SEKANS TEKNİKLERİ GENOMİK-PROTEOMİK Ders Sorumlusu: Doç.Dr. Hatice MERGEN Hazırlayan: Levent ZORBEK Ankara,2006
DNA Dizi Analizi için geliştirilen birbirinden farklı iki yöntem bulunmaktadır. Bu iki yöntem; 1- Maxam ve Gilbert in kimyasal kırılma yöntemi (Maxam et al.,1977). 2- Sanger-Coulson un zincir sonlanma yöntemi. (Sanger et al.,1977). a-) Manuel (Radyoaktif İşaretleme) Dizi Analizi b-) Otomatik (Fluoresan İşaretleme) Dizi Analizi
Sanger-Coulson Zincir Sonlanma Yöntemi DNA dizi analizinde en sık kullanılan yöntem Fred SANGER ve arkadaşlarının geliştirdiği yöntem olan zincir sonlanma yöntemidir (Sanger et al., 1977). Bu yöntem enzimatik DNA sentezine dayanır ve günümüzün en yaygın kullanılan DNA dizi analizi tekniğidir. Bu yöntemde dizisi saptanacak olan DNA ipliği yeni sentezlenecek iplik için kalıp olarak kullanılır. DNA sentezini sağlamak için Klenov, Taq DNA polimeraz, ters transkriptaz ya da sekuenaz enzimlerinden birisi kullanılabilir.
Yöntemin temeli DNA polimerazın dntp lerin (deoksiribonükleozit trifosfat) yanısıra deoksiribozun 3 pozisyonunda OH grubu taşımayan ddntp leri de (dideoksiribonükleozit trifosfat) substrat olarak kullanabilmesine dayanır. Sentezlenen DNA ya bir ddntp nin katılması 3 pozisyonunda OH grubu olmadığı için sentezi durdurur.
datp ddatp
Dizi analizi yapılırken dört ayrı reaksiyon karışımı hazırlanır. Her bir karışım kalıp DNA zinciri, bir primer, dntp lerin dördü ve az miktarda ddntp lerden birini içerir. Özgül zincir sonlanması için her bir reaksiyonda farklı bir ddntp bulunur. Reaksiyonların her birinde çok az miktarda modifiye nükleotit kullanıldığı için yeni zincir sentezi rastgele sonlanarak bir dizi DNA fragmenti meydana gelir (Klug et al., 2000).
Reaksiyonlar sonucu elde edilen DNA parçalarına elektroforez uygulanarak jel üzerinde yan yana yürütülür. Uygulanan elektriksel alanın etkisi ile DNA parçacıkları en kısası en önde olmak üzere jel üzerinde bir merdiven görüntüsü oluşturur. İşaretleme yöntemine göre jel üzerinde, tespit edilen parçacıklar reaksiyon karışımına konulan ddntp nin tipine göre okunur (Klug et al., 2000).
Sanger-Coulson Zincir Sonlanma Yönteminde Kullanılan Kimyasallar Primerler Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde istenilen DNA kalıbının çoğaltılması ve dizi analizinin yapılabilmesi için özgül oligonükleotitlere yani primerlere ihtiyaç vardır. Primer çiftleri kullanılacak kalıp DNA nın genomik DNA dan eldesinde, çoğaltılmasında kullanılır. Ayrıca primerler yöntemin son aşaması olan sonlanma reaksiyonunda polimeraz enzimi için uygun 3 ucu sağlar. Her iki reaksiyondaki primer çifti aynı olabileceği gibi farklı primerler de kullanılabilir.
Gen bölgesinin elde edilmesinde kullanılan primer çifti dizi analizi yapılacak bölgenin daha dışından seçilip dizi analizi reaksiyonunda kullanılan primer ise bu primerlerin arasında ve dizinin analizi yapılacak bölgesine daha yakın olmalıdır. Sekanslama reaksiyonunda tek bir primer kullanılır ve böylece reaksiyon yönü tayin edilmiş olur (Sambrook et al., 1989).
Kalıp DNA Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde hem çift, hem de tek zincirli DNA kullanılabilir. Yöntemin birinci aşamasında polimeraz zincir reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction, PCR) tekniği ile elde edilen ve çoğaltılan DNA parçası kalıp DNA olarak adlandırılır. PCR ürünü kalıp DNA, önce reaksiyon artıklarından arındırılmalıdır. Bu çok özen gösterilmesi gereken bir aşamadır. Eğer kalıp DNA yeterince temizlenemezse bir sonraki sonlanma reaksiyonuna aktarılacak olan kimyasallar ile primer artıkları reaksiyonun hassasiyetini bozacaktır (Sambrook et al., 1989).
Enzimler Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde bir çok tipde DNA polimeraz enzimi kullanılabilmektedir. Bu enzimlerin ortak özellikleri özgül ve hassas olmalarıdır.
E.coli Klenow Fragmenti DNA Polimeraz I İlk geliştirilen yöntemde kullanılan bu enzimin iki büyük dezavantajı vardır. Birincisi enzimin kontrolsüz olarak çoğaltma reaksiyonlarını yarıda kesmesidir. Özellikle uzun okumalarda bu problem iyice belirginleşmektedir. İkincisi enzimin homopolimerik bölgeler ile ikincil yapısı kuvvetli olan bölgelerde istenilen verimde çalışmamasıdır (Sambrook et al., 1989).
Reverse Transcriptase Reverse transcriptase enziminin her ne kadar çok yaygın bir kullanım alanı olmasa da özellikle homopolimerik bölgelerde etkin çözüm verir. Enzim özellikle bu tip bölgelerde Klenow fragmentinden daha etkin ve kullanışlıdır (Sambrook et al., 1989).
Sequenase Enzimleri Sequenase enzimleri T7 bakteriofajın dan elde edilirler. Enzimin 3-5 ekzonükleaz aktivitesi inhibe edilmiştir. İnhibe edilen bu özelliği sayesinde enzim tek yönlü ve hızlı çalışır. Kalıp DNA nın uzun olduğu deneylerde yüksek özgül aktivitesi ve dayanıklılığı ile tercih edilir (Sambrook et al., 1989).
Taq DNA Polimeraz Özellikle tek zincirli DNA dizisinin saptanmasında tercih edilir. Sıcağa dayanıklı olduğu için yaygın kullanılan enzim türüdür. Özellikle 95 0 C da aktif olması nedeni ile homopolimerik bölgelerde bile çok etkindir (Sambrook et al., 1989).
Manuel DNA Dizi Analizi Sekans reaksiyonu kullanılarak zincir sonlandırma metodu uygulanır (Sanger et al., 1977). Örnekler %6 lık denatüre edici poliakrilamid jelde ayrıştırılarak, otoradyografi ile görüntülenir. Çalışılan gen amplifiye edildikten sonra enzimatik ön muamele yapılır. Bu amaçla hidrolitik enzimler (alkalin fosfataz ve ekzonükleaz I ) kullanılır. Ekzonükleaz I ortamdaki tek zincirli DNA iplikciklerini, alkalin fosfataz ise dntp leri uzaklaştırarak, dizi reaksiyonu için kullanılacak amplifikasyon ürününün temizlenmesini sağlar. İşlem tamamlandıktan sonra enzimleri inaktive etmek için, örnek karışımı 80 0 C da 15' bekletilir.
Primer tutunma reaksiyonu Temizlenmiş amplifikasyon ürünü üzerine primer ilave edilir. Karışım 100 0 C da inkübe edildikten sonra, önce buzlu su içinde, sonra buzda bekletilir. Örneğin bu şekilde kademeli olarak soğutulması, kalıp katlanmasını ve primerlerin kendi aralarında eşleşmesini önler.
İşaretleme reaksiyonu İşaretleme reaksiyonu için dört farklı tüp hazırlanır. Her bir tüp dört çeşit dntp nin yanısıra bir ddntp içerir. Bu aşamada kullanılan DNA polimeraz T7 bakteriofaj DNA polimerazının modifiye formudur. Bu enzim 3 5' ekzonükleaz aktivitesi içermez. Enzimin polimerizasyon hızı çok yüksek olup, DNA zincirine ddntp takabilme özelliğine de sahiptir. Reaksiyon karışımı 5' oda sıcaklığında bekletilir. İşaretleme aşamasında kullanılan işaretleme çözeltisi üç farklı dntp içerir. Dördüncü tip dntp, karışıma ilave edilen radyoaktif işaretli dntp dir.
Sonlandırma reaksiyonu Zincir sonlanması 3'OH grubu bulunmayan nükleotit analoglarının (ddntp) zincire takılması ile sağlanır. Dört farklı sonlandırma çözeltisinin her biri 80µl eşit dntp (A; C; G; T) ve 8µl tek bir bazın ddntp siniiçerir. Sonlandırma için hazırlanan tüplerin her birine sonlandırma çözeltisi reaksiyon karışımından ilave edilir. Tüplere formamid içeren durdurma çözeltisi eklenerek reaksiyon durdurulur. Bu örnekler jele yüklemeden önce denatüre edilir.
Reaksiyon Ürünlerinin Elektroforezi Örneklerin görüntülenmesi için ürünler denatüre edici poliakrilamid jel elektroforezine tabi tutulurlar. Jel hazırlandıktan ve polimerizasyon işlemi tamamlandıktan sonra ortamda kalan üre temizlenir. Elektroforez tamponu olarak 1X TBE kullanılır. Sisteme 70 watt, 1800 volt ve 50mA elektrik akımı verilerek 15-30 ön elektroforez uygulanır. Bu uygulama tamlandıktan sonra yapılan DNA Dizi Analizi reaksiyonları jele yüklenerek 2.5-3 saat yürütme yapılır.
Reaksiyon Ürünlerinin Otoradyografisi Elektroforez bitiminde jel, asetik asit metanol karışımında bekletilir, Whatmann 1MM kromatografi kağıdı üzerine alınarak jel kurutucuda kurutulur. Kuruma sonrası X-ışınına duyarlı filmle kaplanır. 1-2 gün boyu oda sıcaklığında karanlık odada tutularak otoradyografisi alınır.
Otomatik DNA Dizi Analizi Otomatik dizi analizi için çoğaltılan PCR ürünleri çeşitli yöntemler kullanılarak temizlenir. En sık kullanılan temizleme yöntemi ticari kitlerin kullanıldığı silika temelli yöntemlerdir.
İşaretleme Reaksiyonu Otomatik Dizi Analizi ticari olarak üretilen kitler kullanılır. En sık olarak ABI Prism Big DyeTM Terminatör Reaksiyon Kiti kullanılır. Bu PCR kitinin özelliği tüm PCR kimyasalları ile beraber, floresan boyalı ddntp ler ile Taq DNA Polimeraz enzimini de tek bir karışım halinde bulundurmasıdır. Big Dye Ready Reaction Mix olarak adlandırılan bu karışıma sadece primer ve temizlenmiş kalıp DNA eklenir ve PCR başlatılır.
BigDye Terminatör DNA Polymerase, dntp s and DyeDeoxyterminator s A C G T A A C AC C ACC G ACCG T ACCGTA ACCGTA T Bağlanma Uzama Ürünler
Fluorescent Dyes Used in 4-Color 4 Detection FAM (Blue) JOE (Green) TAMRA (Yellow) ROX (Red)
Amplifikasyon Koşulları 1 amplifikasyon tüpü (20 µl) için reaksiyon karışımı Kalıp DNA 8.0 µl Big Dye Ready Reaction Mix 8.0 µl Primer (3.2pmol / µl) 1.0 µl Distile su 3.0 µl
PCR Programı 96 0 C 10 50 0 C 5 24 döngü; 60 0 C 4 4 0 C 10 1 döngü;
Örneklerin Hazırlanması Örnek hazırlama sırasında amplifikasyon ürünü izopropanol çöktürmesi ile PCR artıklarından temizlenir. Bu aşama özellikle reaksiyona girmemiş floresan boyalı ddntp lerin uzaklaştırılması açısından da çok önemlidir. İşlem uygun şekilde yapılamazsa kontaminant boyalar lazer tarafından okunacak ve analizin hassasiyetini bozacaktır.
Örneğin Cihaza Yüklenmesi ve Elektroforezin Başlatılması Örnekler izopropanol ile temizlenip alkol tamamen uzaklaştırıldıktan sonra işaretleme reaksiyonu ürünleri formamid veya TSR içinde çözülür. Örnekler denatüre edildikten sonra buz içinde şoklanarak cihaza yüklenir ve elektroforez başlatılır. Yürütme işlemi 15 kv gerilim ve 50 o C sıcaklıkta gerçekleştirilir.
Fluorescent Emission Spectra for ABI Dyes 5-FAM JOE NED ROX Normalized Fluorescent Intensity 100 80 60 40 20 0 Laser excitation (488, 514.5 nm) 520 540 560 580 600 620 640 WAVELENGTH (nm) ABI 310 Filter Set F
Matrix File Table from an ABI 310 These values are used by the GeneScan Analysis Software to separate the various dye colors from one another. The letters B, G, Y, and R represent the dye colors Blue, Green, Yellow, and Red, respectively. 1.0000
Sonuçların Değerlendirilmesi Elektoroforez işlemi tamamlandıktan sonra bilgisayar ana menüsünden Sequence Analysis programı açılır ve yürütülen örnek burada analiz edilir. Analiz sonrası örnek isminin bulunduğu alan fare yardımıyla çift tıklandığında örneğimizin baz dizisi yeni bir ekran üzerinde renkli pikler halinde görünür. Her bir pik bir DNA fragmentine karşılık gelir. Piklerin rengi ise söz konusu DNA fragmentinin son bazı olan ddntp li bazın rengidir. Her bir pik üzerinde o pikin son bazının ilk harfi renkli olarak yazılıdır. Eğer istenirse baz dizisi metin olarak da alınabilir ya da her iki sonuç yazdırıcı vasıtasıyla kağıda aktarılabilir.
Otomatik Dizi Analizi Cihazları 1- Jel Sistemli Cihazlar (ABI Prism 370, 373, 377) 2- Kapiler Sistemli Cihazlar (ABI Prism 310, 3100, 3700)
ABI Prism 377 ABI Prism 377
Labeled DNA fragments (PCR products) Capillary or Gel Lane Sample Detection Size Separation Detection region Ar+ LASER (488 nm) LASER (488 nm) CCD Panel Color Separation Fluorescence ABI Prism spectrograph
ABI 310 PRISM
Kapiller Elektroforez High Voltage Detector Capillary (+) anode (-) cathode
STANDARD OPERATION CAPILLARY FILL PRE-ELECTROPHORESIS ELECTROPHORESIS WATER WASH OF CAPILLARY SAMPLE INJECTION WATER WASH OF CAPILLARY ELECTROPHORESIS DETECTION
Electrokinetic Injection Process Capillary Electrode Q = πr 2 c s (µ ep + µ eo )Etλ b λ s - - DNA - DNA - Sample Tube Q is the amount of sample injected r is the radius of the capillary c s is the sample concentration E is the electric field applied t is the injection time λ s is the sample conductivity λ b is the buffer conductivity µ ep is the mobility of the sample molecules µ eo is the electroosmotic mobility Rose et al (1988) Anal. Chem. 60: 642-648
ABI Prism 310 Genetic Analyzer Stepper Motor Syringe with polymer solution capillary Heat Plate Anode Laser Injection cathode Outlet buffer Pump Block Autosampler tray Inlet buffer
ABI Prism 310 Genetik Analizör Cihazı na ait elektrot ve kapiler Enjeksiyon Elektrodu Kapiler Örnek Tepsisi
ABI Prism 3100
Cihazın İç Yapısı
Long Read BigDye Terminator v 3.0, 80 cm Capillary Array 3100 Genetic Analyzer Model 3100 7_11.ab1 Version 3.4.1 Basecaller-3100POP4_80 2498.13734.1443.567 BC 1.4.b.2 Lane 11 Signal G:304 A:286 T:249 C:197 DT3100POP4{BDv3}v1.mob Points 1570 to 18468 Pk 1 Loc: 1570 Page 1 of 2 Tue, Sep 18, 2001 11:29 AM Tue, Sep 11, 2001 8:36 AM Spacing: 16.00{16.00} CATTCTTTAG ACGCTTCC TG TGCTACCATTCTCGGAAATA CTG CAAG AAATCATCG ATG TCCCATG ACGG AAAAGAAGAACCTGGTATTG CCAAAAAGAT AAACTCAGTA GATGATATTAT 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 TTATCAAATGTCAATGCTGGG TCCAAAAAAATGATGAAGAACGATTAGCT GAAATTTTAT CCATAAACAC AAGAAAAGCA CCACCAAAATTCTATGTTCA CTATGTTAATTACAACAAGCGT 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 TTTAGATGA GTGG ATTACCACTGACAGAATAAACCTGAAGAAGATCCAG TTCCCCAAGAAAGAGGCCAAGACCCCCACT AAGAACGGACTTCCTGGGTCCCGTCCTGGCTCTCCAGAGA GAGAGG 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 GTGCCGGCCTCGGCG CAGGCCAGCG GG AAGACCTTGCCAATCCCGGTCCAGATCA CACTCCGCTTCAACCTGCCC AAGG AGCGGGAGGCCATTCCCGGTGGCGAG CCTGACCAGC CGCTCTCCTC CAGCT 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 TCCTGC CTGCAGCCCA ACCACCGCTC AACGAAACGGAAGGTGGAGGTGGTTTCACCAGCAACTCCAGTGCCCAGCG AGACAGCCCCGGCCTCGGTTTTTCCCCAGA ATGGAGCCGC CCGTAGGGCA GTGG 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 610 620 GCAGCCCAGCCAGGACG GAAGCGAAAATCGAATTGTTTGG GCACTGA TGAGGACTCCCAGG ACAGCT CTGATGGAAT ACCGTCAGCA CCACGCATGA CTGGCAGCCTGG TGTCTGAT CGAAGCCACG A 630 640 650 660 670 680 690 700 710 720 730 740 750 ACGACATCGT CACCCGGATG AAGAACATTGAGTGCATTGAGCTGGGCCGGCACCGCCTCA AGCCGTGGTA CTTCTCCCCG TACCCACAGGAACTCA CCAC ATTGCCTGTC CTCTACC TGT GCGAG 760 770 780 790 800 810 820 830 840 850 860 870 GTTCTG CC TCAAGTAC GGCCGTAGTC TCAAGTGTCT TCAGCGTCAT TTGACCAGTGTGACCTACGA CATCCT CCAG GCAATGAGAT TNCCGCAAGGGCCCATCTCT TCTTNGAGAT GATGGAC 880 890 900 910 920 930 940 950 960 970 980 990
ABI Prism 3700
İki Yöntemin Y KıyaslanmasK yaslanması Manuel Yöntem Maliyeti düşükd Daha fazla işgücüi gerekir En fazla 350 bç okunabilir İlk radyoaktif datp zincire eklendikten sonra okuma başlar Daha fazla zaman alır Otomatik YöntemY Maliyeti yükseky Daha az işgücüi gerekir 1000 baz çifti okunabilir Primerden hemen sonra okunabilir Daha kısa k süre s alır
Otomatik sekansın n teorik kapasitesi 24 kapiller sekans aletinin kapasitesi 2.7 milyon baz/yıl Tüm m insan genomu sekansında nda bir tek cihaz kullanılırsa1000 yıl y l gerekli Bu nedenle 96 ve 384 kapiller sekans aletleri geliştirilmi tirilmiştir. tir. Slab jel kapiller sistem= 24 saat/9 yürütmey 1-66 milyon baz/1 ay/ 1 sekans aleti Amersham Megabase 1000 ile 450 000 baz / 1 güng Büyük k genomlar için i in birçok lab. birarada çalışmakta ve günde 18 milyon bazın n sekansını yapabilmektedir.
İnsan genom projesinde kullanılan sekanslama stratejileri 1- BAC temelli sekanslama 2- tüm genom shutgun stratejisi
BAC temelli sekanslama İnsan genomu yaklaşık 150-200 kb uzunluğunda fragmentlere ayrıldı. Bu fragmentler BAC vektörlere klonlanarak insan genomunun BAC kütüphanesi oluşturuldu. BAC kütüphanesi yaklaşık 20 000 kadar BAC klonundan oluşmaktaydı. Daha sonra her bir BAC klonu insan genomundaki yerinin belirlenmesi amacıyla haritalandı.
Dizi analizi için her bir BAC klonu yaklaşık 2000 bp lik daha kısa fragmentlere parçalandı. Bu subklonların dizi analizi yapılarak bilgisayarlar kullanılarak birleşme noktalarından faydalanılarak her bir BAC klonunun dizisi çıkarıldı. Daha sonra haritalanan BAC klonları birleştirilerek tüm genomun dizisi çıkarıldı.
Tüm Genom Shutgun Stratejisi Dr. J. Craig VENTER ve arkadaşları tarafından geliştirilen bu yöntem haritalamaya gereksinim duymadığından zaman ve işgücü açısından tassarruf sağlamaktadır. Bu yöntemde önce genom yaklaşık 2000 ve 10000 bp lik küçük fragmentlere ayrılır daha sonra bu fragmentler plazmit vektörlere klonlanarak çoğaltıldıktan sonra dizisi çıkarılır. Bu diziler bir algoritm programı ile birleştirilerek genomun dizisi çıkarılır.
Bu teknik basit olarak görünse de insan genomu gibi büyük genomlara uygulandığında kısa bir süre içinde milyonlarca fragmentden elde edilen dizilerin kısıtlı bir sürede birleştirilmesi gerekmektedir. Ayrıca yöntem çok sayıda yüksek kapasitede çalışabilecek sekansır ve sekansı çıkarılan dizilerin birleştirilmesi için bilgisayar sistemlerine gereksinim duymaktadır. Venter bu amaçla TIGR yı (The Institute for Genome Research) kurarak milyonlarca fragmenti biraraya getirmek için Algoritm programı geliştirdi.
Bu algoritmayı kullanarak Venter ve arkadaşları 1.8 milyon bp den oluşan Haemophilus influenza genomunun dizisini çıkardılar. Venter ve arkadaşları bu yöntemi insan genomuna uygulamaya karar verdiklerinde bir çok araştırıcı bu yöntemin insan gibi milyonlarca repetatif DNA içeren büyük genomlarda başarılı olmayacağını öne sürmekteydi.
Ocak 1998 de yüksek kapasiteli 3700 cihazlarının ve shutgun sekans algoritmasının geliştirilmesi ile insan genom projesi hız kazandı. Mayıs 1998 de Venter, 300 adet 3700 ve çok sayıda yüksek kapasiteli bilgisayar alarak Celera Genomics şirketini kurdu ve İnsan genomunun dizisinin 3 yıl içinde tamamlanacağını duyurdu. Venter ve arkadaşları 9 ay içinde insan genomunun taslağını çıkarmayı başararak yöntemlerinin başarılı olduğunu kanıtladılar.
Haziran 2000 de insan genom projesinin tamamlandığı açıklandı. Ancak açıklanan diziler taslak diziler olup düzeltilmesi gerekiyordu. İki grup bir arada çalışarak nisan 2003 yılında diziye son şeklini verdiler
Haziran 2000 Nisan 2003 Genomun %90 ını içeriyor Hata oranı yaklaşı şık k 1000 bazda 1 150 000 gap bulunuyor Genomun %28 i i bitiş standardına na uygun Genomun %99 unu içeriyori Hata oranı yaklaşı şık k 10000 bazda 1 400 gap bulunuyor Genomun %99 i i bitiş standardına na uygun