TÜRKHAYGEN-1 PROJESİ İN VİTRO KOYUN EMBRİYO ÜRETİMİ KURS KİTAPÇIĞI PROTOKOLLER MEDYUMLAR, YÖNTEMLER HAZIRLAYANLAR: Prof.Dr.Serhat Pabuccuoğlu Prof.Dr.Sema Birler 16-20 Temmuz 2007 İstanbul Üniversitesi, Veteriner Fakültesi Dölerme ve Suni Tohumlama Anabilim Dalı Avcılar İstanbul
A. KULLANILAN MALZEME, STOK SOLÜSYON VE MEDYUMLAR 1. Kullanılacak Cam ve Diğer Malzemelerin Özellikleri ve Hazırlanışı: Medyum hazırlamada kullanılacak olan cam malzemelerin tamamı doku kültürüne uygun bir deterjanla özelliklerine uygun olarak temizlenmeli, distile su ile en az üç kez (7X temizleyici ile yıkama yapılıyor ise en az 7 defa) durulanmalı ve 24 saat 180 C da kurutulmalıdır. Bazı otoklavlanabilir cam malzemelerin kapak kısımlarında plastik conta olabilir (örn. Schott marka şişeler). Bu şişelerin kurutma ve sterilizasyonlarında plastik aksam zarar görebileceğinden 140 C ısıyı geçmemek gerekir. Medyumların stoklanmasında steril plastik tek kullanımlık doku kültür kalite tüpler kullanılmalıdır. Medyumların ve bazı stok solüsyonların hazırlanmasında taze Milli-Q su (RO dan geçirildikten sonra organik karbon ve iyonlarından arındırmak amacıyla iyon değiştirici, 0,22 µm por çaplı, vb. filtrelerden geçirilmiş su elektrik direnci >18 MΩ olmalıdır) kullanılmalıdır. Oosit ve embriyo kültüründe kullanılacak olan solüsyonların hazırlanmasında DOKU KÜLTÜR KALİTE veya en iyisi EMBRİYODA TEST EDİLMİŞ SU kullanılmalıdır. 2. Stok Solüsyonlar ve Medyumlar: BU PROTOKOLÜN TAMAMI M.C. GOMEZ DEN ALINMIŞTIR. (Gómez MC, Catt JW, Evans G, Maxwell WM.: Cleavage, development and competence of sheep embryos fertilized by intracytoplasmic sperm injection and in vitro fertilization. Theriogenology. 1998, 49(6):1143-54.) Çalışmalar sırasında kullanılacak olan stok solüsyonlar aşağıda listelenmiştir: 2.1. Stok Solüsyonlar: 2.1.1. 199 stok (10x) M-199 (toz) 1 L ambalaj Milli-Q su son hacim 100 ml M-199 toz suda eritilir ve filtre edilerek sterilize edilir (0.22 µm). 4 o C sıcaklıktaki buzdolabında 2 aya kadar saklanıp kullanılabilir. Bu stokların içinden ihtiyacınız olan miktarları alırken steriliteyi korumak amacıyla maksimum dikkat göstermek gerekir. Fark edilemeyen kontaminasyonlar toksik etkilere neden olacaktır. 2.1.2. Bikarbonat stok (B): NaHCO3 Doku kültür kalite su son hacim Phenol red 1.05 g 50 ml 0.5% (W/V) Solüsyon 0.22 µm filtreden geçirilerek sterilize edilir ve 4 o C sıcaklıktaki buzdolabında 2 hafta saklanarak kullanılabilir. 1
2.1.3. Hepes stok (H): Na Hepes Hepes (free acid) Milli-Q su son hacim Phenol red 6.508 g 6.0 g 200 ml 0.5% (W/V) Solüsyon 0.22 µm filtreden geçirilerek sterilize edilir ve 4 o C sıcaklıktaki buzdolabında 2 ay saklanarak kullanılabilir. 2.1.4. Tuz karışımı stok (S2): NaCl 6.294 g KCl 0.534 g NaH2PO4 0.054 g Doku kültür kalite su son hacim 100 ml Solüsyon 0.22 µm filtreden geçirilerek sterilize edilir ve 4 o C sıcaklıktaki buzdolabında 3 ay saklanarak kullanılabilir. 2.1.5. Laktat stok (L): Na lactate 2.35 ml Doku kültür kalite su son hacim 50 ml Solüsyon 0.22 µm filtreden geçirilerek sterilize edilir ve 4 o C sıcaklıktaki buzdolabında 2 ay saklanarak kullanılabilir. 2.1.6. Glukoz stok (G): Glucose 540 mg Doku kültür kalite su son hacim 50 ml Solüsyon 0.22 µm filtreden geçirilerek sterilize edilir ve 4 o C sıcaklıktaki buzdolabında 2 ay saklanarak kullanılabilir. 2.1.7. Kalsiyum stok (C): CaCl2.2H2O 630 mg Doku kültür kalite su son hacim 25 ml Solüsyon 0.22 µm filtreden geçirilerek sterilize edilir ve 4 o C sıcaklıktaki buzdolabında 2 ay saklanarak kullanılabilir. 2.1.8. Magnezyum stok (M): MgCl2.6H2O 250 mg Doku kültür kalite su son hacim 25 ml Solüsyon 0.22 µm filtreden geçirilerek sterilize edilir ve 4 o C sıcaklıktaki buzdolabında 3 ay saklanarak kullanılabilir. 2
2.1.9. Antibiyotik stok (PS): Penicilin 375 mg Streptomycin 250 mg PBS 50 ml Solüsyon 0.22 µm filtreden geçirilerek sterilize edilir, eppendorf tüplerine 500 µl lik hacimlerde porsiyonlanır ve -20 o C sıcaklıktaki derin dondurucuda kullanılıncaya kadar saklanır. 2.2. Medyumlar: 2.2.1. Ovaryum transport ve yıkama medyumu: Phosphate-buffered saline (PBS): NaCl 40 g (137 mm) KCl 1 g ( 2.7 mm) KH2PO4 1 g ( 1.5 mm) Na2HPO4 10.8 g ( 8.1 mm) Kimyasallar Milli-Q suda eritilir ve 5 L hacme tamamlanır. Osmotik basınç yaklaşık 280 mosmol/kg., ph sı da yaklaşık 7,2 7,4 arasında olmalıdır. PBS 1 L lik porsiyonlar halinde Schott şişelerine paylaştırılır ve 121 o C ısıda 20 dakika otoklavlanır. Osmotik basınç yaklaşık 280 280 mosmol/kg olmalıdır. Hazırlanmış olan bu PBS çözeltisine otoklavlama sonrası solüsyonlar soğuduktan sonra aşağıda belirtilen antibiyotik karışımı ilave edilmelidir. PBS için Antibiyotik karışımı: Her 5 L PBS için: Penicillin Streptomycin Neomycin Milli-Q su son hacim 1.5 g (250 IU/mL) 1.25 g (125?g/mL) 1.25 g (125?g/mL) 50 ml Antibiyotiği katılmış olan PBS şişeleri +4 o C sıcaklıktaki buzdolabında 3 ay saklanarak kullanılabilir. Kullanmadan önce ılıtılması gerekir. 2.2.2. Oosit Yıkama medyumu: Hepes buffered medyum (H-199+): 199 (10x) stok 25 ml H stok 21 ml (10.5mM Na Hepes; 10.5mM Hepes) B stok 4 ml (4 mm) Kanamycin 19 mg (75 µg/ml) Heparin 2.5 mg (10 µg/ml) Milli-Q su son hacim 250 ml Bütün solüsyon ve kimyasallar Milli-Q su içinde çözülür. Hazırlanan solüsyon 0.22 µm filtreden geçirilerek sterilize edilir ve +4 o C sıcaklıktaki buzdolabında 3 ay saklanarak kullanılabilir. Oosit toplama işleminde petriler için kullanılacak olan solüsyon aşağıdaki gibi hazırlanır. H-199 solüsyonu FBS (heat inactivated) 2 ml (10%; v/v) PS stok 200 µl 3
Hazırlanan solüsyonun ph sı 1.0 N NaOH ve 1.0 N HCl kullanılarak 7.2-7.4 e ayarlanmalıdır, osmotik basıncı da 283±10 mosmol/kg olmalıdır. 0.22 µm filtreden geçirilerek sterilize edilir, kullanılmadan önce 37 o C sıcaklığa ısıtılır. 2.2.3. In vitro olgunlaştırma medyumu (IVM+H): M-199 (liquid) 9 ml Na pyruvate 1 mg (0.3 mm) FSH 10 µg/ml LH 10 µg/ml FBS (heat inactivated) 1 ml (10%; v/v) (Tercihen %20 oranında koyun östrus serumu katılabilir) Na pyruvate sıvı M-199 içinde eritilir ve arkasından diğer maddeler eklenir. Solüsyonun ph ı normal atmosfer koşullarında 7.9 a ayarlanır (CO 2 inkübatöründe inkübe edildikten sonra 7.4 olacaktır), osmotik basıncı ise 283±10 mosmol/kg olmalıdır. Final solüsyon 0.22 µm filtreden (FSH ve LH varlığı nedeniyle tercihen düşük protein tutma özelliği olan filtreler kullanılmalıdır) geçirilerek sterilize edilir. Solüsyon her uygulamada günlük taze olarak hazırlanır, uygulamadan, yani oositler içine koyulmadan en az 6 saat önce hazırlanıp petriler %5 CO 2 koşullarındaki etüvde inkübe edilmelidir. 2.2.4. Sperms Yıkama Medyumları (HSOF ve Percoll-SOF): Medyumlar SOF temellidir ve Tervit et ark. (1972) dan modifiye edilmiştir. HSOF Percoll-SOF S2 stok 25 ml S2 stok 5.0 ml H stok 21 ml Na Hepes 137 mg B stok 4 ml Hepes (free acid) 126 mg D stok 2.5 ml D stok 0.5 ml M stok 2.5 ml M stok 0.5 ml L stok 2.5 ml Percoll 50 ml G stok 10 ml Phenol red 0.5% (katılması PS stok 2.5 ml zorunlu değil ) Na pyruvate 9 mg Glutamine 36.5 mg BSA (fraction V) 750 mg Kanamycin 19 mg Milli-Q su son hacim 250 ml Final her iki solüsyonun ph sı 7.2-7.4, HSOF un osmotik basıncı 283±10 mosmol/kg Percoll-SOF un ise 280-300 mosmol/kg olmalıdır. Küçük sapmalar su veya S2 solusyonundan yararlanılarak ayarlanmalıdır. Osmotik basınçta büyük sapmalar var ise solüsyonlar yeniden hazırlanmalıdır. HSOF 0.22 µm filtreden geçirilerek sterilize edilirken Percoll-SOF filtre edilmez. Solüsyonların +4 o C sıcaklıktaki buzdolabında 1 ay saklanarak 4
kullanılabileceği belirtilmiş olsa da Percoll-SOF un her uygulamadan önce taze hazırlanmasında yarar olabilir. 2.2.5. In vitro fertilizasyon and Kültür medyumları (BSOF ve SOF): Fertilizasyon (BSOF) ve embriyo kültür (SOF) medyumları SOF temelli medyumlardır ve Tervit et ark. (1972) dan modifiye edilmiştir. BSOF SOF S2 stok 5 ml S2 stok 5 ml B stok 5 ml B stok 5 ml D stok 1 ml D stok 0.5 ml M stok 0.5 ml M stok 0.5 ml L stok 1.5 ml L stok 0.5 ml Na pyruvate 5.4 mg Na pyruvate 1.8 mg Glutamine 7.3 mg Glutamine 2.3 mg PS stok 0.5 ml PS stok 0.5 ml Kanamycin 4 mg Kanamycin 4 mg Phenol red 1 drop Phenol red %0.2 (w/v) DokuKültürKalite su son hacim50 ml BSA (fatty acid free) 200 mg MEM-aa 1 ml MEM-non ess aa 0.5 ml DokuKültürKalite su son hacim50 ml Medyumların osmotik basınçları kontrol edilmeli ve 283±10 mosmol/kg a ayarlanmalıdır. Her iki medyumun ph sı 7,9 a ayarlanmalıdır. Medyumların ph ve osmotik basınç ayarları yapıldıktan sonra 0.22 µm filtreden geçirilerek sterilize edilip +4 o C sıcaklıktaki buzdolabında 1 hafta kullanılıncaya kadar saklanabilir. Her hafta taze olarak hazırlanmalıdır. Fertilizasyon medyumuna (BSOF) %2 oranında (v/v) koyun serumu ilave edilmelidir. Gametler ve embriyolar medyumların içine koyulmadan %5 CO 2, %5 O 2 ve %90 N 2 gaz karışımlı ortamda ph nın dengelenmesi ve gaz kompozisyonu dengeleninceye kadar önceden ekülibre edilmiş olmaldır. 2.2.6. Koyun serumunun hazırlanması [Sheep serum (SS)] : Koyunlarda ovulasyonları oluşturmak için progesteron emdirilmiş olan vaginal süngerler 14 gün boyunca vagenleri içinde tutulur. Süngerlerin çıkarılma günü ovulasyon cevabını artırmak amacıyla tek doz olarak 400 IU PMSG kas içi yolla enjekte edilir. Süngerlerin çıkarılışından 72 saat sonra vena jugularisten 17 goujluk adaptör kullanılarak kanlar soğutulmuş santrifüj tüplerine toplanır. Toplanan kanlar hemen 5 dakika 100 G kuvvetinde santrifüje edilirler. Plazma ayrılır ve 37 o C da 1 saat yoğun pıhtı oluşuncaya kadar inkübe edilir. Oluşan pıhtı serumundan ayrılır ve kazanılan serumlar inaktive olmaları için 56 o C da 30 dakika bekletilir. İnaktivasyon sonrası elde edilmiş olan serumlar 0.22 µm filtreden geçirilerek sterilize edilip 1 ml hacimlerde porsiyonlanır. Kullanılıncaya kadar -20 o C lık derin dondurucuda saklanır. 5
3. Kullanılan bazı malzemelerin marka ve katalog numaraları Çalışmalarda kullanılacak olan tüm kimyasal ve plastik ürünler mümkünse embriyoda test edilmiş olmalı, bu mümkün değilse mutlaka doku kültüründe test edilmiş olmalıdır. Malzemenin Adı Firma/Marka Katalog numarası Follicle Stimulating Hormone (FSH) From Ovine Pituitaries Sigma F 8174 Luteinizing hormone from ovine pituitaries Sigma L 5269 Fötal Calf Serum 500 ml Sigma F 9665 Bovine Serum Albumin Fraction V Fatty Acid Free 5 g Sigma A8806 Bovine Serum Albumin Fraction V 50 g Sigma A 3311 Medium 199 powder Sigma M 5017 Medium 199 liquid 100 ml Sigma M 2154 MEM Aminoacid Solution(50x) 100 ml Sigma M 5550 MEM Non Essential Aminoacid Solution(100x) 100 ml Sigma M 7145 Hyaluronidase 30 mg Sigma H 4272 Heparin Sigma H 3149 Di-Sodium Hydrogen Phosphate (Na2HPO4) 500 g Sigma S5136 Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4.2H 2 O) Fluka 71645 Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4) 100 g Sigma P5655 Sodyum Klorür (NaCl) 500 g Sigma S5886 KCl cell culture tested Sigma P5405 NaH2PO4 anhidrous Sigma S5011 Glucose Anhydrous 100 g Sigma G 6152 Sodium Lactat syrup %60 (w/w) embryo tested Sigma L7900 Embryo Tested Water 500ml Sigma W 1503 Percoll 500 ml Sigma P 1644 Mineral Oil Embryo Tested 1lt Sigma M 8410 Gentamicin Sülfate 50 mg Sigma G 1264 Kanamycin Monosulfate Sigma K 1377 Streptomycin Sülfate 50 g Sigma S1277 Penicilin G 10.000.000 units Sigma P4687 Penicillin -Streptomycin Solution(100 x ) 100 ml Sigma P 0781 Neomycin Sulfat Sigma N 6386 35 mm T.C. Petri Dish Greiner 627160 60 mm T.C. Petri Dish Greiner 628160 4 weel Plate Nunc 176740 Santrifüj tüp 15 ml steril T.C. kalite Greiner 188271 Santrifüj tüp 50 ml steril T.C. kalite Greiner 210261 Cryo tüp 2 ml Mavi kapak Greiner 121273 Eppendorf tüp 2,2 ml Greiner 623201 Mavi pipet ucu Greiner 686290 Sarı Pipet Ucu Greiner 685290 Enjektör Ucu Filtre low Protein Binding Millipore GPWP04700 Calium Chloride dihydrate cell culture tested Sigma C7902 MgCl2.6H2O Sigma M2393 Na- HEPES cell culture tested Sigma H3784 Na-Pyruvat Sigma P4562 Hepes (free acid) (Embryo tested) Sigma H6147 6
B. KOYUN EMBRİYOLARININ İN VİTRO ÜRETİMİ METODU: 1. Oositlerin kazanılması: Mezbahada kesilen ergin koyunların veya puberta dönemi şişeklerin ovaryumları önceden 25-30 o C sıcaklığa ısıtılmış PBS bulunan termoslarda laboratuara getirilir. Transport süresi mümkün olduğunca 2 saati geçmemelidir. Ovaryumlar çevrelerindeki fazla doku ve yağlardan arındırılır ve üç kez 37 o C deki PBS den geçirilir. İşleninceye kadar ısıtılmış PBS içinde bekletilir. Oositler; 2-8 mm çaplı antral follikülerin sıvısı 21-g uçlu 1 ml lik enjektör kullanılarak aspire edilmesi ile kazanılır. Aspire edilen oositlerin bulunduğu follikül sıvıları 6 cm plastik petri kutuları içindeki önceden ısıtılmış 2 ml hacimdeki oosit yıkama medyumu üzerine dökülür. Oositler (cumulus-oocyte complexes (COCs)) bulundukları bu sıvı karışımı içinden stereo mikroskoptan yararlanılarak ayrılır ve bir başka 3 cm çaplı petri içinde önceden ısıtılmış 2 ml oosit yıkama medyumu içine aktarılır. Aspirasyonla koyun ovaryumlarından oosit kazanılması uygulamada ovaryumların küçük olmasından dolayı güçlükler arz etmektedir. Bu teknik yerine ovaryum yüzeyinde görülen folliküllerin bir bistüri yardımıyla kesilmesi ve insülin iğnesi takılmış 20 ml lik enjektörlerdeki oosit yıkama medyumu kullanılarak, kesilen bölgelerin bir saat camı içine yıkanması kullanılabilir. Kazanılan sıvının stereo mikroskopta incelenmesi ile oositlerin ayrılması hem sayıyı artırmakta hem de uygulamada kolaylık sağlamaktadır. 2. Oositlerin in vitro olgunlaştırılması: Her iki yöntemde elde edilen oositler (COCs) stereo mikroskopta incelenerek en az 3-4 sıra kumulus hücresi tarafından sıkı bir şekilde sarılmış, uygun çapta ve vitellusları homojen görünen (vakuol, yer yer yoğunlaşma v.b. farklılıklar olmayanlar) oositler olgunlaşma için uygun olarak değerlendirilir (Resim 1). Seçilen bu oositler üç kez oosit yıkama medyumundan geçirildikten sonra bir kez de olgunlaşma medyumundan (IVM+H) geçirilerek iyice yıkanır. Olgunlaşma medyumundan geçirildikten sonra daha önceden hazırlanmış ve inkübe edilmiş olan 4 kuyucuklu olgunlaşma petrileri içine, üzeri mineral yağ ile örtülü her bir kuyuda bulunan 500 µl medyum içine 40-50 oosit aktarılır. Eğer 4 kuyucuklu petriler kullanılmayacaksa 6 cm çaplı petrilere üzeri mineral yağ ile örtülmüş 50 µl lik damlalar hazırlanır ve önceden inkübe edilir. Bu damlalar içine 10-15 oosit koyularak inkübasyona alınır. Oositlerin GV aşamasından MII aşamasına gelebilmesi için 19-24 saat 39 o C sıcaklıkta neme doyurulmuş %5 CO 2 li atmosferde inkübe edilmeleri gerekir. Koyunların kesilmesinden inkübasyonun başlanmasına kadar geçecek zaman ortalama olarak 3-5 saat arasında olmalıdır. Resim 1: İn vitro olgunlaşma için seçilmiş kumuluslarla çevrili oositler Vitellus içinde homojen olmayan görüntüler Pabuccoğlu ve ark. 7
Resim 2: Olgunlaşma sonrası oositlerin görünümü, kumulus ekspansiyonu Pabuccoğlu ve ark. Resim 3: Kumulus ekspansiyonu ve kumulus arasına hiyaluronik asit depolanması Pabuccoğlu ve ark. 3. Spermanın fertilizasyon için yıkanması, hazırlanması ve fertilizasyon: Spermalar 3-4 koçtan suni vagen veya alınamıyorsa elektro-ejakulatör aracılığı ile alınır. Sadece iyi motilite görülen spermalar kullanılır. Spermalar taze olarak kullanılabileceği gibi 1:4 oranında (V/V) tris-egg yolk gliserol sulandırıcısı ile sulandırılıp pellet yöntemine göre dondurulup saklanabilir. Taze spermalar oda ısısına getirilir ve 1:20 (sperma:medyum) oranında hepes tamponlu sentetik ovidukt sıvısı ile (HSOF) sulandırılır. Hiperaktif spermatozoonları ayrıştırmak amacıyla kullanılacak olan percoll gradient tekniği için 1 ml eppendorf tüpü (mini-percoll; Ord et al., 1990) veya 10 ml deney tüpü (large-percoll) hazırlanır. Percoll-SOF gradients %90 ve %45 lik olmak üzere iki tabaka halinde tüplere yerleştirilir. Large-Percoll tekniği için 2 ml 1:1 oranında karıştırılmış Percoll-SOF ve HSOF (%45 lik percoll-sof) konik dipli 10 ml lik santrifüj tüpü içinde bulunan 2 ml hacimdeki %90 lık Percoll-SOF üzerine dikkatlice iki solusyon karışmayacak şekilde tabakalandırılarak koyulur. Mini-Percoll için 400 µl %45 lik Percoll-SOF 1 ml eppendorf içine 400 µl %90 lık Percoll-SOF üzerine tabakalandırılarak dikkatlice karıştırılmadan koyulur. (mini-percoll; Ord et al., 1990) (mini percoll için koyulur). Large percoll tekniği için 200 µl, mini percoll tekniği için de 100 µl sulandırılmış taze sperma veya dondurulmuş sperma %45 lik percoll solüsyonunun üstüne tabakalandırılarak koyulur. Sperma koyulduktan sonra hazırlanmış olan tüpler large-percoll tekniğinde 1500 g santrifüj gücünde 15 dakika, mini-percoll tekniğinde ise 3000 g santrifüj gücünde 2 dakika santrifüje edilir. Santrifüj işleminden sonra üstteki percoll tabakaları dikkatli bir şekilde alınıp atılır. Tüpün dip 8
kısmında spermatozoonlar tarafından oluşturulan pellet tekrar large percoll tekniğinde 3 ml, mini percoll tekniğinde 1 ml HSOF ile sulandırılır ve large percoll tekniğinde 600 g snatrifüj gücünde 6 dakika, mini percoll tekniğinde 300 g santrifüj gücünde 1 dakika santrifüje edilir. Üstteki süpernatant alınarak atılır. Tüpte geriye kalan spermatozoonları içeren pellet (yaklaşık 100 µl) üzerine 50 µl HSOF eklenir ve oda ısısında biraz bekletilerek pelletin dağılması sağlanır. Sperma süspansiyonundan örnek alınır ve spermatozoon sayısı belirlenir. 4. Oositlerin İn vitro fertilizasyonu: İn vitro olgunlaşmayı takiben genişlemiş kumulusa sahip olan oositler olgunlaşma ortamından alınır ve kumulus hücreleri ve korona hücreleri H-199 içinde veya hyaluronidaz enzimi (300 IU of hyaluronidaz/ml) bulunan PBS içinde 3-5 dakika hafifçe pipetlenerek uzaklaştırılır. Oositler kumulus hücreleri uzaklaştırıldıktan sonra H-199 içinde iki kez pasajlanır ve arkasından %2 sheep serum (SS) destekli bikarbonat tamponlu sentetik ovidukt sıvısı içinde (BSOF) bir kez yıkanır. Temizlenmiş olan oositler üzeri 400 µl mineral yağ ile örtülmüş 500 µl BSOF + SS içeren 4 kuyucuklu petrinin kuyucuklarına aktarılır. Her bir kuyucuk içine 30-50 oosit koyulmalıdır. Fertilizasyon petrilerine aktarılmış olan oositler percoll gradient tekniği ile elde edilmiş olan sperma ile fertilize edilir. Fertilizasyon ortamına spermatozoonlar final konsantrasyonu 0.6-1 x 10 6 sperm/ml olacak şekilde ayarlanmalıdır. Fertilizasyon süreci neme doyurulmuş % 5CO 2 li atmosferde ve 39 o Cısıda 19-21 saat süre ile gerçekleştirilir. 5. Oositlerin in vitro kültürü: BSOF + SS ortamında 19-21 saat sürdürülen in vitro fertilizasyon işleminden sonra zigot olarak varsayılan hücreler iki kez HSOF içinde yıkandıktan sonra bir kez de SOF içinden geçirilir. Önceden hazırlanmış ve inkübe edilmiş dört kuyucuklu petrilerin her bir bölmesi içine 400 µl mineral yağ ile örtülmüş 500 µl SOF bulunmalıdır. Fertilizasyon ortamından alınıp yıkanarak üzerindeki spermatozoonlardan arındırılmış olan olası zigotlar önceden 39 o C sıcaklıktaki neme doyurulmuş düşük oksijen ortamında (%5 CO 2, %5 O 2, %90 N 2 ) ekilibre edilmiş petriler içine alınır. Her bir kuyucuk içine 30-50 hücre koyulmalıdır. Eğer laboratuarda oksijen kontrollu inkübatör yok ise önceden ısıtılmış 2 L cam desikatör kullanılarak bahsedilen gaz karışımı ile gazlama yapılır. Gazlama sırasında gaz öncelikle 100 ml Milli-Q su içinden baloncuk çıkaracak şekilde geçirilmelidir. Bu sayede gaz desikatöre girmeden önce neme doymuş olacaktır. Desikatörün her açılışından sonra tekrar gazlanması gerekir. İnkübasyonun dördüncü gününde her bir kuyucuğa 12 µl (1.5 mm) glukoz stok eklenmelidir. Blastosist gelişimleri kültürün 6 ile 10 günleri arasında takip edilir. 9
Resim 4: 8 Blastomer Ve Morula Aşamasına Gelişen Embriyolar Resim 7: Kültürün 8. Günü Zonadan Çıkmış (Hatched) Bir Blastosist ve Boş Zona Birler ve ark. Turk J Vet Anim Sci 26 (2002) 891-894 Pabuccoğlu ve ark. Resim 5: İn vitro kültürde blastosist aşamasına gelmiş embriyo Birler ve ark. Turk J Vet Anim Sci 26 (2002) 891-894 Resim 8: kültürün 8. günü hatching(zonadan çıkan) blastosist aşamasına gelişen ve gelişimlerinin farklı aşamalarında kalmış embriyolar Birler ve ark. Turk J Vet Anim Sci 26 (2002) 1421-1426 d a d Resim 6: Kültürün 8. Günü Hatching(zonadan çıkan) Blastosist Aşamasına Gelişen Bir Embriyo Birler ve ark. Turk J Vet Anim Sci 26 (2002) 1421-1426 a b 2 c b 1 d b 1 c a-hatching blastosist; b 1 - sağlıklı ancak gelişiminin iki blastomerli aşamasında kalmış; b 2 - iki blastomerli aşamadan fragmente olmuş; c- 8-16 blastomerli; d- kompaktlaşmaya başlamış morula 10
Resim 9: Kültürün 8. günü ekspanded blastosist aşamasına gelişen ve gelişimlerinin farklı aşamalarında kalmış embriyolar Birler ve ark. Turk J Vet Anim Sci. 26 (2002) 1421-1426 a b a- ekspanded blastosist, ok işareti iç hücre yığını; b- kısmen dejenere fragmente hücreler içeren sağlıklı hücreleri ile blastosist formasyonu gelişmiş ancak kollabe olmuş bir blastosist, ok işareti perivitellin boşlukta yer alan fragmente dejenere hücre döküntüleri. 11
YAYINLARIMIZ A ULUSLARARASI DERGİLERDE YAYINLANAN MAKALELER Evecen, M., Özdaş, Ö.,B., Bacınoğlu, S., Birler, S., Pabuccuoğlu S., B.E. Şahin, Atalla H.,.: In Vitro Fertilization of Virtified Mouse Oocytes. Indian Vet J, (2007) 84:156-158 Muzaffer Taş, Mithat Evecen, Özen Banu Özdaş, Ümüt Cirit, Kamber Demir, Sema Birler and Serhat Pabuccuoğlu: Effect of transport and storage temperature of ovaries on in vitro maturation of bitch oocytes. Animal Reproduction Science, 96: 30 34, 2006 Özdas Ö. B., Pabuccuoglu S., Ileri I. K. Effects of monopotassium phosphate and oviduct cells on the development of mice embryos fertilized in vitro. Medycyna Weterynaryjna vol. 62 (3): 281-284, 2006 (İlk yazarın Doktora Özeti) Çörekçi, Ş., Yılmaz, A., Birler, S., Pabuccuoğlu, S., Atalla, H.: A comparative study on the growth and survival characteristics of lambs produced by the transfer of in vitro produced (IVP) embryos. Turk. J. Vet.Anim.Sci, 28 (5) : 831-835, 2004 Evecen M., Özdaş, Ö.,B., Pabuccuoğlu S., Birler, S.,Tek Ç., İleri,İ.K.: The Effects Reproductive Status of Queens on In Vitro Maturation of Cat Oocytes. Indian Veterinary Journal 81: 1005-1009, 2004 Evecen, M., Pabuccuoğlu, S., Alkan S, İleri, İ.K.: The Effects of Various BSA Levels On Development in In Vitro Culture of Mouse Embryos Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences, 28: 337-342. 2004 (İlk yazarın Doktora Özeti) Birler, S., Pabuccuoğlu, S., Atalla, H., Alkan, S., Ozdas, O.B., Bacınoğlu, S., Cirit, Ü., Zavar, İ., Sönmez, M.E.C., İleri, I.K.: İn vitro üretilen koyun embriyolarının transferi. Türk. Vet. ve Hayv. Derg., 26: 1421-1426, 2002 Birler, S., Pabuccuoğlu, S., Alkan, S., Ozdas, O.B., Atalla, H., Ileri, I.K.: İn vitro fertilizasyonla elde edilen koyun embriyolarının blastosist dönemine kadar geliştirilmesi. Türk. Vet. ve Hayv. Derg., 26: 891-894, 2002 Birler, S., Pabuccuoğlu, S., Alkan, S., Ozdas, O.B., Atalla, H., Ileri, I.K.: İn vitro fertilizasyonla elde edilen koyun embriyolarının blastosist dönemine kadar geliştirilmesi. Turk. Vet. ve Hayv. Derg. 26: 891-894, 2002 Birler, S., Pabuccuoglu, S., Alkan, S., Ak, K., Evecen, M., Ileri, I.K.: Effects of Different Maturation and Culture Media on IVF of Sheep Oocytes. Pakistan Vet.J., 21 (2): 100-102, 2001 Birler, S., Pabuccuoğlu, S., Alkan, S., Evecen, M., İleri, İ.K.: İn-Vitro Fertilize Edilen Sığır Oositlerindeki Pronüklear Gelişim Üzerine Olgunlaştırma ve Fertilizasyon Sürelerinin Etkisi. Türk Vet. ve Hayv. Derg. 22 (1): 1-15., 1998 Birler, S., Pabuccuoğlu, S., İleri, İ.K., Alkan, S., Evecen, M.: Sığır Ositlerinin İn-Vitro Olgunlaştırılmasında Farklı Sürelerin Etkisi. Türk Vet. ve Hayv. Derg. 22 (6): 551-557, 1998 Alkan, S., Pabuccuoğlu, S., İleri, İ.K.: Horoz Spermasının +5 o C'de Saklanmasında İki Farklı Sulandırıcının Etkileri. Türk Vet. ve Hayv. Derg. 21 (1): 91-97, 1997 12
Bağış, H., Pabuccuoğlu, S.: Studies on the production of transgenic mice. Turk. J. Vet. Anim. Sci.. 21: 287-292, 1996 Pabuccuoğlu, S., İleri, İ.K.: PMSG'nin İki Farklı Uygulaması İle Kazanılan Tavşan Embriolarının Değişik Vasatlarda İnvitro Kültürleri ve Transferleri. TÜBİTAK, Doğa Türk Vet. ve Hayv.Derg.,18 (2): 53-58, 1994 (Doktora Çalışması Özeti) Ahmad, M., Ozkoca, A., Ileri, I.K., Pabuccuoglu, S. Usta, S.: Effect of Variable Concentration of Bovine Serum on Rabbit Embryo Development. Pakistan Vet.J., 12 (4), 186 189, 1992 B- ULUSLARARASI KONGRE BİLDİRİLERİ 1- SÖZLÜ BİLDİRİLER Özdaş Ö.B., Cirit U., Taş M., Demir K., Bacınoğlu, S., Evecen M., Pabuccuoğlu, S., Ak K., İleri, İ.K. Effect of different transport temperatures (+4 o C, +32 o C) on in vitro maturation of oocytes collected from frozen thawed sheep ovaries. 5th Joint Scientific Symposium of Veterinary Faculties of Ludwig Maximilians University and Istanbul University 2006. 5-6 October 2006, İstanbul-Türkiye, p. 76 Birler, S., Pabuccuoğlu, S., İleri, İ.K: New Reproductive Technologies in Ruminants: Applications in Turkey. The 12th Congress of Mediterranean Federation for Health and Production of Ruminants. September, 16-19, İstanbul, 2004 (Invited) Pabuccuoglu, S., Armutak, A.: Education of Veterinary Medicine in Turkey. 4th Joint Scientific Symposium within the Framework of the Partnership between the Veterinary Faculties of T.C. Istanbul University and Ludwig Maximilians University. June 23-27 Munich Germany, 2004 (Invited). Evecen, M., Özdaş, Ö.B., Pabuccuoğlu, S., Birler, S., Tek, Ç., İleri, İ.K: The Effects of Reproductive Status of Donors on In Vitro Maturation of Cat Oocytes. 4 th Joint Scientific Symposium within the Framework of the Partnership between the Veterinary Faculties of T.C. Istanbul University and Ludwig Maximilians University. June 23-27 Munich Germany, 2004 Birler, S., Pabuccuoglu, S., Alkan, S., Atalla, H., Ileri, I.K.: Pronuclear Development of in vitro Fertilized Sheep Oocytes. Reproduction, Abstract Series, 27, 8. Society for the Study of Fertility, Annual Conference, 8-11 July, Cambridge-England, 2001 Birler, S., Pabuccuoglu, S., Alkan, S., Ak, K., Evecen, M., Ileri, I.K.: Effects of different maturation and culture media on in vitro fertilization of sheep oocytes. The Second International Alpha Congress, 16-19 September, Copenhagen-Denmark., 1999 Birler, S., Pabuccuoglu, S., Alkan, S., Evecen, M., Ileri, I.K.: Effects of serum and hormone additives in maturation media and co-culture with sheep oviductal epithelial cells (SOEC) on in vitro fertilization of sheep oocytes. J Reprod Fertility, Abstract Series, 23, 44. Society for the Study of Fertility, Annual Conference, 4-7 July, Aberystwyth-England, 1999 2- POSTER Taş M., Bacınoğlu S., Cirit U., Özgümüş S., Kaşgöz H., Pabuccuoğlu S. Determination of the potential fertility in bulls: Using polyacrylamdie gel instead of 13
cervical mucus in the sperm penetration test. 5th Joint Scientific Symposium of Veterinary Faculties of Ludwig Maximilians University and Istanbul University 2006. 5-6 October 2006, İstanbul-Türkiye, p.115 Muzaffer Taş, Mithat Evecen, Özen Banu Özdaş, Ümüt Cirit, Kamber Demir, Sema Birler and Serhat Pabuccuoğlu: Effect of transport and storage temperature of ovaries on in vitro maturation of bitch oocytes. 5th Joint Scientific Symposium of Veterinary Faculties of Ludwig Maximilians University and Istanbul University 2006. 5-6 October 2006, İstanbul-Türkiye, p.116 Evecen, M, Özdaş, Ö.B., Pabuccuoğlu, S., Birler, S., Tek, Ç., İleri, İ.K.: The Effect of Reproductive Status of Donors on In Vitro Maturation of Cat Oocytes. III. Türk- Alman Günleri Kongresi 4-6 Ekim, İstanbul, 93-94, 2002 Ozdas, B, O., Pabuccuoglu, S., Ileri, I, K.: Effects of Different Concentrations of Potassium Phosphate on The development of In Vitro Produce Mouse Embryos. Theriogenology Vol. 59, Issue 1 (1, January 2003) 457 IETS Meeting 2003 /Auckland Pabuccuoğlu, S., İleri, İ.K.: Tavşanlarda süperovulasyon amacı ile PMSG'nin iki farklı yöntemle uygulanışı. Türk-Alman Günleri 1993, 29-30 Nisan 1993 İstanbul, S. 390-392, 1993 Pabuccuoğlu, S., İleri, İ.K.: 24 saatlik tavşan embryolarının farklı medyumlarda in vitro kültürleri. Türk-Alman Günleri 1993, 29-30 Nisan 1993 İstanbul, 384-386, 1993 Pabuccuoğlu, S., Usta, S.: Tavşan embryolarının in vivo gelişim safhaları ve kazanıldıkları yerler. Türk-Alman Günleri 1993, 29-30 Nisan 1993 İstanbul, 377-379, 1993 D- ULUSAL DERGİLERDE YAYINLANAN MAKALELER Birler, S., Pabuccuoğlu, S., Alkan, S., Ak, K., Evecen, M., Ileri, I.K.: Koyun embriyolarının in vitro üretilmesi üzerine olgunlaşma ve fertilizasyon medyumlarına yapılan katkılar ve koyun ovidukt epitel hücreleri ile ko-kültürün etkileri. İ.Ü. Vet. Fak. Derg. 29 (1) 157-165, 2003 Rahimi Aghdam, H., Alkan, S., Pabuccuoğlu, S.: Kıvırcık Irkı Koyunlarda Mevsim İçi ve Dışı Östrus Senkronizasyonu ve Embriyo Transferi Çalışmaları. İ.Ü. Vet. Fak. Derg. 28 (2) 475-487, 2002 Pabuccuoğlu S.: Sığır oositlerinin in vitro olgunlaştırılmasında hepes ve hormonların etkileri. İstanbul Üniversitesi Birler, Vet.Fak.Derg. 27 (2), 659-670, 2001 Birler, S., Pabuccuoğlu, S., Ak, K., Alkan, S., Evecen, M., Ozturkler, Y., Ileri, I.K.: Effects of Serum and Hormone Additions to Maturation Medyum on In Vitro Maturation of Sheep Oocytes. J.Fac.Vet.Univ.Istanbul. 25 (1) 75-79, 1999 Alkan, S., Pabuccuoğlu, S., Baran, A., Özdaş, Ö.B., İleri, İ.K: BPSE ve PBS Sulandırıcılarının Hindi Spermasının Soğukta Saklanması ve Fertilitesi Üzerine Etkileri. İ.Ü. Vet. Fak. Derg. 24 (2) 213-222, 1998 Birler, S., Pabuccuoğlu, S., Alkan, S., Evecen, M., İleri, İ.K.: Sığır Oositlerinin İn- Vitro Fertilizasyonu Üzerine Farklı Medyumların ve Bu Medyumlara Yapılan Hormon İlavelerinin Etkileri. İ. Ü. Vet. Fak. Derg. 23(2) 511-516, 1997 14
Pabuccuoğlu, S., Birler, S., İleri, İ.K., Alkan, S., Baran, A., Öztürkler, Y., Evecen, M., Sönmez, C.: Koyunlarda İntra-vaginal Sünger Uygulaması ile Yapılan Senkronizasyon Çalışmalarında Siklus Atlattırma ile PMSG Enjeksiyonunun Mevsim İçi Etkileri. İ. Ü. Vet. Fak. Derg. 22 (2) 241-251, 1996 Şenünver, A, Kılıçarslan, M.R., Horoz, H., Ak, S., A., Hasöksüz, M., Ak, K., Pabuccuoğlu, S., Sönmez, C.,: Kısraklarda enfeksiyöz infertilite. Bülten Dif. 7 Haziran 1996: 2-5 Pabuccuoğlu, S.: Sığır yetiştiriciliğimiz üzerine. Hasad Dergisi, 11 (130): 46-47, 1996 Birler, S., Pabuccuoğlu, S., İleri, İ:K., Alkan, S.: Biyoteknolojik Yöntemlerin Reprodüktif Çalışmalar ve Hayvan Islahındaki Yeri. Hasad Dergisi, 11(124), 44-47, 1995 Pabuccuoğlu, S., Usta, S., İleri, İ.K.: Tavşan embryolarının in vivo gelişim safhaları ve kazanıldıkları yerler. İstanbul Üniversitesi Vet.Fak.Derg. 20 (1): 123-130, 1994 İleri, İ.K., Pabuccuoğlu, S.: Embrio nakli amacıyla süperovulasyon tedavisi yapılan ineklerden elde edilen embryoların gelişim devreleri ve değerlendirilmeleri. Hayvancılık Araştırma Derg. 3 (1): 58 61, 1993 Özpınar, A., Özpınar, H., Fırat, A., Pabuccuoğlu, S., Alkan, S., Leidl, W.: Untersuchungen zur Beziehung zwischen Blutprogesteronspiegel und Ablammrate unter verschiedenen Haltungs-und Ernährungsverhälttinissen bei Türkgeldi Schafen. Hayvancılık Araştırma Derg. 2 (2): 25-38, 1992 İleri, İ.K., Pabuccuoğlu, S., Soylu, K., Ak, K., Usta S.: Süt İneklerinde PMSG ile Yürütülen Süperovulasyon Çalışmalarında Anti-PMSG Uygulamalarının Embrioların Kalite ve Kantitesi Üzerine Etkileri. Türk Vet.Hek.Derg. 4 (2): 20 24, 1992 Ak, K., İleri, İ.K., Pabuccuoğlu, S., Usta, S., Alkan, S.: Boğalarda Seksüel Dinlenmenin Akrozomal Morfoloji ve Diğer Spermatolojik Özelliklere Etkisi. Türk Veteriner Hekimleri Birliği Vakfı Dergisi. 4 (3): 23 24, 1992 İleri,İ.K., Pabuccuoğlu, S., Ak, K., Alkan, S.: Sığırlarda Sun i Tohumlamaya Bağlı Olarak Kullanılan Bir GnRH Analoğunun Ovulasyon ve Gebelik Üzerine Etkisi. İstanbul Üniv.Vet.Fak.Derg. 17 (1), 61-67, 1991 Pabuccuoğlu, S., İleri, İ.K.: Tavşan Embryolarının İn Vitro Kültüründe Sığır Serumunun Kullanılabilirliği. İstanbul Üniv.Vet.Fak.Derg. 17 (2), 39 45, 1991 E- ULUSAL KONGRE BİLDİRİLERİ 1- SÖZLÜ BİLDİRİLER Evecen, M, Taş, M., Özdaş, Ö.B., Cirit, Ü., Demir, K., Birler, S., Pabuccuoğlu, S.: Köpek oositlerinin in vitro olgunlaştırılması üzerine ovaryum taşıma sıcaklığı, reprodüktif dönem ve yaş ın etkisi. 3. Ulusal Reprodüksiyon ve Sun i Tohumlama Kongresi, 30 Eylül-2 Ekim, Antalya, 2004 Özdaş, Ö.B., Cirit, Ü., Taş, M., Demir, K., Pabuccuoğlu, S., Ak, K., İleri, İ.K. (2004). KCL ve CaCl2H2O un Fare Spermasının İn Vitro Kapasitasyonuna ve Fare Oositlerinin İn Vitro Fertilizasyonuna Etkisi. 3. Ulusal Reprodüksiyon ve Suni Tohumlama Kongresi, 30 Eylül-02 Ekim 2004, s, 126, Antalya. 15
Taş, M., Bacınoğlu, S., Cirit, Ü., Kaşgöz, H., Pabuccuoğlu (Özgümüş), S., Pabuccuoğlu, S. (2004): Boğa Spermasında Potansiyel Fertilitenin Belirlenmesinde Yararlanılan Migrasyon Testlerinde Servikal Mukus Yerine Poliakrilamid Jelin Kullanılabilirliği. 3. Ulusal Reprodüksiyon ve Suni Tohumlama Kongresi, 30 Eylül-02 Ekim 2004, s, 89, Antalya. Birler, S., Pabuccuoğlu, S., Atalla, H., Ak, K., Alkan, S., Bacınoğlu, S., Cirit, Ü., Ozdas, O.B., İleri, I.K.: Koç spermasının dondurulmasında kullanılan gliserolün koyun embriyolarının in vitro üretilmesi üzerine etkileri. II. Ulusal Reprodüksiyon ve Sun i Tohumlama Kongresi. S.Ü.Veteriner Fakültesi 4-6 Eylül Konya. Tebliğ Özetleri Kitabı, 15., 2002 Atalla, H., Pabuccuoğlu, S., Birler, S.: İn vitro fertilizasyon yöntemi ile elde edilen koyun embriyolarının dondurulması. II. Ulusal Reprodüksiyon ve Sun i Tohumlama Kongresi. S.Ü.Veteriner Fakültesi 4-6 Eylül Konya. Tebliğ Özetleri Kitabı, 16, 2002 Pabuccuoğlu, S., Birler, S., Alkan, S., Atalla, H., Evecen, M., Ozdas, O.B.: İn vitro üretilmiş sığır embriyolarında blastosist gelişimine BSA, FCS, PVP nin etkisi. II. Ulusal Reprodüksiyon ve Sun i Tohumlama Kongresi. S.Ü.Veteriner Fakültesi 4-6 Eylül Konya. Tebliğ Özetleri Kitabı, 8. 2002 Çörekçi, Ş.G., Yılmaz, A., Birler, S., Pabuccuoğlu, S., Atalla, H.: IVF yöntemi ile geliştirilen embriyoların transferinden doğan kuzuların vücut gelişimleri ve yaşama güçleri üzerinde karşılaştırmalı araştırmalar. II. Ulusal Reprodüksiyon ve Sun i Tohumlama Kongresi. S.Ü.Veteriner Fakültesi 4-6 Eylül Konya. Tebliğ Özetleri Kitabı, 9, 2002 Birler, S., Pabuccuoğlu S.: Hayvan Islahında Yeni Ufuklar Mezbahada kesilen koyunlardan alınan yumurta hücrelerinin laboratuvarda olgunlaştırılması ve döllenmesi sonucu Türkiye de ilk defa kuzular elde edildi. III Ulusal Veteriner Hekimliği Öğrencileri Araştırma Kongresi, 10-12 Mayıs 2001(Invited) Ansen, S., Özdaş, Ö.B., Pabuccuoğlu S.,: Fare Embriyolarının İn vitro kültüründe Farklı Ozmotik Basınçların Gelişimlerine Etkisi. II.Ulusal Veteriner Hekimliği Öğrencileri Araştırma Kongresi. İstanbul 11-13 Mayıs 2001 Pabuccuoğlu, S., Birler, S., Alkan, S., Evecen, M., İleri, İ.K.: Sığır Oositlerinin İn Vitro Fertilizasyon Sonrası Gelişimlerinde İki Farklı Medyumun Clevage Oranlarına Etkileri. V. Ulusal Nükleer Tarım ve Hayvancılık Kongresi. 20-22 Ekim 1998, Tebliğ Tam Metinleri, 181-184, Selçuk Üniversitesi-KONYA, 1998 Say, R. Pabuccuoğlu, S., Cantekin, D.: Endometriosise Bağlı Subfertilite Tedavisinde İmmunomodülatör Ajan Olarak Verapamil in Etkisinin Araştırılması. Jinokoloji ve obstetrik kongresi. 2-5 Nisan 1997. Tebliğ Özetleri Kitabı, 13 İstanbul, 1997 Pabuccuoğlu, S., Birler, S., İleri, İ.K.: Koyun oositlerinin in vitro olgunlaştırılmasında FSH, LH, Östardiol 17β Hormonlarının ilavesi ve IVF sonrası gelişimde ko-kültürün etkileri. Ulusal I. Reprodüksiyon ve Sun i Tohumlama Kongresi. İ.Ü.Veteriner Fakültesi 18-19 Eylül 1997 Avcılar. Tebliğ Özetleri Kitabı, 21. İstanbul, 1997 Alkan, S., Pabuccuoğlu, S., İleri, İ.K.: Horoz Spermasının +5C de Saklanmasında İki Farklı Sulandırıcının Etkileri. Ulusal I. Reprodüksiyon ve Sun i Tohumlama Kongresi. İ.Ü.Veteriner Fakültesi 18-19 Eylül 1997 Avcılar. Tebliğ Özetleri Kitabı, 42, Avcılar- İstanbul, 1997 16
Birler, S., Pabuccuoğlu, S., Ak, K., Alkan, S., Evecen, M., İleri, İ.K.: Koyun oositlerinin in vitro olgunlaştırılmasında hormon ve serum kullanımının etkileri. Ulusal I. Reprodüksiyon ve Sun i Tohumlama Kongresi. İ.Ü.Veteriner Fakültesi 18-19 Eylül 1997 Avcılar. Tebliğ Özetleri Kitabı, 20. İstanbul, 1997 Evecen, M., Pabuccuoğlu, S., Birler, S., İleri, İ.K.: Fare Embriyolarının in vitro kültüründe farklı BSA oranlarının gelişime etkisi. Ulusal I. Reprodüksiyon ve Sun i Tohumlama Kongresi. İ.Ü.Veteriner Fakültesi 18-19 Eylül 1997 Avcılar. Tebliğ Özetleri Kitabı, 18. İstanbul, 1997 Pabuccuoğlu, S., Birler, S., İleri, İ.K., Alkan, S., Baran, A., Öztürkler, Y., Evecen, M., Sönmez, C.: Koyunlarda intravaginal sünger uygulaması ile yapılan senkronizasyon çalışmalarında siklus atlattırma ile PMSG enjeksiyonunun mevsim içi etkileri. Marmara Bölgesi II. Hayvancılık Kongresi, 25-27 Ekim 1995. 39, Bursa, 1995 Özkoca, A., İleri, İ.K., M. Ahmad,, Pabuccuoğlu, S., Usta S.: Tavşan Embryolarının İn Vitro Kültüründe Farklı Sığır Serumu Konsantrasyonlarının Etkileri. Türkiye Atom Enerjisi Kurumu, 2. Ulusal Nükleer Tarım ve Hayvancılık Kongresi, 25-27 Kasım, Ankara, 1992 İleri, İ.K., Özkoca, A., Ak, K., Pabuccuoğlu, S., Usta S., Soylu, M.K.: Hayvan Islahında Embryo transfer Çalışmalarının Yeri ve Önemi. Bursa Veteriner Hekimler Odası II. Mesleki Eğitim Semineri, 17-18 Mayıs, Bursa, 1989 2- POSTER Say, R. Pabuccuoğlu, S., Cantekin, D.: Endometriosis tedavisinde immunomodülatör kullanımı. 2000 e 3 kala Jinokoloji ve obstetrik kongresi. 9-12 Eylül 1997. Ankara (Poster yarışmasında en iyi ilk üç eser ödülü.), 1997 17