. Arteryel ve venöz yetmezliğin pediküllü fleplerdeki kayıplara etkileri üzerine pek çok çalışmalar yapılmıştır. Venöz akımdaki yetmezliğin, yeterli arteryel akım olsa bile flep nekrozuna neden olabileceği gösterilmiştir 39. Serbest doku aktarımlarında venöz oklüzyon, arteryel oklüzyondan daha sıktır ve hızla düzeltilmezse flep kaybı ile sonuçlanır. Çoğu pediküllü fleplerde ise ikisi birlikte olur ve nekroze olan doku miktarı belirgin olarak daha fazladır. Deneysel modellerde primer venöz iskemi arteryele oranla daha ciddi gözükmektedir. Benzer olarak sekonder iskemi modellerinde de venöz iskemi arteryel iskemiden ve primer iskemiden daha tehlikelidir 5,51-2. Random ve aksiyel kalıplı fleplerde hatalı flep planlaması, iskemi reperfüzyon hasarı, mikro dolaşımı etkileyen sistemik faktörler (hipotansiyon, sepsis, sigara kullanımı, vazokonstriktörler) veya flep üzerine fiziksel baskı (hatalı yerleştirme, pedikülde katlanma, 6
hematom) nedeniyle mikro dolaşım düzeyinde düşük akımın gelişmesine ikincil olarak trombozis oluşur. Serbest flepler içinse total flep nekrozu aksiyel arteryel veya venöz tromboz, anastomoz hattından kaynaklanmaktadır. Bu durum genellikle düzgün endotel uzanımı yerine adventisya ve medianın lümen içinde trombosit ve fibrin depolanmasına yol açan kötü teknik sonucudur. Bu yüzden antitrombotik tedavi serbest fleplerde sıklıkla kullanılmaktadır 48,50,64. Hücre hasarını oluşturan biyokimyasal süreçlerin başlamasında bugün kabul gören tetikleyici başlangıç noktası, hücrenin enerji depolarının belirli bir seviyenin altına inmesidir. Bu basamak, daha sonra oluşacak, yıkım potansiyeli çok daha fazla olan ve moleküler oksijenin geri gelmesi ile tetiklenen reaksiyonlara zemin hazırlamaktadır. Sonuçta; hücre içerisinde çok yüksek oranlarda süperoksit ile bundan oluşan sekonder reaktif moleküller üretilecek ve masif doku yıkımı oluşacaktır 17,81,87,97. Kritik iskemi süresi (KİS); kan akımının kesilmesinden sonra, dokunun canlı kalması ve enerji depolarının eşik seviyenin altına azalmasına kadar geçen azami süreyi ifade eder. Bu süre aşıldığında doku perfüzyonu yeniden sağlansa dahi doku hasarı kaçınılmazdır (Şekil 1-2) 17,141. +, - O2 hipoksi normoksi Reaktif oksijen hipoksi + - Reaktif O2 Hücre hasarı Canlı hücreler Düzelmiş Şekil 1-2: Hipoksik ortamda serbest radikal oluşumu ve iskemi-reperfüzyon hasarı t İskemik doku anaerob metabolizmaya yönelir ve oksijen, glikoz, adenozin trifosfat (ATP) seviyeleri düşerken; CO 2, laktik asit seviyeleri artmaktadır. Prostasiklin ve tromboksan düzeyleri belirgin olarak yükselir 59. Hipoksi aynı zamanda dokuda neden olduğu iyon hemostaz bozukluğu, ATP/ADP oranının azalması ve mitokondriyal permeabilite bozulması gibi olumsuz değişikliklerle reaktif moleküllere karşı hücre savunmasını da zayıflatmaktadır. 7
Bu durumda hipoksinin sadece reaktif oksijen üretimini arttırmak yoluyla dahi hücre hasarına yol açmaktadır 6,59,83. Anaerobik metabolizmayla birlikte toksik süperoksit radikallerin üretiminde artış olur. Bu radikaller direkt sitotoksik etki gösterebilir veya daha da önemli olarak, lokal akut inflamasyonun, sonrasında endotelyal hasarın ve hücresel olaylarla mikro dolaşımın iflasının gelişeceği lökosit yapışmasının ve birikiminin tetikleyicisi olarak rol alırlar. Flep distalinde vücudun anahtar koruyucu enzimi olan süperoksit dismutaz düzeylerinde düşme olur 46,83,99. İskemi sonrası yeniden oksijenlenme sırasında ksantin dehidrojenaz enzimi ksantin oksidaza dönüşür. Ksantin oksidaz; oksijen ve iskemide oluşan hipoksantin ile reaksiyona girer ve ürün olarak süperoksit anyon oluşur. Bu anyon diğer oksijen radikal türlerine dönüşerek doğrudan hücre hasarı yapar. Süperoksit radikal, endotel ile doğrudan etkileşir ve lipit peroksidasyonu, membran proteinlerinde ayrışma, hücre geçirgenliğinde artış, sitoplazmik şişme ve işlev bozukluğuna yol açar. İkinci mekanizma oksijen metabolitleri tarafından reperfüzyon sahasına nötrofil göçü sonrası gerçekleşir. Damar içinde hızla nötrofil birikimi perfüzyonun ilerleyen şekilde düşmesine ve iskemi reperfüzyonla ile ilişkili noreflow fenomenine yol açmaktadır. Nötrofiller doğrudan endotel hasarına sebep oldukları veya mikro damarlarda tıkanma yaparak iskemi oluşturdukları bildirilmiştir 23,29,46,86,95,99 (Şekil 1-2). Lantieri ve ark. TRAM (Transvers Rektus Abdominis Muskokulokutan) ya da DİEP (Derin İnferior Epigastrik Arter Perforatör) flepleri ile meme rekonstruksiyonu uygulanan hastalarda reperfüzyon öncesi ve sonrasında genel dolaşımdan ve flepten aldıkları kan ve doku örneklerinde çok güçlü bir vazospazm yapıcı ajan olan endotelin-1 düzeylerini araştırmışlardır. Çalışmayla serbest fleplerde anlamlı bir endotelin-1 artışı izlenmiştir. Sonuç no-reflow fenomeninin patogenezini anlamamıza yeni bir katkı sağlamıştır 75. Oksijen metabolitleri ve onların doku hasarına etkileri üzerine birçok çalışma yapılmıştır 6,83,99. Fleplerin distallerinde ksantin oksidaz ve diğer bir serbest radikal oluşumunu gösteren malonildialdehit düzeylerinde artış gözlenen çalışmalar mevcuttur 43,99,137. Süperoksit dismutaz uygulaması ile flep sağkalımının arttığı gözlenmiştir 83-118. Bu bulgulara dayanarak allopurinol (ksantin oksidaz inhibitörü) ve deferoksamin (demir şelatörü ve serbest radikal 8
temizleyicisi) kullanılmıştır. Buna rağmen insan dokusundaki ksantin oksidazın sıçandakinin 1/40 ı kadar olması nedeniyle bu çalışmaların klinik etkinlikleri belirsizdir 7,44,137. Serbest radikaller hematom ilişki flep nekrozunda da önemli rol oynarlar. Hemoglobin ve demir, hidroksil radikali başta olmak üzere birçok serbest radikalin oluşacağı kimyasal reaksiyonlara katılırlar. Deferoksamin deneysel olarak hematom varlığında flep sağkalımını artırdığı gösterilmiştir 44. İskemi-reperfüzyon hasarı günümüzde klinik olarak kalp ve beyin başta olmak üzere tüm organların iskemik durumlarını takip eden, örneğin stent uygulaması, anjioplasti ya da fibrinolitik tedavi sonrası reoksijenasyonunda, viseral dokuların allotransplantasyonunda, hemorajik şokta, plastik cerrahide replantasyon ve mikrovasküler flep cerrahisinde karşımıza çıkmaktadır 130. 3 İSKEMİK HASAR VE HÜCRENİN PROGRAMLI ÖLÜMÜ ( APOPTOZİS ) Önkoşullama tarafından uyarılan hipoksinin hücre programlı ölümü tetiklediği bildirilmiştir. Bir kısım hücrenin programlı ölümü sonrası oksijen ortaya çıkması ile iskemiye tabi tutulan hücreler sınırlı kaynak halinde sayılarını kısıtlayarak hayatta kalabilmektedir. Diğer olası mekanizma ise protein kinaz C (PKC) aktivasyonu ile inhibitör faktör IκB nın fosforilasyonu yoluyla gerçekleşir. IκB nın fosforilasyonu; hücre koruyucu proteinlerin üretimine yol açan NFκB nin artışına izin verir 18,41. Anti-apoptotik protein Bcl-2, oksidatif hücre ölümünü inhibe etmektedir. Buna ek olarak Bcl-2 ailesi üyelerinin iskemik hasara uğrayan hücrelerde hücre koruyucu etki gösterdiği saptanmıştır 53. 4 YENİ DAMAR OLUŞUMU Yeni damar oluşumu; anjiogenez ve vaskulogenez olarak iki mekanizma ile gerçekleşir. Anjiogenez mevcut olan venüllerden endotel hücrelerinin aktivasyonu, göçü ve proliferasyonunu içeren yeni kapiller oluşumudur 26. Anjiogenez; nitrik oksit (NO), VEGF (vascular endothelial growth factor) gibi ürünlerle damar geçirgenliğinde artış ile başlar. Anjiogenezin geç fazları da VEGF, PDGF (platelet 9
derived growth factor) ve bfgf (basic fibroblast growth factor) gibi çok sayıda büyüme faktörü ve sitokinler tarafından düzenlenir 26,139,146-7. VEGF anjiojenik, mitojenik ve vaskuler geçirgenliği artıran proteindir ve endotel hücrelerinde nitrik oksit sentazı uyarma yoluyla vazodilatasyona neden olduğu ve aynı zamanda hücre göçünü uyarıp, apoptozisi inhibe ettiği belirtilmiştir 71. Anjiojenik büyüme faktörleri lokal olarak sekrete olan proteinlerdir ve embriyogenez, tümör büyümesi, yara iyileşmesi, damar büyümesinin düzenlenmesinde kilit rol oynarlar. bfgf, PDGF, TGF-β (transforming growth factor- beta) ve VEGF gibi büyüme faktörleri anjiogenezi aktive edebilir ve iskemik hasara uğramış olan deri fleplerinde fonksiyonel mikro dolaşımı yönlendirmektedirler 26,79,144,147. Vaskülogenez endotel öncü hücrelerine dayandırılmaktadır. Bölgesel damar hasarı, iskemi, miyokard enfarktüsü ve yanık yaralanması endotel öncü (progenitör) hücrelerinin hareketlenmesi ve dolaşımdaki bu hücrelerin artışı için güçlü uyaranlardır. Bu durumda hücre artışına VEGF seviyelerindeki artış eşlik etmektedir 102. Son yıllarda birçok büyüme faktörünün tanımlanması, flebin damarlanması ve canlılığını iyileştiren potansiyel başka yöntemler sağlamıştır. Bulgular neovaskularizasyonun anjiojenik faktörler aracılığıyla olduğunu önermektedir. Yapılan deneysel çalışmalarda temel fibroblast büyüme faktörü, vasküler endotelyal büyüme faktörü ve vasküler endotelyal büyüme faktör cdna sının flep distalinde perfüzyonu iyileştirdiği ve nekrozu önlediği gösterilmiştir 8,58,96,120,139,142-3,147. 5 TEDAVİ PROTOKOLLERİ Flep sağkalımındaki en önemli etkenler; doğru flep seçimi ve dizaynı, defektin özenli debridmanı ve flep yatağının hazırlanması, flebin dikkatli kaldırılması, yerleştirilmesi ile ameliyat sonrası yakın klinik takiptir. Hiçbir ilaç, araç, monitör veya manevra kötü planlama veya kötü teknik uygulamasının üstesinden gelemez. Flep yerleştirilmesinde, pansumanda dikkat edilmesi esastır. Ameliyat sonrası erken dönemde müdahale ile hematom, bası, katlanma, anastomozda tromboz gibi mekanik nedenlerle, iskemiye uğrayan flepler kurtarılabilir 130,64. 10
Elektif ameliyatların öncesinde flep fizyolojisini etkileyebilecek olan sistemik metabolik faktörler, sigara ve ilaç kullanımı değerlendirilmelidir. Sigara sistemik vazokonstriksiyona ve vazospazm flebin tamamının nekrozuna neden olabilecek tromboza yol açar 64. Hipotermi durumunda, mikro dolaşımda vazokonstriksiyon ve doku perfüzyonunda azalma meydana gelir. Bununla birlikte hipoterminin iskemi-reperfüzyon hasarında koruyucu etkisi de bulunmaktadır. İskemik dokunun soğutulması ile metabolizma hızı belirgin olarak düşer ve daha uzun süre iskemide reperfüzyon sağlanabilir. Hipoterminin koruyucu etkisi iskemiden ziyade reperfüzyon esnasında daha fazladır. Bu etki, nötrofil birikiminin ve nötrofil aracılı doku hasarının azalmasıyla ilişkilidir. Bu durum reperfüze edilen iskemik fleplere klinikte sıklıkla yapılan sıcak uygulamasının hatalı olduğunu göstermektedir 90,116. Steroidler flep cerrahisinde hem deneysel hem de klinik olarak kullanılmaktadır. Membran stabilazatörü ve özgün olmayan anti-inflamatuar ajan olarak etkili olur. Klinik kullanımında genel eğilim, flep ödemini azalttığı yönündedir. Sistemik steroid uygulamasının enfeksiyon gibi içerdiği pek çok risk, olası faydalarından ağır basmaktadır 57,94,130. Dekstran ilk olarak hacim genişletici olarak geliştirilse de, trombositin yapışma ile toplanmasını ve kan viskozitesini azalttığı gösterilmiştir. Anaflaksiyi de içerebilen allerjik reaksiyonlar ve aşırı hacim artışı özellikle yaşlı hastalarda akciğer ödemine yol açmaktadır. Bu nedenle uygulama öncesi test dozu uygulanmalıdır ve yaşlı hastalar için göreceli olarak kontrendikedir. Dekstranın flep ve mikro cerrahide kullanılması desteklense de etkinliğini ispatlayan randomize klinik çalışmalar bulunmamaktadır 110. Aspirin, trombosit kümelenmesini ve tromboz oluşumunu bloke eden etkisi nedeniyle flep cerrahisinde sıklıkla kullanılmaktadır. Prostasiklin inhibisyonu yapmadan tromboksan inhibisyonu sağlayan ideal dozu 50-100 mg dır. Tek doz bebe aspirini (81 mg) ile tedavi dozuna ulaşılabilir 48,54,130. Heparin cerrahide en sık kullanılan antitrombotiktir. Antitrombine bağlanarak etki gösterir. Sistemik veya anastomoz hattına lokal olarak uygulanabilir. Deneysel modellerde patensi arttırdığı gösterilmiştir. Flep cerrahisinde aşırı hematom oluşturma riski sebebiyle sistemik heparin ameliyat esnasında tromboz ile karşılaşıldığında uygulanabilir 3,11,48,81. 11
Sülükler, (Hiruda medicinalis) eskiden beri flep komplikasyonlarının tedavisinde kullanılmaktadır ve replantasyon başta olmak üzere fleplerdeki venöz konjesyonu azaltmak için sıklıkla kullanılmaktadır. Sülük terapisindeki en belirgin riskler aşırı kanama ve tedavi boyunca profilaktik antibiyotik kullanımı gerektiren Aeromanas hidrofili infeksiyonudur 14,130. 6 İSKEMİK ÖNKOŞULLAMA VE GECİKTİRME (DELAY) FENOMENİ Cerrahi geciktirme işlemi flep sağkalımını klinik olarak arttırdığı defalarca gösterilen tek gerçekçi yöntemdir. Bu yöntemde flep kısmi olarak kaldırılmakta, flep distalinde nekroza yol açmayacak kadar iskemi oluşturulmaktadır. Böylelikle flebin tamamı akut olarak kaldırıldığında oluşması beklenen distal nekrozun, bu yöntem sonrasında flebin tamamı kaldırıldığında oluşmadığı gösterilmiştir 88,92,108,130. Delay fenomeni nde yeni damar oluşumu (neovaskularizasyon) da rol oynayabilir. Bu olayda fiziksel değişimin veya hücresel seviyedeki fizyolojik değişimlerin daha belirgin olduğu net değildir. Yine de fiziksel değişim için gün veya haftalar gerekirken, hücresel değişimler çok daha hızlı olacaktır. Dhar ve Taylor primer olayın yeni damar oluşumu değil, flep damarlarındaki genişleme olduğunu bildirmiştir. Operasyondan 3 saat sonra çözülen ve en fazla 48 72 saat arasında anastomotik damarlardaki aktif ve ilerleyici genişleme ile sonuçlanan başlangıçta bir vazokonstriksiyon periyodunu gözlemlediler. Anastomotik (choke) damarlardaki bu genişleme; arter duvarının tüm tabaklarında hiperplazi ve hipertrofi sonucunda kalıcı bir dönüşümdür. Ayrıca Taylor cerrahi geciktirme ile flep uzunluğunda en azından ilave bir vaskuler alanın güvenle eklenebileceğini vurgulamıştır 24,88,108. Klasik cerrahi geciktirme işlemi, flep her iki tarafının insize edilmesi ve flep distal ucu salim bırakılarak tabandan ayrılmasını içermektedir. Myers ve Cherry geciktirme işleminin başarılı olabilmesi için cerrahi esnasında flebin aksiyel damarlarının kesilmesi gerektiğini gösterdi. Flebin aksiyel damarlarının kesilmesi ile oluşan kısmi iskeminin, sonradan iskemiye karşı koruyuculuğun uyarılmasındaki kritik rolü vurgulanmıştır. Bu şekilde işlem gerçekleştirildiğinde flep distal kısımdaki yaşayabilirlik artacak ve daha uzun flep hazırlanmasına olanak sağlayacaktır 24,92-3. Transvers rektus abdominis kas-deri flebi gibi geniş random kısım içeren aksiyel fleplere cerrahi geciktirme (delay) uygulandığında flep damarlanmasında ve doku canlılığında olumlu etki sağlanabilmektedir. Özellikle serbest doku nakillerinde dokunun iskemiye önkoşullandırılması yoluyla canlılıkta artış olmasının değeri 12
büyüktür. Günümüz birçok flep araştırmasında odaklanan alan iskemik önkoşullamadır 109,121,130. İskemik önkoşullama dokuya letal olmayan kısa iskemik periyot uygulanması işlemidir. Bu işlem dokunun daha sonra karşılaşacağı uzun iskemiye bağlı hasar için direncini sağlar. Erken faz, iskemik önkoşullamanın hemen sonrasında başlayıp 4 saate kadar uzayan etki gösterirken; geç faz, önkoşullamadan takriben 24 saat sonra başlayan ve 72 saat süreyle etki gösterir 1,89,91. Başlıca önkoşullama yöntemleri; 1-iskemik( flep geciktirilmesi, klempleme) 2-uzak iskemik (turnike) 3-farmakolojik ( adenozin, monofosforil lipit A, NO donörü) 4-ısı uygulaması ( HSP 70i/72 ) olarak toplanmıştır 15,57,73,82,91. İskemik önkoşullamanın dokuyu koruma mekanizması hala tam olarak anlaşılamamıştır. Rees ve arkadaşlarının yaptığı deneysel çalışmalarda random fleplerin distalindeki nötrofil aracılı nekrozun, önkoşullama sonrasında nötrofil birikiminde azalmayla birlikte canlılıkta artış gözlemiştir 106. Birçok otör, K + -ATP kanalları gibi proteinlerin fosforilasyonuna neden olan protein kinaz C nin aktivasyonu ile hücresel korunmanın sağlandığını öne sürmektedir. Bu görüş, adenozin uygulanmasıyla iskemik önkoşullama benzeri etkinin oluşması ve adenozin reseptör antagonistlerince etkinin önlenmesini gösteren çalışmalarla desteklendi 2,25,148. Pang ve arkadaşları, domuz latissimus dorsi kasında en az 3 siklus halinde 10 dakika iskemiyi takiben 10 dakika reperfüzyon uygulayarak iskemik önkoşullamanın koruyucu etkisini sağlamıştır. Koruyucu etkinin kas flebinde oluşması için gereken süre daha önce kalp kası için yapılmış olan önkoşullamada gerekenden çok daha fazla idi 101. Repefüzyon hasarında iskemik toleransın kas lifi tipine göre değiştiği gösterilmiştir 138. İskemi sonrası kas fonksiyonlarının korunmasında iskemik önkoşullamanın olumlu yönde etkisi saptanmıştır 45. Forrest kalpte olduğu gibi domuz kas fleplerinde adenozin ile iskemik toleransta artış gözledi 37. Hopper ve arkadaşları, domuz latissimus kasındaki iskemik önkoşullamanın koruyucu etkisinin protein kinaz C (PKC) inhibitörlerince bloke edilip, PKC aktivatörlerince taklit edilebileceğini bildirdi 56. 13
Bir diğer farmakolojik önkoşullama yöntemi de önkoşullamanın geç fazını taklit eden sentetik monofosforillipit A bileşimidir. Klinikte kardiak bypass hastalarında kullanılan bu bileşim, deneysel olarak random deri flepleri ve pediküllü iskelet kas fleplerinde uygulanmıştır. Sonuç olarak ilacın nekroz azaltıcı etkisinin hücre içi sinyal aracılarının tetiklenmesine ve nitrik oksit artışına bağlı olduğu belirtilmiştir 82. Her ne kadar farmakolojik önkoşullama ile başarılı sonuçlar alınsa da, ilaçları yan etkileri (adenozin-hipotansiyon gibi) kullanımlarını sınırlamaktadır. Bu nedenle klinikte uygulanabilir bir teknik olarak uzak iskemik önkoşullama üzerinde çalışılmıştır. Domuzlarda ekstremiteye turnike ile iskemik önkoşullama uygulanarak latissimus dorsi kas flebindeki nekroz alanında anlamlı azalma gösterilmiştir. Bu koruyucu etkinin mitokondriyal ATP duyarlı K + kanal inhibitörlerince bloke olması, uzak ve lokal iskemik önkoşullamanın benzer mekanizma ile etki ettiğini göstermektedir 72-74. Önkoşullama için iskemi mevcut tek stres şekli değildir. Isı ve ısı şok proteinlerinin üretimi ile önkoşullama sağlanabilmektedir. Birçok araştırmacı, deneysel olarak ısı şoku uygulayarak flep derisinde ısı şok protein ekspresyonunda artma ile birlikte flep sağkalımında artış sağlanacağını göstermiştir 15,28,84. İskemik önkoşullamadaki tüm mekanizmalar, süregelen çalışmaların konusu olmaya devam etmektedir. Mekanizmaların daha iyi anlaşılması, mekanik önkoşullama tekniklerinde ilerleme ve başka önkoşullama tekniklerinin gelişmesine yol açması beklenmektedir. Bu tekniklerle iskemi ile ilişkili doku hasarı azaltılarak, rekonstrüktif potansiyelimizin genişlemesi sağlanabilir 15,72,141. 14
III- GEREÇ VE YÖNTEM Birden fazla pedikül içeren aksiyal deri flebi modelinde farklı pediküllere aralıklı klempleme ve reperfüzyon döngüsü yoluyla iskemik önkoşullama uygulanmasının flep sağkalımına etkisini değerlendirmek için sıçanlarda bu deneysel çalışma planlandı. Çalışmada flep modeli olarak sabit anatomik yapısı, diseksiyonunun kolay olması, pedikül varyasyonunun olmaması ve çift pedikül üzerinden hazırlanabilmesi nedeniyle sıçanda karın flebi model olarak kullanılmıştır. Bu flep ilk olarak 1978 yılında geciktirme fenomeni araştırmalarında kullanılmak üzere Finseth ve Cutting tarafından tarif edilmiştir 36. 1984 de Petry ve Wortham ın epigastrik ada flebinin vasküler anatomisini açıklamasıyla, bu anatomik bilgiye dayandırılarak deneysel modellerde planlamalar yapılmaktadır 4,31,98,103,112. Epigastrik arter veya inferior epigastrik arter flebi olarak isimlendirilen bu flep modeli, çift pedikül içermesi sayesinde flep dolaşımı ve sağkalımı hakkında çalışmalara olanak sağlamaktadır 4,31,103. İnferior epigastrik arter deri flebi bu çalışmada sağ, sol ve her iki pedikülüne klemp uygulanması ile iskemik önkoşullama yapılmasının flep sağkalımına etkisini araştırmak için seçilmiştir. Bu çalışmanın cerrahi bölümü Şişli Etfal Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi Kliniği Mikrocerrahi Eğitim Geliştirme Araştırma Merkezi (MEGAM) laboratuarında; histoloji ve immunohistokimyasal araştırma bölümü Şişli Etfal Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Patoloji Kliniği laboratuarında gerçekleştirildi. 1- Kullanılan Denekler Ağırlıkları 150-225gr arasında değişen 159 adet erişkin Sprague-Dawley sıçan araştırmaya dahil edilmiştir. 2- Kullanılan Alet ve Malzemeler: Çalışmada kullanılan alet ve malzemeler aşağıda gösterilmektedir: Ketamin HCL (ketalar) Enjektör 5ml Elektrikli tıraş makinesi Çizim kalemi 15
Cetvel Flaster Dil basacağı (tahta abeslan) Povidon-iodin 15 numara bistüri Adson penset Steven s doku makası Portegue 4/0 ipek 1 adet mikro makas 1 adet mikro penset Steril gazlı bez Tartı aleti adet mini damar klembi (Aesculap AG, D7200, F:0.1-0.15 N, Germany) Dijital fotoğraf makinesi ( Konica Minolta Dimage Z20 ) Anti VEGF antikor: (JH121 monoklonal IgG 1κ, Upstate, Lake Placid, NY, 12946) Anti CD-105 antikor: (MJ7/18 monoklonal IgG 2aκ, Chemicon Int. Inc.) 3- Sıçan İnferior Epigastrik Arter Flebinin Hazırlanması A) Anatomi: Sıçanda epigastrik arter flebi olarak da isimlendirilen karın flebi; ksifoid üst sınır, pubis alt sınır ve yanlarda her iki aksiler çizgi sınırları içinde kalan alanı içerir. Bu anatomik dayanak noktalarına göre daha küçük sıçanlarda daha küçük boyutlu flepler kullanılabilmektedir 31,103. Bu çalışmada da anatomik kriterlere uygun olarak flep hazırlanmıştır. Flep dolaşımı her iki taraftaki yüzeyel epigastrik arterin medial dalları ve eşlik eden venleri tarafından sağlanmaktadır. Epigastrik arterin lateral dalları nekroz alanı büyüklüğü çalışmasında değişkenliği azaltmak için flebe dahil edilmemektedir 31,103. 16
B) Cerrahi Yöntem: Anestezi kas içi ketamin enjeksiyonu (10 mg/kg) ile sağlandı. Sıçanlar supin pozisyonda iken ekstremiteleri zemine bant ile tespit edildi. Sıçan karın bölgesi tıraş edildikten sonra povidon iodin emdirilmiş steril gazlı bez ile temizlendi. Deneklerin tümünde 6x6cm boyutlarında bilateral epigastrik arterin medial dalları pedikülü ile karın flebi ( epigastrik arter flebi ) planlandı ve uygun çizimler yapıldı (Resim 1). Resim 1: Anatomik kriterlere uygun flep çizimi Anestezi ve çizim sonrasında flebin üst (kranial) sınırı olan ksifoidden geçen yatay hat üzerinden ve her iki yan sınır hattından karın duvarı kasları üzerindeki gevşek plana inecek şekilde insizyonlar uygulandı. Flep disseksiyonu esnasında kranial kısmında her iki torasik arterin uç dalları ile yanlarda epigastrik arterin lateral dalının uzantıları kısa süre klemplenerek kanama kontrolü sağlandı. Flep kranyalden kaudale doğru kas üzeri gevşek planda kaudal bazlı olarak yarımada şeklinde kaldırıldı. Resim 2: Flebin ada şeklinde hazırlanması Her iki taraf epigastrik pedikül kasık yağ yastığından serbestlendikten sonra kaudal kenar kesisi uygulanarak flep ada flebi haline getirildi (Resim 2,3). Tüm deneklerin ek iskemi uygulanmasından önce sol pedikülleri 4/0 ipek ile bağlandı. Tüm deneklerde bu flep standardize edildi. Resim 3: Bipedikül üzerinden hazırlanan ada flebi Operasyon sonunda flepler yerlerine 4/0 ipek ile sütüre edildi (Resim 4). 17
Resim 4: Cerrahi işlemin sonunda flebin sütüre edilmesi ve denek göğsüne uygulanan koruyucu yelek 4- Deney Protokolü ve Deneklerin Gruplandırılması Çalışmaya dahil edilen 159 adet sıçan, 119 u çalışma grubunu (grup 1) ve 40 tanesi kontrol grubunu (grup 2) oluşturacak şekilde rastgele seçilerek iki kısma ayrıldı. Çalışma grubu, sağ (pedikül) önkoşullama (n: 40), sol (pedikül) önkoşullama (n: 40) ve bilateral (pedikül) önkoşullama (n: 39) olmak üzere 3 ana gruba ayrıldı. Yaptığımız literatür araştırmasında üç döngü halinde iskemi-reperfüzyon uygulayarak önkoşullama gerçekleştirildiğini saptadık 45,101,105,141. Önkoşullamanın geç faz etkisinin de birden fazla reperfüzyon döngüsü ile oluştuğu bildirilmiştir 105. Çalışmamızda da 10 ar dakika klempleme, 10 ar dakika reperfüzyon olacak şekilde 3 döngüde önkoşullama uygulandı. Önkoşullama için sabit basınç uygulayan mini klempler kullanıldı (Resim 5). Resim-5: Tüm deneklerde ek iskemi uygulamalarında ve çalışma gruplarında önkoşullama uygulamalarında kullanılan mini damar klembi (Aesculap AG, D7200, F:0.1-0.15 N, Germany) 18
İskemik önkoşullama çalışmalarında 0 ile 14 saat arasında değişen farklı ek iskemi sürelerindeki önkoşullama sonuçları değerlendirilmiştir 135,141. Bu çalışmada alt grup sayısını ve dolayısıyla sakrifiye edilecek denek sayısını azaltmak için deneklere 0-6 saat arasında 5 farklı sürede ek iskemi uygulandı. Çalışma ana grupları, uygulanacak ek iskemi süresine göre 5 alt gruba ayrıldı. Buna göre ek iskemi uygulanmayan (n: 8), 1 saat ek iskemi uygulanan (n:8, bilateral önkoşullama grubu 7 denekten oluşmakta), 2 saat ek iskemi uygulanan (n:8), 4 saat ek iskemi uygulanan (n:8) ve 6 saat ek iskemi uygulanan (n: 8) olmak üzere 20 çalışma alt grubu oluşturuldu. Kontrol grubundan (n:40) ise yukarıda belirtilen ek iskemi sürelerine göre 5 eşit (n:8) alt grup oluşturuldu. Tüm alt gruplara uygulanan cerrahi yöntem aşağıda sunulmaktadır. ÇALIŞMA GRUPLARI Sağ önkoşullama 0 saat (n: 8) : Flepler kaldırıldıktan sonra sağ pediküle toplam 1 saat süreyle mini klemp (Resim-5) yardımıyla 10 dakika iskemi ve 10 dakika reperfüzyon 3 döngü halinde uygulanarak iskemik önkoşullama gerçekleştirildi. Flepler bipedikül üzerinden 1 saat süreyle perfüze edildikten sonra sol pedikülleri 4/0 ipek ile bağlandı. Flepler ek iskemiye tabi tutulmadan eski yerlerine 4/0 ipek ile sütüre edildi. Sağ önkoşullama 1 saat (n:8) : Fleplerin hazırlanmasını takiben sağ pediküle toplam 1 saat süreyle mini klemp yardımı ile 10 dakika iskemi ve 10 dakika reperfüzyon 3 döngü halinde uygulanarak iskemik önkoşullama gerçekleştirildi. Fleplerin bipedikül üzerinden 1 saat süreyle dolaşımları sağlandıktan sonra sol pediküller 4/0 ipek ile bağlandı. Flepler 1 saat ek iskemiye tabi tutulmalarını takiben eski yerlerine 4/0 ipek ile sütüre edildi. 19
Sağ önkoşullama 2 saat (n: 8) : Flepler ada flebi şeklinde kaldırıldıktan sonra sağ pediküle toplam 1 saat süreyle mini klemp yardımıyla 3 döngü halinde 10 dakika iskemi ve 10 dakika reperfüzyon uygulanarak iskemik önkoşullama gerçekleştirildi. Fleplerin bipedikül üzerinden 1 saat süreyle perfüze edildikten sonra sol pedikülleri 4/0 ipek ile bağlandı. Flepler mini damar klembi ile 2 saat ek iskemiye tabi tutulmalarını takiben eski yerlerine 4/0 ipek ile sütüre edildi. Sağ önkoşullama 4 saat (n: 8) : Flepler kaldırıldıktan sonra sağ pediküle toplam 1 saat süreyle mini klemp yardımı ile 3 döngü halinde 10 dakika iskemi ve 10 dakika reperfüzyon uygulanarak iskemik önkoşullama gerçekleştirildi. Fleplerin bipedikül üzerinden 1 saat süreyle perfüzyonu sonrasında sol pedikülleri 4/0 ipek ile bağlandı ve 4 saat ek iskemiye tabi tutulmalarını takiben eski yerlerine 4/0 ipek ile sütüre edildi. Sağ önkoşullama 6 saat (n: 8) : Fleplerin kaldırılmasını takiben sağ pediküle toplam 1 saat süreyle mini klemp yardımıyla 10 dakika iskemi ve 10 dakika reperfüzyon 3 döngü halinde uygulanarak iskemik önkoşullama gerçekleştirildi. Fleplerin bipedikül üzerinden 1 saat süreyle perfüzyonu sonrasında sol pedikülleri 4/0 ipek ile bağlandı ve 6 saat ek iskemiye tabi tutulmalarını takiben eski yerlerine 4/0 ipek ile sütüre edildi. Sol önkoşullama 0 saat (n: 8) : Flepler hazırlandıktan sonra sol pediküle mini klemp yardımıyla toplam 1 saat süreyle 10 dakika iskemi ve 10 dakika reperfüzyon 3 döngü halinde uygulanarak iskemik önkoşullama gerçekleştirildi. Fleplerin bipedikül üzerinden 1 saat süreyle perfüzyonunu takiben sol pedikülleri 4/0 ipek ile bağlandı ve flepler ek iskemiye tabi tutulmadan eski yerlerine 4/0 ipek ile sütüre edildi. Sol önkoşullama 1 saat (n:8) : Flepler cerrahi yönteme uygun olarak kaldırıldı. Sol pediküle mini klemp yardımıyla toplam 1 saat süreyle 3 döngü halinde 10 dakika iskemi ve 10 dakika reperfüzyon uygulanarak iskemik önkoşullama gerçekleştirildi. Fleplerin bipedikül üzerinden 1 saat 20
süreyle perfüzyonu sonrasında sol pedikülleri 4/0 ipek ile bağlandı. Fleplere 1 saat ek iskemi uygulandı ve flepler eski yerlerine 4/0 ipek ile sütüre edildi. Sol önkoşullama 2 saat (n: 8) : Flepler kaldırıldı ve sol pediküllerine mini klemp yardımıyla toplam 1 saat süreyle 10 dakika iskemi ve 10 dakika reperfüzyon 3 döngü halinde uygulanarak iskemik önkoşullama gerçekleştirildi. Fleplerin dolaşımları 1 saat süreyle bipedikül üzerinden sağlandıktan sonra sol pedikülleri 4/0 ipek ile bağlandı. Fleplere mini klemp yardımıyla 2 saat ek iskemi uygulandıktan sonra flepler eski yerlerine 4/0 ipek ile sütüre edildi. Sol önkoşullama 4 saat (n: 8) : Flepler hazırlandıktan sonra sol pediküllerine mini klemp yardımı ile toplam 1 saat süreyle 3 döngü halinde 10 dakika iskemi ve 10 dakika reperfüzyon uygulanarak iskemik önkoşullama gerçekleştirildi. Fleplerin bipedikül üzerinden 1 saat süreyle perfüzyonu sonrasında sol pedikülleri 4/0 ipek ile bağlandı ve 4 saat ek iskemiye tabi tutulmalarını takiben eski yerlerine 4/0 ipek ile sütüre edildi. Sol önkoşullama 6 saat (n: 8) : Flepler kaldırılmasını takiben sol pediküllerine mini klemp yardımıyla toplam 1 saat süreyle 10 dakika iskemi ve 10 dakika reperfüzyon 3 döngü halinde uygulanarak iskemik önkoşullama gerçekleştirildi. Fleplerin dolaşımları bipedikül üzerinden 1 saat süreyle sağlandıktan sonra sol pedikülleri 4/0 ipek ile bağlandı. Flepler 6 saat ek iskemiye tabi tutulmalarını takiben eski yerlerine 4/0 ipek ile sütüre edildi. Bilateral önkoşullama 0 saat (n: 8) : Flepler kaldırıldıktan sonra her iki pediküle mini klemp yardımıyla toplam 1 saat süreyle 10 dakika iskemi ve 10 dakika reperfüzyon 3 döngü halinde uygulanarak iskemik önkoşullama gerçekleştirildi. Fleplerin bipedikül üzerinden 1 saat süreyle perfüzyonunu takiben sol pedikülleri 4/0 ipek ile bağlandı. Flepler ek iskemiye tabi tutulmadan eski yerlerine 4/0 ipek ile sütüre edildi. 21
Bilateral önkoşullama 1 saat (n:7) : Flepler ada flebi şeklinde hazırlandı. Her iki pediküle mini klemp yardımı ile toplam 1 saat süreyle 3 döngü halinde 10 dakika iskemi ve 10 dakika reperfüzyon uygulanarak iskemik önkoşullama gerçekleştirildi. Fleplerin dolaşımı bipedikül üzerinden 1 saat süreyle sağlandıktan sonra sol pedikülleri 4/0 ipek ile bağlandı. Fleplere mini klemp yardımıyla 1 saat ek iskemi uygulandı. Flepler eski yerlerine 4/0 ipek ile sütüre edildi. Bilateral önkoşullama 2 saat (n: 8) : Fleplerin kaldırılmasını takiben her iki pediküle mini klemp yardımıyla toplam 1 saat süreyle 10 dakika iskemi ve 10 dakika reperfüzyon 3 döngü halinde uygulanarak iskemik önkoşullama gerçekleştirildi. Fleplerin kan dolaşımları bipedikül üzerinden 1 saat süreyle sağlandı.fleplerin sol pedikülleri 4/0 ipek ile bağlandı ve flepler 2 saat ek iskemiye tabi tutulmalarını takiben eski yerlerine 4/0 ipek ile sütüre edildi. Bilateral önkoşullama 4 saat (n: 8) : Flepler kaldırıldıktan sonra her iki pediküle mini klemp yardımıyla toplam 1 saat süreyle 3 döngü halinde 10 dakika iskemi ve 10 dakika reperfüzyon uygulanarak iskemik önkoşullama gerçekleştirildi. Fleplerin bipedikül üzerinden 1 saat süreyle dolaşımları sağlandı ve sonrasında sol pedikülleri 4/0 ipek ile bağlandı. Flepler 4 saat ek iskemiye tabi tutulmalarını takiben eski yerlerine 4/0 ipek ile sütüre edildi. Bilateral önkoşullama 6 saat (n: 8) : Flepler kaldırıldı ve her iki pediküle mini klemp yardımıyla toplam 1 saat süreyle 10 dakika iskemi ve 10 dakika reperfüzyon 3 döngü halinde uygulanarak iskemik önkoşullama gerçekleştirildi. Fleplerin dolaşımı 1 saat süreyle bipedikül üzerinden sağlandıktan sonra sol pedikülleri 4/0 ipek ile bağlandı. Fleplere mini klemp yardımıyla 6 saat ek iskemi uygulanmasını takiben flepler eski yerlerine 4/0 ipek ile sütüre edildi. 22
KONTROL GRUPLARI Kontrol 0 saat (n: 8) : Fleplerin kaldırılmasını ve 1 saat süreyle bipedikül üzerinden perfüzyonunu takiben fleplerin sol pedikülleri 4/0 ipek ile bağlandı ve ek iskemi uygulanmadan flepler eski yerlerine 4/0 ipek ile sütüre edildi. Kontrol 1 saat (n: 8) : Flepler ada şeklinde hazırlandı ve 1 saat süreyle bipedikül üzerinden dolaşımları sağlandıktan sonra, sol pedikülleri 4/0 ipek ile bağlandı ve mini damar klembi (Resim-5) ile sağ pediküle 1 saat ek iskemi uygulandı. Flepler 4/0 ipek ile eski yerlerine sütüre edildi. Kontrol 2 saat (n: 8) : Flepler kaldırıldıktan ve 1 saat süreyle bipedikül üzerinden dolaşımları sağlandıktan sonra, sol pedikülleri 4/0 ipek ile bağlandı ve mini klemp yardımıyla sağ pediküle 2 saat ek iskemi uygulandı. Flepler 4/0 ipek ile eski yerlerine sütüre edildi. Kontrol 4 saat (n: 8) : Fleplerin kaldırılmasını ve 1 saat süreyle bipedikül üzerinden perfüzyonunu takiben, sol pedikülleri 4/0 ipek ile bağlandı ve mini damar klembi ile sağ pediküle 4 saat ek iskemi uygulandı. Flepler 4/0 ipek ile eski yerlerine sütüre edildi. Kontrol 6 saat (n: 8) : Flepler daha önce açıklanan cerrahi yönteme uyun olarak hazırlandı ve 1 saat süreyle bipedikül üzerinden dolaşımları sağlandı. Daha sonra sol pedikülleri 4/0 ipek ile bağlandı ve mini damar klembi ile sağ pediküle 6 saat ek iskemi uygulandı. Flepler 4/0 ipek ile eski yerlerine sütüre edildi. 23
5- Hayvanların Bakımı: Tüm deneklere cerrahi sonrası povidon-iodin ile pansuman uygulandı. Sıçanlarda otokanibalizasyonu ( öze dönük yamyamlık ) engellemek için gazlı bez, flaster ve dil basacağı ile modifiye edilen koruyucu yelekler kullanıldı 16 (Resim 4). Sıçanlar sabit oda sıcaklığında (20 santigrat derece), 12 saat aydınlık 12 saat karanlık ritmi uygulanan ortamda, su ve standart laboratuar yemine istedikleri zaman ulaşabildikleri kafesler içinde tek tek yerleştirilerek barındırıldılar. 6- Değerlendirmeler A) Klinik ve Yüzey Alanı (Topografik) Değerlendirmesi: Flepler oluşan nekroz ve diğer komplikasyonlar açısından günlük olarak değerlendirildi. Deney süresince sıçan ağırlıklarında değişim gözlenmedi. Yara enfeksiyonu ve fleplerde dikiş hattında ayrışma saptanmadı. Gruplarda sıçan kaybı gerçekleşmedi. Deneysel çalışmalarda flep sağkalımı operasyon sonrası 5. veya 7. günde değerlendirildiği belirtilmiştir 57,82,141. Bu çalışmada denek sayısının fazla olması da göz önünde tutularak cerrahi sonrası 5. günde flep yüzey alanı ölçümleri için çizimler yapıldı ve biyopsiler alındı. Kontrol ve çalışma gruplarında cerrahi işlemin tamamlanmasından sonra fleplerin asetat üzerine çizimleri yapıldı. Flep alanının asetat üzerine yapılan bu ilk çizimi, 1. yüzey alan çizimi olarak adlandırıldı. Cerrahi işlem sonrası 5. günde asetat üzerine flebi ve nekroz alanını gösteren ikinci çizimler yapıldı ve biyopsiler alındı. Flep alanını ve oluşan nekroz alanının asetat üzerine geçirilmesi olan bu ikinci çizimler 2. yüzey alan çizimleri olarak adlandırıldı. Denekler aşırı doz ketamin enjekte edilerek sakrifiye edildi. Şekil 3-4: Asetat üzerindeki çizimlerin tarayıcıdan geçirildikten sonra alanların bilgisayar programı ile boyanması 24
Topografik çalışmada yüzey alanların 1/1 lik çizimleri asetat üzerine alındıktan sonra asetatlar; arkalarına milimetrik kağıtlar konularak tarayıcıdan geçirilerek çizimler bilgisayara aktarıldı. Çizimler, Microsoft Paint programında birebir görüntüleme için açıldı. Daha sonra çizimler Adobe Photoshop 6.0 CE programına resim olarak aktarıldı. Çizim boyanmadan önce renk paletindeki kırmızı(r), yeşil (G),mavi(B) renklerden herhangi biri 255 değerine diğer ikisi 0 (sıfır) değerine ayarlandı. Böylece o renge ait mutlak ton değeri elde edilmiş oldu. Çizimin içi ayarlanmış olan renge boyanarak dolduruldu. Boyanan renk seçilerek mevcut grafikte 255 değeri seçilir ve açılan pencerede piksel sayımı kaydedildi. Daha sonra 1 cm 2 lik bir kare alan, dörtgen seçme aracıyla seçildi. Aynı boyama ve piksel sayma işlemi bu kare için yapılarak 1 cm 2 ye düşen piksel sayımı bulundu. İlk önce bulunan değer bu son bulunan değere bölünerek mevcut boyalı alanın kaç cm 2 olduğu hesaplandı. Kullanılan bu yöntem ile 1.yüzey alan çizimi üzerinden peroperatif (perop nekroz % perop nekroz), 2. yüzey alan çizimi üzerinden postoperatif (postop nekroz % postop nekroz) ve kontraksiyon yüzdesi (% kontraksiyon) değerlerine ulaşıldı. B) Histolojik Değerlendirme : Histolojik ve immunohistokimyasal çalışma aynı patolog tarafından hangi doku örneğinin hangi gruba dahil olduğunu bilmeden ve doku örnekleri içinden rastgele seçim yapılarak gerçekleştirilmiştir. Doku örnekleri fleplerde nekroz-sağlam sınırına komşu sağlam alandan cerrahi işlemden sonraki 5. günde alındı. Histolojik çalışma için formalinde fikse edilen doku örnekleri rutin doku takip işlemlerinin ardından parafine gömülerek 4 mikronluk kesitler alındı. Hematoksilen eozin boyası ile ışık mikroskobunda nekroz varlığı (-/+), nekroz çevresindeki alanlarda polimorf nükleuslu lökosit infiltrasyonu, interstisyel ödem, yeni damar oluşumu (neovaskülarizasyon), kronik inflamasyon ve mast hücresi varlığı(-/+/++/+++) açısından semikantitatif olarak değerlendirildi. Sonuç olarak histolojik çalışmada iskemi-reperfüzyon hasarının ve iskemik önkoşullamanın flep üzerindeki etkilerini görmek için nekroz, yeni damar oluşumu, akut ve kronik inflamasyon bulgularının varlığı ve şiddeti semikantitatif olarak araştırıldı. 25
C )İmmunohistokimyasal Değerlendirme : İmmunohistokimyasal çalışma için parafin bloklardan elde edilen kesitlerde strepavidinbiotin yöntemi ile immunohistokimyasal olarak CD105 ve VEGF antikorları ile boyama yapıldı. CD105 ile mikro damar yoğunluğu (MVD) belirlenirken nekroz çevresinde boyanmanın en fazla olduğu 3 alan belirlenerek x400 büyütme ile boyanma içeren tek bir endotel hücresi ya da birbiri ile bağlantılı endotel hücre kümeleri, lümen oluşturmasına bakılmaksızın mikro damar kabul edilerek sayıldı ve ortalamaları alındı. VEGF boyanması değerlendirilirken nekroz çevresindeki alanda ekstrasellüler matriks ve endotel hücrelerinde sitoplazmik ve hücre yüzeyindeki boyanma, yaygınlığına göre seyrekorta-yaygın olarak derecelendirildi. D) İstatistiksel Değerlendirme: Bu çalışmada topografik, histolojik ve immunohistokimyasal verilerin istatistiksel analizleri GraphPad Prisma V.3 paket programı ile yapılmıştır. Topografik verilerin değerlendirilmesinde tanımlayıcı istatistiksel metotların (ortalama, standart sapma) yanı sıra gruplar arası karşılaştırmalarda Kruskal Wallis testi alt grup karşılaştırmalarında Dunn s çoklu karşılaştırma testi, % kontraksiyon ve % nekroz farkı arasındaki ilişkiyi belirlemede Spearman korelasyon testi kullanılmıştır. Histoloji ve VEGF gibi nitel verilerin karşılaştırmalarında ki-kare testi, CD105 verileri için Kruskal Wallis testi kullanılmıştır. Sonuçlar, anlamlılık p<0,05 düzeyinde değerlendirilmiştir. 26
IV BULGULAR 1- Topografik Değerlendirme Sonuçları Ek iskemi sürelerine göre grupların nekroz alan ölçümleri (cm 2 ) tablo 1 de gösterilmiştir. Ek iskemi uygulanmadığında bilateral önkoşullama grubunda nekroz alanı belirgin olarak yüksek iken sağ önkoşullama grubunda nekroz alanı kontrol grubundan azdı. 1 saat ek iskemi uygulandığında ise tüm çalışma gruplarında nekroz alanı kontrol grubundan belirgin olarak az bulundu. 2 saat ek iskemi uygulandığında ise çalışma gruplarındaki nekroz alanının arttığı, fakat yine de kontrol grubundan az olduğu gözlendi. 4 saat ek iskemi uygulandığında çalışma grubundaki nekroz alanlarında 2 saat ek iskemiye göre belirgin azalma olurken kontrol grubunda artış olduğu saptandı. En az nekroz alanı bilateral önkoşullama grubunda mevcuttu. 6 saat ek iskemi uygulandığında tüm çalışma gruplarında nekroz alan miktarında artış olduğu saptandı. Bununla birlikte sol önkoşullama grubundaki nekroz alanı, diğer çalışma gruplarından ve kontrol grubundan az olarak tespit edildi. Tablo 1 deki nekroz alanı grafiğinde kontrol grubu nekroz alanının ek iskemi süresi arttıkça arttığı görülmektedir. Çalışma gruplarında ise nekroz alanı grafiğinin ondülen seyir gösterdiğini tespit ettik. cm 2 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Nekroz Alanı 0 Saat 1 Saat 2 Saat 4 Saat 6 Saat Sağ Önkoşul. Sol Önkoşul. Bilateral Önkoşul. Kontrol Gr. Tablo 1: Grupların ek iskemi sürelerindeki nekroz alanlarının karşılaştırılması 27