Kullanım Talimatları SAS-3 Alkalin Fosfataz İzoenzim REF 300800 (reaktif dahil) REF300801 (sadece jel kit), REF 300802 (sadece reaktif kit)
KULLANIM AMACI SAS-3 Alkalin Fosfataz izoenzim kiti, agaroz jel elektroforezi tarafından Alkalin fosfataz izoenzimlerinin miktarının belirlenmesi ve ayrılması için tasarlanmıştır. Alkaline Fosfataz (ALP) (EC 3.1.3.1) alkalin ph da fosfat esterlerin hidrolizini katalizleyen bir enzimdir. ALP in en iyi konsantrasyonu karaciğer, kemik, bağırsak ve plasenta da bulunur. Ancak, hemen hemen her vücut dokusu ALP in küçük bir miktarını içerir. Bu geniş dağılımdan dolayı, total bir ALP miktarının yararlılığı sınırlıdır. Ne yazık ki, ALP in her kaynağı bir baskın izoenzim üretir ve serumda yükseltilmiş ALP in doku kaynağı izoenzim tipi tespit ediliyorken belirlenebilir. Fizikokimyasal ve elektroforetik özelliklerinde ALP farklı izoenzimler ve bu farklılıkların avantajlarını alarak tek tek izoenzimler tespit edebilir 1. Karaciğer (makrohepatik ya da hızlı karaciğer içerir), kemik, bağırsak ve plesanta izoenzimlerine ek olarak diğer ALP izoenzimler serumda tespit edilmiştir. Regan, Nagao, PA ve renal izoenzimler bunlar arasındadır. SAS-3 ALP prosedürü karaciğer ve makrohepatik (hızlı karaciğer) ayrımı için jelde bir deterjan ve neroaminidez 2,3 için izoemzimlerin yanıtında farklılıkları kullanan yüksek çözünürlüklü bir elektroforez yöntemidir. Sonuç, karaciğer, kemik, paratiroid ve bağırsak bozuklukları tedavisinde ve teşhisinde kullanılmak için bağırsak ALP izoenzimleri, kemik, makrohepatik ve karaciğerden ayırabilir. Bu sistem, 3 ayrı bantta bağırsak izoenzimi ayırabilir. UYARILAR VE ÖNLEMLER Tüm kitler sadece in-vitro diagnostik kullanım içindir. Herhangi bir kit bileşenini ağzınızla pipetlemeyin, ağzınıza sürmeyin. Tüm kit bileşenlerinin işlemi sırasında eldiven giyin. Risk, güvenlik koşulları ve atım bilgisi için ürün güvenlik kağıdına bakın. BİLEŞENLER 1.SAS-3 ALP Izoenzim Jel (x10) Koruyucu olarak sodyum azid ve thimersal ile bir Tris/Barbital tamponunda agaroz içerir. Paket içindeki jel kullanım için hazırdır. 2. SAS-1 ALP Izoenzim Ayırma Fazlalığı (1x2.1ml) Vibrio koleradan nöraminidaz içerir. Ayırma fazlalığı paketlenmiş olarak kullanıma hazırdır. 3. SAS-3 ALP Izoenzim Substrate (1x32ml) BCIP (5-Bromo-4-kloro-3-indolil fosfat) 2-amino-2-metil-1,3-propanediol tampon içerir. Substrat paketlenmiş olarak kullanıma hazırdır. 4. SAS-3 ALP Izoenzim kromajen (10x3 ml) NBT (nitromavi tetrazolium) toz içerir. Çözündürme kılavuzu için ADIM-ADIM PROSEDURE bakın. 5. Diğer Kit Bileşenleri Her kit kullanımı için talimatlar ve 10 jeli tamamlamak için yeterli Kağıt kurutucu C içerir.
SAKLAMA VE RAF ÖMRÜ 1 - SAS-3 ALP Isoenzim Jel Jeller 15-30 derecede saklanmalıdır ve paket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. DOLABA KOYMAYIN VEYA DONDURMAYIN. Jelin bozulma belirtileri,1) jelin dondurulması sonucu oluşan kristal görünüm, 2) çatlama ve kuruluk jelin kurumasını gösterir veya 3) bakteriyal ya da fungal kaynaklı agarozun görülür kontaminasyonunu jelin bozunma belirtileridir. 2. SAS-3 ALP Isoenzim Ayırma yükseltici Ayırma yükselticisi 2...6 C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. 3. SAS-3 ALP Isoenzime Substrat Substrat 2...6 C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Substrat solüsyonunun kontaminasyonu önlenmelidir. 4. SAS-3 ALP Isoenzime kromagen Kromajen şişeleri 2...6 C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. SAĞLANMAYAN FAKAT GEREKSİNİLEN ÖĞELER Katalog No.310200 Aplikatör Ucu (1 x 10) Katalog No.310300 Aplikatör Ucu (5 x 10) Katalog No.210100 Tek kullanımlık numune kapları (100) Katalog No. 3100 REP Prep Katalog No.210500 Elektrotlar Saf su Boya arındırıcı solüsyon: 400 ml glisial asetik asit ve 950 ml saf suyu karıştırın. Sıkı kapatılmış şişede saklanır. Vorteks NUMUNE TOPLANMASI VE HAZIRLANMASI Tercih edilen numune taze toplanmış serumdur. Serum kan toplandıktan sonra en kısa zamanda kan hücrelerinden alınmalıdır. Oksalat, sitrat veya EDTA içeren numuneler bu maddelerin alkalin fosfataz aktivitesi inhibe olarak kullanılamaz 4.Total ALP düzeyi uygun bir yöntem tarafından belirlenmelidir. Hastalar aç olmalıdır. O veya B kan gruplu hastaların yağlı bir yemekten sonra 2 saat içinde bağırsakta ALP si yükselmiş olabilirler 4-6. Serum toplandıktan sonra en kısa zamanda test edilmeli ve 2..6 C de saklanmalıdır. Eğer gerekirse, serum 24 saatten az olmayacak şekilde -20 C de dondurularak saklanmalıdır 7,8. Etkileyici Faktörler: 1) Fosfat, oksalat, sitrat ve siyanür ALP aktivitesini engelleyebilir 4,8, 2) Aşırı glisin kompleks Magnezyum iyonları tarafından ALP yi inhibe edebilir, 3) EDTA bazı ALP izoenzimleri inhibe edebilir 4, 4) Bir kaç ilaç ALP düzeyini etkileyebilen enzimatik dengesizliğe neden olur 4,9.
Eğer yüksek aktivite izoenzim türleri arasındaki ayrımı etkilerse, yüksek total ALP aktiviteli numuneler dilüe edilebilir. Dilüsyon izoenzimin yer değiştirmesini etkilediği için saline yada su da yapılmamalıdır. Dilüsyonlar, endojen ALP aktivitesini yok etmek için ısıtılan (15-20 dakika boyunca 56 C) erkek donörden alınan serumda yapılmalıdır. Bir dilüent olarak kullanmak için serumun kararlılığını kullanım öncesi kontrol edin. ADIM-ADIM PROSEDÜR 1. Cihaza aşağıdaki parametreleri programlayın: Adım Zaman(dk:sn) Sıcaklık(derece) Voltaj Diğer Elektroforez Numune Yükleme 00:30 21 Hız 1 Numune Uygulama 01:00 21 Hız 1* 4 uygulama için Numune Yükleme, Numune Uygulama tekrar edin. Elektroforez 30:00 10 500 Uygulama Reaktifi 21 8 döngü İnkübasyon 35:00 45 Kurutma 03:00 54 * SPIFE 3000 / SAS-3 için pozisyon 1 kullanılır. NOT: SPIFE 3000 / SAS-3 kullanıcıları için: 'Reaktif uygulama' adım çözündürme sonrası, reaktif şişe reaktif bar merkezine konulduğundan dolayı komut 'devam etmek için tuşuna basın' ile programlanmış olmalıdır. Adım Zaman(dk:sn) Sıcaklık(derece) Voltaj Diğer Boyayıcı Boya arındırma 05:00 Dolaşım AÇIK Boya arındırma 05:00 Dolaşım AÇIK Kurutma 17:00 63 2. Aplikatör ucunu cihaz üzerindeki pozisyonuna yerleştirin: 3.Her 30μL numune/kontrol için 10μL ALP Ayırma Yükseltici ekleyin ve iyice karıştırın. Kullanım öncesi 10 dakika boyunca 15...30 C de inkübe edin. 4. i) SPIFE Kombo Kullanıcıları: Numune bazının uygun kuyusu içine 20μl numune pipetleyin. Buharlaşmadan numuneleri koruyun. ii) SPIFE 2000 / 3000 / SAS-3 Kullanıcıları: Tek kullanımlık uygun numune kaplarına 35μl numune pipetleyin. Buharlaşmadan numuneleri koruyun. 5. Jeli paketinden çıkarın ve kaplamasını atın. 6.2ml REP Prep i bölmenin sol tarafına boşaltın ve dikkatlice bölme içine jeli koyun, bölme içinde iğneler ile jel bağlarındaki delikleri hizalayın ve jelin altında kabarcık oluşturmamaya dikkat edin. Elektrot kollarına elektrotlar eklenir böylece jel blokları ile temasa ederler.
7.Jelin yüzeyi kurutma kağıdı C ile kurutulur, kurutma kağıdı alınır. 8.Alkaline fosfataz test programını seçin ve uyarıları izleyin, numuneleri uygulayın, elektroforezi yapın ve jeli inkübe edin. 9.Elektroforez sonlandırılmadan önce yaklaşık 10 dakika 1ml ALP izoenzim substrat ekleyerek 1 şişe ALP Izoenzim kromajeni çözündürün. 30 saniye boyunca vorteksleyin ve bırakın. 10. Elektroforezin ardından: i) SPIFE Combo / 2000 Kullanıcıları: Jelin ortasına doğru ALP içeren şişeyi dökün. Reaktif yaydırıcı kullanarak, jel yüzeyine jeli yayın ve homojen kaplamak için yaydırıcıyı ileri geri iki kez hareket ettirin. ii) SPIFE 3000 / SAS-3 Kullanıcıları: Reaktif dökme çubuğunun yuvasına şişeyi koyun ve devam etmek için tuşa basın. 11.İnkübasyonun ardından, elektrotları alın ve Gel Block Remover kullanarak her iki jelin kurutucusunu alın. 12.Boyama kabı jel tutucusuna jeli koyun. 13.Boyama ünitesinde Alkaline fosfataz test programı seçilir ve izleyen uyarılar, Boyama, Boya arındırma ve jel kurutmadır. 14.Boyama döngüsünün sonunda, boyama alanından jeli alın. Jel şimdi incelenmek için hazırdır. SONUÇLARIN YORUMLANMASI ALP izoenzim paternlerinin yorumlanması hastanın serumunda total ALP düzeyini bilmeden denenmemelidir. Normal bireyler alınan serum karaciğer, kemik ve bağırsak ALP de küçük miktarlarda bulunabilir 6,10,11. ALP düzeyleri yaş ve cinsiyet bağlıdır 12,13. Hamile kadın plasental bir bant gösterilebilir. Neoplazmlerde görülen makrohepatik (hızlı karaciğer) bant toplam ALP düzeyine bakılmaksızın hastalık durumuna bir uyarı olarak yorumlanmalıdır. Bu sistem ile nadiren Nagao, Regan ve PA izoenzimlerinin performansı şu aralar bilinmemektedir. Anormal bantlar normal ALP düzeyli hastalarda rapor edilmiştir. Şekil 1 ana ALP izoenzim bantlarının göç özelliklerini bir şematik olarak gösterir. Karaciğer bandı tüm bantların en anodik olanına göç eder. Yüksek toplam ALPli hastaların karaciğer bandı normal seviye hastalardan daha anodal olana göç edecektir. Toplam ALP düzeyleri yüksek olduğunda karaciğer en sık yükselen
enzimdir 6,10. Karaciğer ALPsi karaciğer hastalığında diğer karaciğer fonksiyon testleri anormallikler göstermeden önce ilk olarak artar. Artan karaciğer ALP neden olan koşullar akut hepatit, siroz, yağlı karaciğer, karaciğer hastalığına indüklenen ilaç, pankreas başında kanser tarafından safra akışının tıkanıklığı, safra kanalı daralması, primer biliyer siroz ve karaciğerin metastatik karsinomu içerir 8. Karaciğer bandının yanında, çalıştırılan sonraki katholdal kemik bandıdır. Kemik izoenzimin yüksek faaliyetleri içeren numunede, kemik bandı normal bir hastadan daha yavaş çalışır. Kemik bandı elektroforetik bantların normal dikdörtgen şekline karşı karakteristik bir kare şekline sahiptir. Kemik izoenzim artan osteoblast bir aktivitenin sonucu olarak artar. Bu izoenzim normalde büyüyen çocuklarda ve 50 yaşın üzerindeki erişkinlerde yükselir. Yüksek toplam ALP değerleri, Paget s hastalığı veya renal raşitizm de artan kemik izoenzime neden olmuştur 14. Anormal yüksek kemik izoenzim düzeyi de kemik kanseri, kemik yumuşaması veya çölyak tropik bir hastalık göstergesi olabilir 8. Çocuklarda azalan bir kemik ALPsi kretinizm veya hipofosfatazya neden olabilir. Kemik bandı kathodal çalışması makrohepatik (hızlı karaciğer) bandıdır. Makrohepatik ALP karaciğerde metastatik karsinom vakasında izole edilmiştir ve bu gibi durumlarda tanımlanan bir teşhis aracı olarak önerilmektedir. Ayrıca, viral hepatit, alkolik siroz ve diğer karaciğer hastalıklı hastalarda izole edilmiştir. Viot tarafından oluşturulan veri göstermektedir ki makrohepatik ALP yüksek olarak karaciğer metastazı varlığı ile ilişkilidir ve bu izoenzimin varlığı karaciğer metastazın varlığını tahmin edebilir. Viot de rapor edilen makrohepatik ALP hastalarda herhangi bir hastalık durumunda zaman zaman serbest olarak görünür 15. Bağırsak ALP izoenzim bant(ları) makrohepatik için kathodu çalıştırır. En fazla üç bandın görünümü aç olmayan hastalardan alınan numunelerde daha yaygındır. 1.Kalitatif Değerlendirme: Jeller ilgili belirli bantların yokluğunun veya varlığını görsel olarak kontrol edebilir. 2.Kantitatif Değerlendirme: 2 saat içinde SPIFE ALP izoenzim jellerini (jel yüzü aşağı) tarayın. Her iki durumda da belirli serum bileşenleri veya olağandışı serum bileşenlerinin tespitinde bir artış veya düşüş araştırma gerektirir. Tamamlanmış SAS-3 ALP izoenzim jeli karanlıkta artan arka plan renklenmesini önlemek için saklanmalıdır. KALİTE KONTROL Alkalin fosfataz İzoenzim Kontrol (Kat. No.3059) karaciğer ve kemik izoenzimlerin normal düzeylerini içerir ve prosedürün bütün fazlarını doğrulamak için kullanılabilir ve her plate çalışmasında kullanılmalıdır. Kabul edilebilir test değerleri için ek paketlere bakın. SINIRLAMALAR Regan, Nagao ve PA gibi ALP izoenzimin tanımlanması ısı inaktivasyonu 16, amino asit inhibasyonu 17-19, üre denaturasyonu 17,18 veya poliakrilamid jellerde ayırma 20,21 gibi ek test protokollerin kullanımını gerektirir.
Hassasiyet Yöntem, tamamlanmış jel üzerinde ayrık bir bant gibi görünen ALP izoenzimin en düşük konsantrasyonu olarak belirlendi ve bant başına 8U/L için hassasiyete sahiptir. Doğrusallık Metodun doğrusallığı, jel performansı gibi densitometre özelliğinin bir fonksiyonudur. Laboratuarda kullanılan densitometreye dayalı metodun doğrusallığının belirlenmesi her müşteriye tavsiye edilir. REFERANS DEĞERLERİ Jellerin değerlendirmesi her bir laboratuarda bu test için üretilen normal değerlere karşı yapılmalıdır. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Tekrarlanabilirlik BİBLİYOGRAFİ 1. Fishman, W.H. Am. J. Med., 1974; 56 : 617-650. 2. Moss, D.W. and Edwards, R.K. Clin. Chim. Acta, 1984; 143 : 177-182. 3. Moss, D.W. et al. Biochem. J., 1966; 98 : 32C-33C. 4. Young, D.S. et al., Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests, 3rd Ed., AACC Press, Washington D.C., 1990. 5. Sundblad, L. et al Clin. Chim. Acta, 1973; 45 : 219-223. 6. Rhone, D.P. et al., Clin. Chem., 1973; 19(10) : 1142-1147. 7. Massion, C.G. and Frankenfeld, J.K., Clin. Chem., 1972; 18(4) : 366-373. 8. Wolf, P.L., Arch. Pathol. Lab. Med., 1978; 102 : 497-501. 9. Ahmad, I., Clin. Chem., 1978; 24(10) : 1850-1851. 10. Fritsche, H.A. and Adams-Park, H.R., Clin. Chem., 1972; 18(5) : 417-421. 11. Lee, L.M. and Kenny, M.A., Clin. Chem., 1975; 21(8) : 1128-1135. 12. Eastman, J.R. and Bixler, D., Clin. Chem., 1977; 23(9) : 1769-1770. 13. Cherian, A.G. and Hill, J.G., Am. J. Clin. Pathol., 1978; 70(5) : 783-789. 14. Nerenburg, S.T. Medical Technology, Lea and Febiger Inc., Philadelphia, 122-123, 1973. 15. Viot, M. et al., Biomedicine, 1979; 31 : 74-77. 16. Posen, S. et al., Ann. Int. Med., 1965; 62(6) : 1234-1243. 17. Stepan, J. and Vecerek, B., Acta Univ. Carol., 1977; Mono 77 : 135-140. 18. O Carroll, D. et al., Am. J. Clin. Pathol., 1975; 63 : 564-572. 19. Rhone, D.P. and Mizuno, F.M., Am. J. Clin. Pathol., 1973; 59 : 531-541. 20. Johnson, R.B. et al., Clin. Chem., 1972; 18(2) : 110-115. 21. Rosalki, S.B. and Foo, A.Y., Clin. Chem., 1985; 31(7) : 1198-2000.