BİTKİLERDE DOKU KÜLTÜRÜ Ismail Bezirganoglu
Bitki doku kültürü Aseptik koşullarda yapay bir besin ortamında hücre, doku veya organ gibi bitki kısımlarından (eksplant) kontrollu çevre koşullarında yeni doku, bitki veya bitkisel ürünlerin üretilmesidir.
Bitki doku kültürleri l Yeni çeşit geliştirmek ve var olan çeşitlerde genetik değişim oluşturmak l Kaybolmakta olan türlerin korunması l Çoğaltılması zor olan türlerin üretiminde rutin olarak uygulanmaktadır.
Bitki doku kültürü işlemlerinde ve genetik iyileştirmede kullanılan temel sistem bitki rejenerasyonudur.
Bitki rejenerasyonu kültürü yapılan hücrelerin özellikleri itibariyle 3 kısımda incelenebilir l Organize olmuş meristematik hücreleri ihtiva eden somatik dokulardan rejenerasyon. l Meristematik olmayan hücrelereden rejenerasyon l Mayoz bölünme geçirmiş gametik hücrelerden rejenerasyon
l l Birinci tip rejenerasyonda uç ve yan meristemlerden bitkiler çoğaltılır. buna meristem kültürü yoluyla klonal çoğaltım denilir. Elde edilen hücreler tamamen donör bitkiye benzerler. Ikinci tip rejenerasyon; doğrudan bitki eksplantının kesilmiş yüzeylerindeki belirli somatik hücrelerin bir kısmının genellikle bitki büyüme düzenleyicilerinin etkisi sonucu bölünerek ve organize olarak, ve daha sonra da bitkiyi (direkt organogenesis) veya somatik bir hücrenin sürekli bölünerek embriyo ve daha sonra da tam bir bitkiyi oluşturması (direkt somatik embryogenesis) şeklinde olabilir. Ayrıca her iki durum, belirli bir kallus proto-kallus veya hücre süspansiyonu oluşumu devresinden sonrada ortaya çıkabilir (indirekt rejenrasyon). Ortaya çıkan bitkilerde bazı kalıtsal veya geçici varyasyonlar oluşabilir. Son olarak normal kromozom sayısının yarısını ihtiva eden hücrelerdende direkt veya dolaylı yollarla bitki rejenerasyonu olabilir. Bu durumda donör bitkinin kromozom sayısının yarısına sahip, genellikle steril olan haploid bitkiler elde edilebilir.
Daha önce var olan yapılardan gelişme Totipotensi temelli yeniden gelişme Aksiller tomurcuk Adventif tomurcuk
Tuber oluşumu Çiçeklenme in vitro
Ovaryum Gelişimi Kök oluşunu Rizogenez
Aşı in vitro Bulbil Gelişimi
Pamukta somatik embiryogenez
Bitki doku kültürlerinin bitki ıslahındaki uygulama alanları l l l l l l l l l l l l Türler arası melezlemelerden sonra embriyo kültürü Haploid bitki üretiminde anter (polen) veya yumurtalık (ovül) kültürü Somaklonal varyasyon İn vitro seleksiyon İn vitro döllenme İn vitro germplazm korunması Somatik hücre melezlemesi (protoplast füzyonu) Gen transferi Sekonder metabolit üretimi Kimeralar Mikroçoğaltım Sentetik tohum üretimi
Bitki Doku Kültürü Tarihçesi l TOTİPOTENSİ Hücre teorisi l SCHLEIDEN 1838 bitkilerde, l SCHWANN 1839 bitki ve hayvanlarda açıkladı: l Among the lower plants any cell can be separated from the plant and continue to grow. Thus, entire plants may consist of cells whose capacity for independent life can be clearly demonstrated.
Haberland, 1902 (İlk aseptik kültür denemesi)
White,1934 İlk kök kültürü
l WHITE, GAUTHERET ve NOBECOURT l WHITE Nicotiana melezi, l GAUTHERET ve NOBECOURT l Daucus carota ile 1939 da ilk bitki kültürünü yaptılar.
Gautheret, İlk kallus kültürü
Skoog, 1954
Murashige l Murashige ve Skoog besiyeri
Maheswari, 1960 Anter kültürü
Nitsch, 1974 Mikrospor kültürü
Cocking, 1960 Protoplast kültürü l
Morel, 1960 mikropropagasyon Melchers, 1978 protoplast l füsyonu Pomato l
Nickell, Sekonder metabolit üretimi l
Türkiye de Bitki Doku Kültürü l Üniversiteler ve Tarımsal Araştırma Enstitü Laboratuvarlarında mikroüretim çalışmaları ile başlamıştır. l Ege ve Ankara Üniversiteleri ile Bornova Ziraai Araştırma Enstitüsü öncü kuruluşlardır. l Günümüzde çok sayıda Üniversite, Araştırma Enstitüsü, TÜBİTAK ve Özel sektör laboratuvarlarında bitki doku kültürü çalışmaları gerçekleştirilmektedir.
Öneriler Koridorlar transport için geniş olmalı Temiz alanda basınç olmalı Lab hijyeni : Günlük temizlik yapılmalı Ayakkabılar, ağız ve baş kapatılıp temiz önlük giyilmeli Aseptik alan;: besiyeri saklama,, transfer odası, büyüme odaları Lab.Bölümleri Hazırlik ve sterilezasyon odası Aseptik alanlar: ofis, resepsiyon ve taşıma
Otoklav odası Besiyeri saklama odası * * laminar flows
Totipotensi ve Kompetens Totipotensi:Bütünü verme yeteneği Kompetens:Farklılaşma yeteneği olma
Bitki doku kültürü aşamaları Ø Uygun bir laboratuvar düzeninin kurulması Ø Kullanılacak bitki parçalarının ve besin ortamlarının seçimi, hazırlanması ve sterilizasyonu Ø Kallus veya hücre süspansiyonlarının oluşturulması Ø Kallus veya hücre süspansiyonlarından veya doğrudan somatik veya gametik hücrelerden bitki rejenerasyonunun uyarılması Ø Oluşan sürgünlerin çoğaltılması ve boylarının uzatılması, somatik embriyoların oluşturulması Ø Uzayan sürgünlerin köklendirilmesi Ø Köklenen bitkilerin dış ortama alıştırılması
l Su Besin ortamları l Makro elementler (azot, fosfor,sodyum, magnezyum, kükürt, vb.) l Mikro elementler (demir, manganez, çinko, bakır, vb.) l Vitaminler (thiamin, nikotinik asit, vb.) l Şekerler (sakkaroz, glikoz, vb.) l Jel yapıcı maddeler (agar, pytagel,jelatin, vb.) l Amino asitler (glisin, arginin, vb.) l Kimyasal olarak tanımlanamayanlar (hindistan cevizi sütü, vb.) l Bitki büyüme düzenleyicileri
Bitki büyüme düzenleyicileri Hormon Genel Etki Oksinler Fotoperyodizm, köklendirme, apikal dominans, yan sürgünlerin gelişiminin engellenmesi, hücre gelişimi. Sitokininler Hücre bölünmesi, yeniden farklılaşma, bitki rejenerasyonu, sürgün çoğaltımını etkiler, sürgünlerde köklenmeyi ve embriyogenesisi engeller. Gibberellinler Meristemlerden bitki rejenerasyonun uyarılması, sürgünlerin boylarının uzatılması, embriyo ve ovül kültürlerinin gelişiminde, kallus gelişimi, organogenesis ve adventif kök oluşumunu engeller Absisik asit Doku kültüründeki rolü tam olarak bilinmemekle beraber somatik embriyoların olgunlaştırılmasında kullanılmaktadır. Etilen Köklerin uzamasını engelleyerek enine büyüme ve çoğalmayı arttırmaktadır.
Ø Sıcaklık ayarlanır. Ø Işık Kültür Şartları Kültür odalarında kullanım amacına göre 18±2, 22 ±2 veya 25 ±2 0 C ye Genellikle serin floresan lambalarıyla sağlanır. Aynı zamanda ışıklama süresi ve zamanlamasıda önemlidir. Ø Nem % 50-70 arasında bir değere ayarlanır.
Bitki Rejenerasyonu l Organogenesis l Somatik embriyogenesis l Protoplast kültürü l Haploid hücre kültürü l Meristem kültürü (hastalıksız bitki üretimi)
ORGANOGENESİS Hücrelere ve dokulara baskı uygulayıp bazı değişikliklere sebep olarak sürgün veya kök taslağı diye adlandırılan tek kutuplu ve vasküler sistemi kökenini aldığı dokuya bağlı olan bir yapının meydana gelmesine yol açan işlemdir.
organogenesis l l l l l Döllenme eşeyli üreyen bir bitkinin hayat döngüsündeki en önemli biyolojik olaylardan birisidir. Döllenmeyi takiben hızlı bir mitotik döngüye giren zigot,sonuçta yüksek yapılı bir bitkinin çok hücreli (doku) ve çok organlı (organizma) bünyesini meydana getirir. Bunlar arasında epidermis,meristem, iletim, parenkima, kolleankima ve sklerenkimayı sayabiliriz. Tek hücreli bir yapı olan zigotun milyonlarca mitoz bölünme geçirdiği dikkate alındığında, bitkinin bünyesini oluşturan bütün bu hücrelerin; ister çiçeğin, ister iletim dokusunun veya isterse kök veya gövdenin yapısına katılsın zigotta var olan genetik materyalin aynısına sahip olmasını bekleriz. Dolayısıyla genetik olarak birbirinin aynısı olan bu hücrelerin göstermiş olduğu geniş yapısal varyasyon şunu göstermektedir ki bu hücreler üzerinde genetik faktörlerden ziyade başka faktörlerde etkili olmaktadır Söz konusu bu varyasyonların Farklı doku ve organların meydana geldiği bu süreç bitki büyüme ve gelişme fizyolojisinde farklılaşma (differentiation) olarak adlandırılmaktadır.
l Tamamen farklılaşmış bitki dokusunun bu şekilde organize olmamış hücreler yığınına dönüşmesine tersine farklılaşma (de-differentitation), böyle bir yığından sürgün veya kök şeklinde tekrar bir morfolojik farklılaşmaya gidilmesine ise yeniden farklılaşma (re-differentitation). l Böylece bitkiyi meydana getiren ve nihai farklılaşmasını tamamlamış olan canlı hücrelerden herhangi birisi tekrar bölünerek ve farklılaşarak yeni bir bitki meydana getirebilme kapasitesine her zaman sahiptir. l Hayvansal organizmalardan farklı olarak bitkisel dokularda görülen bu özel yetenek totipotensi olarak adlandırılmaktadır.
In vitro organogenesis de etkin bitki rejenerasyonu için gerekli koşullar 1. Uygun eksplantın seçilmesi 2. Büyümede aktif maddeleri içeren uygun bir besin ortamının seçilmesi 3. Fiziksel çevre koşullarının kontrolü
Eksplant seçimi l Doku kaynağı olarak kullanılan organ l Organın ontogenetik ve fizyolojik yaşı l Eksplantın bitkiden alındığı dönem l Eksplantın büyüklüğü l Eksplantın alındığı bitkinin diğer özellikleri
kallus l l l l l l l Kallus aseptik şartlarda düzenli zaman aralıkları ile altkültür yapılıp yeni ortamlara aktarılarak uzun bir süre korunabilir. Fakat dış görünüşüne rağmen, kallus değişmez bir doku değildir. Hücre büyüklüğü ve şekli Vakuoleşme oranı Stoplazma içeriği Hücre duvarının yapısı bakımından çeşitli farklılık gösterir. Fakat tipik kallus hücresi fazlaca vakuollü parankima hücresidir ve çok ince sitoplazma katmanı ile hücre duvarına baskılanmış bir çekirdeğe sahiptir. Ayrıca alt kültür yapılmış kalluslarda trakeri elemanlarınada rastlamak mümkündür. Bu nedenle aslında kallus hücrelerini farklılaşmamış hücreler yığını olarak değilde, herhangi bir organizasyon göstermemiş hücreler yığını olarak tanımlamak daha doğrudur.
l Kallusun uzun süre kültüre alınması bazı yapısal değişikliklere yol açmaktadır. sık görülenler l Büyüme ve gelişme için gerekli olaneksojen hormon gereksiniminin ortadan kalkması, diğer bir ifadeyle kallus hücrelerinin bölünme ve gelişme için artık hormona gerek duymamaları ve neticede hormon-otonom bir kallusun meydana gelmesi (habituation). l Organik potansiyelin yani yeni adventif sürgün veya kök meydana getirme yeteneğinin azalması veya tamamen ortadan kalkması l Kallus dokusunun yapısında bazı değişikliklerin kendiliğinden ortaya çıkması örneğin, nispeten daha küçük hücrelerden meydana gelmiş sık yapılı (compact) bir kallus veya daha büyük ve şeffaf hücrelerden meydana gelmiş gevşek yapılı (friable) bir kallusun meydana gelmesi.
l Bazı avantajlarıda vardır. örneğin gevşek yapılı kallus kullanıldığında hücre süspansiyonların başlatılması daha kolay olur. Sadece ortamdaki oksin ortamını artırarak veya giberllik asit ekleyerek veya eklemeden sadece sitokinin konsnatrasyonunu düşürerek bu ur dokulardan süspansiyohn kültürü gerçekleşir. l Aynı bitki türünden alınan eksplantlar organogenes oluşturma kapasitesi bakımından büyük farklılıklar gösterebilirler. Bunun yanında kallus homojen değildir ve kültürde yaş ile birlikte çeşitli değişikliklere maruz kalmaktadır.
Besin ortamının temel içerikleri l İnorganik maddeler l Organik maddeler l Bitki büyüme düzenleyicileri l Doğal kompleksler
Inorganik maddeler l Ilk kullanılan inorganik tuz formülleri white 1943 ve Heller (1953) tarafından geliştirilmiştir. l Murashige and Skoog (1962) yüksek tuz formülasyonlarını ve bunların türevlerini kullanmışlardır. l Bu yüksek tuz ortamları arasındaki en önemli farklar, azot miktarı ve şekli ile bazı mikroelementlerin nisbi miktarıdır.
Organik maddeler l Besin ortamındaki enerji gereksinimleri genellikle sakkaroz ile karşılanır fakat bazen glikoz-sakkarozun yerine geçebilir. bunun yanında karbonhidratların organogenesisde ozmotik bir rolede sahip olduğu gösterilmiştir. l Besin ortamına vitamin veya amino asit ilave edilmesi kallus büyümesini ve organ farklılaşmasını önemli ölçüde teşvik edebilir. En çok eklenen vitamin Thiamindir. Bunu nikotini asit ve pridoksin takip eder. Inositol ise bir çok dokunun büyüme ve farklılaşmasına yardım eder.
l Organik azot eklenmesi kallus başlatılması esnasında çok sık kullanılır fakat alt kültür ve organogenesis esnasında yararlı olabilir. l Kazein hidrolizat çok bilinen bir organik azot kaynağıdır. l Glutamat, asparjin, tirozin ve adenin gibi bileşiklerde en fazla kullanılan indirgenmiş azot kaynaklarıdır.
Bitki büyüme düzenleyicileri l Oksin ve sitokinin in vitro kültürde en fazla ihtiyaç duyulan bbd dir. l Ortamda bulunan sitokinin ve oksinin konsantrasyonu ve oranı in-vitro büyümenin miktar ve çeşidini kontrol eder. l Doğal olarak sentezlenen veya sentetik olarak elde edilen oksin ve sitokininler kullanılmaktadır.
l En fazla kullanılan oksinler 2,4-D l NAA, IAA ve IBA. l Sitokiniler ise l Kinetin, N 6 benzil adenin/benzil amino pürin (BA/BAP),izopentil adenin ve zeatin
DOĞAL KOMPLEKSLER l doğada bulunurlar ve genelde bilinmeyen çeşitli içeriklere sahiptirler. l hidrolize olmuş protein preparasyonlari l maya ürünleri l endosperm sivisi l meyve posasi ve suyu l hindistan cevizi sütü
Kültür koşulları l Ortamın fiziksel hali l Ortamın ph değeri l Nem l Işık l Sıcaklık
Ortamın fiziksel hali l Ortamın fiziksel hali yani katı veya sıvı olması organogenesisde önemli bir rol oynayabilir. l Agar ve Gelrite in her ikiside kompleks bir polisakkarittir ve en yaygın jelleştirme (katılaştırma) maddeleridir. l Agar (%0.6-1.0 a/h) ile katılaştırılmış ortamda büyütülen kalllus yavaş büyür ve varolan kallus kümesinin çevresinde yeni hücreler gelişir.
l Organogenesisde en çok başarı katı ortam üzerinde kallus veya yayılmış hücre süspansiyonları ile başarılmıştır. l Ortamın fiziksel hali farklılaşmanın çeşidinde önemli bir rol oynayabilir.
Ortamın ph değeri l Genellikle 5.0-6.5 arasındadır. l Inkübasyon esnasında ortamın ph sapması olmaktadır. l Ortamın ph düzeyi besin maddelerinin çökelmesi ile besin maddelerinin ve bitki büyüme düzenleyicilerinin alımını etkilemektedir.
Nem l Genellikle nem oranının %100 e yakın olmalıdır.
ışık l Kültür ortamının önemli faktörlerinden birisidir. l Farklılaşma için gerekli olan ışık birkaç bileşenden oluşmaktadır. bunlar ışığın şiddeti, gün içinde uygulama periyodu ve niteliğidir. l Doku kültürü için gerekli olan güneş enerjisi ototrofik bitkilerden faklıdır. l çünkü doku kültüründe zaten ortam içerisinde yeterli karbonhidrat hazır
l Fakat bunun yanında bazı fotomorfojenik olaylar için ışık gerekli olabilir. l Maksimum kallus büyümesi karanlıkta olmasına rağmen düşük ışık şiddeti organogenesisi ve embryogenesisi artırabilir.
Sıcaklık l Genellikle kültürler 20 ila 30 C arasındaki sabit sıcaklıklarda tutulurlar fakat yinede belli bir bitki türü için büyüme ve farklılaşmanın optimum düzeyde gerçekleştiği sıcaklık değerinin önceden belirlenmesi gerekir. l Çünkü farklı bitki türlerin optimum sıcaklık istekleri farklı olabilir. l Sıcaklığın diğer bir önemli rolüde ortamdaki su miktarına bağlı olarak vitrifikasyonu (camlaşmayı) etkilemesidir.
Kültür kaplarında biriken gazlar l Kültüre alınan eksplantların etrafındaki atmosferin gaz içeriğidir. l Böylesi bir gaz atmosfer, etilen, oksijen, karbondioksit, etanol ve asetaldehitten oluşur. l Aynı zamanda bbd olan etilen kültürleri yapılan dokular tarafından üretilir ve farklı morfogenik etkilee sahiptir.
ORGANOGENESİS ÇEŞİTLERİ İndirekt organogenesis Direkt organogenesis Kallus Sürgün veya kök Sürgün veya kök Bitki Bitki
Organogenesisde meydana gelen önemli olaylar Eksplant Yeterlilik kararlılık Kök veya sürgün Yeterliliğin kazanılması Organogenik uyarılma Farklılaşma ve gelişme
Organogenesis Avantajları; l l Hücre veya dokulardan yeni bitki bireyleri meydana getirmeye imkan tanıdığı için, generatif yoldan çoğaltılması zor olan bitkilerin üretimine kolaylıklar sağlamaktadır. Bitki transformasyon çalışmalarında oldukça önemlidir. Dezavantajları; l Bütün bitki türleri için evrensel bir rejenerasyon protokolü yoktur. Her bitki türü, hatta her bitki çeşidi için spesifik bir sistemin optimize edilmesi edilmesi gerekir.
Pamukta rejenerasyon protokolü Apeks Node
Pamuk nod eksplantlarından kallus oluşumu ve rejenerasyon
Pamuk nod eksplantlarından direkt gövde rejenerasyonu
Pamukta kök rejenerasyonu
İn vitro da rejenere olan pamuk bitkisinin toprağa aktarımı
SOMATİK EMBRİYOGENESİS Bağımsız vasküler sistemi olan ve kök ile sürgün aksini içeren iki kutuplu bir yapının oluşmasına yol açan bir süreçtir. Vejetatif hücrelerden gelişen embriyolar da somatik embriyo olarak adlandırılır.
Dikotiledon bitkilerde somatik embriyoların gelişim dönemleri globular kalp torpedo kotiledon
Somatik embriyogenesis l Bireysel bitkilerin hücrelerinden geliştikleri için somatik embriyolardan elde edilen bitkiler genetik olarak klon oluştururlar. l Döllenmiş yumurtadan gelişen embriyoda olduğu gibi, iki çenekli bitkilerde somatik embriyolar da globular, kalp, torpedo ve kotiledon oluşum safhalarını geçirirler. l Gövde-kök eksenine aynı zamanda sahip olup, asıl doku ile vaskular bağlantıları olmadığından dolayı dokudan kolaylıkla ayrılabilirler.
Tanım l Bitki hücrelerden embryo elde edilmesi döllenmiş yumurta hücresiyle sınırlı değildir. l In vitro kültür şartlarını ve özelliklede bitki büyüme düzenleyicilerini ayarlayarak bir bitkinin herhangi bir somatik hücre, doku ve organından embriyo elde etmek mümkün olabilmektedir. l Vejetatif hücrelerden gelişen embriyolar somatik embriyo olarak adlandırılmaktadır. l Somatik doku hücreleri öncelikle yüksek oranda oksin içeren ortamda kültüre alınır, daha sonra da oksin içermeyen yeni ortama aktarılırsa embriyo üretme yeteneği kazanmaktadırlar l Oksinlerin somatik bitki hücrelerine embriyo üretimi için yeniden zigotik bir kapasite kazandırdığı belirtiilmektedir.
l Somatik ve zigotik embryogenesis arasındaki önemli fark elde ediliş yöntemlerinden kaynaklanmaktadır. l Zigotik embriyo döllenmiş bir bir zigottan geliştiğinden dolayı, elde edilen bitkiler potansiyel olarak açılma gösterirler. l Öte yandan bireysel bitkilerin hücrelerinden geliştikleri için somatik embriyolardan elde edilen bitkiler genetik olarak klon oluştururlar. l Döllenmiş yumurtadan gelişen embriyoda olduğu gibi, iki çenekli bitkilerde somatik embriyolarda globular, kalp, torpido ve kotiledon oluşum safhaları geçirirler.
l Somatik embryolar organogenesis yoluyla gelişen sürgünlerden farklılık gösterirler. l Gövde- kök eksenine aynı zamanda sahip olup, asıl doku ile vaskular bağlantıları olmadığından dolayı dokudan kolaylıkla ayrılabilirler. l En yaygın kullanılan olgunlaşmamış zigotik embriyolardır. l Bunun nedeni ise zigotik embriyoların embriyogenik gelişme için gerekli olan genleri aktif hale getirdiklerine inanılmaktadır.
Somatik embriyogenesisi etkileyen faktörler l Eksplant kaynağı l Genotip l Besin ortamının içeriği l Çevre şartları
Eksplant kaynağı l Yüksek oranda başarı için eksplantın hızlı hücre bölünmesine sahip iyi gelişen ve sağlıklı bitkilerden alınması gereklidir. l olgun ve yüksek oranda organize olmuş dokuların embriyogenesisi son derece düşük olmaktadır. l eksplant alınacak olan bitkilerin yetiştirme şartlarıda embriyogenesisin başarısında önemli rol oynamaktadır. ışık, nem, toprağın besin durumu ve mevsimsel faktörler l Sera şartları tarlada yetişen bitkilerden daha iyi sonuç vermektedir. Ayrıca in vitro gelişen bitkiciklerden alınan eksplantlardan da yüksek oranda başarı sağlanmaktadır.
genotip l Genel olarak otsu bitkiler ağaç ve çalılara göre daha kolay rejenerasyon sağlamaktadırlar. l Somatik embriyo oluşturma frekansı bakımından türler arasında önemli farklılıklar gözlendiği gibi, aynı tür içerisindeki farklı genotip ve çeşitlerin dahi embryo oluşturma kabiliyetleride farklı olmaktadır.
Besin ortamının içeriği
Somatik Embriyo Rejenerasyonu l Direkt embriyogenesis Eksplant l İndirekt embriyogenesis Eksplant Somatik embriyolar Kallus Pro-embriyolar Bitki Bipolar embriyolar Bitki
Somatik embriyogenesisin kullanım alanları Ø Klonal çoğaltım Ø Sentetik tohum üretimi Ø Gen aktarımı
Paulownia elongata da indirekt somatik embriyogenesis
PROTOPLAST KÜLTÜRÜ Hücre çeperleri yok edilmiş hücre zarı ile çevrili hücrelerin kültürüdür. Bir hücrenin duvarı uzaklaştırıldığında geriye kalan kısmına protoplast denir. Protoplastlar izotonik ortamlarda canlılığını sürdürüp, yeni duvar oluşturup, mitozla bölünebilir, yeni hücre grupları ve daha sonra da yeni bitkiler oluşturabilirler.
Protoplast izolasyonu, kültürü ve rejenerasyonunda önemli aşamalar Başlangıç materyali seçimi ve özellikleri a. Bitki türü/genotip b. Yaş, hücre hayat döngüsü, fizyolojik durum c. Eksplant ve donör materyal seçimi Bitki materyali ve enzim karışımlarının hazırlanması a. Yüzey sterilizasyonu b. Enzim karışımları ve özellikleri c. Yıkama solusyonları d. Pre-plazmolizasyon e. Ozmotik basınç
Protoplast izolasyonu, kültürü ve rejenerasyonunda önemli aşamalar Protoplast izolasyonu, saflaştırılması ve testler a. İnkübasyon metodu b. Saflaştırma yöntemleri c. Hücre duvarı kalıntısı, canlılık ve verim testleri Protoplast kültürü a. Besin ortamlarının özellikleri ve bitki büyüme düzenleyicileri b. Kültür yoğunluğu c. Kültür sistemleri Protoplastlardan kallus oluşumu ve bitki rejenerasyonu a. Besin ortamları ve yapılacak değişiklikler b. Ozmotik basıncın azaltılması c. Kallusun rejenerasyon ortamına transferi ve sürgün oluşumu
Protoplast Füzyonu ve Somatik Melezleme l Protoplast teknolojisi ile en küçük canlı üniteye ulaşılabilmekte, hücre füzyonu, seleksiyonu ve klonlanması ile genetik transformasyona imkan sağlanmaktadır. l Protoplast kültürü ve somatik melezleme bitki ıslahında daralan genetik varyabiliteyi genişletmede önemli metodlardan biridir. l Son yıllarda bakteriler ve diğer yollarla aktarılan kimerik genleri taşıyan transgenik türlere karşı büyük bir reaksiyonun ortaya çıkması bu çalışmaların önemini daha da arttırmaktadır.
Protoplast Füzyonu ve Somatik Melezleme l Protoplast kültürü ve füzyonu klasik ıslah yöntemleriyle gerçekleştirilemeyen ve çeşitli uyuşmazlıklar gösteren cins ve türler arası melezleme, ve hatta yeni türlerin elde edilmesinde bir araç olabilir. l Protoplast füzyonu ve bu yolla bitki rejenerasyonu aynı zamanda cins ve türler arası mitokondriyel DNA (sitoplazmik erkek kısırlığı), kloroplast ve sitoplazma gibi çekirdek dışı genetik elementlerin transferine de imkan sağlamaktadır.
Yeni çeşit geliştirmede somatik melezlemenin uygulanışı
Somatik melezleme, iki protoplastın çekirdek, sitoplazma veya her ikisininde birbiriyle belirli ortam ve şartlarda birleştirilmesidir. Füzyon sonucu oluşan yapılara füzyon ürünleri veya heterokaryon denir. Bu birleşme sonucu oluşan bitki sitoplazmalar (sibrit), çekirdekler (hibrit) veya her iki bakımdan da somatik melez olabilir.
Protoplastların kimyasal ve elektriksel füzyonu ve somatik melezlerin elde edilmesi
Protoplast kültürünün dezavantajları l Her bitki türü için tekrarlanabilir bir şekilde protoplasttan bitki elde etme metodu geliştirilmiş değildir. l Heterokaryonların etkin bir şekilde ayırımı yapılamamaktadır. l Somatik melez bitkiler genellikle steril olmakta, döl vermemekte veya fertil olması durumunda çok geniş bir somaklonal varyasyon göstermektedir.
HAPLOİD BİTKİ ÜRETİMİ Somatik hücrelerdeki kromozom sayısı, ait oldukları bitki türünün gamet hücrelerinde bulunan kromozom sayısı kadar olan bitkilere haploid bitkiler denir. Haploid sayıda kromozoma sahip hücrelerde (polen/mikrospor veya megaspor) veya bu hücreleri içeren bitki kısımlarının (anter veya ovül) doku kültürü yoluyla elde edilen hücrelerinde veya rejenerantlarında yapılan kromozom katlanması sonucu homozigot bitkiler elde edilebilir. Bu tekniğe in vitro haploidi tekniği denir.
Haploid bitki üretimi l Erkek gametten haploid uyartımı (Androgenesis) - Anter kültürü - Mikrospor kültürü l Dişi gametten haploid uyartımı (Ginogenesis ve partenogenesis) - Ovül ve ovaryum kültürleri
Anter kültürü esas olarak içerisinde olgunlaşmamış polenleri (mikrosporları) bulunduran anterlerin tomurcuklardan ayrılarak in vitro koşullarda yapay besin ortamlarına yerleştirilmesi ve burada olgunlaşmamış polenlerden haploid embriyolar elde edilmesi olayına verilen isimdir. l Anter kültürü yapılarak normal koşullarda iki çekirdekli yapıya dönüşecek olan polen tanesinin gametik gelişme yönü; henüz tek çekirdekli dönemdeyken somatik gelişme yönüne doğru çevrilmekte ve böylece mikrospor androgenesis veya sadece androgenesis denir. l Androgenesisi etkileyen faktörler l Donör bitkiden kaynaklanan l Anter kültürü tekniğinin uygulanması sırasındaki koşullarla ilgilidir.
l Anter verici bitkiden kaynaklanan faktörler l A. Genotip l B. Donör Bitkinin yetişme koşulları l B1. bitkilerin yetiştirildiği dönemdeki, sıcaklık, ışık yoğunluğu, günlük ışıklanma süresi, havadaki CO2 konsantrasyonu, bitkinin beslenme koşulları başta olmak üzere tüm çevresel faktörler. l Bitkilerdeki androgenetik potansiyel ile ilgilide diğer bir parametrede anterlerdeki mikrosporların yapıları ve kaliteleridir. l Yapılan araştırmalarda bazı bitki türlerinde polenlerin tümünün aynı morfolojiye sahip olmadıkları aralarında farklı yapıların bulunduğu belirlenmiştir. l Polen dimorfizmi olarak adlandırılan bu durumdaki polenlerin bir bölümü gametofik gelişmesini sürdürerek normal polenleri oluştururken, diğer bir bölümü ise sporofitik gelişme yönüne kayarak embryo oluşturma yeteneği kazanmaktadır.
l Anter kültürü tekniğinden kaynaklanan faktörler l Anterlerin gelişme dönemi l Anterlere yapılan ön uygulama l Besin ortamının bileşimi ve yapısı l Inkübasyon koşulları
Haploid bitkilerin sağlamış oldukları bazı avantajlar; l l l l l l Tam bir homozigotiyi çok kısa sürede elde etmek mümkündür. Resesif mutasyonların açığa çıkartılmasında başvurulan en etkin yöntemdir. Haploidler ve bunların katlanması ile geliştirilen dihaploidler sitolojik, fizyolojik ve genetik açıdan önemli deneysel materyallerdir. Dioik türlerde veya klasik yöntemlerle homozigotiye ulaşmanın zor olduğu türlerde dihaploidizasyon yöntemi kullanılarak bu sorun bir generasyonda giderilebilir. Çok yıllık meyve ağaçları ve orman bitkileri gibi tohumdan çiçeklenmeye kadar oldukça uzun bir gençlik kısırlığı olan türlerde de haploidizasyon önem kazanmaktadır. Haploid bitkiler, farklı patojenlere karşı in vitro seviyede seçime olanak vermekte, hastalıklara dayanıklılık çalışmalarında yer, zaman ve maddi kazanç sağlamaktadır.
Haploid bitkilerin üretiminde 5 yol; l Bunlardan ilki ginogenesis olarak adlandırılmaktadır. Bu durumda yumurta hücresi döllenme olmaksızın zigot gibi bölünmeye başlayarak haploid yapıda bir embriyo oluşturur. Dişi eşey hücresi ile erkek eşey hücresi birleşmediği halde; embriyo kesesi sekonder çekirdekleri ile polen generatif çekirdeği birleşerek embriyonun gelişip çimlenebilmesi için gereksinim duyacağı endospermi oluştururlar. l Haploidlerin oluştuğu bir diğer yolda ise yumurta hücresinin döllenmesinden önce, dişi eşey hücresinin çekirdeği kaybolur veya inaktif hale geçer. Bu yolla oluşan haploidler, hücrelerinde yalnızca erkek gametin kromozom takımını içerdiklerinden bu olaya androgenesis adı verilmektedir.
l Erkek ve dişi eşey hücrelerinin birleşerek embriyo oluşumuna katılmasının söz konusu olduğu, fakat çekirdeksel erimenin gerçekleşmediği semigami durumunda ise ana ve babaya ait sektörlerin bulunduğu kimeralı haploid bitkiler oluşmaktadır. l Dördüncu yol olan poliembriyoni durumunda, normal döllenme sonucu zigot bölünmeye başlar. Ancak döllenmis yumurta hücresinin yanındaki sinerjit hücrelerinden biri de bölünerek gelişir ve haploid embriyo haline geçer. Böylece yeni oluşan tohum içinde biri diploid, diğeri haploid olan iki embriyo bulunur (Lacadena, 1974). Biberde ve şeftalide poliembriyoni yolu ile haploid bitkiler oluşabilmektedir.
l Beşinci haploid oluşum yolunda, yumurta hücresi ile polen generatif çekirdeği birleşirler ve döllenme olur. Ancak embriyo gelişmesinin ilk devrelerinde ebeveynlerden birine, genellikle babaya ait kromozomlar elimine olur ve gelişen embriyo n sayıda kromozom içerir. Bu şekildeki haploid oluşumuna da kromozom eliminasyonu adı verilir
l Haploidlerin oluştuğu bir diğer yolda ise yumurta hücresinin döllenmesinden önce, dişi eşey hücresinin çekirdeği kaybolur veya inaktif hale geçer. Bu yolla oluşan haploidler, hücrelerinde yalnızca erkek gametin kromozom takımını içerdiklerinden bu olaya androgenesis adı verilmektedir.
l günümüzde haploid bitkilerin elde edilebilmesi için en etkin ve verimli yöntemler; erkek veya dişi gametlerin başlangıç materyali olarak kullanıldığı in vitro tekniklerle sınırlı kalmaktadır. Bir türün normal kromozom sayısının yarısına (n) sahip olan eşey hücreleri yani gametlerden yararlanılarak; o türün gametik kromozom sayısını taşıyan bitkilerin elde edilmesine haploidizasyon adı verilmektedir. l Haploid bitkiler, morfolojik görünümleri bakımından diploidlere göre daha küçük yapılıdırlar. Normal bir bitkide bulunan tüm organlara sahip oldukları halde, diploidlere oranla hücreleri daha küçük olan haploid bitkilerin boyları daha kısa, yaprakları dar ve küçüktür. Çiçekleri de diploidlere oranla küçük olan haploidler, hücrelerinde taşıdıkları kromozom sayısı bakımından indirgenmiş gametlerin yapısını gösteren bitkilerdir. Bu bitkiler gamet oluşturamadıkları için kısırdırlar ve tohum bağlayamazlar.
Dişi Gametten Haploidi Uyartımı (Ginogenesis ve Partenogenesis) Ovül ve ovaryum kültürleri l Döllenmemiş yumurtalığın ya da yumurta hücrelerinin kültüre alınmasıyla haploid embriyo ve bitki oluşumuna ovaryum veya ovül kültürleri adı verilmektedir. Ovül veya ovaryum kültürlerinden başarı elde edebilmek için dikkat edilmesi gereken en önemli noktalardan birisi, yumurtalığın alındığı çiçeğin büyüklüğü, yani yumurtalığın fizyolojik olarak içinde bulunduğu gelişme dönemidir. Yumurtalığın gelişme dönemini pratik olarak belirleyebilmek için kullanılabilecek en etkili yol, aynı çiçek içerisinde bulunan anterlerdeki mikrospor gelişme dönemlerini izlemektir.
Haploid Bitkilerde Kromozom Katlama l Haploid bitkilerin elde edilmesindeki temel yaklaşım kuşkusuz bu bitkilerin kromozom setlerinin iki katına çıkartılması (katlanması) ve %100 homozigot safhatların hızla geliştirilmesidir. Kromozom katlanması bazı bitki türlerinde kendiliğinden meydana gelmekle birlikte, pratikte çoğunlukla kimyasal madde uygulamalarıyla gerçekleştirilmektedir. Bu amaçla azot protoksit, kafein, kloral hidrat, asenaften, sulfinilamid, etil merkuriklorid, hekzaklorosiklohekzan ya da kolhisin gibi antimitotik özellik gösteren kimyasallardan yararlanılmaktadır. Yine bu amaçla 2,4 D ve NAA gibi hormonlar (Changdeng ve ark., 1998) ve trifluralin ve orizalin gibi bazı herbisitler (Bouvier ve ark., 1994; Hansen ve Andersen, 1998) de kullanılabilmektedir.
l Günümüzde kromozom katlaması için bitki ıslahçıları tarafından en yaygın kullanılan kimyasal madde, kolhisindir. Bu madde Liliaceae familyasına ait Colchicum automnale L. (güz çiğdemi) bitkisinin köklerinden elde edilen, alkaloid yapısında kuvvetli bir zehir olup; alkol, kloroform ve soğuk suda eriyen, buna karşılık sıcak suda ve eterde erimeyen bir maddedir. Kimyasal formülü C22H25O6 olarak gösterilen kolhisin, değişik kaynaklarda kolkisin, kolşisin veya kolçisin olarak da ifade edilebilmektedir. Kolhisin, uygulandığı dokuların hücrelerinde mitoz bölünmenin metafaz safhasında iğ ipliklerinin oluşumunu engeller ve dolayısı ile replikasyona uğramış kromozomların kutuplara çekilmesini önleyerek, kromozom sayısının iki katına çıkmasını sağlar.
Ploidi belirleme l 1. Fenotipik gözlemler l Bitkilerin kromozom sayısı arttıkça, yani poliploidi oluşması halinde bitkinin tüm organlarında bir irileşme meydana gelmekte; buna karşılık haploid bitkilerin elde edilmesi halinde bitkinin organları tam olarak oluştuğu halde diploidlere göre daha küçük olmaktadır. Gerçekten de ister androgenetik, isterse gynogenetik yolla elde edilmiş olsun; haploid bitkiler, diploid bitkilerle karşılaştırıldıklarında tüm organlarının daha küçük yapılı oldukları görülmektedir.
2. Kromozom sayımları l Bitkilerin genellikle kök uçlarında yapılan kromozom sayımları, deneyimli elemana gereksinim göstermesi ve preparat hazırlama sırasında yapılan hidroliz, boyama gibi işlemlerin uzun süre alması gibi dezavantajlarının yanında güvenirliliği en fazla olan yöntemdir. Sağlıklı ve güçlu bir gelişme gösteren taze kök uçlarından, bölünmenin en hızlı olduğu sabah saatlerinde alınan örnekler, kromozom sayımları için en uygun materyaldir. Kromozom sayımlarında ilk işlem, mitoz bölünmenin metafaz aşamasında ig iplikçiklerinin yapısını bozarak ig oluşumunu engellemek, kromozomların ekvatoral tablada toplanmasını sağlayarak, hücre içinde dağılmasının önüne geçmektir.
l Bu amaçla α- monobromonaftalin kullanılmaktadır. Bu madde, iğ ipliklerinin oluşumunu durdurmakta, kromozomların kısalmasını ve düzelmesini sağlamaktadır (Elçi, 1982). Değişik bitki köklerinde kromozom sayımları için doymuş α- monobromonaftalin içerisinde kalma süresi farklı olmakla birlikte bu süre genellikle 3-4 saattir. Daha sonra çözeltinin köklerden süzülmesi ve uzaklaştırılması için de köklerin birkaç kez su ile yıkanması gerekmektedir. Bu uygulamaların ardından yapılan, glasial asetik asit içerisinde tespit işlemi ile hücrelerin hayat seyrinin birdenbire sona erdirilmesi ve mümkün olduğunca hayattaki durumunu bozmadan gözlenmesi amaçlanır. Hücrelerin birbirinden ayrılması ve daha iyi gözlenmesi için yapılan hidroliz işlemi, iyi bir preparat yapılabilmesi için en önemli aşamalardan birisidir. Genellikle 1 N HCl içerisinde 60o C de 10-20 dakika sürelerle yapılan hidroliz işlemiyle hücreler, aralarında birleştirici bir kuvvet bulunmayan serbest hücrelerden oluşan bir yığın durumuna getirilmektedir. Yoğun bölünmenin olduğu kök uçlarının, Feulgen gibi çeşitli boyalarda tutulması ile kromozomlar son şeklini almaktadır. Kök uçlarının lam üzerine yerleştirilmelerinden sonra uygulanan %1 lik asetokarmin eriyiği ise kromozomların net görülebilecek biçimde boyanmasını sağlamaktadır.
l 3. Flow sitometri l Otomatik floresan yönteminin bulunmasının ardından hücrelerde kromozom sayılarının belirlendiği ploidi ölçümleri, insan onkolojisinde çok geniş bir uygulama alanı bulmuştur (Göhde ve ark., 1979). Daha sonra bazı bitki bilimciler yöntemi flow sitometri olarak adlandırmışlar ve pekçok bitki türüne giren çok sayıda genotipte bitki hücrelerindeki çekirdeksel DNA ölçümlerinde kullanmışlardır.
l Ploidi belirlemesi için klasik kromozom sayımları iyi bir laboratuvar altyapısı ve deneyimli elemana ihtiyaç göstermekte; bu koşullar sağlansa bile bazı bitki türlerinde kromozom sayımlarının çok güç olması nedeniyle bazen olanaksız olabilmektedir. Diğer yöntemlerin de etkili olarak çalışmadığı durumlarda flow sitometri, güvenilir ve geçerli sonuçlar sunmaktadır. Flow sitometri (Flow cytophotometric, FCM), hücrelerin tek tek flouresans dedektörden geçerken emdiklerin ışının analizine dayanan bir yöntemdir. Bunun için enzimatik olarak parçalanan yaprak örneklerinde hücre çekirdekleri serbest bırakılmakta, H 33258 veya DAPI gibi flouresans boyalarla boyanan hücre çekirdeklerinde, çekirdeksel DNA miktarı belirlenmektedir. Her bitki türü için yöntemin optimize edilme gereksinimi, bu yöntemin dezavantajlarından biri olsa da; miksoploid hücrelerin varlığının ortaya çıkartılması, bir kişinin günde 100 den fazla bitkide analiz yapabilme olanağını sunması gibi avantajları, flow sitometrinin günümüzde kromozom sayımlarının yapılması için en fazla tercih edilen yöntem haline gelmesine neden olmuştur.
l l 4. Stomatal incelemeler Bilindiği gibi stomalar, yaprak epidermisinde gömülü olarak bulunan, havadaki karbondioksitin yaprağa girmesini, su ve oksijenin ise yapraktan çıkmasını sağlayan açıklıklardır. Değişik bitki türlerinde stomaların iriliği, dolayısıyla birim alanda bulunan stoma sayısı ile ploidi düzeyi arasında güvenilir ilişkiler saptanmıştır. Örneğin kereviz (Şalk, 1979), tütün (Emiroğlu, 1980), brüksel lahanası (Doré, 1986), havuç (Rode ve Dumas de Vaulx, 1987), karpuz (Sarı ve ark., 1999b), kavun (Abak ve ark., 1996), hıyar (Çağlar ve Abak, 1996), kahve (Mishra, 1997), biber (Abak ve ark., 1998) ve kabak (Kurtar, 1999) ta haploid bitkilerin stomalarının diploidlerine göre daha küçük olduğu, dolayısıyla birim alanda daha fazla stoma bulunduğu saptanmıştır. Stomalar içerisinde bulunan kloroplastların sayısı da bazı bitki türlerinde (şeker pancarı: Doctrinal ve ark., 1989; karpuz: Sarı ve ark., 1999b; kavun: Abak ve ark., 1996; hıyar: Çağlar ve Abak, 1996; biber: Abak ve ark., 1998; kabak: Kurtar, 1999) ploidi ayırıcı, güvenilir bir yöntem olarak dünya literatüründe yer almaktadır. Buna rağmen, çilek (Quarto ve ark., 1991) gibi poliploidi olgusu yaygın olan bitkilerde kloroplast sayımlarının ploidi belirlemek için yeterli olmadığı, mutlaka kromozom sayımlarıyla desteklenmesi gerektiği vurgulanmıştır.
MERİSTEM KÜLTÜRÜ Meristematik hücreleri kullanarak gerçekleştirilen doku kültürü özellikle virüsten arındırılmış bitkilerin elde edilmesinde yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Apikal sürgün ve kök meristemi hücrelerinin virüs içerme ihtimali oldukça düşüktür.
Meristem ve sürgün ucu kültürlerinin uygulama alanları l Virüssüz materyal elde etmek l Mikroçoğaltım l Germplazm muhafazası l Genetik transformasyonlar l Bitki materyallerinin uluslararası değişimi l Bakteri ve mantarlardan arındırılmış bitkilerin üretimi
Meristem ucu kültürlerinde başarıyı etkileyen faktörler l l l Bitki materyali - Eksplantın büyüklüğü - Donör bitkinin fizyolojik durumu - Eksplantın alındığı mevsim - Çeşit Kültür ortamı - Mineral tuzlar - Şekerler - Agar - Büyüme düzenleyicileri Kültür şartları
Meristem ucu kültürünün yararları l l l l l En yüksek genetik kararlılık in vitro klonal çoğaltımda elde edilmektedir. Meristem ucu kültürü ile bulaşık olan bir donör bitkiden viral, bakteriyal, ve fungal patojenler uzaklaştırılabilir. Meristem ucu, soğukta muhafaza ve diğer kültür muhafaza teknikleri için homojen bir doku tipi olması ve küçük olması bakımından çok uygundur. Kimera olan bir materyalin aynen çoğaltımı için meristem ucu kültürü çok uygun bir tekniktir. Meristem ucu kültürleri, karantina uygulamalarına göre uluslararası taşımada çoğunlukla kabul edilen kültürlerdendir.
Meristem ucu kültürü tekniğinin sınırlamaları l Virüsten arındırmada eksplant boyutu ile kontaminasyon derecesi arasında negatif bir ilişki vardır. l Virüsten arındırılmış bitkilerin elde edilmesinde stok bitkinin fizyolojik durumu etkili olmaktadır. Bu nedenle virüsten arındırma sezon ile değişmektedir ve her mevsim virüsten arındırılmış bitkileri elde etme şansı mümkün olmamaktadır. l Meristem kültürünün virüs eliminasyonunda etkili bir yöntem olarak tanımlanmasına karşın meristemlerin her zaman virüsten arındırılmış olmadığı da unutulmamalıdır.
MİKROÇOĞALTIM Bir bitkiden alınan ve tam bir bitkiyi oluşturabilme potansiyeline sahip bitki kısımlarından (embriyo, tohum, gövde, sürgün, kök, kallus, vb.) yapay besin ortamlarında ve aseptik koşullar altında yeni bitkilerin elde edilmesidir.
BİTKİLERDE MİKROÜRETİM
Mikroçoğaltımın bitki yetiştiriciliği ve genetiği yönünden önemi ve avantajları; l l l Hastalık ve zararlılardan arındırılmış bitkisel materyal elde edilmesi Kitlesel üretimde - üretilen bitkilerde fenotipik ve genotipik benzerlik - alışılagelen yöntemlerden daha kısa kültür süresi - zor üretilen türlerin daha kolay üretimi - seçilen belirli/üstün genotiplerin hızlı üretimi - üretimde daha az anaç kullanılması Somaklonal varyasyondan dolayı yeni çeşitlerin/ genotiplerin elde edilmesi
Mikroçoğaltım aşamaları l l l l l Hazırlık aşaması Kültür başlangıç aşaması - Eksplant seçimi - Sterilizasyon - Başlangıç ortamları - Çevresel faktörler Sürgün çoğaltım aşamaları - Besin ortamları - Kallus oluşumu - Adventif tomurcuk oluşumu -Aksillar tomurcuk oluşumu Sürgün gelişimi ve köklendirme aşaması Dış ortama alıştırma (aklimatizasyon) aşaması
Mikroçoğaltımda karşılaşılan sorunlar l Vitrifikasyon l Toksik bileşiklerin birikmesi ve kararma l Kontaminasyon
SOMAKLONAL VARYASYON Bitki ıslahında doğal varyasyonun daraldığı veya varyasyon meydana getirmenin zor olduğu durumlarda avantajlı olarak değerlendirilen varyasyon yeni bir kaynak olarak görülmektedir ve doku kültüründe ortaya çıkan bu kalıtsal değişikliklerin tümü somaklonal varyasyon olarak tanımlanmaktadır.
Somaklonal varyasyonun orijini l Kültür uyarımı dönemi l Kültürün gelişme dönemi l Bitki rejenerasyonu dönemi
Somaklonal varyasyonun nedenleri l Hücre organizasyonunun varyasyonda etkisi l Doku kaynağındaki varyasyon - donör bitki orijinindeki değişimler - eksplant kaynaklı varyasyon l DNA metilasyonu l Nükleik asit öncüllerinin kaybı l In vitro hücre bölünmesindeki anormallikler l Bitki büyüme düzenleyicilerinin önemi l Kültür ortamının bileşimi l Kültür süresi l Genotipin etkisi
Faktör Somaklonal varyasyonu etkileyen faktörler Genel Etki Genotip Farklı genotipler farklı derecede varyasyon gösterebilirler. Ploidi Yüksek ploidi düzeyine sahip olan bitkilerde daha fazla kromozom sayısı değişimleri görülmektedir. Rejenerasyon sistemi Protoplastlar eksplantlara göre daha yüksek varyasyon gösterir. Kültür süresi Uzun süreli kültürler daha büyük varyasyonlara neden olurlar. Doku kaynağı Bazı dokular daha fazla varyasyon gösterir. Büyüme düzenleyicileri Yüksek konsantrasyonları varyabiliteyi artırır.
Kallus kültürlerinden organogenesis yoluyla elde edilen bitkilerde genetik varyasyon kaynakları
Kallus kültürlerinde ve kallustan rejenere olan bitkilerde genetik varyabiliteyi etkileyen faktörler
Somaklonal varyasyonun avantajları l Hızlı bir varyasyon kaynağı olarak elverişlidir. l Bazı değişmeler yüksek frekanslarda meydana gelebilir. l Agronomik özellikler değişebilir. l Bazı değişimler homozigottur. l Yeni varyantlar ortaya çıkabilir. l Yeni varyeteler üretilebilir.
Somaklonal varyasyonun dezavantajları l Somaklonal varyasyon mikroüretimde büyük kayıplara neden olmaktadır. l Bitki biyoteknolojisinde bitki ıslahı teknikleri somatik hücrelerden rejenerasyona dayanmaktadır. Bu tür bitkiler somaklonal varyasyonun etkisi altındadır. Ancak istenmeyen mutantlar ayrılabilir. Fakat bu çok yıllık bitkiler için olanaklı olmamaktadır. l Bazı istenmeyen mutasyonlar hemen tanınamayacak ve bu yüzden bu mutantlar uzaklaştırılamayacaktır. l Somaklonal varyasyon, hücre kültürlerinde sekonder metabolit üretimini de etkilemektedir.