HEMOSTAZ TESTLERİNİ ETKİLEYEN PRE-ANALİTİK FAKTÖRLER Doç.Dr.Z.Günnur Dikmen HÜTF Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı Merkez ve Acil Laboratuvarları 19-20 Mayıs, Pre-Analitik Evre Sempozyumu, Adana
Koagülasyon ve Hemostaz Laboratuvar Testleri Primer Hemostaz Testleri: Kanama zamanı Trombosit fonksiyon testleri Sekonder Hemostaz Testleri: Prothrombin Time (PT) Aktive Parsiyel Thromboplastin Time (aptt) Trombin zamanı Faktör düzeyleri (Faktör I-XIII) Tromboz paneli (Protein S, Protein C, AT III)
Kan vermeden 24 saat önce ağır egzersizden kaçınılmalıdır. Akut ağır egzersiz, prokoagülan bir durum yaratır; -platelet hiperreaktivitesine, -pıhtılaşma faktörlerinin aktivitesinde artışa, -trombin üretiminde artışa yol açar. Tüm bu etkiler geri dönüşümlü olup, 24 saat içinde normale döner. Favaloro EJ. Lab Medicine 2012
İlaç kullanımı Heparin, vitamin K antagonistleri gibi anti-koagülan ilaç veya veya anti-platelet ilaç kullanan hastalar hakkında laboratuvara bilgi verilmelidir. Heparin tedavisi alanlarda yanlış lupus anticoagulant veya düşük faktör seviyesi saptanabilir. Oral antikoagülan kullanımına bağlı Protein C ve protein S düzeyinde yanlış düşüklük saptanabilir. Kalıtsal trombofililer için tarama, aktif bir trombotik epizoddan sonra istenmemelidir. (ATIII, Protein C, Protein S, APC rezistansı)
Sigara ve Diyet Sigara içimi platelet aggregasyonunu artırdığı için kan vermeden önce sigara içilmemelidir. Kan örneği, 8-10 saatlik açlık sonrası alınmalıdır. Yağlı yemekler FVII aktivitesini artırırken, bazı faktörlerin aktivitesini (FII, FIX, FX, FVII, FXII) azaltmaktadır. Şilomikronlar platelet aggregasyonunda interferans yaratır. Lippi G et al. Semin Thromb Hemost 2012;38:565 575
Sirkadiyen Ritm Sabaha karşı yükselen kan basıncı, kortizol artışı, geçici bir vazokonstrüktif ve protrombotik etki yaratır. - Akut arteriel tromboz (Angina, AMI, ani ölüm) - Venöz tromboembolizm (VTE) - Serebral hemorajiler sabah saatlerinde pik yapar. Koagülasyon ve fibrinolizis testleri için kan alımı, günün hep aynı saatinde tercihan sabah saatlerinde yapılmalıdır. Semin Thromb Hemost 2009; 35(3). Circadian Variation within Hemostasis
Kan Alımı 1) Turnike süresi <1 dk olmalı Turnike süresinde uzama, ekstravazasyon sonucu damar içinde hemokonsantrasyona neden olur: -Fibrinojen ve diğer faktörlerde artışa, -APTT and PT de kısalmaya yol açar. 2) Orta boy iğneler (19-21 gauge) 3)Primer vakumlu tüpler 4) Kan alımını takiben 3-6 kez alt üst etme Yetersiz karıştırma Pıhtılı örnek Fazla sert çalkalama Hemoliz, faktör aktivasyonu sonucu PT/aPTT de kısalma
Koagülasyon testleri için tüp Trisodyum sitrat içeren mavi kapaklı tüpler (108 mm %3.2 veya 129 mm %3.8) Sonuçların standardizasyonu için hep aynı sitrat konsantrasyonuna sahip tüplerle çalışılmalıdır. Tüpler çizgi seviyesine kadar doldurulmalıdır. İdeal antikoagülan/kan oranı (1/10): 9 birim kan, 1 birim antikoagülan Bu oranın tutturulamaması nedeniyle enjektörle kan alımı tavsiye edilmez, zorunluluk nedeniyle alınmışsa 30sn içinde sitratlı tüpe aktarılması gerekir. Lippi G et al. Semin Thromb Hemost 2012;38:565 575
Hemostaz testleri ve TFT için fizyolojik ph nın sağlanması kritik öneme sahiptir. Trisodyum sitrat örnek ph sını 7.30-7.45 arasında tutar. Kapağı 30dk.dan fazla açık tutulan örneklerde plazmadan çevre atmosfere CO 2 difüze olur ve ph yükselir. ph artışı özellikle PT ve aptt testlerinde uzamaya neden olur. (0.8 ünitlik ph artışı aptt de 20sn uzama) Plazması ayrılmış örneklerde, Hb tamponlama kapasitesi kaybolur, bu nedenle tam kan örneklerine göre ph değişikliklerine daha hassatır.
Yanlış tüp Koagülasyon testleri K-EDTA, Li-heparin içeren tüpler kullanılamaz. Cam tüpler kullanılmaz. Negatif yükü olan cam yüzey ile temas eden koagülasyon faktörleri aktive olabilir.bu nedenle hemostaz testlerinde polipropilen plastik tüpler tercih edilir. Alikotlamada kullanılacak sekonder tüpler polipropilen olmalı Polistren sekonder tüpler koagülasyon testleri için uygun değildir, platelet aktivasyonu tetikler! Alikotlama yapıldıktan sonra, sekonder tüplerin identifikasyonu yapılmalı ve ph değişikliğini önlemek amacıyla ağzı kapatılmalıdır. Alikotlanmış fakat identifikasyonu yapılmamış sekonder tüplerdeki plazma örneklerinin karışma riski vardır! aptt testinde pıhtı tespit edilemiyorsa muhtemelen örnek serumdur veya lityum heparinli tüpe alınmış plazma örneğidir.
Hastada bilinen sistemik bir hastalık var mı? Tiroid hastalıklarında hemostaz bozuklukları sıktır. Franchini M et al. Seminars in Thrombosis & Hemostasis 2009
Yüksek Htc düzeyleri sorun mudur? Yüksek Htc değerlerinde eritrosit sayısındaki artış, kan/antikoagülan oranını bozacaktır, bu nedenle düzenleme yapılması gereklidir: Htc>%55 ise CLSI kılavuzuna göre önerilen hematokrit-bağımlı düzenleme: Sitrat Konsantrasyonu: [1.85x10 3 ]x[100-hematokrit]x [kan hacmi] Hematokrit değeri %55-65 arasında ise 0.1 ml sitrat tüpten çıkarılabilir. Lippi G et al. Semin Thromb Hemost 2012;38:565 575
Örneklerin Transportu *Transport dik pozisyonda ve oda ısısında yapılmalı *Pnömotik sistemin yol açtığı fiziksel travma; platelet aktivasyonuna ve eritrositlerden ADP salınımına yol açar. *Bu nedenle TFT için pnömotik sistem tercih edilmez! *Plazmanın kullanıldığı diğer koagülasyon testleri için pmömotik sistem kullanılabilir. *Örneklerin santrifüjden sonra transportu gerekirse ve alikotlama yapılmamışsa, analizden önce mutlaka yeniden santrifüj edilmelidir!
Örnek Kabulünde Red Nedenleri Pıhtılı örnek %38.4 Uygunsuz örnek hacmi %33.2 Hatalı klinik istem %7.3 Hatalı kimlik tanımlama %6.5 Hemoliz %6 Yanlış tüp %3.8 Gecikmiş transport %1.5 Z.G. Dikmen, A.Pınar, F. Akbıyık. Specimen rejection in laboratory medicine: Necessary for patient safety? Biochemia Medica 2015;25(3):377 85
Tüp Dolum Oranının Sonuçlara Etkisi Tüplerin %90 dan az dolu olması red nedenidir. Yetersiz hacim -PT sonucunu fazla etkilememektedir. -aptt sonucunda belirgin uzamaya, -Fibrinojen ve FVIII düzeylerinde düşüklüğe neden olmaktadır. Lippi G et al. Semin Thromb Hemost 2012;38:565 575
Tüp dolum oranının test sonuçlarına etkisi Lippi G et al. Semin Thromb Hemost 2012;38:565 575
Pıhtı Varlığı Pıhtı varlığı, boyutundan bağımsız olarak red nedenidir. Örnekte mikropıhtı olması koagülasyon kaskadının ve plateletlerin analizden önce aktive olduğunu gösterir. Seminars in Thrombosis & Hemostasis 2012
Hemoliz Eritrositlerin parçalanmasıyla hücre dışına çıkan serbest hemoglobin, spektrofotometrik ölçümlerde interferans yaratabilir. Membranların parçalanmasıyla açığa çıkan membran fosfolipileri, hücre içi enzimler ve ADP platelet aktivasyonuna neden olarak primer ve sekonder hemostazı etkiler. Hemolizli örneklerde fibrinojen düşer, D-dimer düzeyi yükselir.
Santrifüj ve Plazma Eldesi Santrifüj oda sıcaklığında 1500g, 10-15dk Daha düşük derecelerde yapılan santrifüj, platelet ve pıhtılaşma faktörlerinin aktivasyonuna neden olur. Plazma ideal olarak 1 st içinde veya en geç 4st içinde santrifüj edilerek ayrılmalı
Tra Transport süresindeki uzama nedeniyle Protein S, Faktör V ve VIII de aktivite kaybı olur! Seminars in Thrombosis & Hemostasis Vol. 2012
Plazma Örneklerinin Saklanması Soğukta saklama (+4 0 C):Trombositlerin granüler şekil almasına, kontrakte olup mikrotübüler sistemlerini kaybetmelerine yol açar. Spontan platelet aggregasyonuna neden olur. Soğukta vwf ve Faktör VIII aktivitesi azalır, Faktör VII aktive olur! 2 hafta içinde çalışılacak testler için -20 o C yeterlidir. 2 haftadan daha geç çalışılacak aylık testler için -70 o C gereklidir. Plazma başka bir merkeze gönderilecekse kuru buz üzerinde transfer edilmelidir.
Örneklerin Çözdürülmesi Dondurulmuş örnekler 37 0 C lik su banyosunda 5-10 dk bekletilerek çözülmeli, tamamen çözüldükten sonra iyice karıştırılmalıdır. 37 0 C de uzun süre kalması veya daha yüksek sıcaklıklara maruz kalması faktör inaktivasyonuna ve güvenilir olmayan test sonuçlarına neden olur. Çözdürülmüş örnekler tekrar dondurulmamalıdır! Seminars in Thrombosis & Hemostasis Vol. 2012
Dondurup-Çözdürme FII, FVII, FX, FIX, FXI, Antithrombin III, Protein C, VWF ve plasminogen aktiviteleri birkaç kez dondurup-çözdürmeden etkilenmez. FVIII, tek bir çözdürmeden sonra bile aktivitesini kaybedebilir. FXI aktivitesi artabilir. Özellikle FV and FVIII, Proetin S aktivitesi, birkaç kez dondurup-çözdürmeden sonra azalır. Seminars in Thrombosis & Hemostasis Vol. 2012
Trombosit Fonksiyon Testleri (TFT) Agregometri gold standart test Plateletleri aktive eden agonistler (ADP, epinefrin, kollagen, ristosetin) PRP ye eklenerek platelet agregasyonu 37 o C de monitörize edilir.
0 KOLLAGEN İLE UYARILAN AGREGASYON Agregasyon YÜZDE 100 Reaktif ekleme Baseline Trombositlerde şekil değişikliği a b c a b c ZAMAN (Dak:sn)
Örnek Kabulü ve Plazma Eldesi Hastanın kullandığı ilaçlar (aspirin, NSAI, antibiyotik, anti-depresan, anti-koagulan vs) 10-14 gün önce kesilmelidir. Kan vermeden 1-2 gün önce soğan, sarımsak, zencefil, ginseng, balık yağı, vitamin C, vitamin E, alkol ve kafein alınmamalıdır. Örnekler oda ısısında elde transport edilmelidir. TFT için hastanın trombosit sayısı >50x10 3 PRP (TROMBOSİTTEN ZENGİN PLAZMA) 1000g de 7dk santrifüj edilerek elde edilir. PPP (TROMBOSİTTEN FAKİR PLAZMA): Kör olarak kullanılır. 2500 g de 7dk santrifüj ile elde edilir.
TFT, santrifüjden 30dk sonra-4 st içinde yapılmalıdır! Santrifüj sırasında eritrosit ve plateletlerden salınanan ADP nedeniyle santrifüjü takiben 30 dk süresinde plateletlerde cevapsızlık görülebilir. 4 saatten sonra örneklerdeki ph artışı ve enerji rezervlerinin tükenmesi nedeniyle nedeniyle TFT de düzgün yanıt alınmaz. Yanlış negatif sonuç sayısı 2. saat 4. saat 8. saat Agonistler ADP (2 µm) 1 (%5) 6 (%30) 13 (%65) ADP (6 µm) 4 0 0 (%20) Epinefrin 1 0 0 (%5) Kollajen 0 0 0 Ristosetin (0,5 mg/ml) 0 0 0 Ristosetin (1,25 mg/ml) 0 0 0